本發(fā)明屬于生物
技術領域：
，具體涉及一種與植物光合作用相關的PSF蛋白及其編碼基因和應用。
背景技術：
：光合作用是地球上最重要的化學反應，光合作用分子機制的研究，將為提高作物光能轉化效率、為開辟太陽能利用的新途徑提供理論依據(jù)，從而促進和推動農(nóng)業(yè)和能源科學與技術的發(fā)展及新興產(chǎn)業(yè)的形成。葉綠體是高等植物進行光合作用的非常重要的細胞器。葉綠體基因組編碼包括光合作用、基因表達、其他必需的細胞器功能等所必需的蛋白。由藍藻為祖先內共生進化而來的葉綠體，結合了真核細胞和原核細胞的共同特征。葉綠體基因的表達調控包括轉錄、轉錄后加工、翻譯、翻譯后修飾，這些過程受到核基因多層次的調控作用。葉綠體基因表達同葉綠體發(fā)育過程密切相關，葉綠體基因表達受到影響的植株個體導致葉綠體發(fā)育缺陷，進而表現(xiàn)出光合功能受損。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個目的是提供一種蛋白質。本發(fā)明提供的蛋白質是如下a)或b)或c)的蛋白質：a)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白質；b)在序列表中序列2所示的蛋白質的N端和/或C端連接標簽得到的融合蛋白質；c)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質。為了使a)中的蛋白質便于純化，可在序列表中序列2所示的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。表1、標簽的序列標簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個)RRRRRPoly-His2-10(通常為6個)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述c)中的蛋白質，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為 不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述c)中的蛋白質可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述c)中的蛋白質的編碼基因可通過將序列1所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。本發(fā)明的另一個目的是提供與上述蛋白質相關的生物材料。本發(fā)明提供的與上述蛋白質相關的生物材料為下述A1)至A12)中的任一種：A1)編碼上述蛋白質的核酸分子；A2)含有A1)所述核酸分子的表達盒；A3)含有A1)所述核酸分子的重組載體；A4)含有A2)所述表達盒的重組載體；A5)含有A1)所述核酸分子的重組微生物；A6)含有A2)所述表達盒的重組微生物；A7)含有A3)所述重組載體的重組微生物；A8)含有A4)所述重組載體的重組微生物；A9)含有A1)所述核酸分子的轉基因植物細胞系；A10)含有A2)所述表達盒的轉基因植物細胞系；A11)含有A3)所述重組載體的轉基因植物細胞系；A12)含有A4)所述重組載體的轉基因植物細胞系。上述相關生物材料中，A1)所述核酸分子為如下1)或2)或3)所示的基因：1)其編碼序列是序列表中序列1的cDNA分子或DNA分子；2)與1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼上述蛋白質的cDNA分子或基因組DNA分子；3)在嚴格條件下與1)或2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼上述蛋白質的cDNA分子或基因組DNA分子。這里使用的術語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的編碼序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價相關序列之間的同一性。上述75％或75％以上同一性，可為80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述生物材料中，所述嚴格條件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗 膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。上述生物材料中，所述載體可為質粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。上述生物材料中，所述微生物可為酵母、細菌、藻或真菌，如農(nóng)桿菌。上述生物材料中，所述轉基因植物細胞系不包括繁殖材料。本發(fā)明還有一個目的是提供上述蛋白質或上述相關生物材料的新用途。本發(fā)明提供了上述蛋白質或上述相關生物材料在調控植物光合作用活性中的應用。上述應用中，所述調控植物光合作用活性是通過調控植物光系統(tǒng)活性體現(xiàn)的。上述應用中，所述調控為提高。本發(fā)明還提供了上述蛋白質或上述相關生物材料在培育光合作用活性提高的轉基因植物中的應用。本發(fā)明的最后一個目的是提供一種培育光合作用活性提高的轉基因植物的方法。本發(fā)明提供的培育光合作用活性提高的轉基因植物的方法包括將上述蛋白質的編碼基因導入受體植物中，得到轉基因植物的步驟；所述轉基因植物的光合作用活性高于所述受體植物。上述方法中，所述蛋白質的編碼基因的核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子。上述方法中，所述蛋白質的編碼基因是通過重組載體導入受體植物的；所述重組載體為將序列表中序列1所示的DNA分子插入pSN1301載體的BamHI和KpnI酶切位點間，且保持pSN1301載體的其他序列不變得到的載體。上述方法中，所述轉基因植物的光合作用活性高于所述受體植物體現(xiàn)在轉基因植物的Fv/Fm值高于受體植物。上述方法中，所述受體植物為單子葉植物或雙子葉植物，所述雙子葉植物具體為擬南芥。本發(fā)明從擬南芥中發(fā)現(xiàn)了一個與植物光合功能相關的PSF基因，該基因編碼一個定位于葉綠體的可溶性蛋白，PSF基因的缺失突變體表現(xiàn)出生長遲緩、葉色黃綠、光合效率明顯降低、土壤中不能實現(xiàn)自養(yǎng)成活等特征。本發(fā)明通過對PSF基因的分離和基因功能的鑒定分析，證明了PSF蛋白具有調控植物的光合作用的功能。附圖說明圖1為突變體psf和野生型擬南芥培養(yǎng)基萌發(fā)10天的生長表型。圖2為突變體psf和野生型擬南芥的葉綠素激發(fā)熒光成像。圖3為突變體psf和野生型擬南芥的葉綠素慢誘導曲線。其中，圖3A為突變體psf 的葉綠素慢誘導曲線；圖3B為野生型擬南芥的葉綠素慢誘導曲線。圖4為PSF蛋白的定位。圖5為互補植株的表型及葉綠素激發(fā)熒光成像。圖6為互補植株、突變體植株和野生型擬南芥的葉綠素慢誘導曲線。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中的野生型和突變體材料均為擬南芥哥倫比亞生態(tài)學(Col-0)。下述實施例中的農(nóng)桿菌C58在文獻“Jose′-AntonioDaro`sandRicardoFlores*(2004)，ArabidopsisthalianahastheenzymaticmachineryforreplicatingrepresentativeviroidspeciesofthefamilyPospiviroidae.PNASVol.101No.17；6792–6797”中公開過，公眾可從中國科學院植物研究所獲得。實施例1、PSF基因的獲得一、突變體的獲得及表型1、突變體的獲得將野生型擬南芥和突變體種子(從NASC種質資源庫中訂購的T-DNA插入突變體，種子標號為salk_037487和salk_072637)進行低溫春化(浸水后4℃避光處理)處理，處理72h后用10％次氯酸鈉消毒10min，無菌水清洗4遍，播種到含有2％蔗糖和0.8％瓊脂的MS培養(yǎng)基上，置于溫度為22℃、光強為100umolm-2s-1、光周期為12h/12h(光/暗)的培養(yǎng)條件下進行培養(yǎng)，得到野生型擬南芥幼苗(WT)、突變體植株(psf-1)和突變體植株(psf-2)。結果發(fā)現(xiàn)：與野生型植株相比，突變體植株(psf-1)和突變體植株(psf-2)的葉色發(fā)黃，且生長遲緩，無法在土壤中自養(yǎng)生長(圖1)。2、植物熒光成像觀察植物吸收光能后會有部分能量以熒光形式散發(fā)出來，正常生長的植物熒光發(fā)射量很低，但當植物類囊體膜結構或功能出現(xiàn)異常時，電子傳遞受阻，葉綠素吸收的光能不能及時傳遞下去轉化為化學能，此時植物熒光發(fā)射量就會升高。利用植物熒光成像技術對野生型擬南芥植株(WT)和突變體植株(psf-1)進行觀察。結果如圖2所示：與野生型幼苗相比，突變體植株(psf-1)的熒光發(fā)射量升高，說明突變體植株(psf-1)中的光合電子傳遞鏈受阻。3、葉綠素熒光動力學分析利用PAM2000對野生型擬南芥植株(WT)和突變體植株(psf-1)進行葉綠素熒 光動力學分析。葉綠素熒光慢誘導測定時，葉片在暗適應20min后，施加一次飽和脈沖(3000umolm-2s-1)時，PSII暫時達到飽和，PSII電子受體QA被完全還原，葉綠素熒光產(chǎn)量由基態(tài)(F0)上升到最大值(Fm)。通過計算可以得到PSII最大光化學效率Fv/Fm＝(Fm-F0)/Fm。野生型擬南芥植株(WT)和突變體植株(psf-1)的葉綠素慢誘導曲線如圖3所示：野生型擬南芥植株(WT)的Fv/Fm值為0.786，而突變體植株(psf-1)的Fv/Fm值為0.347，光系統(tǒng)II最大光化學效率約為野生型的一半，表明突變體植株中熒光穩(wěn)定在一個非常高的水平，化學淬滅沒有被激活，預示光系統(tǒng)II以后的電子通路沒有被打開，葉綠素熒光無法回落到一個穩(wěn)定的水平(Ft)，突變體植株(psf-1)為光合功能缺陷突變體。4、純合突變體植株(psf-1)的獲得通過T-DNA元件中攜帶的Bar基因對野生型擬南芥植株(WT)和突變體植株(psf-1)進行PCR擴增驗證，確認突變體植株(psf-1)中確實有T-DNA插入并篩選到純合突變體植株(psf-1)。PCR驗證的引物序列如下：SALK_037487-LP:ATCCCCAAGTTTGACTTGAGC；SALK_037487-RP:GTGTTGTGGTTTCGGGTAATG；LBb1.3：ATTTTGCCGATTTCGGAAC。若引物SALK_037487-LP和SALK_037487-RP擴增出大小為1042bp的條帶，且SALK_037487-RP和LBb1.3擴增出大小為848bp的條帶的為雜合突變體植株；若引物SALK_037487-LP和SALK_037487-RP擴增出大小為1042bp的條帶，且SALK_037487-RP和LBb1.3擴增無條帶的為純合突變體植株。二、PSF基因的獲得提取擬南芥(Col-0生態(tài)型，購自擬南芥生物資源中心)的基因組DNA，以獲得的基因組DNA為模板，采用引物PSF-pSN1301-BamHI-s和PSF-pSN1301-KpnI-a進行PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物，并將PCR產(chǎn)物切膠純化后連接T-easy載體，轉入大腸桿菌DH5α,篩選陽性克隆，進行PCR酶切、測序。引物序列如下：PSF-pSN1301-BamHI-s:5'–GCCGGATCCATGCAAACGCTTCTCTGTCA-3'；PSF-pSN1301-KpnI-a:5'-GGCGGTACCTCACTGACTCTCGAACTTGA-3'。測序結果表明：PCR產(chǎn)物的核苷酸序列如序列表中序列1所示，將序列1所示的基因命名為PSF基因，PSF基因編碼的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。三、PSF蛋白的定位分析1、pPUC18-GFP中間載體的構建(1)以質粒pCmGFP(來源NCBIGeneID:7011691)為模板，采用引物： 5’-GCCTCTAGAATGAGTAAAGGAGAAGAAC-3’和5’-AAGCTTCTCGAGTTGTATAGTTCATCC-3’進行PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物，即為GFP基因。(2)用XbaI和HindIII雙酶切PCR產(chǎn)物和pPUC18載體(購于Taraka公司，貨號D3218)。經(jīng)連接、轉化、鑒定，得到pPUC18-GFP中間載體。2、以序列1所示的DNA分子為模板，采用引物：5'-GCCGTCGACATGCAAACGCTTCTCTGTCA-3'和5'-GGCCCATGGGCTGACTCTCGAACTTGAAC-3'進行PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物，即為PSF基因。用SalI和NcoI雙酶切PCR產(chǎn)物及步驟1獲得的pPUC18-GFP中間載體，經(jīng)連接、轉化、鑒定，得到pPUC18-PSF-GFP。3、用SalI和NcoI酶切步驟2獲得的pPUC18-PSF-GFP，經(jīng)連接、轉化、鑒定出陽性克隆。并將pPUC18-PSF-GFP轉化植物原生質體。4、用激光掃描共聚焦顯微鏡(LSM510META，Zeiss)觀察葉肉細胞中GFP的表達，觀察時物鏡放大倍數(shù)為40倍，激發(fā)光波長為488nm，帶通BP505～530nm，長通LP560nm。結果如圖4所示：PSF蛋白定位于葉綠體。實施例2、互補植株的獲得及其光合作用活性分析一、互補植株的獲得1、將序列表中序列1所示的DNA分子插入pSN1301載體(購自BioVector質粒載體菌株細胞基因保藏中心，產(chǎn)品貨號Biovector105802)的BamHI和KpnI酶切位點間，且保持pSN1301載體的其他序列不變，得到重組載體。2、將步驟1獲得的重組載體轉化到C58農(nóng)桿菌中，得到重組菌。3、采用花粉管通道法用步驟2獲得的重組菌侵染實施例1的步驟一中的4獲得的純合突變體植株(psf-1)。4、收到種子后，在添加潮霉素的MS培養(yǎng)基平板上進行陽性苗篩選。并進行PCR驗證(PCR驗證的引物如下：SALK_037487-LP:ATCCCCAAGTTTGACTTGAGC；SALK_037487-RP:GTGTTGTGGTTTCGGGTAATG；LBb1.3：ATTTTGCCGATTTCGGAAC)。具體步驟如下：SALK_037487-LP和SALK_037487-RP擴增出大小為1042bp的條帶，SALK_037487-RP和LBb1.3擴增出大小為848bp的條帶的為雜合突變體；SALK_037487-LP和SALK_037487-RP擴增出大小為1042bp的條帶，SALK_037487-RP和LBb1.3擴增無條帶的為純合突變體。5、驗證出的雜合突變體，單株收種子。每株數(shù)約100粒，播種于添加潮霉素的MS培養(yǎng)基平板上。若全部長出陽性苗，則證明上一代的雜合突變體為農(nóng)桿菌侵染后得到的純合體。6、將上一步得到的農(nóng)桿菌侵染后的純合體進行PCR驗證，引物同步驟4中的PCR驗證的引物，SALK_037487-LP和SALK_037487-RP擴增無條帶，SALK_037487-RP和LBb1.3擴增出大小為848bp的條帶的為陽性互補苗，將其命名為互補植株(Psf-互補苗)。將上述步驟中的重組載體替換成pSN1301載體，其他步驟不變，得到轉空載體擬南芥植株。二、互補植株的獲得及其光合作用活性分析1、利用植物熒光成像技術對上述步驟一獲得的互補植株(Psf-互補苗)、野生型擬南芥植株和轉空載體擬南芥植株進行觀察。結果如圖5所示：從圖5中可以看出，互補植株(Psf-互補苗)的熒光和野生型擬南芥植株無顯著差異，而轉空載體植株不能恢復正常的熒光。2、利用PAM2000對野生型擬南芥植株、psf突變體(psf-1)及互補植株(Psf-互補苗)進行葉綠素熒光動力學分析。分析方法參照實施例1的步驟一中的2。結果如圖6所示，從圖中可以看出：互補植株(Psf-互補苗)的熒光和野生型擬南芥植株無顯著差異，在熒光激發(fā)后回落到穩(wěn)態(tài)水平Fv/Fm值約為0.8，說明互補植株恢復正常光合功能。上述結果說明PSF基因具有調控植物光合作用的功能。當前第1頁1 2 3