一種兩親性聚肽共聚物、自組裝體及制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種新型兩親性聚肽共聚物，所述兩親性聚肽共聚物由油溶性聚肽和水溶性聚肽組成，是一種生物相容性好的兩親性物質(zhì)。本發(fā)明還公開了所述兩親性聚肽共聚物的制備方法，以化學(xué)改性后的兩種氨基酸衍生物為單體，通過N?羧基?α氨基酸酐開環(huán)聚合法(NCA?ROP)得到溶解性不同的兩種均聚肽；再通過點(diǎn)擊化學(xué)過程將兩種均聚肽連接形成所述兩親性聚肽共聚物。本發(fā)明還公開了由所述兩親性聚肽共聚物制備得到的自組裝體。本發(fā)明的制備方法操作簡單、易行；制備的嵌段共聚物在藥物釋放、組織功能材料等領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用前景。
【專利說明】
一種兩親性聚肽共聚物、自組裝體及制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于生物材料、自組裝材料技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種新型兩親性聚肽共聚物及 其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]共聚物（copolymer)是指由兩種或兩種以上聚合物單元組成的大分子聚合物，又 稱為共聚體。對(duì)于兩嵌段共聚物來說，兩個(gè)嵌段在溶劑中溶解能力具有較大差別的，稱為兩 親性嵌段共聚物或雙親性嵌段共聚物。其中以親水鏈段(Hydrophilic Chain)和疏水鏈段 (Hydrophobic Chain)組成的"親水-親油"型兩嵌段共聚物最為常見，具有這種結(jié)構(gòu)的聚合 物在水溶液中，往往會(huì)形成以親油鏈段為核，以親水鏈段為殼的有序結(jié)構(gòu)，這是一種良好的 自組裝材料，在藥物的輸送和釋放、診斷影像學(xué)、納米反應(yīng)器等方面有著廣泛的應(yīng)用。
[0003] 聚肽是由氨基酸單體，通過羧基與氨基脫水縮合得到的一類高分子聚合物。根據(jù) 組成成分的不同，可將聚肽分成聚肽均聚物和聚肽嵌段共聚物。均聚物聚肽已經(jīng)被廣泛地 研究和報(bào)道，但嵌段聚肽的合成直到近幾十年才逐漸被報(bào)道，可能是聚合方法限制了對(duì)復(fù) 雜結(jié)構(gòu)聚肽的構(gòu)建。嵌段聚肽又可以分成：1.嵌段均為聚肽結(jié)構(gòu)的嵌段聚肽（block copolypepdite) ;2?嵌段中含有聚肽鏈段的雜化聚肽嵌段聚合物(polypeptide hybrid)。 從聚肽的結(jié)構(gòu)上來看，由于肽鏈上存在著強(qiáng)烈的氫鍵作用，使得聚肽鏈能形成獨(dú)特的二級(jí) 結(jié)構(gòu)(a-螺旋或者折疊），賦予了聚肽許多優(yōu)異的性能，在生物材料、自組裝材料、組織功 能材料等領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用前景。
[0004] 然而，受聚合方法、聚合物結(jié)構(gòu)等的限制，在聚肽共聚物的合成中，往往以雜化嵌 段聚肽居多，而嵌段聚肽的報(bào)道并不多見，而且得到的產(chǎn)物分布指數(shù)寬，分子量較小，這限 制了嵌段聚肽的發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為克服現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明提出了一種兩親性嵌段聚肽及其制備方法， 本發(fā)明的方法簡便易行，充分利用點(diǎn)擊化學(xué)的優(yōu)點(diǎn)，得到的兩親性嵌段聚肽的分布指數(shù)較 窄。本發(fā)明還提出了由所述兩親性聚肽共聚物制備的自組裝材料，所述自組裝材料具有有 序結(jié)構(gòu)。
[0006] 本發(fā)明目的在于：1.提供一種新的制備方法，用其合成出一類新型結(jié)構(gòu)的兩親性 聚肽共聚物，該類聚合物在生物材料、自組裝材料、組織功能材料等領(lǐng)域的應(yīng)用提供新的一 類兩親性聚肽共聚物材料。2.利用得到的兩親性聚肽共聚物制備了具有有序結(jié)構(gòu)的聚肽自 組裝材料，該類材料在藥物的輸送和釋放等領(lǐng)域的應(yīng)用提供新的一類自組裝材料。
[0007] 本發(fā)明提出的兩親性聚肽共聚物，由油溶性聚肽嵌段(末端帶有炔基的均聚肽： PBLG)和水溶性聚肽嵌段(末端帶有疊氮基的均聚肽:PCysPEGMA)組成，即，由一個(gè)嵌段為油 溶性的聚肽，另一個(gè)嵌段為水溶性的聚肽組成，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如式(I)所示：
[0009]式（I)中，聚乙二醇的聚合度X為3-5;n = 20-80;m=10-30。
[0010] 優(yōu)選地，聚乙二醇的聚合度x為4;n = 30;m=15
[0011]所述油溶性聚肽為聚(L-谷氨酸芐酯），結(jié)構(gòu)如式(a)所示，
[0013] 其中，n = 2〇-8〇,優(yōu)選地，n = 30。
[0014] 所述水溶性聚肽嵌段為聚半胱氨酸聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯，結(jié)構(gòu)如式(b)所 示，
[0016] 其中，聚乙二醇的聚合度x為3-5;m=10-30;
[0017] 優(yōu)選地，聚乙二醇的聚合度x為4;m=15。
[0018] 本發(fā)明的兩親性聚肽共聚物以化學(xué)改性后的兩種氨基酸衍生物為單體，通過N-羧 基-a-氨基酸酐開環(huán)聚合法(NCA-R0P)得到了溶解性不同的兩種均聚肽(均聚物），即式(a) 所示的油溶性聚肽和式(b)所示的水溶性聚肽;再通過點(diǎn)擊化學(xué)過程(click chemistry)將 兩種聚肽連接而形成兩親性嵌段聚肽材料?，F(xiàn)有的制備氨基酸多肽的技術(shù)，主要通過分步 添加單體逐步開環(huán)聚合的方法。對(duì)比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)在于：1.選擇性 高，對(duì)于設(shè)計(jì)具有特定聚合度的兩親性聚氨基酸多肽具有較高的應(yīng)用價(jià)值。在聚肽的合成 中，產(chǎn)物聚合度的控制往往較難。對(duì)于均聚物，通常利用NCA單體和引發(fā)劑的摩爾比來控制。 但是，對(duì)于多嵌段聚氨基酸多肽而言，現(xiàn)有技術(shù)需要先合成末端帶有氨基的均聚肽，再以此 作為大分子引發(fā)劑，引發(fā)另一個(gè)氨基酸NCA單體聚合。在這個(gè)過程中，聚肽大分子引發(fā)劑的 量難以控制，因此難以控制另一個(gè)聚肽單元的聚合度。本發(fā)明提供的方法，可分別通過控制 小分子引發(fā)劑與NCA單體的摩爾比，設(shè)計(jì)得到具有特定聚合度的兩種均聚肽，再通過點(diǎn)擊化 學(xué)將兩者結(jié)合，以得到特定聚合度的嵌段聚氨基酸多肽。2.產(chǎn)物的多分散指數(shù)(PDI)窄。相 比分步添加單體逐步開環(huán)聚合法，點(diǎn)擊化學(xué)法制備的嵌段多肽PDI分布更窄。圖2是利用本 發(fā)明方法制備的兩親性嵌段多肽凝膠滲透色譜(GPC)測試的數(shù)據(jù)，PDI = 1.30;圖3是利用分 步添加單體逐步開環(huán)聚合的方法制備的兩親性聚氨基酸多肽的GPC測試數(shù)據(jù)，PDI = 1.65。 對(duì)比兩者可知，利用本法制備的產(chǎn)物，分散指數(shù)明顯變窄。3.適用性廣。通過改變?nèi)脖放c BLG-NCA單體的比例，1-疊氮-3-氨基丙烷與CysPEGMA-NCA單體的比例，可制備得到不同聚 合度的均聚肽PBLG/PCysPEGMA，再通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，得到不同聚合度組成的兩親性聚肽 共聚物。4.操作簡單。在聚肽的合成過程中，NCA單體極易發(fā)生水解，因此對(duì)操作的要求特別 高，尤其在分步添加單體的過程中。本發(fā)明方法為合成兩親性聚肽共聚物提供了一種簡便、 有效的方法。所述兩親性嵌段聚肽的分布指數(shù)較窄、生物相容性好。本發(fā)明兩親性聚肽共聚 物在自組裝材料、組織功能材料、生物材料等方面存在著廣泛的應(yīng)用前景。
[0019] 本發(fā)明提出的兩親性聚肽共聚物的制備方法，包括均聚合和點(diǎn)擊化學(xué)改性兩個(gè)反 應(yīng)：
[0020] (1)均聚合反應(yīng)
[0021] i)所述油溶性聚肽制備過程為：
[0023]其中，n = 2〇-80;優(yōu)選地，n = 30。
[0024]以L-谷氨酸芐酯-N羧基-a氨基酸酐為原料，在有機(jī)溶劑中，以炔丙胺為引發(fā)劑，反 應(yīng)溫度控制在60~80°C，反應(yīng)時(shí)間為72-96小時(shí)，得到式(a)所示的油溶性聚肽。優(yōu)選地，所 述反應(yīng)溫度為75°C ;所述反應(yīng)時(shí)間為72小時(shí)。
[0025]其中，所述原料L-谷氨酸芐酯-N羧基-a氨基酸酐、炔丙胺的摩爾比為20-80:1;優(yōu) 選地，為30:1。
[0026]所述有機(jī)溶劑選自四氫呋喃、二氧六環(huán)、N，N_二甲基甲酰胺或二甲亞砜溶劑;優(yōu)選 地，為N，N-二甲基甲酰胺。
[0027] ii)所述水溶性聚肽制備過程為：
[0029] 其中，聚乙二醇的聚合度x為3-5;m=10-30。
[0030] 優(yōu)選地，聚乙二醇的聚合度x為4;m=15。
[0031]以L-半胱氨酸(聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯)-N羧基-a氨基酸酐為原料，在有機(jī)溶 劑中，以1-疊氮-3-氨基丙烷為引發(fā)劑，反應(yīng)溫度控制在45~75°C，反應(yīng)時(shí)間為72-84小時(shí)， 得到式(b)所示的水溶性聚肽。優(yōu)選地，所述反應(yīng)溫度為65°C;所述反應(yīng)時(shí)間為72小時(shí)。 [0032]其中，所述原料L-半胱氨酸（聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯)-N羧基-a氨基酸酐、1-疊氮-3-氨基丙烷的摩爾比為10-30:1;優(yōu)選地，為15:1。
[0033]其中，所述有機(jī)溶劑選自四氫呋喃、二氧六環(huán)、N，N_二甲基甲酰胺或二甲亞砜;優(yōu) 選地，為四氫呋喃。
[0034] (2)點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)
[0036] 其中，聚乙二醇的聚合度x為3-5 ;m= 10-30 ;n = 20-80。
[0037] 優(yōu)選地，聚乙二醇的聚合度x為4;n = 30;m=15。
[0038]向有機(jī)溶劑中加入步驟(1)制備的油溶性聚肽和水溶性聚肽，除去體系中的氧，再 加入由溴化亞銅、N，N，Y，V，N〃 -五甲基二乙基三胺組成的催化體系，反應(yīng)溫度控制在40~ ll〇°C，反應(yīng)時(shí)間為20-70小時(shí)，得到所述兩親性聚肽共聚物。
[0039]其中，所述催化體系的組成為溴化亞銅，N〃_五甲基二乙基三胺的摩爾 比為1:1~1.5;優(yōu)選地，兩者的摩爾比為1:1.2。
[0040]其中，步驟（1)制備的油溶性聚肽和水溶性聚肽、催化體系的摩爾比為1:1~1.5:1 ~1.5;優(yōu)選地，為1:1.2:1.2。
[0041]其中，所述有機(jī)溶劑選自四氫呋喃、二氧六環(huán)或N，N-二甲基甲酰胺;優(yōu)選地，為N，N 二甲基甲酰胺。
[0042]本發(fā)明反應(yīng)機(jī)理:本發(fā)明分別以兩種不同的氨基酸衍生物為原料，以兩種特定的 伯胺為引發(fā)劑，利用N-羧基-a氨基酸酐開環(huán)聚合法(NCA法)制備了末端帶有炔基的均聚肽 PBLG和末端帶有疊氮基的均聚肽PCysPEGMA。其次，利用"炔基-疊氮基"點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，選擇 性的使用溴化亞銅、，N〃-五甲基二乙基三胺為催化體系，制備兩親性聚肽共聚物 PBLG-b-PCysPEGMA。
[0043]現(xiàn)有的制備氨基酸多肽的技術(shù)，主要通過分步添加單體逐步開環(huán)聚合的方法。對(duì) 比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)在于：1.選擇性高，對(duì)于設(shè)計(jì)具有特定聚合度的兩 親性聚氨基酸多肽具有較高的應(yīng)用價(jià)值。在聚肽的合成中，產(chǎn)物聚合度的控制往往較難。對(duì) 于均聚物，通常利用NCA單體和引發(fā)劑的摩爾比來控制。但是，對(duì)于多嵌段聚氨基酸多肽而 言，現(xiàn)有技術(shù)需要先合成末端帶有氨基的均聚肽，再以此作為大分子引發(fā)劑，引發(fā)另一個(gè)氨 基酸NCA單體聚合。在這個(gè)過程中，聚肽大分子引發(fā)劑的量難以控制，因此難以控制另一個(gè) 聚肽單元的聚合度。本發(fā)明提供的方法，可分別通過控制小分子引發(fā)劑與NCA單體的摩爾 比，設(shè)計(jì)得到具有特定聚合度的兩種均聚肽，再通過點(diǎn)擊化學(xué)將兩者結(jié)合，以得到特定聚合 度的嵌段聚氨基酸多肽。2.產(chǎn)物的多分散指數(shù)(PDI)窄。相比分布添加單體逐步開環(huán)聚合 法，點(diǎn)擊化學(xué)法制備的嵌段多肽PDI分布更窄。相比分布添加單體逐步開環(huán)聚合法，點(diǎn)擊化 學(xué)法制備的嵌段多肽PDI分布更窄。如下圖所示：圖2是利用本發(fā)明方法制備的兩親性嵌段 多肽凝膠滲透色譜(GPC)測試的數(shù)據(jù)，PDI = 1.30;圖3是利用分步添加單體逐步開環(huán)聚合的 方法制備的兩親性聚氨基酸多肽的GPC測試數(shù)據(jù)，PDI = 1.65。對(duì)比兩者可知，利用本法制備 的產(chǎn)物，分散指數(shù)明顯變窄。3 .適用性廣。通過改變?nèi)脖放cBLG-NCA單體的比例，1-疊氮-3_氨基丙烷與Cy sPEGMA-NCA單體的比例，可制備得到不同聚合度的均聚肽PBLG/ PCysPEGMA，再通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，得到不同聚合度組成的兩親性聚肽。4.操作簡單。在聚肽 的合成過程中，NCA單體極易發(fā)生水解，因此對(duì)操作要求特別高，尤其在分步添加單體的過 程中。本發(fā)明方法為合成兩親性聚氨基酸多肽提供了一種簡便、有效的方法。
[0044]在一具體的實(shí)施方式中，所述兩親性嵌段聚肽共聚物的制備方法為：以化學(xué)改性 后的兩種氨基酸衍生物為單體，通過N-羧基_a氨基酸酐開環(huán)聚合法(NCA-R0P)得到了溶解 性不同的兩種均聚肽;再通過點(diǎn)擊化學(xué)過程(click chemistry)將兩種聚肽連接而形成兩 親性嵌段聚肽材料。
[0045] 氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將L-谷氨酸芐酯3.018，（12.6臟〇1)、三光氣1.328，（4.2111111〇1)和乙酸 乙酯90ml加入到裝有冷凝回流管干燥的250ml三口瓶中，于85°C的油浴中回流攪拌反應(yīng)至 體系澄清透明，反應(yīng)時(shí)間大約5小時(shí)左右。停止反應(yīng)并冷卻至室溫后，用冰水及冰碳酸氫鈉 溶液洗至中性并用無水硫酸鈉干燥。用石油醚重結(jié)晶，真空干燥，得到白色固體L-谷氨酸芐 酯-N-羧基內(nèi)酸酐(BLG-NCA)產(chǎn)率48%。
[0046] 在干燥的50ml雙口瓶中加入1.6(^(6.1111111〇1)81^-%六單體以及161111干燥的01^溶 劑，通氮除氧60mins。加入5yl的炔丙胺，引發(fā)聚合。避光反應(yīng)72hours。反應(yīng)結(jié)束后，甲醇沉 淀，重復(fù)操作3遍，得到白色固體聚(L-谷氨酸芐酯），產(chǎn)率80 %。
[0047] 在100ml帶有磁子的單口瓶中加入6.0g(50mmol)L-半胱氨酸并溶于60ml去離子 水，用lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH至6~9。向體系中加入聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸 酯(Mn = 300)16.12g(53mmol)，室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)結(jié)束后，乙酸乙酯萃取并保留水層產(chǎn)物。 冷凍干燥，得到白色膏狀固體L-半胱氨酸聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯（CysTOGMA)，產(chǎn)率 90% 〇
[0048] 氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將CysPEGMA 7 ? 41g( 18 ? 6mmol)、三光氣 1 ? 81g，（6 ? 2mmol)和 150ml干 燥的THF加入到裝有冷凝回流管干燥的250ml三口瓶中，于60°C的油浴中回流攪拌反應(yīng)至體 系澄清透明，反應(yīng)時(shí)間大約8小時(shí)左右。停止反應(yīng)并冷卻至室溫后，用正己烷沉淀并真空干 燥，得到黃褐色膏狀固體L-谷氨酸芐酯-N-羧基內(nèi)酸酐(PCysPEGMA-NCA)5.62g，產(chǎn)率71 %。
[0049] 在100ml帶有磁子的雙口燒瓶中，加入5.04g(l 1.9mmol)CysPEGMA-NCA并溶于50ml 干燥的THF溶劑，通氮除氧60mins。使用微量進(jìn)樣器向體系中加入22yl的1-疊氮-3氨基丙烷 引發(fā)聚合。避光通氮反應(yīng)72h 〇Urs。反應(yīng)結(jié)束后，提濃，用正己烷沉淀，得到黃色粗產(chǎn)物。真空 干燥后將粗產(chǎn)品溶于水，透析3天。最后，使用"冷凍干燥法"得到黃色固體聚(L-半胱氨酸聚 乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯），產(chǎn)率82 %。
[0050] 在20ml干燥的試管中，依次加入已經(jīng)制備好的PBLG 0.20g(lequiv)，PCysPEGMA 0.25g(l .4equiv)，提純過的溴化亞銅44mg(lequiv)，并溶于5ml干燥的DMF中。通氮除氧 30mins后加入配體N，N，Y，N〃-五甲基二乙基三胺(PMDETA)6.4yl并密封試管，轉(zhuǎn)入50°C 的油浴鍋，避光反應(yīng)70hourS。反應(yīng)結(jié)束后，淬冷。產(chǎn)物用甲醇沉淀并抽濾。重復(fù)操作3遍以后 真空干燥1 OOhours，得到淡黃色固體顆粒，產(chǎn)率70 %。
[0051]本發(fā)明的制備方法簡便易行，充分利用點(diǎn)擊化學(xué)的優(yōu)點(diǎn)；現(xiàn)有的制備氨基酸多肽 的技術(shù)，主要通過分步添加單體逐步開環(huán)聚合的方法。對(duì)比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn) 和優(yōu)點(diǎn)在于：1.選擇性高，對(duì)于設(shè)計(jì)具有特定聚合度的兩親性聚氨基酸多肽具有較高的應(yīng) 用價(jià)值。在聚肽的合成中，產(chǎn)物聚合度的控制往往較難。對(duì)于均聚物，通常利用NCA單體和引 發(fā)劑的摩爾比來控制。但是，對(duì)于多嵌段聚氨基酸多肽而言，現(xiàn)有技術(shù)需要先合成末端帶有 氨基的均聚肽，再以此作為大分子引發(fā)劑，引發(fā)另一個(gè)氨基酸NCA單體聚合。在這個(gè)過程中， 聚肽大分子引發(fā)劑的量難以控制，因此難以控制另一個(gè)聚肽單元的聚合度。本發(fā)明提供的 方法，可分別通過控制小分子引發(fā)劑與NCA單體的摩爾比，設(shè)計(jì)得到具有特定聚合度的兩種 均聚肽，再通過點(diǎn)擊化學(xué)將兩者結(jié)合，以得到特定聚合度的嵌段聚氨基酸多肽。2.產(chǎn)物的多 分散指數(shù)(PDI)窄。相比分布添加單體逐步開環(huán)聚合法，點(diǎn)擊化學(xué)法制備的嵌段多肽PDI分 布更窄。相比分布添加單體逐步開環(huán)聚合法，點(diǎn)擊化學(xué)法制備的嵌段多肽roi分布更窄。如 下圖所示：圖2是利用本發(fā)明方法制備的兩親性嵌段多肽凝膠滲透色譜(GPC)測試的數(shù)據(jù)， PDI = 1.30 ;圖3是利用分步添加單體逐步開環(huán)聚合的方法制備的兩親性聚氨基酸多肽的 GPC測試數(shù)據(jù)，PDI = 1.65。對(duì)比兩者可知，利用本法制備的產(chǎn)物，分散指數(shù)明顯變窄。3.適用 性廣。通過改變?nèi)脖放cBLG-NCA單體的比例，1-疊氮-3-氨基丙烷與CysPEGMA-NCA單體的 比例，可制備得到不同聚合度的均聚肽PBLG/PCysPEGMA，再通過點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，得到不同聚 合度組成的兩親性聚肽。4.操作簡單。在聚肽的合成過程中，NCA單體極易發(fā)生水解，因此對(duì) 操作要求特別高，尤其在分步添加單體的過程中。本發(fā)明方法為合成兩親性聚氨基酸多肽 提供了一種簡便、有效的方法。
[0052]本發(fā)明還提出了一種自組裝體，所述自組裝體是具有有序結(jié)構(gòu)的自組裝材料，由 上述的兩親性聚肽共聚物自組裝形成，具有親水-親油結(jié)構(gòu);為碗狀膠束、柱狀膠束、梭型片 層膠束。與現(xiàn)有的技術(shù)相比，其特點(diǎn)在于：1.自組裝材料通常由兩親性小分子(如十二烷基 硫酸鈉等)或兩親性的嵌段共聚物(如PE〇-b-PS等)構(gòu)成。以兩親性聚氨基酸多肽為自組裝 前體，能夠形成有序自組裝材料卻并不多見。2 .對(duì)于自組裝體，尤其是膠束，具有特殊的親 水-親油結(jié)構(gòu)，是一種良好的潛在藥物載體材料。然而，目前常見的非聚肽類自組裝前體材 料存在著生物相容性差，毒性大等缺點(diǎn)，限制了這種材料的發(fā)展。聚肽，作為構(gòu)成生命物質(zhì) 蛋白質(zhì)的重要組成部分，具有其它材料所不具備的優(yōu)異的生物相容性，以其作為自組裝前 體材料，有望解決其在藥物載體等應(yīng)用領(lǐng)域的難題。
[0053]本發(fā)明還提出了由所述兩親性嵌段聚肽共聚物制備得到的自組裝體的制備方法， 包括:將所述兩親性嵌段聚肽共聚物溶解在有機(jī)溶劑中，形成共聚物的稀溶液，向其中滴入 共聚物的稀溶液的1~2倍體積的水，滴加速率為1~5ml/min;加過量的超純水淬滅;通過透 析將多余有機(jī)溶劑除去，得到所述自組裝體。所述自組裝體是具有有序結(jié)構(gòu)的自組裝材料： 有機(jī)溶劑為四氫呋喃時(shí)，所述自組裝體為碗狀膠束，球形的膠束的某一面塌陷而形成了碗 型的膠束結(jié)構(gòu)，經(jīng)過測量，自組裝體的平均粒徑為55nm，碗型膠束的塌陷方向不一;有機(jī)溶 劑為N，N-二甲基甲酰胺時(shí)，所述自組裝體為柱狀膠束，管狀膠束之間相互連接、重疊，并含 有鏤空部分，形成了類似于空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu);有機(jī)溶劑為1，4_二氧六環(huán)時(shí)，所述自組裝體為梭 型片層膠束，其結(jié)構(gòu)中間寬，兩頭窄，并在兩端有較為突出的毛刺狀，經(jīng)測量，膠束的平均長 度為600nm，寬度平均為200nm。其中，所述"過量"是指聚合物稀溶液加水自組裝后，溶液體 積的5~10倍。
[0054]其中，所述"透析"的條件為選擇透析袋的截留分子量為3500Da，材質(zhì)為再生纖維 素酯。
[0055]其中，所述兩親性嵌段聚肽共聚物、有機(jī)溶劑的質(zhì)量比：1000-3000:1;優(yōu)選地，為 2000:1〇
[0056]其中，所述有機(jī)溶劑選自四氫呋喃，N，N_二甲基甲酰胺或1，4_二氧六環(huán)溶劑。
[0057] 1~5ml/min的滴加速率是非常重要的技術(shù)手段，若速率超出這一范圍，難以得到 有序的自組裝結(jié)構(gòu)。如圖6所示，是溶解在THF中的嵌段多肽，以8ml/min的速率滴加超純水 所得到自組裝體的TEM圖，其結(jié)構(gòu)并不規(guī)整。圖8是溶解在Dioxane中的嵌段多肽，以10ml/ min的速率滴加超純水所得到自組裝體的TEM圖，其結(jié)構(gòu)并不規(guī)整。
[0058]本發(fā)明還提出了式（I)所示的兩親性聚肽共聚物在制備自組裝材料、組織功能材 料、生物材料中的應(yīng)用。其中，所述自組裝材料、組織功能材料、生物材料用于藥物的輸送和 釋放。
[0059] 本發(fā)明還提出了式(I)所示的兩親性聚肽共聚物或所述的自組裝體在藥物的輸送 和釋放中的應(yīng)用。
[0060] 本發(fā)明還提出了制備的自組裝體在藥物的輸送和釋放等方面存在著廣泛的應(yīng)用 前景。
【附圖說明】
[0061 ]圖1為新型兩親性聚肽共聚物(PBLG-b-PCysPEGMA)的核磁共振氫圖。
[0062] 圖2為新型兩親性聚肽共聚物(PBLG-b-PCysPEGMA)的GPC圖譜
[0063] 圖3為利用分步添加單體逐步開環(huán)聚合的方法制備的兩親性聚氨基酸多肽的GPC 測試數(shù)據(jù)，PDI = 1.65。
[0064] 圖4為溶解在N，N_二甲基甲酰胺中的新型兩親性聚肽共聚物形成的自組裝體的透 射電鏡圖。
[0065] 圖5為溶解在四氫呋喃中的新型兩親性聚肽共聚物形成的自組裝體的透射電鏡 圖。
[0066] 圖6為溶解在四氫呋喃中的新型兩親性聚肽共聚物形成的自組裝體的透射電鏡 圖；滴加超純水的速率為8ml/min，其為不規(guī)整結(jié)構(gòu)。
[0067] 圖7為溶解在1，4_二氧六環(huán)中的新型兩親性聚肽共聚物形成的自組裝體的透射電 鏡圖。
[0068] 圖8為溶解在1，4_二氧六環(huán)中的新型兩親性聚肽共聚物形成的自組裝體的透射電 鏡圖。
[0069] 滴加超純水的速率為10ml/min，其為不規(guī)整結(jié)構(gòu)。
【具體實(shí)施方式】
[0070] 結(jié)合以下具體實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。實(shí)施本發(fā)明的過程、 條件、實(shí)驗(yàn)方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識(shí)和公知常識(shí)，本發(fā) 明沒有特別限制內(nèi)容。
[0071] 實(shí)施例1兩親性聚肽共聚物的制備
[0072]通過三光氣法將L-谷氨酸芐酯轉(zhuǎn)變成單體L-谷氨酸芐酯-N-羧基內(nèi)酸酐，以炔丙 胺為引發(fā)劑、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)為溶劑，通過溶液開環(huán)聚合法，制備聚（L-谷氨酸芐 酯），即PBLG。通過"巰基-乙烯"點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)將L-半胱氨酸與聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯 反應(yīng)，得到L-半胱氨酸聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯(CysPEGMA)，再通過三光氣法將其轉(zhuǎn)變 為單體L-半胱氨酸聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯-N-羧基內(nèi)酸酐，以1 -疊氮-3-氨基丙烷為引 發(fā)劑，四氫呋喃為溶劑，通過開環(huán)聚合法，制備聚（L-半胱氨酸聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸 酯），即PCysPEGMA。再將均聚物PBLG和PCysPEGMA溶于DMF中，除去體系中的氧，加入由溴化 亞銅、N，N，NW，N〃 -五甲基二乙基三胺(PMDETA)組成的催化體系后，通過"點(diǎn)擊化學(xué)"反應(yīng) 得到新型兩親性聚肽共聚物。
[0073] 氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將L-谷氨酸芐酯3.018，（12.6臟〇1)、三光氣1.328，（4.2111111〇1)和乙酸 乙酯90ml加入到裝有冷凝回流管干燥的250ml三口瓶中，于85°C的油浴中回流攪拌反應(yīng)至 體系澄清透明，反應(yīng)時(shí)間大約5小時(shí)左右。停止反應(yīng)并冷卻至室溫后，用冰水及冰碳酸氫鈉 溶液洗至中性并用無水硫酸鈉干燥。用石油醚重結(jié)晶，真空干燥，得到白色固體L-谷氨酸芐 酯-N-羧基內(nèi)酸酐(BLG-NCA)產(chǎn)率48%。
[0074] 在干燥的50ml雙口瓶中加入1.6(^(6.1111111〇1)81^-%六單體以及161111干燥的01^溶 劑，通氮除氧60mins。加入5yl的炔丙胺，引發(fā)聚合。避光反應(yīng)72hours。反應(yīng)結(jié)束后，甲醇沉 淀，重復(fù)操作3遍，得到白色固體聚(L-谷氨酸芐酯），產(chǎn)率80 %。
[0075] 在100ml帶有磁子的單口瓶中加入6.0g(50mmol)L-半胱氨酸并溶于60ml去離子 水，用lmol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH至6~9。向體系中加入聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸 酯(Mn = 300)16.12g(53mmol)，室溫?cái)嚢柽^夜。反應(yīng)結(jié)束后，乙酸乙酯萃取并保留水層產(chǎn)物。 冷凍干燥，得到白色膏狀固體L-半胱氨酸聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯（CysTOGMA)，產(chǎn)率 90% 〇
[0076] 氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將CysPEGMA 7 ? 41g( 18 ? 6mmol)、三光氣 1 ? 81g，（6 ? 2mmol)和 150ml干 燥的THF加入到裝有冷凝回流管干燥的250ml三口瓶中，于60°C的油浴中回流攪拌反應(yīng)至體 系澄清透明，反應(yīng)時(shí)間大約8小時(shí)左右。停止反應(yīng)并冷卻至室溫后，用正己烷沉淀并真空干 燥，得到黃褐色膏狀固體L-谷氨酸芐酯-N-羧基內(nèi)酸酐(PCysPEGMA-NCA)5.62g，產(chǎn)率71 %。
[0077] 在100ml帶有磁子的雙口燒瓶中，加入5.04g(l 1.9mmol)CysPEGMA-NCA并溶于50ml 干燥的THF溶劑，通氮除氧60mins。使用微量進(jìn)樣器向體系中加入22yl的1-疊氮-3氨基丙烷 引發(fā)聚合。避光通氮反應(yīng)72h 〇Urs。反應(yīng)結(jié)束后，提濃，用正己烷沉淀，得到黃色粗產(chǎn)物。真空 干燥后將粗產(chǎn)品溶于水，透析3天。最后，使用"冷凍干燥法"得到黃色固體聚(L-半胱氨酸聚 乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯），產(chǎn)率82 %。
[0078] 在20ml干燥的試管中，依次加入已經(jīng)制備好的PBLG 0.20g(lequiv)，PCysPEGMA 0.25g(l .4equiv)，提純過的溴化亞銅44mg(lequiv)，并溶于5ml干燥的DMF中。通氮除氧 30mins后加入配體N，N，Y，N〃-五甲基二乙基三胺(PMDETA)6.4yl并密封試管，轉(zhuǎn)入50°C 的油浴鍋，避光反應(yīng)70hourS。反應(yīng)結(jié)束后，淬冷。產(chǎn)物用甲醇沉淀并抽濾。重復(fù)操作3遍以后 真空干燥1 OOhours，得到淡黃色固體顆粒，產(chǎn)率70 %。
[0079]如圖1所示，圖1是兩親性聚肽共聚物一聚L-谷氨酸芐酯-聚(L-半胱氨酸聚乙二醇 甲醚甲基丙烯酸酯），即TOLG-b-PCysPEGMA的核磁共振氫譜，其特征峰（7.25，5.06，3.75， 3.50，1.25，0.15ppm)及其對(duì)應(yīng)的積分面積比證明了 PBLG-b-PCysPEGMA共聚物的成功合成。
[0080] 如圖2所示，圖2是兩親性聚肽共聚物一聚L-谷氨酸芐酯-聚(L-半胱氨酸聚乙二醇 甲醚甲基丙烯酸酯），即PBLG-b-PCysPEGMA的GPC圖譜，通過圖譜可以看出聚合物具有較窄 的分布指數(shù)(PDI = 1.30)。
[0081] 圖3是利用分步添加單體逐步開環(huán)聚合的方法制備的兩親性聚氨基酸多肽的GPC 測試數(shù)據(jù)，PDI = 1.65。對(duì)比兩者可知，利用本發(fā)明方法制備的產(chǎn)物，分散指數(shù)明顯變窄。所 述"分布添加單體逐步開環(huán)聚合的方法"是指：以L-半胱氨酸（聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸 酯)-N羧基-a氨基酸酐（g卩Cy sPEGMA-NCA)為單體，以正丁胺為引發(fā)劑，通過NCA開環(huán)聚合法 制得末端含有氨基的均聚肽PCysPEGMA-NH 2。然后，以此作為大分子引發(fā)劑，引發(fā)L-谷氨酸 芐酯-N-羧基內(nèi)酸酐（即BLG-NCA)單體聚合，得到兩嵌段聚肽PBLG-b-PCysPEGMA。如下所示：
[0083] 具體步驟如下：
[0084]首先使用正丁胺作為小分子引發(fā)劑，引發(fā)CysPEGMA-NCA開環(huán)聚合得到均聚物 PCy sPEGMA。將 1 ? 31 g (3 ? 09mmo 1) Cy sPEGMA-NCA溶于 13ml 干燥的 THF溶劑中，通氮除氧 30mins。使用微量進(jìn)樣器，向體系中加入6111(0.06181111]1〇1)的正丁胺引發(fā)聚合。通氮避光條 件下反應(yīng)12hours。其次，使用PCysPEGMA-NH 2作為大分子引發(fā)劑，引發(fā)聚合BLG-NCA單體。在 Cy sPEGMA-NCA 開環(huán)聚合反應(yīng)至 12hour s時(shí)，稱量 BLG-NCA 單體 1.22g (4.6mmo 1)，溶解在 12ml 干燥的THF中，通氮除氧后，迅速從CysPEGMA-NCA開環(huán)聚合的反應(yīng)體系中取3ml液體加入本 體系，引發(fā)BLG-NCA聚合。室溫避光反應(yīng)72hourS。反應(yīng)結(jié)束后，甲醇沉淀，得到淺黃色絮狀沉 淀，抽濾得到粗產(chǎn)品。將粗產(chǎn)品用THF溶解后，甲醇沉淀。重復(fù)操作兩次，進(jìn)一步提純產(chǎn)物。真 空干燥，得到黃色固體顆粒，產(chǎn)率56 %。
[0085]實(shí)施例2兩親性聚肽共聚物自組裝材料的制備
[0086] 將實(shí)施例1制備的兩親性聚肽共聚物TOLG-b-PCysPEGMA以0.5mg/ml的濃度分別溶 解在01^、1'冊(cè)、1，4-01(?&116中。將一定量的水以11111/111111的速率滴加到配置好的聚合物的稀 溶液中。滴加完成后，快速滴加大量的超純水淬滅。透析3天后收集產(chǎn)品。
[0087]圖4是由溶解在DMF中的聚合物制備的自組裝材料，其結(jié)構(gòu)是規(guī)則的管狀膠束，管 狀膠束之間相互連接、重疊，并有鏤空部分出先，形成了類似于空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。圖5是溶解在 四氫呋喃(THF)中的聚合物制備的自組裝材料，其結(jié)構(gòu)是規(guī)則的碗狀膠束，為球形的膠束的 某一面塌陷而形成了碗型的膠束結(jié)構(gòu)，經(jīng)過測量，自組裝體的平均粒徑為55nm，碗型膠束的 塌陷方向不一。
[0088]其他條件相同，兩親性聚肽共聚物TOLG-b-PCysPEGMA溶解在四氫呋喃中，當(dāng)?shù)渭?超純水的速率為8ml/min時(shí)，圖6為兩親性聚肽共聚物形成的自組裝體的透射電鏡圖，由圖 可知，其為不規(guī)整結(jié)構(gòu)，其包括部分碗裝結(jié)構(gòu)以及部分模糊的尚未形成有序排列的自組裝 體。
[0089]圖7是溶解在l，4-Dioxane中的聚合物制備的自組裝材料，其結(jié)構(gòu)是規(guī)則的梭型片 狀膠束，其結(jié)構(gòu)中間寬，兩頭窄，并在兩端有較為突出的毛刺狀;經(jīng)測量，膠束的平均長度為 600nm，寬度平均為200nm。
[0090] 其他條件相同，兩親性聚肽共聚物PBLG-b-PCySPEGMA溶解在1，4_二氧六環(huán)中，當(dāng) 滴加超純水的速率為l〇ml/min時(shí)，圖8為兩親性聚肽共聚物形成的自組裝體的透射電鏡圖， 由圖可知，其為不規(guī)整結(jié)構(gòu)，包括4個(gè)相互連接的、襯度較高的、類似于球形的結(jié)構(gòu)，但由于 其結(jié)構(gòu)模糊，尚未能形成完整的膠束；同時(shí)，在其周圍有類似于針形的片層結(jié)構(gòu)，但是其并 不完整、獨(dú)立，分布也不均一，亦未能形成有序的自組裝體。
[0091] 本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以上實(shí)施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本 領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點(diǎn)都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保 護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種兩親性聚膚共聚物，其特征在于，所述兩親性聚膚共聚物包括油溶性聚膚嵌段 和水溶性聚膚嵌段，其結(jié)構(gòu)如式(I)所示：式（I)中，聚乙二醇的聚合度X為3-5;m=10-30;n = 20-80。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的兩親性聚膚共聚物，其特征在于，所述兩親性聚膚共聚物W化 學(xué)改性后的兩種氨基酸衍生物為單體，通過N-簇基-α-氨基酸酢開環(huán)聚合法得到溶解性不 同的兩種均聚膚;再通過點(diǎn)擊化學(xué)過程將兩種均聚膚連接形成所述兩親性聚膚共聚物。3. -種兩親性聚膚共聚物的制備方法，其特征在于，包含均聚合反應(yīng)、點(diǎn)擊化學(xué)改性反 應(yīng)： (1)均聚合反應(yīng)： i) 油溶性聚膚的制備： 谷氨酸節(jié)醋-N簇基-α氨基酸酢為原料，在有機(jī)溶劑中，W烘丙胺為引發(fā)劑，反應(yīng)溫 度控制在60~80°C，反應(yīng)時(shí)間為72-96小時(shí)，得到式(a)所示的油溶性聚膚，如反應(yīng)式（1)所 示；其中，n = 20-80; ii) 水溶性聚膚的制備： Wレ半脫氨酸（聚乙二醇甲酸甲基丙締酸醋）-膊多基-α氨基酸酢為原料，在有機(jī)溶劑 中，W1-疊氮-3-氨基丙烷為引發(fā)劑，反應(yīng)溫度控制在45~75 °C，反應(yīng)時(shí)間為72-84小時(shí)，得 到式(b)所示的水溶性聚膚，如反應(yīng)式(2)所示；其中，聚乙二醇的聚合度X為3-5;m=10-30; (2)點(diǎn)擊化學(xué)改性反應(yīng)： 向有機(jī)溶劑中加入步驟（1)制備的油溶性聚膚和水溶性聚膚，除去體系中的氧，再加入 由漠化亞銅、N，N，N/，滬，N"-五甲基二乙基Ξ胺組成的催化體系，反應(yīng)溫度控制在40~110 °C，反應(yīng)時(shí)間為20-70小時(shí)，得到所述兩親性聚膚共聚物，如反應(yīng)式(3)所示；其中，聚乙二醇的聚合度X為3-5;m=10-30;n = 20-80。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（1)油溶性聚膚的制備中，所 述原料k谷氨酸節(jié)醋-N簇基-α氨基酸酢、烘丙胺的摩爾比為20~80:1。5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（1)水溶性聚膚的制備中，所 述原料心半脫氨酸（聚乙二醇甲酸甲基丙締酸醋)-膊多基-曰氨基酸酢、1-疊氮-3-氨基丙烷 的摩爾比為10-30:1。6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，所述油溶性聚膚和水 溶性聚膚、催化體系的摩爾比為1:1~1.5:1~1.5。7. -種自組裝體，其特征在于，所述自組裝體由如權(quán)利要求1所述的兩親性聚膚共聚物 自組裝形成，具有親水-親油結(jié)構(gòu);為碗狀膠束、柱狀膠束、梭型片層膠束結(jié)構(gòu)。8. -種自組裝體的制備方法，其特征在于，將如權(quán)利要求1所述的兩親性聚膚共聚物溶 解在有機(jī)溶劑中，形成共聚物的稀溶液，向其中滴入共聚物的稀溶液的1~2倍體積的水，滴 加速率為1~5ml/min;加過量的超純水澤滅;通過透析將多余有機(jī)溶劑除去，得到如權(quán)利要 求7所述的自組裝體。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備方法，其特征在于，所述自組裝體，具有有序結(jié)構(gòu)的自組 裝材料，當(dāng)有機(jī)溶劑為N，N-二甲基甲酯胺時(shí)，得到的自組裝體為柱狀膠束；當(dāng)有機(jī)溶劑為四 氨巧喃時(shí)，得到的自組裝體為碗狀膠束；當(dāng)有機(jī)溶劑為1,4-二氧六環(huán)時(shí)，得到的自組裝體為 梭型片層膠束。10. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述式（I)所示的兩親性聚膚共聚物在制備自組裝材料、組織功 能材料、生物材料中的應(yīng)用。11. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述式（I)所示的兩親性聚膚共聚物或根據(jù)權(quán)利要求7所述的自 組裝體在藥物的輸送和釋放中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K47/42GK105968367SQ201610303977
【公開日】2016年9月28日
【申請(qǐng)日】2016年5月10日
【發(fā)明人】賀小華, 陳宇翔, 張盈, 姬翠紅, 林雪
【申請(qǐng)人】華東師范大學(xué)