技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于治療或預(yù)防結(jié)核病(特別是用于治療或預(yù)防潛伏結(jié)核病以及預(yù)防或延緩結(jié)核病的再活化)的多肽和多核苷酸(以及涉及相關(guān)方法)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含所述多肽和多核苷酸的藥物和免疫原性組合物，以及涉及結(jié)核病(特別是潛伏結(jié)核病)的診斷方法。
背景技術(shù)：
：結(jié)核病(TB)是一種由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)和其它分枝桿菌種類(lèi)的感染引起的慢性傳染疾病。它是世界上發(fā)展中國(guó)家的一種主要疾病，并成為發(fā)達(dá)區(qū)域日益嚴(yán)重的問(wèn)題。超過(guò)20億人被認(rèn)為感染了TB桿菌，每年新增約920萬(wàn)TB病例和170萬(wàn)死亡病例。其中10％感染TB桿菌的人會(huì)發(fā)展為活動(dòng)性TB，每位患有活動(dòng)性TB的人平均每年感染10-15其他人。盡管在全球的年均發(fā)病率已經(jīng)達(dá)到頂峰，由于人口增長(zhǎng)，死亡數(shù)和病例數(shù)依然在上升(WorldHealthOrganisationTuberculosisFacts2008)。結(jié)核分枝桿菌通過(guò)呼吸道途徑感染個(gè)體。肺泡巨噬細(xì)胞吸入該細(xì)菌，但它能夠通過(guò)抑制具有酸性溶酶體的吞噬體融合存活和增殖。隨后發(fā)生涉及CD4+和CD8+T細(xì)胞的復(fù)雜免疫應(yīng)答，最終導(dǎo)致肉芽腫的形成。結(jié)核分枝桿菌成為病原體的關(guān)鍵在于該分離但未根除的細(xì)菌可長(zhǎng)期存在，使得個(gè)體容易在隨后發(fā)展為活動(dòng)性TB。在感染后的第一年，少于5％的感染個(gè)體會(huì)發(fā)展為活動(dòng)性TB。該肉芽腫可存在數(shù)十年，并被認(rèn)為在缺乏氧和營(yíng)養(yǎng)的休眠狀態(tài)下包含活結(jié)核分枝桿菌。然而，最近表明，大部分處于休眠狀態(tài)的細(xì)菌位于遍布體內(nèi)的非巨噬細(xì)胞的細(xì)胞類(lèi)型中(Locht等人，ExpertOpin.Biol.Ther.20077(11)：1665-1677)。當(dāng)宿主的天然免疫和病原體之間的平衡發(fā)生變化時(shí)(例如由于免疫抑制事件)則發(fā)展為活動(dòng)性TB(AndersonPTrendsinMicrobiology200715(1)：7-13；EhlersSInfection200937(2)：87-95)。也已提出描述潛伏TB和活動(dòng)性TB之間的平衡的動(dòng)力學(xué)假設(shè)(CardanaP-JInflammation&Allergy-DrugTargets20066：27-39；CardanaP-JInfection200937(2)：80-86)。盡管感染在相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)可以是無(wú)癥狀的，活動(dòng)性疾病最常顯現(xiàn)為肺的急性炎癥，從而導(dǎo)致疲勞、體重下降、發(fā)燒和持續(xù)咳嗽。如果未經(jīng)治療，通常可導(dǎo)致嚴(yán)重的并發(fā)癥和死亡。結(jié)核病通?？刹捎瞄L(zhǎng)期抗生素療法進(jìn)行控制，盡管該種治療并不足以防止該疾病的擴(kuò)散。感染的個(gè)體可以是無(wú)癥狀的，但在一定時(shí)間具有傳染性。此外，盡管對(duì)治療方案的順應(yīng)性是關(guān)鍵的，但患者的行為很難監(jiān)測(cè)。一些患者并未完成治療周期，這可能導(dǎo)致無(wú)效治療和耐藥性的形成。多重耐藥性TB(MDR-TB)是一種對(duì)一線藥物沒(méi)有應(yīng)答的形式。所有TB病例中有5％是MDR-TB，每年估計(jì)有490,000新MDR-TB病例。當(dāng)耐受針對(duì)MDR-TB開(kāi)發(fā)的二線藥物時(shí)，產(chǎn)生廣泛耐藥TB(XDR-TB)。據(jù)估計(jì)每年產(chǎn)生40,000實(shí)際無(wú)法治療的XDR-TB新病例(WorldHealthOrganisationTuberculosisFacts2008)。即使完成抗生素治療的整個(gè)療程，結(jié)核分枝桿菌的感染可能無(wú)法從感染個(gè)體根除，并可保留為能夠再活化的潛伏感染。為了控制結(jié)核病擴(kuò)散，對(duì)疾病的有效免疫和準(zhǔn)確早期診斷是最為重要的。潛伏TB感染的診斷通常是采用結(jié)核菌素皮試來(lái)完成的，該皮試包括皮內(nèi)暴露至結(jié)核菌素蛋白-純化的衍生物(PPD)?？乖禺愋訲細(xì)胞應(yīng)答導(dǎo)致注射后在注射部位48-72小時(shí)的可測(cè)量硬結(jié)，其表示暴露至分枝菌抗原。然而，該測(cè)試的靈敏度和特異性是一個(gè)問(wèn)題，且接種了BCG的個(gè)體并不能始終容易地與感染個(gè)體相區(qū)別(這對(duì)于BCG無(wú)法對(duì)潛伏感染形成保護(hù)的事實(shí)特別重要)。一般而言，已經(jīng)接受BCG但未被結(jié)核分枝桿菌感染的個(gè)體顯示了直徑小于10mm的PPD反應(yīng)，而具有直徑在10mm以上的PPD反應(yīng)的人被認(rèn)為已經(jīng)被結(jié)核分枝桿菌感染。然而，這一原則不適用于由于HIV感染而免疫抑制的個(gè)體，后者可導(dǎo)致直徑小于10mm的PPD反應(yīng)；或者在發(fā)病地區(qū)，被非結(jié)核分枝桿菌感染的人能顯示直徑在10mm以上的PPD反應(yīng)。近些年在體外基于T細(xì)胞的測(cè)定上已經(jīng)取得了進(jìn)展，該測(cè)定基于干擾素-gamma釋放并采用比PPD對(duì)結(jié)核分枝桿菌更具特異性的抗原，稱(chēng)為ESAT-6和CFP-10。這些高特異性測(cè)試看來(lái)至少具有結(jié)核菌素皮試的靈敏度，且由于BCG接種而顯示更少的交叉反應(yīng)性。有關(guān)潛伏TB診斷的最近綜述參見(jiàn)PaiM等人ExpertRev.Mol.Diagn.20066(3)：413-422。然而，由于ESAT-6/CFP-10是初期抗原，基于ESAT-6/CFP-10的測(cè)定僅能在新近感染的人員中最佳實(shí)施。因此，與潛伏結(jié)核病特異性相關(guān)的新抗原的鑒定有助于能夠檢測(cè)更長(zhǎng)期潛伏感染的更靈敏測(cè)定的開(kāi)發(fā)。對(duì)于治療和預(yù)防結(jié)核病(特別是治療和預(yù)防潛伏TB以及預(yù)防TB的再活化)的有效策略存在著需求。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明總體涉及作為T(mén)B抗原(特別是與潛伏TB相關(guān)的抗原)的Rv2386c的鑒定，并涉及預(yù)防和治療TB(尤其是預(yù)防和治療潛伏TB以及預(yù)防或延緩TB再活化)的相關(guān)方法和用途。本發(fā)明提供了分離的多肽，其包含：(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段。本發(fā)明還提供了多肽，其包含：(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段；該多肽用作藥劑。本發(fā)明另一方面涉及治療或預(yù)防TB的方法，其包括向有此需要的對(duì)象施用安全和有效量的多肽，該多肽包含：(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段；其中所述多肽誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，特別是抗結(jié)核分枝桿菌的免疫應(yīng)答。多肽在用于制備治療或預(yù)防TB的藥物中的用途，該多肽包含：(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段；該用途代表了本發(fā)明的另一方面。本發(fā)明提供了包含編碼多肽的核酸序列的分離多核苷酸，該多肽包含：(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段。還提供了包含編碼多肽的核酸序列的分離多核苷酸，該多肽包含：(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段；該多核苷酸用作藥劑。本發(fā)明另一方面涉及治療或預(yù)防TB的方法，其包括向有此需要的對(duì)象施用安全和有效量的包含編碼多肽的核酸序列的多核苷酸，該多肽包含：(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段；其中所述多核苷酸誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，特別是抗結(jié)核分枝桿菌的免疫應(yīng)答。包含編碼多肽的核酸序列的多核苷酸在用于制備治療或預(yù)防TB的藥物中的用途，該多肽包含：(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段；該用途代表了本發(fā)明的另一方面。另外，提供了藥物組合物，其包含：(a)多肽，其包含：(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段；或者(b)包含編碼(a)的多肽的核酸序列的多核苷酸；以及(c)藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。進(jìn)一步地，提供了免疫原性組合物，其包含：(a)多肽，其包含：(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段；或者(b)包含編碼(a)的多肽的核酸序列的多核苷酸；以及(c)非特異性免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑。適當(dāng)?shù)兀撍幬锖兔庖咴越M合物包含了Rv2386c和第二異種結(jié)核病抗原成分的組合。還提供了包含編碼多肽的核酸序列的表達(dá)載體，該多肽包含：(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段。用所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞構(gòu)成了本發(fā)明進(jìn)一步的方面。另外提供了重組表達(dá)多肽的宿主細(xì)胞，該多肽包含：(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段。進(jìn)一步提供了生產(chǎn)多肽的方法，該多肽包含：(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段；所述方法包括在宿主細(xì)胞內(nèi)重組表達(dá)所述多肽的步驟。另外提供了與多肽特異性結(jié)合的抗體或其片段，該多肽包含：(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段。還提供了所述抗體在診斷中的用途(例如診斷結(jié)核病的方法，其包括在來(lái)自測(cè)試對(duì)象的生物樣本中確定與本發(fā)明多肽特異性結(jié)合的抗體或其片段的存在)。還提供了診斷試劑盒，其包含：(a)本發(fā)明的多肽；(b)使所述多肽與來(lái)自個(gè)體的樣本(例如，全血或更合適地為PBMC)充分接觸的設(shè)備；和(c)對(duì)樣本的T細(xì)胞應(yīng)答進(jìn)行定量的裝置。本發(fā)明的另一方面涉及診斷試劑盒，其包含：(a)本發(fā)明的多肽；和(b)使所述多肽與患者的真皮細(xì)胞充分接觸的設(shè)備。在一個(gè)實(shí)施方式中，接受本發(fā)明的多肽、多核苷酸或組合物的對(duì)象可患有活動(dòng)性結(jié)核病(例如被結(jié)核分枝桿菌活動(dòng)性感染)。在第二實(shí)施方式中，該對(duì)象可具有潛伏結(jié)核病(例如，被結(jié)核分枝桿菌潛伏感染)。在第三實(shí)施方式中，該對(duì)象可未患結(jié)核病(例如，未被結(jié)核分枝桿菌感染)。接受本發(fā)明的多肽、多核苷酸或組合物的對(duì)象可能之前已經(jīng)進(jìn)行結(jié)核接種(例如，針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的感染接種)，例如已用卡介桿菌(BCG)接種。替代性地，接受本發(fā)明的多肽、多核苷酸或組合物的對(duì)象可未曾進(jìn)行結(jié)核接種(例如，未針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的感染接種)，例如未曾用卡介桿菌(BCG)接種。附圖說(shuō)明圖1：在第21天(即，第二次接種后7天)來(lái)自免疫CB6F1小鼠的表達(dá)IFN-gamma和/或IL-2和/或TNF-alpha細(xì)胞因子的CD4和CD8細(xì)胞的百分比。圖2：免疫CB6F1小鼠中抗原特異性CD4應(yīng)答在第21天(即，第二次接種后7天)的細(xì)胞因子分布(profile)。圖3：免疫CB6F1小鼠中抗原特異性CD8應(yīng)答在第21天(即，第二次接種后7天)的細(xì)胞因子分布。圖4：在第35天(即，第三次接種后7天)來(lái)自免疫CB6F1小鼠的表達(dá)IFN-gamma和/或IL-2和/或TNF-alpha細(xì)胞因子的CD4和CD8細(xì)胞的百分比。圖5：免疫CB6F1小鼠中抗原特異性CD4應(yīng)答在第35天(即，第三次接種后7天)的細(xì)胞因子分布。圖6：免疫CB6F1小鼠中抗原特異性CD8應(yīng)答在第35天(即，第三次接種后7天)的細(xì)胞因子分布。圖7：在第21天(即，第二次接種后7天)來(lái)自免疫C57BL/6小鼠的表達(dá)IFN-gamma和/或IL-2和/或TNF-alpha細(xì)胞因子的CD4和CD8細(xì)胞的百分比。圖8：免疫C57BL/6小鼠中抗原特異性CD4應(yīng)答在第21天(即，第二次接種后7天)的細(xì)胞因子分布。圖9：免疫C57BL/6小鼠中抗原特異性CD8應(yīng)答在第21天(即，第二次接種后7天)的細(xì)胞因子分布。列出的序列描述SEQIDNo：1：來(lái)自結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株的Rv2386c的多肽序列。SEQIDNo：2：來(lái)自結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株的Rv2386c的多核苷酸序列。SEQIDNo：3：來(lái)自結(jié)核分枝桿菌CDC1551菌株的Rv2386c的多肽序列。SEQIDNo：4：來(lái)自結(jié)核分枝桿菌F11菌株的Rv2386c的多肽序列。SEQIDNo：5：來(lái)自結(jié)核分枝桿菌HaarlemA菌株的Rv2386c的多肽序列。SEQIDNo：6：來(lái)自結(jié)核分枝桿菌C菌株的Rv2386c的多肽序列。SEQIDNo：7：來(lái)自BCG的Rv2386c的多肽序列。SEQIDNo：8：Mtb8.4的多肽序列。SEQIDNo：9：Mtb9.8的多肽序列。SEQIDNo：10：Mtb9.9的多肽序列。SEQIDNo：11：Ra12的多肽序列。SEQIDNo：12：Ra35的多肽序列。SEQIDNo：13：TbH9的多肽序列。SEQIDNo：14：Mtb40的多肽序列。SEQIDNo：15：Mtb41的多肽序列。SEQIDNo：16：ESAT-6的多肽序列。SEQIDNo：17：Ag85A的多肽序列。SEQIDNo：18：Ag85B的多肽序列。SEQIDNo：19：alpha-晶體蛋白的多肽序列。SEQIDNo：20：MPT64的多肽序列。SEQIDNo：21：Mtb32A的多肽序列。SEQIDNo：22：Ser/Ala突變成熟Mtb32A的多肽序列。SEQIDNo：23：TB10.4的多肽序列。SEQIDNo：24：Mtb72f的多肽序列。SEQIDNo：25：M72的多肽序列。SEQIDNo：26：Mtb71f的多肽序列。SEQIDNo：27：M92融合體的多肽序列。SEQIDNo：28：M103融合體的多肽序列。SEQIDNo：29：M114融合體的多肽序列。SEQIDNo：30：推定人CD4細(xì)胞表位1。SEQIDNo：31：推定人CD4細(xì)胞表位2。SEQIDNo：32：推定人CD4細(xì)胞表位3。SEQIDNo：33：推定人CD4細(xì)胞表位4。SEQIDNo：34：推定人CD4細(xì)胞表位5。SEQIDNo：35：推定人CD4細(xì)胞表位6。SEQIDNo：36：推定人CD4細(xì)胞表位7。SEQIDNo：37：推定人CD4細(xì)胞表位8。SEQIDNo：38：推定人CD4細(xì)胞表位9。SEQIDNo：39：推定人CD4細(xì)胞表位10。SEQIDNo：40：推定人CD4細(xì)胞表位11。SEQIDNo：41：推定人CD4細(xì)胞表位12。SEQIDNo：42：推定人CD4細(xì)胞表位13。SEQIDNo：43：推定人CD4細(xì)胞表位14。SEQIDNo：44：推定人CD4細(xì)胞表位15。SEQIDNo：45：推定人CD4細(xì)胞表位16。SEQIDNo：46：推定人CD4細(xì)胞表位17。SEQIDNo：47：推定人CD4細(xì)胞表位18。SEQIDNo：48：推定人CD4細(xì)胞表位19。SEQIDNo：49：推定人CD4細(xì)胞表位20。SEQIDNo：50：推定人CD4細(xì)胞表位21。SEQIDNo：51：推定人CD4細(xì)胞表位22。SEQIDNo：52：推定人CD4細(xì)胞表位23。SEQIDNo：53：推定人CD8細(xì)胞表位1。SEQIDNo：54：推定人CD8細(xì)胞表位2。SEQIDNo：55：推定人CD8細(xì)胞表位3。SEQIDNo：56：推定人CD8細(xì)胞表位4。SEQIDNo：57：推定人CD8細(xì)胞表位5。SEQIDNo：58：推定人CD8細(xì)胞表位6。SEQIDNo：59：推定人CD8細(xì)胞表位7。SEQIDNo：60：推定人CD8細(xì)胞表位8。SEQIDNo：61：推定人CD8細(xì)胞表位9。SEQIDNo：62：推定人CD8細(xì)胞表位10。SEQIDNo：63：推定人CD8細(xì)胞表位11。SEQIDNo：64：推定人CD8細(xì)胞表位12。SEQIDNo：65：推定人CD8細(xì)胞表位13。SEQIDNo：66：推定人CD8細(xì)胞表位14。SEQIDNo：67：推定人CD8細(xì)胞表位15。SEQIDNo：68：推定人CD8細(xì)胞表位16。SEQIDNo：69：推定人CD8細(xì)胞表位17。SEQIDNo：70：推定人CD8細(xì)胞表位18。SEQIDNo：71：推定人CD8細(xì)胞表位19。SEQIDNo：72：推定人CD8細(xì)胞表位20。SEQIDNo：73：推定人CD8細(xì)胞表位21。SEQIDNo：74：推定人CD8細(xì)胞表位22。SEQIDNo：75：推定人CD8細(xì)胞表位23。SEQIDNo：76：推定人CD8細(xì)胞表位24。SEQIDNo：77：推定人CD8細(xì)胞表位25。SEQIDNo：78：推定人CD8細(xì)胞表位26。SEQIDNo：79：推定人CD8細(xì)胞表位27SEQIDNo：80：推定人CD8細(xì)胞表位28。SEQIDNo：81：推定人CD8細(xì)胞表位29。SEQIDNo：82：推定人CD8細(xì)胞表位30。SEQIDNo：83：推定人CD8細(xì)胞表位31。SEQIDNo：84：推定人CD8細(xì)胞表位32。SEQIDNo：85：推定人CD8細(xì)胞表位33。SEQIDNo：86：推定人CD8細(xì)胞表位34。SEQIDNo：87：推定人CD8細(xì)胞表位35。SEQIDNo：88：推定人CD8細(xì)胞表位36。SEQIDNo：89：推定人CD8細(xì)胞表位37。SEQIDNo：90：推定人CD8細(xì)胞表位38。SEQIDNo：91：推定人CD8細(xì)胞表位39。SEQIDNo：92：推定人CD8細(xì)胞表位40。SEQIDNo：93：推定人CD8細(xì)胞表位41。SEQIDNo：94：推定人CD8細(xì)胞表位42。SEQIDNo：95：推定人CD8細(xì)胞表位43。SEQIDNo：96：推定人CD8細(xì)胞表位44。SEQIDNo：97：推定人CD8細(xì)胞表位45。SEQIDNo：98：推定人CD8細(xì)胞表位46。SEQIDNo：99：推定人CD8細(xì)胞表位47。SEQIDNo：100：推定人CD8細(xì)胞表位48。SEQIDNo：101：推定人CD8細(xì)胞表位49。SEQIDNo：102：推定人CD8細(xì)胞表位50。SEQIDNo：103：推定人CD8細(xì)胞表位51。SEQIDNo：104：推定人CD8細(xì)胞表位52。SEQIDNo：105：推定人CD8細(xì)胞表位53。SEQIDNo：106：推定人CD8細(xì)胞表位54。SEQIDNo：107：推定人CD8細(xì)胞表位55。SEQIDNo：108：推定人CD8細(xì)胞表位56。SEQIDNo：109：推定人CD8細(xì)胞表位57。SEQIDNo：110：推定人CD8細(xì)胞表位58。SEQIDNo：111：推定人CD8細(xì)胞表位59。SEQIDNo：112：推定人CD8細(xì)胞表位60。SEQIDNo：113：推定人CD8細(xì)胞表位61。SEQIDNo：114：推定人CD8細(xì)胞表位62。SEQIDNo：115：推定人CD8細(xì)胞表位63。SEQIDNo：116：推定人CD8細(xì)胞表位64。SEQIDNo：117：推定人CD8細(xì)胞表位65。SEQIDNo：118：推定人CD8細(xì)胞表位66。SEQIDNo：119：推定人CD8細(xì)胞表位67。SEQIDNo：120：推定人CD8細(xì)胞表位68。SEQIDNo：121：推定人CD8細(xì)胞表位69。SEQIDNo：122：推定人CD8細(xì)胞表位70。SEQIDNo：123：推定人CD8細(xì)胞表位71。SEQIDNo：124：推定人CD8細(xì)胞表位72。SEQIDNo：125：推定人CD8細(xì)胞表位73。SEQIDNo：126：推定人CD8細(xì)胞表位74。SEQIDNo：127：推定人CD8細(xì)胞表位75。SEQIDNo：128：推定人CD8細(xì)胞表位76。SEQIDNo：129：推定人CD8細(xì)胞表位77。SEQIDNo：130：推定人CD8細(xì)胞表位78。SEQIDNo：131：推定人CD8細(xì)胞表位79。SEQIDNo：132：推定人CD8細(xì)胞表位80。SEQIDNo：133：推定人CD8細(xì)胞表位81。SEQIDNo：134：推定人CD8細(xì)胞表位82。SEQIDNo：135：推定人CD8細(xì)胞表位83。SEQIDNo：136：推定人CD8細(xì)胞表位84。SEQIDNo：137：推定人CD8細(xì)胞表位85。SEQIDNo：138：推定人CD8細(xì)胞表位86。SEQIDNo：139：推定人CD8細(xì)胞表位87。SEQIDNo：140：推定人CD8細(xì)胞表位88。SEQIDNo：141：推定人CD8細(xì)胞表位89。SEQIDNo：142：推定人CD8細(xì)胞表位90。SEQIDNo：143：推定人CD8細(xì)胞表位91。SEQIDNo：144：推定人CD8細(xì)胞表位92。SEQIDNo：145：推定人CD8細(xì)胞表位93。SEQIDNo：146：推定人CD8細(xì)胞表位94。SEQIDNo：147：推定人CD8細(xì)胞表位95。SEQIDNo：148：推定人CD8細(xì)胞表位96。SEQIDNo：149：推定人CD8細(xì)胞表位97。SEQIDNo：150：推定人CD8細(xì)胞表位98。SEQIDNo：151：推定人CD8細(xì)胞表位99。SEQIDNo：152：推定人CD8細(xì)胞表位100。SEQIDNo：153：推定人CD8細(xì)胞表位101。SEQIDNo：154：推定人CD8細(xì)胞表位102。SEQIDNo：155：來(lái)自結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株的Rv1753c的多肽序列。SEQIDNo：156：來(lái)自結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株的Rv2707c的多肽序列。具體實(shí)施方式目前，用活菌接種是誘導(dǎo)保護(hù)性免疫最有效的方法。用于該目的的最常用的分枝桿菌是卡介桿菌(BCG)，這是60多年前開(kāi)發(fā)的牛分枝桿菌的無(wú)毒性菌株。然而，BCG的安全性和有效性成為爭(zhēng)論的來(lái)源-盡管在兒童中顯示了對(duì)嚴(yán)重疾病的保護(hù)，BCG并不能預(yù)防成年人中潛伏TB的形成或者肺部疾病的再活化。此外，在一些國(guó)家，例如美國(guó)，并未用這種藥劑來(lái)給普通人群接種。幾乎所有目前在臨床開(kāi)發(fā)中的新一代TB疫苗均被設(shè)計(jì)為暴露前(pre-exposure)疫苗。其中包括了亞基疫苗，其在加強(qiáng)由先前的BCG接種誘導(dǎo)的免疫中特別有效，還包括高級(jí)活分枝桿菌疫苗，其用于將BCG替換為更有效和/或更安全的菌株。盡管這些疫苗的目的在于改進(jìn)對(duì)感染的耐受性，它們?cè)跐摲黅B病例中作為暴露后或治療性疫苗的效力可能相對(duì)較低(LinMY等人Endocrine，Metabolic&ImmuneDisorders-DrugTargets20088：15-29)。這些蛋白中有多種在分枝桿菌感染早期被強(qiáng)烈表達(dá)，據(jù)顯示它們可在動(dòng)物接種模型中提供很強(qiáng)的保護(hù)效力。然而，用感染早期高度表達(dá)的抗原接種可能無(wú)法提供處理感染后期的最佳免疫應(yīng)答。對(duì)感染后期的充分控制可能需要T細(xì)胞，其特異性針對(duì)在該時(shí)期表達(dá)的特定抗原。直接靶向持續(xù)休眠菌的暴露后疫苗可能有助于針對(duì)TB再活化的保護(hù)，從而強(qiáng)化TB控制，或者甚至能清除感染。因此，靶向潛伏TB的疫苗可以顯著和經(jīng)濟(jì)地降低全球TB感染率。基于后期抗原的亞基疫苗還可與早期抗原聯(lián)合使用以提供多階段疫苗。替代性地，后期抗原可用于補(bǔ)充和改善BCG接種(通過(guò)促進(jìn)BCG應(yīng)答或者通過(guò)形成高級(jí)重組BCG菌株)。Rv2386c，也稱(chēng)為MbtI，可通過(guò)將分支酸鹽轉(zhuǎn)化為水楊酸鹽催化分枝桿菌素生物合成中的初始轉(zhuǎn)化(Zwahlen等人Biochemistry200746：954-964)。Rv2386之前已被鑒定為與應(yīng)激狀態(tài)下的表達(dá)相關(guān)，盡管在豚鼠模型中作為DNA疫苗施用時(shí)未形成保護(hù)(Vipond等人Vaccine200624：6340-6350)。最近，基于對(duì)結(jié)核分枝桿菌基因組的全基因組生物信息學(xué)分析(Zvi等人BMCMedicalGenetics20081：18)和對(duì)活動(dòng)性和潛伏感染個(gè)體中差異表達(dá)蛋白的測(cè)試(SchuckSD等人PLoSONE20094(5)：e5590)已經(jīng)提出了一些結(jié)核分枝桿菌疫苗候選物。盡管已顯示巨噬細(xì)胞是分枝桿菌免疫性的首要效應(yīng)物，T細(xì)胞是該種免疫性的主要誘導(dǎo)物。T細(xì)胞在針對(duì)結(jié)核病的保護(hù)中的關(guān)鍵作用解釋為人免疫缺陷病毒感染個(gè)體中(由于CD4+T細(xì)胞的相關(guān)耗竭)增加的TB再活化速率。此外，在針對(duì)結(jié)核分枝桿菌初次免疫應(yīng)答的頂點(diǎn)進(jìn)行的CD4+T細(xì)胞的繼承轉(zhuǎn)移已顯示賦予T細(xì)胞缺陷型小鼠中針對(duì)結(jié)核分枝桿菌的保護(hù)(Orme等人J.Exp.Med.1983158：74-83)。分枝桿菌活性CD4+T細(xì)胞據(jù)顯示是γ-干擾素(IFN-γ)的有效生產(chǎn)者，這進(jìn)而顯示觸發(fā)在小鼠中巨噬細(xì)胞的抗分枝桿菌作用(Flynn等人J.Exp.Med.1993178：2249-2254)。盡管對(duì)IFN-γ在人體內(nèi)的作用所知更少，研究已顯示，1，25-二羥基-維生素D3單獨(dú)或者與IFN-γ或腫瘤壞死因子-alpha組合激活人巨噬細(xì)胞以抑制結(jié)核分枝桿菌感染。此外，已知IFN-γ刺激人巨噬細(xì)胞來(lái)制備1，25-二羥基-維生素D3。類(lèi)似地，已顯示白介素-12(IL-12)在刺激針對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染的耐受性上起作用。有關(guān)結(jié)核分枝桿菌感染免疫學(xué)的綜述可參見(jiàn)Chan＆Kaufmann，tuberculosis：Pathogenesis，ProtectionandControl(Bloom編輯，1994)，tuberculosis(第2版，Rom和Garay，編輯2003)，和Harrison’sPrinciplesofInternalMedicine，第150章，pp953-966(第16版，Braunwald，等人，編輯2005)。本發(fā)明總體涉及作為T(mén)B抗原(特別是與潛伏TB相關(guān)的抗原)的Rv2386c的鑒定，并涉及預(yù)防和治療TB(尤其是預(yù)防和治療潛伏TB以及預(yù)防或延緩TB再活化)的相關(guān)方法和用途。因此，本發(fā)明提供了Rv2386c蛋白、其變體或其免疫原性片段，或者編碼所述蛋白、變體或片段的多核苷酸，以用于治療或預(yù)防TB。適當(dāng)?shù)兀撚猛究商貏e針對(duì)潛伏TB的預(yù)防和治療(尤其是潛伏TB的治療)。替代性地，該用途可針對(duì)TB再活化的預(yù)防或延緩(特別是TB再活化的延緩，例如延緩數(shù)月、數(shù)年或甚至無(wú)限期)。術(shù)語(yǔ)“結(jié)核復(fù)合物(complex)的分枝桿菌種類(lèi)”包括通常被認(rèn)為引起結(jié)核病疾病的種類(lèi)，以及引起免疫缺陷患者(例如患有AIDS的患者)的結(jié)核病和肺部疾病的分枝桿菌環(huán)境和機(jī)會(huì)種，例如結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)、牛分枝桿菌(M.bovis)或非洲分枝桿菌(M.africanum)、BCG、鳥(niǎo)結(jié)核分枝桿菌(M.avium)、胞內(nèi)分枝桿菌(M.intracellulare)、隱藏分枝桿菌(M.celatum)、日內(nèi)瓦分枝桿菌(M.genavense)、嗜血分枝桿菌(M.haemophilum)、堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)、猿分枝桿菌(M.simiae)、牝牛分枝桿菌(M.vaccae)、偶發(fā)分枝桿菌(M.fortuitum)以及瘰疬分枝桿菌(M.scrofulaceum)(參見(jiàn)，例如，Harrison’sPrinciplesofInternalMedicine，第150章，pp953-966(第16版，Braunwald，等人，編輯，2005)。本發(fā)明特別涉及結(jié)核分枝桿菌的感染。術(shù)語(yǔ)“活動(dòng)性感染”指具有已顯現(xiàn)的疾病癥狀和/或損傷(合適地具有顯現(xiàn)的疾病癥狀)的感染(例如，結(jié)核分枝桿菌感染)。術(shù)語(yǔ)“非活動(dòng)性感染”、“潛伏感染”或“潛伏性感染”指未顯示疾病癥狀和/或損傷(合適地未顯示疾病癥狀)的感染(例如，結(jié)核分枝桿菌感染)。術(shù)語(yǔ)“原發(fā)結(jié)核病”指在感染(例如，結(jié)核分枝桿菌感染)后直接形成的臨床疾病(疾病癥狀的顯現(xiàn))。參見(jiàn)Harrison’sPrinciplesofInternalMedicine，第150章，pp953-966(第16版，Braunwald，等人，編輯，2005)。術(shù)語(yǔ)“繼發(fā)性結(jié)核病”或“原發(fā)后結(jié)核病”指潛伏、非活動(dòng)性或潛伏性感染(例如，結(jié)核分枝桿菌感染)的再活化。參見(jiàn)Harrison’sPrinciplesofInternalMedicine，第150章，pp953-966(第16版，Braunwald，等人，編輯，2005)。術(shù)語(yǔ)“結(jié)核病再活化”指感染測(cè)試呈陽(yáng)性(例如，在結(jié)核菌素皮試中呈陽(yáng)性，合適地在體外基于T細(xì)胞的測(cè)定中呈陽(yáng)性)但沒(méi)有明顯的疾病癥狀的個(gè)體隨后顯現(xiàn)疾病癥狀。該陽(yáng)性診斷測(cè)試表明該個(gè)體被感染，然而，該個(gè)體可能曾顯示或未曾顯示已進(jìn)行過(guò)充分治療以將結(jié)核病帶入非活動(dòng)性或潛伏狀態(tài)的活動(dòng)性疾病的癥狀。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，預(yù)防、延緩或治療結(jié)核病再活化的方法可在顯現(xiàn)活動(dòng)性疾病癥狀的個(gè)體內(nèi)啟動(dòng)。術(shù)語(yǔ)“耐藥性”結(jié)核病指感染(例如，被結(jié)核分枝桿菌感染)，其中該感染菌株不被一種或多種能夠有效治療結(jié)核病的所謂“一線”化療劑(例如，異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素和吡嗪酰胺)所壓制或殺死(即，耐受)。術(shù)語(yǔ)“多重耐藥性”結(jié)核病指耐受兩種或更多種能夠有效治療結(jié)核病的“一線”化療劑的感染菌株的感染(例如，被結(jié)核分枝桿菌感染)?！盎焺敝副绢I(lǐng)域已知并用于治療結(jié)核病(例如，被結(jié)核分枝桿菌感染)的藥劑。用于治療結(jié)核病的示范性的藥劑包括，但不限于，阿米卡星、氨基水楊酸、卷曲霉素、環(huán)絲氨酸、乙胺丁醇、乙硫異煙胺、異煙肼、卡那霉素、吡嗪酰胺、利福霉素類(lèi)(即，利福平、利福噴汀和利福布汀)、鏈霉素、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、克拉霉素、阿齊霉素和氟喹諾酮類(lèi)。用于治療非耐藥性結(jié)核病的“一線”或“前線”化療劑包括異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素和吡嗪酰胺。用于治療對(duì)一種或多種“一線”藥物顯示了耐藥性的結(jié)核病的“二線”化療劑包括氧氟沙星、環(huán)丙沙星、乙硫異煙胺、氨基水楊酸、環(huán)絲氨酸、阿米卡星、卡那霉素和卷曲霉素。參見(jiàn)GoodmanandGilman’sThePharmacologicalBasisofTherapeutics，HardmanandLimbird編輯，2001第48章中綜述的這些藥劑。術(shù)語(yǔ)“多肽”、“肽”和“蛋白”在此可互換使用以表示氨基酸殘基的聚合物。該術(shù)語(yǔ)還可用于其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基為相應(yīng)天然存在氨基酸的人工化學(xué)模擬物的氨基酸聚合物，還可用于天然存在氨基酸聚合物和非天然存在氨基酸聚合物。合適地，根據(jù)本發(fā)明的多肽將僅由天然存在氨基酸殘基(特別是由遺傳密碼編碼的那些氨基酸)組成。術(shù)語(yǔ)“氨基酸”指天然存在和合成的氨基酸，以及以類(lèi)似于天然存在氨基酸的方式發(fā)揮功能的氨基酸類(lèi)似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸為由遺傳密碼編碼的氨基酸，以及隨后被修飾的氨基酸，例如，羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸。氨基酸類(lèi)似物指與天然存在的氨基酸具有相同基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，即，與氫連接的a碳，羧基基團(tuán)，氨基基團(tuán)以及R基團(tuán)，例如，高絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞砜、蛋氨酸甲基锍。該種類(lèi)似物具有修飾的R基團(tuán)(例如，正亮氨酸)或修飾的肽骨架，但保留了與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物指具有與氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)，但功能上與天然存在的氨基酸類(lèi)似的化合物。合適地，氨基酸為天然存在的氨基酸或氨基酸類(lèi)似物，特別是天然存在的氨基酸，尤其是由遺傳密碼編碼的氨基酸?！昂怂帷敝该撗鹾颂呛塑账峄蚝颂呛塑账峒捌鋯捂溁螂p鏈形式的聚合物。該術(shù)語(yǔ)包括含有合成、天然存在的和非天然存在的、與參考核酸具有類(lèi)似結(jié)合特性的且與參考核苷酸以類(lèi)似方式代謝的已知核苷酸類(lèi)似物或修飾的骨架殘基或連鎖的核酸。該種類(lèi)似物的范例包括，但不限于，硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性-膦酸甲酯、2-O-核糖核苷酸甲酯、肽核酸(PNAs)。合適地，術(shù)語(yǔ)“核酸”指天然存在的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。除非另行指明，特定的核酸序列還意指包含其保守修飾的變體(例如，簡(jiǎn)并密碼子置換)和互補(bǔ)序列，以及明確指出的序列(合適地，它指明示指出的序列)。特別地，簡(jiǎn)并密碼子置換可通過(guò)生成其中一個(gè)或多個(gè)選定的(或者所有的)密碼子的第三位置被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基所置換的序列來(lái)實(shí)現(xiàn)(Batzer等人，NucleicAcidRes.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes8：91-98(1994))。術(shù)語(yǔ)核酸可與基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互換使用。本文的氨基酸可用常見(jiàn)的三個(gè)字母的符號(hào)表示或者可通過(guò)IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會(huì)推薦的單字母符號(hào)表示。同樣地，核苷酸也可采用其通常接受的單字母密碼來(lái)表示。本文所用的術(shù)語(yǔ)“Rv2386c蛋白序列”指SEQIDNo：1中提供的多肽序列或其同源物，其來(lái)自結(jié)核復(fù)合物的分枝桿菌種類(lèi)，例如，結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌或非洲分枝桿菌等種類(lèi)，或者環(huán)境性和機(jī)會(huì)性的并引起免疫缺陷宿主(例如，患有AIDS的患者)的機(jī)會(huì)性感染如肺部感染的分枝桿菌種類(lèi)，例如，BCG，鳥(niǎo)結(jié)核分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、隱藏分枝桿菌、日內(nèi)瓦分枝桿菌、嗜血分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、猿分枝桿菌、牝牛分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌和瘰疬分枝桿菌(參見(jiàn)，例如，Harrison’sPrinciplesofInternalMedicine，第150章，pp953-966，第16版，Braunwald，等人，編輯，2005)。為了確保在接種宿主中的高效力比例，疫苗的成分應(yīng)當(dāng)在具有臨床意義的菌株中良好保藏。合適地，Rv2386c蛋白來(lái)自于結(jié)核分枝桿菌H37Rv(即，SEQIDNo：1中提供的多肽序列)或者是來(lái)自其它結(jié)核分枝桿菌菌株(例如CDC1551、F11、HaarlemA和C菌株)的同源物。與耐藥性相關(guān)的結(jié)核分枝桿菌菌株(例如，MDR或特別是XDR)是Rv2386c蛋白序列的特別有價(jià)值的基礎(chǔ)。感興趣的菌株包括：CDC1551-可傳遞且強(qiáng)毒性菌株Haarlem家族(例如HaarlemA)-在擁擠人群中發(fā)現(xiàn)的耐藥性菌株。結(jié)核分枝桿菌菌株中的Haarlem家族成員已在世界各地被發(fā)現(xiàn)。該家族的第一個(gè)代表成員發(fā)現(xiàn)于荷蘭的Haarlem。KZN4207-從南非KwaZulu-Natal的患者得到的藥物敏感分離物。KZN1435-從南非KwaZulu-Natal的患者得到的多重耐藥(MDR)分離物。KZN605-從南非KwaZulu-Natal的患者得到的廣泛耐藥(XDR)分離物。C-在紐約市高度傳遞。在一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)該菌株在注射藥物使用者中更為常見(jiàn)，且耐受活性氮中間體(Friedman等人J.Infect.Dis.1997176(2)：478-84)。94M4241A-1994年在舊金山從一名出生于中國(guó)的患者分離得到。該菌株曾通過(guò)基因缺失分析進(jìn)行分析(Gagneux等人，PNAS2006103(8)：2869-2873)。02_1987-2002年在舊金山從一名出生于南韓的患者分離得到。該菌株曾通過(guò)基因缺失分析進(jìn)行分析(Gagneux等人，PNAS2006103(8)：2869-2873)。T92-1999年在舊金山從一名出生于菲律賓的患者分離得到。該菌株發(fā)表于Hirsh等人PNAS2004101：4871-4876。T85-1998年在舊金山從一名出生于中國(guó)的患者分離得到。該菌株發(fā)表于Hirsh等人PNAS2004101：4871-4876。EAS054-1993年在舊金山從一名出生于印度的患者分離得到。該菌株曾通過(guò)基因缺失分析進(jìn)行分析(Gagneux等人，PNAS2006103(8)：2869-2873)。Gagneux等人，PNAS2006103(8)：2869-2873和Herbert等人Infect.Immun.200775(12)：5798-5805為已知存在的結(jié)核分枝桿菌菌株范圍提供了有價(jià)值的背景知識(shí)。最適宜地，Rv2386c蛋白選自SEQIDNo：1和3-7、特別是SEQIDNo：1和3-6(例如SEQIDNo：1)中提供的多肽序列。特別感興趣的多核苷酸是包含(例如由其組成)編碼如下的序列的那些多核苷酸：(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段。多核苷酸將合適地包含(例如由其組成)編碼Rv2386c蛋白的免疫原性片段的SEQIDNO：2的變體或SEQIDNO：2的片段。組合本發(fā)明的Rv2836c相關(guān)的多肽可進(jìn)一步包含設(shè)計(jì)用于增強(qiáng)其免疫原性或在其它方面改善這些抗原的其它成分。例如，可通過(guò)在抗原的一端添加一段組氨酸殘基(通常稱(chēng)為his-tag)來(lái)促進(jìn)多肽抗原的改善分離。術(shù)語(yǔ)“his-tag”指參考序列中插入的一串組氨酸殘基，通常是六個(gè)殘基。為了最小化對(duì)與參考序列相關(guān)的活性的破壞，his-tag一般被插在N-末端，通常緊鄰起始蛋氨酸殘基，或者插在C-末端。它們對(duì)于天然序列通常是異源的，但由于它們可通過(guò)改善與固定化金屬親和層析樹(shù)脂(IMAC)的蛋白結(jié)合促進(jìn)分離而被整合入天然序列。通常而言，從引發(fā)針對(duì)參考蛋白的所需免疫應(yīng)答而言his-tag的存在與否并不重要。然而，為了避免針對(duì)his-tag本身的不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，據(jù)認(rèn)為最好最小化his-tag的長(zhǎng)度，例如，降低至四個(gè)或更少的殘基，特別是兩個(gè)殘基(或者完全不用his-tag)。為了提高引發(fā)的免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和/或幅度，本發(fā)明的組合物、多肽和核酸可包含來(lái)自分枝桿菌種類(lèi)(特別是結(jié)核分枝桿菌)的本發(fā)明抗原和/或另外的異源多肽(或編碼它們的多核苷酸)的多個(gè)拷貝。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，當(dāng)一些成分組合使用時(shí)，精確的存在可發(fā)生變化。例如，Rv2386c成分和本發(fā)明的抗原或另外的異源抗原成分的另外拷貝可以如下方式存在：(1)兩種單獨(dú)的多肽成分；(2)包含兩種多肽成分的融合蛋白；(3)一種多肽和一種多核苷酸成分；(4)兩種單獨(dú)的多核苷酸成分；(5)編碼兩種單獨(dú)多肽成分的單個(gè)多核苷酸；或者(6)編碼包含兩種多肽成分的融合蛋白的單個(gè)多核苷酸。這種靈活性可同樣應(yīng)用于三種或更多種成分組合使用的情況。然而，為方便起見(jiàn)，通常期望當(dāng)存在多種成分時(shí)，它們包含于單個(gè)融合蛋白中或編碼單個(gè)融合蛋白的多核苷酸中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，所有的抗原成分以多肽提供(例如，在單個(gè)融合蛋白中)。在本發(fā)明的一個(gè)替代性的實(shí)施方式中，所有抗原成分以多核苷酸提供(例如，單個(gè)多核苷酸，例如編碼單個(gè)融合蛋白的多核苷酸)。在用于表示核酸的部分時(shí)，術(shù)語(yǔ)“異源的”表示該核酸包含兩種或更多種被發(fā)現(xiàn)性質(zhì)上關(guān)系彼此不相同的子序列。例如，該核酸通常重組生成，具有兩個(gè)或更多個(gè)來(lái)自無(wú)關(guān)基因的序列并排列為生成新的功能核酸，例如，來(lái)自一個(gè)來(lái)源的啟動(dòng)子和來(lái)自另一來(lái)源的編碼區(qū)。類(lèi)似地，異源蛋白表示該蛋白包含兩種或更多種被發(fā)現(xiàn)性質(zhì)上關(guān)系彼此不相同的子序列(例如，融合蛋白)?！叭诤隙嚯摹被颉叭诤系鞍住敝妇哂兄苯踊蛲ㄟ^(guò)氨基酸接頭共價(jià)連接的至少兩種異源多肽(例如，至少兩種分枝桿菌屬多肽)的蛋白。形成融合蛋白的多肽通常將C-末端連接至N-末端，盡管它們也可將C-末端連接至C-末端，N-末端連接至N-末端，或者將N-末端連接至C-末端。融合蛋白的多肽可以呈任意順序。該術(shù)語(yǔ)還指構(gòu)成該融合蛋白的抗原的保守修飾的變體、多形態(tài)變體、等位基因、突變體、免疫原性片段和種間同源物。結(jié)合分枝桿菌抗原描述于Cole等人，Nature393：537(1998)，其披露了整個(gè)結(jié)核分枝桿菌基因組。對(duì)應(yīng)于結(jié)核分枝桿菌抗原的來(lái)自其它分枝桿菌種類(lèi)的抗原可通過(guò)例如采用本文所述的序列比較算法或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法(例如，雜交測(cè)定和抗體結(jié)合測(cè)定)進(jìn)行鑒定。術(shù)語(yǔ)“融合”指融合蛋白中兩個(gè)多肽之間的共價(jià)鍵。多肽通常通過(guò)肽鍵彼此直接連接或經(jīng)氨基酸接頭連接。任選地，肽可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的非肽共價(jià)鍵連接?？膳cRv2386c結(jié)合的示范性結(jié)核分枝桿菌抗原包括如下(例如(i)至(xii)的一種或多種)的一種或多種(例如，1-5種，如1-3種，特別是1種)：(i)Mtb8.4(也稱(chēng)為DPV和Rv1174c)，其多肽序列描述于WO97/09428的SEQIDNo：102(cDNA以SEQIDNo：101顯示)和Coler等人JournalofImmunology1998161：2356-2364中。特別感興趣的是成熟Mtb8.4序列，其缺失前導(dǎo)信號(hào)肽(即，WO97/09428的SEQIDNo：102的氨基酸殘基15-96)。Mtb8.4的全長(zhǎng)多肽序列以SEQIDNo：8顯示；(ii)Mtb9.8(也稱(chēng)為MSL和Rv0287)，其多肽序列描述于WO98/53075的SEQIDNo：109(MSL的片段披露于WO98/53075的SEQIDNo：110-124，特別感興趣的是SEQIDNo：119和120)以及Coler等人Vaccine200927：223-233(特別是其中圖2所示的活性片段)中。Mtb9.8的全長(zhǎng)多肽序列以SEQIDNo：9顯示；(iii)Mtb9.9(也稱(chēng)為Mtb9.9A、MTI、MTI-A和Rv1793)，其多肽序列描述于WO98/53075的SEQIDNo：19和Alderson等人JournalofExperimentalMedicine20007：551-559(MTI的片段披露于WO98/53075的SEQIDNo：17和51-66，特別感興趣的是SEQIDNo：17、51、52、53、56和62-65)。一些MTI多肽變體描述于WO98/53075的SEQIDNo：21、23、25、27、29和31以及Alderson等人JournalofExperimentalMedicine20007：551-559中。Mtb9.9的全長(zhǎng)多肽序列以SEQIDNo：10顯示；(iv)Ra12(也稱(chēng)為Mtb32AC-末端抗原)，其多肽序列描述于WO01/98460的SEQIDNo：10和Skeiky等人JournalofImmunology2004172：7618-7682中。Ra12的全長(zhǎng)多肽序列以SEQIDNo：11顯示；(v)Ra35(也稱(chēng)為Mtb32AN-末端抗原)，其多肽序列描述于WO01/98460的SEQIDNo：8和Skeiky等人JournalofImmunology2004172：7618-7682中。Ra35的全長(zhǎng)多肽序列以SEQIDNo：12顯示；(vi)TbH9(也稱(chēng)為Mtb39、Mtb39A、TbH9FL和Rv1196)，其多肽序列描述于WO97/09428的SEQIDNo：107以及Dillon等人InfectionandImmunity199967(6)：2941-2950和Skeiky等人JournalofImmunology2004172：7618-7682中。TbH9的全長(zhǎng)多肽序列以SEQIDNo：13顯示；(vii)Mtb40(也稱(chēng)為HTCC1和Rv3616c)，其多肽序列描述于WO98/53075的SEQIDNo：138(cDNA描述于SEQIDNo：137)。Mtb40的全長(zhǎng)多肽序列以SEQIDNo：14顯示；(viii)Mtb41(也稱(chēng)為MTCC2和Rv0915c)，其多肽序列描述于WO98/53075的SEQIDNo：142(cDNA描述于SEQIDNo：140)和Skeiky等人JournalofImmunology2000165：7140-7149中。Mtb41的全長(zhǎng)多肽序列以SEQIDNo：15顯示；(ix)ESAT-6(也稱(chēng)為esxA和Rv3875)，其多肽序列描述于WO97/09428的SEQIDNo：103(cDNA以SEQIDNo：104描述)和Sorensen等人InfectionandImmunity199563(5)：1710-1717中。ESAT-6的全長(zhǎng)多肽序列以SEQIDNo：16顯示；(x)Ag85復(fù)合抗原(例如Ag85A，也稱(chēng)為fbpA和Rv3804c；或者Ag85B，也稱(chēng)為fbpB和Rv1886c)，其在例如，Content等人InfectionandImmunity199159：3205-3212和Huygen等人NatureMedicine19962(8)：893-898中討論。Ag85A的全長(zhǎng)多肽序列以SEQIDNo：17顯示(特別感興趣的是殘基43-338的成熟蛋白，即，缺失信號(hào)肽)。Ag85B的全長(zhǎng)多肽序列以SEQIDNo：18顯示(特別感興趣的是殘基41-325的成熟蛋白，即，缺失信號(hào)肽)；(xi)Alpha-晶體蛋白(也稱(chēng)為hspX和Rv2031c)，其描述于Verbon等人JournalofBacteriology1992174：1352-1359和Friscia等人ClinicalandExperimentalImmunology1995102：53-57(特別感興趣的是對(duì)應(yīng)于殘基71-91、21-40、91-110和111-130的片段)。alpha-晶體蛋白的全長(zhǎng)多肽序列以SEQIDNo：19顯示；(xii)Mpt64(也稱(chēng)為Rv1980c)，其描述于Roche等人ScandinavianJournalofImmunology199643：662-670。MPT64的全長(zhǎng)多肽序列以SEQIDNo：20顯示(特別感興趣的是殘基24-228的成熟蛋白，即，缺失信號(hào)肽)；(xiii)Mtb32A，其多肽序列描述于WO01/98460的SEQIDNo：2(全長(zhǎng))和SEQIDNo：4的殘基8-330(成熟)，特別是具有催化三聯(lián)體突變的至少一個(gè)的變體(例如，催化絲氨酸殘基，其可例如突變?yōu)楸彼?。Mtb32A的全長(zhǎng)多肽序列以SEQIDNo：21顯示。具有Ser/Ala突變的Mtb32A的成熟形式以SEQIDNo：22顯示；(xiv)TB10.4，TB10.4的全長(zhǎng)多肽序列以SEQIDNo：23顯示；(xv)Rv1753c，來(lái)自于結(jié)核分枝桿菌H37Rv的Rv1753c的全長(zhǎng)多肽序列以SEQIDNo：155顯示；和/或(xv)Rv2707c，來(lái)自于結(jié)核分枝桿菌H37Rv的Rv2707c的全長(zhǎng)多肽序列以SEQIDNo：156顯示?；蚱浣M合，例如(如(a)至(g)的組合)：(a)Ra12、TbH9和Ra35成分的組合，例如呈融合蛋白形式，如Mtb72f。Mtb72f的多肽序列描述于WO2006/117240的SEQIDNo：6(cDNA以SEQIDNo：5描述)以及Skeiky等人JournalofImmunology2004172：7618-7682(其中結(jié)合了任選的His-tag來(lái)幫助純化，當(dāng)應(yīng)用于本發(fā)明中時(shí)，合適地，Mtb72f不具有該任選的組氨酸殘基)。Mtb72f的多肽序列以SEQIDNo：24顯示；(b)Ra12、TbH9和Ser/Ala突變的Ra35(即，催化絲氨酸殘基被丙氨酸替換)成分的組合，例如呈融合蛋白形式，如M72。M72的多肽序列描述于WO2006/117240的SEQIDNo：4(cDNA以SEQIDNo：3描述)，其中結(jié)合了任選的雙組氨酸來(lái)幫助生產(chǎn)，當(dāng)應(yīng)用于本發(fā)明中時(shí)，M72也可結(jié)合雙組氨酸，但合適地，M72不含該任選的雙組氨酸(即，特別感興趣的是WO2006/117240的SEQIDNo：4的殘基4-725)。M72的多肽序列以SEQIDNo：25顯示；(c)Mtb8.4、Mtb9.8、Mtb9.9和Mtb41成分的組合，例如呈融合蛋白形式，如Mtb71f。Mtb71f的多肽序列描述于WO99/051748的SEQIDNo：16(cDNA以SEQIDNo：15描述)，其中結(jié)合了任選的His-tag來(lái)幫助純化，當(dāng)應(yīng)用于本發(fā)明中時(shí)，合適地，Mtb71f對(duì)應(yīng)于來(lái)自WO99/051748的SEQIDNo：16的氨基酸殘基9-710。Mtb71f的多肽序列以SEQIDNo：26顯示；(d)Mtb72f或M72(合適地不具有任選的幫助表達(dá)的組氨酸殘基)與Mtb9.8和Mtb9.9的組合，例如呈融合蛋白形式。M72-Mtb9.9-Mtb9.8融合體的多肽序列以SEQIDNo：27(M92融合)顯示，在用于本發(fā)明時(shí)，該M72-Mtb9.9-Mtb9.8融合體可任選地在起始蛋氨酸殘基后結(jié)合雙組氨酸以幫助生產(chǎn)。(e)Mtb72f或M72(合適地不具有任選的幫助表達(dá)的組氨酸殘基)與Ag85B的組合，例如呈融合蛋白形式，如Mtb103f。Mtb103f的多肽序列描述于WO03/070187的SEQIDNo：18(cDNA以SEQIDNo：10描述)，其結(jié)合了任選的His-tag以幫助純化，當(dāng)用于本發(fā)明時(shí)，合適地，Mtb103f對(duì)應(yīng)于WO03/070187的SEQIDNo：18的氨基酸殘基8-1016。還特別感興趣的是M103，即Mtb103f結(jié)合了Ra35成分中的Ser/Ala突變，當(dāng)用于本發(fā)明時(shí)，合適地，M103對(duì)應(yīng)于WO03/070187的SEQIDNo：18的氨基酸殘基8-1016，其中在第710位的Ser殘基被替換為Ala。M103的多肽序列以SEQIDNo：28顯示，當(dāng)用于本發(fā)明時(shí)，該M72-Mtb9.9-Mtb9.8融合體可任選地在起始蛋氨酸殘基后結(jié)合雙組氨酸以幫助生產(chǎn)；(f)Mtb72f或M72(合適地不具有任選的幫助表達(dá)的組氨酸殘基)與Mtb41的組合，例如呈融合蛋白形式，如Mtb114f。Mtb114f的多肽序列描述于WO03/070187的SEQIDNo：16(cDNA描述于SEQIDNo：9)，其結(jié)合了任選的His-tag以幫助純化，當(dāng)用于本發(fā)明時(shí)，合適地，Mtb114f對(duì)應(yīng)于WO03/070187的SEQIDNo：16的氨基酸殘基8-1154。還特別感興趣的是M114，即Mtb114f結(jié)合了Ra35成分中的Ser/Ala突變，當(dāng)用于本發(fā)明時(shí)，合適地，M114對(duì)應(yīng)于WO03/070187的SEQIDNo：16的氨基酸殘基8-1154，其中在第710位的Ser殘基被替換為Ala。M114的多肽序列以SEQIDNo：29顯示，當(dāng)用于本發(fā)明時(shí)，該M72-Mtb9.9-Mtb9.8融合體可任選地在起始蛋氨酸殘基后結(jié)合雙組氨酸以幫助生產(chǎn)；(g)Ag85B和ESAT-6成分的組合，例如在Doherty等人JournalofInfectiousDiseases2004190：2146-2153所述的融合體中；和/或(h)Ag85B和TB10.4成分的組合，例如在Dietrich等人JournalofImmunology2005174(10)：6332-6339190：2146-2153所述的融合體中。特別感興趣的是Rv2386c成分和Mtb40成分的組合。顯然，該種組合可任選地包含其它附加的抗原成分(例如，M72成分)。另一感興趣的組合包含Rv2386c成分和M72成分。另一感興趣的組合包含Rv2386c成分和Rv1753c成分。其它感興趣的組合包括那些包含Rv2386c成分和Rv2707c成分的組合。另外的感興趣的組合包含Rv2386c成分和alpha-晶體蛋白成分。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，這些組合并不依賴(lài)于上文(i)-(xvi)和(a)-(h)中所述的特定序列，且所述序列的保守修飾的變體(例如，具有至少70％一致性，例如至少80％一致性，特別是至少90％一致性，尤其至少95％一致性)或免疫原性片段(例如，全長(zhǎng)抗原的至少20％，例如該抗原的至少50％，特別是至少70％，尤其是至少80％)可用于實(shí)現(xiàn)相同的實(shí)際效果。上述單獨(dú)抗原序列的每一個(gè)還披露于Cole等人Nature1998393：537-544和CamusMicrobiology2002148：2967-2973。公眾已可獲得結(jié)核分枝桿菌H37Rv的基因組，例如可見(jiàn)WelcomeTrustSangerInstitute的網(wǎng)站(www.sanger.ac.uk/Projects/M_tuberculosis/)以及其它途徑。上述抗原中的多個(gè)還披露于美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?8/523,435、08/523,436、08/658,800、08/659,683、08/818,111、08/818,112、08/942,341、08/942,578、08/858,998、08/859,381、09/056,556、09/072,596、09/072,967、09/073,009、09/073,010、09/223,040、09/287,849以及PCT專(zhuān)利申請(qǐng)PCT/US98/10407、PCT/US98/10514、PCT/US99/03265、PCT/US99/03268、PCT/US99/07717、WO97/09428和WO97/09429、WO98/16645、WO98/16646，其每一個(gè)在此引入作為參考。本發(fā)明的組合物、多肽和核酸還可包含來(lái)自其它來(lái)源的另外的多肽。例如，本發(fā)明的組合物和融合蛋白可包含多肽或編碼多肽的核酸，其中該多肽增強(qiáng)抗原的表達(dá)，例如，NS1，流感病毒蛋白(參見(jiàn)例如WO99/40188和WO93/04175)。本發(fā)明的核酸可根據(jù)所選種類(lèi)，例如人(當(dāng)進(jìn)行體內(nèi)表達(dá)時(shí))或特定細(xì)菌(當(dāng)進(jìn)行多肽生產(chǎn)時(shí))的密碼子偏好進(jìn)行工程改造。Rv2386c成分還可與一種或多種抗結(jié)核病(例如，結(jié)核分枝桿菌感染)有效的化療劑施用。這些化療劑的范例包括，但不限于，阿米卡星、氨基水楊酸、卷曲霉素、環(huán)絲氨酸、乙胺丁醇、乙硫異煙胺、異煙肼、卡那霉素、吡嗪酰胺、利福霉素類(lèi)(即、利福平、利福噴汀和利福布汀)、鏈霉素、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、克拉霉素、阿齊霉素和氟喹諾酮類(lèi)。該種化療可由主治醫(yī)生采用優(yōu)選藥物組合的判斷來(lái)確定。用于治療非耐藥性結(jié)核病(例如，結(jié)核分枝桿菌感染)的“一線”化療劑包括異煙肼、利福平、乙胺丁醇、鏈霉素和吡嗪酰胺。用于治療已證明對(duì)一種或多種“一線”藥物有耐藥性的結(jié)核病(例如，結(jié)核分枝桿菌感染)的“二線”化療劑包括氧氟沙星、環(huán)丙沙星、乙硫異煙胺、氨基水楊酸、環(huán)絲氨酸、阿米卡星、卡那霉素和卷曲霉素。傳統(tǒng)的化療劑通常在相對(duì)較長(zhǎng)的周期內(nèi)給藥(約9個(gè)月)。傳統(tǒng)化療劑與根據(jù)本發(fā)明的Rv2386c成分給藥的組合可縮短化療治療周期(例如，縮短至8個(gè)月、7個(gè)月、6個(gè)月、5個(gè)月、4個(gè)月、3個(gè)月或更短)而不降低效力。特別感興趣的是Rv2386c成分與卡介桿菌(BCG)的聯(lián)用。例如，以重組表達(dá)Rv2386c(或其如本文所述的變體或片段)的修飾BCG的形式。替代性地，該Rv2386c成分可用于通過(guò)同時(shí)給藥或通過(guò)促進(jìn)之前的BCG免疫來(lái)增強(qiáng)對(duì)象對(duì)于BCG免疫的應(yīng)答。當(dāng)用于增強(qiáng)對(duì)象對(duì)BCG接種的應(yīng)答時(shí)，該Rv2386c成分可顯然地以多肽或多核苷酸(任選地結(jié)合上述另外的抗原成分)的形式提供。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，成分的組合不必同時(shí)給藥，并可按如下方式應(yīng)用：?jiǎn)为?dú)或組合；同時(shí)、相繼或在短時(shí)間內(nèi)；通過(guò)相同或不同的途徑。然而，為方便起見(jiàn)，通常期望將成分的組合作為單種組合物給藥(當(dāng)給藥方案相容時(shí))。本發(fā)明的多肽、多核苷酸和組合物通常向人給藥，但對(duì)包括家養(yǎng)哺乳動(dòng)物(例如，狗、貓、兔、大鼠、小鼠、豚鼠、倉(cāng)鼠、南美栗鼠)和農(nóng)用哺乳動(dòng)物(例如，牛、豬、綿羊、山羊、馬)等其它哺乳動(dòng)物也有效。免疫原性片段T細(xì)胞表位是被T細(xì)胞(例如，CD4+或CD8+T細(xì)胞)識(shí)別的氨基酸的短連續(xù)片段。T細(xì)胞表位的鑒定可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的表位定位實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)(參見(jiàn)，例如Paul，F(xiàn)undamentalImmunology，第3版，243-247(1993)；Beiβbarth等人Bioinformatics200521(Suppl.1)：i29-i37)。替代性地，可采用實(shí)施例中所述的方法預(yù)測(cè)表位。由于結(jié)核病中T細(xì)胞應(yīng)答的關(guān)鍵參與，顯然包含至少一個(gè)T細(xì)胞表位的全長(zhǎng)Rv2386c多肽的片段將具有免疫原性并有助于免疫保護(hù)。該種片段在此稱(chēng)為免疫原性片段。根據(jù)本發(fā)明的免疫原性片段將通常包含全長(zhǎng)多肽序列的至少9個(gè)連續(xù)氨基酸(例如，至少10個(gè))，例如至少12個(gè)連續(xù)氨基酸(例如，至少15或至少20個(gè)連續(xù)氨基酸)，特別是至少50個(gè)連續(xù)氨基酸，例如至少100個(gè)連續(xù)氨基酸(例如至少200個(gè)連續(xù)氨基酸)。合適地，該免疫原性片段將是該全長(zhǎng)多肽序列長(zhǎng)度的至少20％，例如至少50％、至少70％或至少80％。應(yīng)當(dāng)理解，在不同的遠(yuǎn)系交配群體(例如人)中，不同的HLA類(lèi)型表示該特定表位可能不被該群體所有成員所識(shí)別。因此，為了最大化識(shí)別的水平以及對(duì)多肽的免疫應(yīng)答的強(qiáng)度，通常期望該免疫原性片段包含來(lái)自該全長(zhǎng)序列的多個(gè)表位(適當(dāng)時(shí)為全部表位)?？梢允褂玫腞v2386c蛋白的具體片段包括包含至少一個(gè)CD4+表位、適當(dāng)?shù)匕辽賰蓚€(gè)CD4+表位、特別是包含所有CD4+表位(例如實(shí)施例和SEQIDNo：30-52中所述的那些表位，特別是與多個(gè)HLA等位基因相關(guān)的表位，例如與2、3、4、5或更多個(gè)等位基因相關(guān)的表位)的那些Rv2386c蛋白?？梢允褂玫腞v2386c蛋白的其它片段包括包含至少一個(gè)CD8表位、適當(dāng)?shù)匕辽賰蓚€(gè)CD8表位、特別是包含所有CD8表位(例如實(shí)施例和SEQIDNo：53-154中所述的那些表位，特別是與多個(gè)HLA等位基因相關(guān)的表位，例如與2、3、4、5或更多個(gè)等位基因相關(guān)的表位)的那些Rv2386c蛋白。當(dāng)使用全長(zhǎng)多肽的單獨(dú)片段時(shí)，該種片段在其引發(fā)的應(yīng)答達(dá)到參考序列在PBMC或全血對(duì)特定抗原的體外再刺激測(cè)定(例如，在數(shù)小時(shí)至長(zhǎng)達(dá)兩周之間，例如長(zhǎng)達(dá)一天、1天至1周或者1至2周的時(shí)間內(nèi)再刺激)中活性的至少20％、合適地至少50％且特別是至少75％(例如至少90％)時(shí)被認(rèn)為是免疫原性的，其中該測(cè)定通過(guò)培養(yǎng)懸浮液中淋巴組織增殖、細(xì)胞因子生成(通過(guò)ELISA、CBA等測(cè)量)或者通過(guò)胞內(nèi)和胞外染色(例如，采用特異性針對(duì)免疫標(biāo)記物的抗體，例如CD3、CD4、CD8、IL2、TNFa、IFNg、CD40L、CD69等)然后以流式細(xì)胞儀分析T和B細(xì)胞應(yīng)答特征來(lái)測(cè)量細(xì)胞的活化。合適地，當(dāng)片段引發(fā)參考序列在T細(xì)胞增殖和/或IFN-gamma生成測(cè)定中的活性的至少20％、合適地至少50％且特別是至少75％(例如至少90％)的應(yīng)答時(shí)被認(rèn)為具有免疫原性。在一些情況下，全長(zhǎng)多肽的多個(gè)片段(其可與全長(zhǎng)序列重疊或不重疊并且覆蓋或不覆蓋該全長(zhǎng)序列的全部)可被用于獲得與全長(zhǎng)序列本身同等的生物應(yīng)答。例如，至少兩個(gè)(例如三個(gè)、四個(gè)或五個(gè))上述免疫原性片段組合提供的活性是該參考序列在PBMC或全血的體外再刺激測(cè)定(例如，T細(xì)胞增殖和/或IFN-gamma生成測(cè)定)中活性的至少50％、合適地至少75％且尤其是至少90％。變體“變體”或“保守修飾變體”可同時(shí)用于氨基酸和核酸序列。對(duì)于特定的核酸序列，保守修飾的變體指編碼相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸，或者當(dāng)該核酸不編碼氨基酸序列時(shí)，指基本相同的序列。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并，大量功能相同的核酸編碼任意給定蛋白。例如，密碼子GCA、GCC、GCG和GCU均編碼氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密碼子限定的每個(gè)位置，該密碼子可被改為所述的任意相應(yīng)的密碼子而不改變編碼的多肽。該種核酸變體可導(dǎo)致“沉默”或“簡(jiǎn)并”變體，其為保守修飾變異的一種。本文編碼多肽的每個(gè)核酸序列也描述了該核酸每個(gè)可能的沉默變異。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到核酸中的每個(gè)密碼子(除了AUG，其通常是蛋氨酸的唯一密碼子，以及TGG，其通常是色氨酸的唯一密碼子)可被修飾以得到功能相同的分子。因此，每個(gè)所述的序列中暗示了編碼多肽的核酸的每個(gè)沉默變異。本發(fā)明的多核苷酸與參考序列相比可包含多個(gè)沉默變異(例如，1-50個(gè)，例如1-25個(gè)，特別是1-5個(gè)，尤其是1個(gè)密碼子被更改)。本發(fā)明的多核苷酸與參考序列相比可包含多個(gè)非沉默保守變異(例如，1-50個(gè)，例如1-25個(gè)，特別是1-5個(gè)，尤其是1個(gè)密碼子被更改)。非沉默變異是那些可導(dǎo)致編碼氨基酸序列的變化(通過(guò)氨基酸殘基的置換、缺失或添加)的變異。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，特定的多核苷酸序列可同時(shí)包含沉默和非沉默保守變異。對(duì)于蛋白序列的變體，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到改變、添加或缺失單個(gè)氨基酸或少量百分比的氨基酸的多肽的單獨(dú)置換、缺失或添加是“保守修飾變體”，其中該改變導(dǎo)致以功能類(lèi)似的氨基酸置換氨基酸或者殘基的置換/缺失添加基本不影響該變體的生物功能。提供功能類(lèi)似的氨基酸的保守置換表是本領(lǐng)域公知的。該種保守修飾的變體附加于且不排除本發(fā)明多形態(tài)變體、種間同源物以及等位基因。本發(fā)明的多肽與參考序列相比可包含多個(gè)保守置換(例如，1-50個(gè)，例如1-25個(gè)，特別是1-10個(gè)，尤其是1個(gè)氨基酸殘基被更改)?？傮w而言，該種保守置換將落入下文限定的氨基酸分組之一，盡管在一些情況下，也可能有其它置換而可能基本不影響該抗原的免疫原性。以下八組各包含了彼此可進(jìn)行典型保守置換的氨基酸：1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴(lài)氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；以及8)半胱氨酸(C)，蛋氨酸(M)(參見(jiàn)，例如，Creighton，Proteins1984)。合適地，該種置換不發(fā)生在表位區(qū)域，因此對(duì)該抗原的免疫原性不具有明顯影響。蛋白變體還可包括相對(duì)于參考序列其中插入了另外氨基酸的那些蛋白變體，例如，該種插入可發(fā)生在1-10個(gè)位置(例如1-5個(gè)位置，合適地1或2個(gè)位置，特別是1個(gè)位置)，并可以，例如，在每個(gè)位置添加50或更少的氨基酸(例如20個(gè)或更少，特別是10個(gè)或更少，尤其是5個(gè)或更少)。合適地，該種插入不發(fā)生在表位區(qū)域，因此對(duì)該抗原的免疫原性不具有明顯影響。插入的一個(gè)實(shí)施例包括一段短的組氨酸殘基(例如，2-6個(gè)殘基)以幫助目的抗原的表達(dá)和/或純化。蛋白變體包括相對(duì)于參考序列氨基酸已經(jīng)缺失的那些蛋白變體，例如，該種缺失可發(fā)生在1-10個(gè)位置(例如1-5個(gè)位置，合適地1或2個(gè)位置，特別是1個(gè)位置)，并可以，例如，涉及在每個(gè)位置缺失50或更少的氨基酸(例如20個(gè)或更少，特別是10個(gè)或更少，尤其是5個(gè)或更少)。合適地，該種缺失不發(fā)生在表位區(qū)域，因此對(duì)該抗原的免疫原性不具有明顯影響。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到特定的蛋白變體可包括置換、缺失和添加(或其任意組合)。確定抗原表位區(qū)域的方法在實(shí)施例中描述和示范。變體優(yōu)選地顯示相對(duì)于相關(guān)參考序列至少約70％一致性，更優(yōu)選地至少約80％一致性和最優(yōu)選地至少約90％一致性(例如至少約95％，至少約98％或至少約99％)。上下文中兩個(gè)或更多核酸或多肽序列的“一致性”或百分比“一致性”指，當(dāng)比較和比對(duì)得到比較窗口中的最大對(duì)應(yīng)或指定區(qū)域采用下列序列比較算法之一測(cè)量或通過(guò)人工比對(duì)和視覺(jué)觀察時(shí)，兩個(gè)或更多個(gè)序列或子序列彼此相同或具有一定百分比的相同(即，相對(duì)指定區(qū)域70％一致性，任選地75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的一致性)的氨基酸殘基或核苷酸。這樣的序列隨后可被稱(chēng)為“基本一致的”。該定義還指測(cè)試序列的結(jié)果(compliment)。任選地，該一致性存在于長(zhǎng)度至少約25至約50個(gè)氨基酸或核苷酸的區(qū)域，或者任選地長(zhǎng)度為75-100個(gè)氨基酸或核苷酸的區(qū)域。合適地，該比較在對(duì)應(yīng)于參考序列全長(zhǎng)的窗口進(jìn)行。在序列比較中，通常將一個(gè)序列作為參考序列，將測(cè)試序列與之比較。當(dāng)使用序列比較算法時(shí)，將測(cè)試和參考序列輸入計(jì)算機(jī)，指定子序列坐標(biāo)，并在需要時(shí)指定序列算法程序參數(shù)。可采用默認(rèn)程序參數(shù)，或指定供選參數(shù)。隨后序列比較算法將根據(jù)程序參數(shù)計(jì)算測(cè)試序列相對(duì)于參考序列的序列一致性的百分比。本文所用的“比較窗口”指對(duì)兩個(gè)序列進(jìn)行最佳比對(duì)后，其中序列可與相同數(shù)量連續(xù)位置的參考序列比較的片段。通過(guò)比對(duì)序列進(jìn)行比較的方法已為本領(lǐng)域所熟知。通過(guò)序列的最佳比對(duì)進(jìn)行比較可通過(guò)下述方法實(shí)現(xiàn)，例如，通過(guò)Smith＆Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法，通過(guò)Needleman＆Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比對(duì)算法，通過(guò)Pearson＆Lipman，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA85：2444(1988)的相似性搜索法，通過(guò)這些算法的計(jì)算機(jī)執(zhí)行(GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA，以及Wisconsin遺傳學(xué)軟件包中的TFASTA，GeneticsComputerGroup，575ScienceDr.，Madison，WI)，或者通過(guò)人工比對(duì)和視覺(jué)觀察(參見(jiàn)，例如，CurrentProtocolsinMolecularBiology(Ausubel等人，編輯，1995supplement))。一種有用算法的實(shí)施例為PILEUP。PILEUP采用漸進(jìn)的，雙序列比對(duì)建立了來(lái)自一組相關(guān)序列的多重序列比對(duì)，從而顯示相關(guān)性和序列一致性百分比。它還繪制了可顯示用于建立比對(duì)的聚類(lèi)關(guān)系的樹(shù)狀圖或系統(tǒng)樹(shù)圖。PILEUP采用了簡(jiǎn)化的Feng＆Doolittle，J.Mol.Evol.35：351-360(1987)的漸進(jìn)比對(duì)法。所采用的方法與Higgins＆Sharp，CABIOS5：151-153(1989)所描述的方法類(lèi)似。該程序可對(duì)高達(dá)300個(gè)序列進(jìn)行比對(duì)，每個(gè)序列的最大長(zhǎng)度為5,000個(gè)核苷酸或氨基酸。該多重比對(duì)程序始于對(duì)兩個(gè)最為相似的序列的成對(duì)比對(duì)，從而產(chǎn)生兩個(gè)比對(duì)序列的聚類(lèi)。然后將該聚類(lèi)與下一個(gè)最相關(guān)的序列或比對(duì)序列的聚類(lèi)進(jìn)行比對(duì)。兩個(gè)序列聚類(lèi)通過(guò)將兩個(gè)單獨(dú)序列的成對(duì)比對(duì)的簡(jiǎn)單擴(kuò)展進(jìn)行比對(duì)。最終比對(duì)可通過(guò)一系列的漸進(jìn)，雙序列比對(duì)實(shí)現(xiàn)。該程序通過(guò)指定特定的序列及其氨基酸或核苷酸坐標(biāo)為序列比較區(qū)域并指定程序參數(shù)來(lái)運(yùn)行。使用PILEUP時(shí)采用下列參數(shù)通過(guò)比較參考序列和其它測(cè)試序列以確定序列一致性關(guān)系百分比：默認(rèn)gapweight(3.00)，默認(rèn)gaplengthweight(0.10)，以及weightedendgaps。PILEUP可以從GCG序列分析軟件包的7.0版等版本中獲取(Devereaux等人，Nuc.AcidsRes.12：387-395(1984)。適于確定序列一致性和序列相似性百分比的算法的另一實(shí)施例為BLAST和BLAST2.0算法，其分別描述于Altschul等人，Nuc.AcidsRes.25：3389-3402(1977)和Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)?？蛇M(jìn)行BLAST分析的軟件可通過(guò)國(guó)家生物技術(shù)信息中心公開(kāi)獲取(網(wǎng)址在www.ncbi.nlm.nih.gov)。該算法包括首先通過(guò)鑒定待測(cè)序列中長(zhǎng)度為W的短字來(lái)鑒定高得分序列對(duì)(HSPs)，其中該短字與數(shù)據(jù)庫(kù)序列中相同長(zhǎng)度的字比對(duì)時(shí)匹配或滿(mǎn)足某些正數(shù)值閾值得分T。T指鄰近字得分閾值(Altschul等人，同前)。這些初始鄰近字采樣數(shù)(wordhits)作為種子啟動(dòng)對(duì)包含它們的更長(zhǎng)HSPs的搜索。該字采樣數(shù)沿著每個(gè)序列的兩個(gè)方向伸展，直至累計(jì)比對(duì)得分增加。對(duì)核苷酸序列的累計(jì)分?jǐn)?shù)采用參數(shù)M(對(duì)一對(duì)匹配殘基的獎(jiǎng)賞分?jǐn)?shù)；總是＞0)和N(對(duì)不匹配殘基的懲罰分?jǐn)?shù)；總是＜0)進(jìn)行計(jì)算。對(duì)于氨基酸序列，可使用得分矩陣來(lái)計(jì)算累計(jì)分?jǐn)?shù)。以下情況下字采樣數(shù)向各方向的伸展被停止：累計(jì)比對(duì)分?jǐn)?shù)較其最大獲得值小數(shù)量X；由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)得分殘基比對(duì)的累積，累計(jì)分?jǐn)?shù)降至0或以下；或者達(dá)到了任一序列的末端。BLAST算法的參數(shù)W、T和X確定了比對(duì)的靈敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)用默認(rèn)字長(zhǎng)(w)為11，預(yù)期(E)為5，M＝5，N＝-4，并同時(shí)對(duì)兩條鏈進(jìn)行比較。對(duì)于氨基酸序列，BLASTP程序用默認(rèn)字長(zhǎng)(w)為3，和預(yù)期(E)為10，以及該BLOSUM62得分矩陣(參見(jiàn)Henikoff＆Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915(1989))的比對(duì)(B)為50，預(yù)期(E)為10，M＝5，N＝-4，并對(duì)兩條鏈進(jìn)行比較。BLAST算法還可進(jìn)行兩個(gè)序列間的相似度統(tǒng)計(jì)學(xué)分析(例如，參見(jiàn)Karlin＆Altschul，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA90：5873-5787(1993))。由BLAST算法所提供的一種相似度檢測(cè)為最小總可能性(P(N))，它對(duì)兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間偶然產(chǎn)生匹配的可能性提供了指示。例如，當(dāng)測(cè)試核酸與參考核酸之間比較得到的最小總可能性小于約0.2，更優(yōu)選小于約0.01，最優(yōu)選小于約0.001時(shí)，該核酸被認(rèn)為與參考核酸相類(lèi)似。本發(fā)明還涉及多核苷酸，其包含在適度嚴(yán)格條件(例如高度嚴(yán)格條件)下與編碼多肽的第二核苷酸序列的補(bǔ)體選擇性雜交的第一核苷酸序列，該多肽包含：(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段。短語(yǔ)“高度嚴(yán)格雜交條件”指探針與其目標(biāo)子序列(通常在核酸的復(fù)雜混合物中)而不與其它序列進(jìn)行雜交時(shí)的條件。高度嚴(yán)格條件為序列依賴(lài)性的且在不同的環(huán)境中將不同。更長(zhǎng)序列特別在更高的溫度下雜交。對(duì)于核酸雜交的全面指導(dǎo)可參見(jiàn)Tijssen，TechniquesinBiochemistryandMolecularBiology--HybridizationwithNucleicProbes，“Overviewofprinciplesofhybridisationandthestrategyofnucleicacidassays”(1993)。一般而言，高度嚴(yán)格條件可選定為較限定離子強(qiáng)度pH下具體序列的熱熔點(diǎn)(Tm)低大約5-10℃。Tm為(在限定離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)平衡時(shí)50％的與目標(biāo)互補(bǔ)的探針與目標(biāo)序列進(jìn)行雜交時(shí)的溫度(由于目標(biāo)序列為過(guò)量存在，因此在平衡時(shí)在Tm下50％的探針被占用)。高度嚴(yán)格條件將是在pH7.0至8.3下鹽濃度小于約1.0M鈉離子，通常為約0.01至1.0M鈉離子濃度(或其它鹽)，且對(duì)于短探針(例如，10至50個(gè)核苷酸)，溫度為至少約30℃，以及對(duì)長(zhǎng)探針(例如，大于50個(gè)核苷酸)，溫度為至少約60℃的條件。高度嚴(yán)格條件還可通過(guò)添加去穩(wěn)定劑例如甲酰胺實(shí)現(xiàn)。對(duì)于選擇性或特異性雜交，陽(yáng)性信號(hào)是背景的至少兩倍，任選地為背景雜交的10倍。示例性的高度嚴(yán)格雜交條件可以是如下條件：50％甲酰胺、5xSSC以及1％SDS，42℃下孵育，或者5xSSC，1％SDS，65℃下孵育，并在65℃下用0.2xSSC和0.1％SDS洗滌。當(dāng)核酸編碼的多肽基本一致時(shí)，在高度嚴(yán)格條件下不能彼此雜交的該核酸仍然功能相同。這發(fā)生于，例如，當(dāng)核酸的拷貝是通過(guò)遺傳密碼允許的最大密碼子簡(jiǎn)并所生成時(shí)。在該種情況下，該核酸通常在適度嚴(yán)格雜交條件下雜交。示例性的“適度嚴(yán)格雜交條件”包括在37℃下于40％甲酰胺，1MNaCl，1％SDS的緩沖液中雜交，并在45℃下于1XSSC中洗滌。陽(yáng)性的雜交是背景的至少兩倍。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將容易認(rèn)識(shí)到，可采用替代性的雜交和洗滌條件以提供具有類(lèi)似嚴(yán)格度的條件。短語(yǔ)“選擇性(或特異性)雜交”指在嚴(yán)格雜交條件下，當(dāng)特定核苷酸序列存在于復(fù)合混合物(例如，總細(xì)胞或文庫(kù)DNA或RNA)中時(shí)，一種分子僅與該特定序列結(jié)合、雙聯(lián)或雜交。在任意情況下，多肽序列的變體將具有與參考序列基本相同的活性(對(duì)于多核苷酸，變體多核苷酸序列將編碼與參考序列具有基本相同活性的多肽)?；鞠嗤幕钚灾竻⒖夹蛄性赑BMC或全血對(duì)特定抗原的體外再刺激測(cè)定(例如，再刺激數(shù)小時(shí)至長(zhǎng)達(dá)兩周之間，例如長(zhǎng)達(dá)一天、1天至1周或者1至2周的時(shí)間)中活性的至少50％、合適地至少75％且特別是至少90％，其中該測(cè)定通過(guò)培養(yǎng)懸浮液中淋巴組織增殖、細(xì)胞因子生成(通過(guò)ELISA、CBA等測(cè)量)或者胞內(nèi)和胞外染色(例如，采用特異性針對(duì)免疫標(biāo)記物的抗體，例如CD3、CD4、CD8、IL2、TNFa、IFNg、CD40L、CD69等)然后以流式細(xì)胞儀分析T和B細(xì)胞應(yīng)答特征來(lái)測(cè)量細(xì)胞的活化。合適地，基本相同的活性指參考序列在T細(xì)胞增殖和/或IFN-gamma生成測(cè)定中的活性的至少50％、合適地至少75％且尤其是至少90％。多核苷酸組合物本文所用的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”指經(jīng)過(guò)分離不含特定種類(lèi)的總基因組DNA的分子。因此，編碼多肽的多核苷酸指包含一個(gè)或多個(gè)編碼序列，且從獲得該多核苷酸的種類(lèi)的總基因組DNA基本分離或純化的多核苷酸片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能理解，本發(fā)明的多核苷酸可包括表達(dá)或可改造為表達(dá)蛋白、多肽、肽等的基因組序列、基因組外和質(zhì)粒編碼的序列以及更小的工程改造基因片段。該種片段可天然分離，或人工修飾合成。本文所用的“分離”指多核苷酸與其它編碼序列基本分開(kāi)，且該多核苷酸不包含大比例的無(wú)關(guān)編碼DNA，例如大染色體片段或其它功能基因或多肽編碼區(qū)。分離的核酸與位于該基因側(cè)翼并編碼與該基因不同的蛋白的其它開(kāi)放閱讀框架相隔離。當(dāng)然，這是指原始分離的DNA片段，且不排除隨后通過(guò)人工向該片段添加的基因或編碼區(qū)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能理解，多核苷酸可以是單鏈(編碼或反義)或雙鏈的，且可以是DNA(基因組、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子，其包含內(nèi)含子并以一對(duì)一的方式與DNA分子相對(duì)應(yīng)，還包括不包含內(nèi)含子的mRNA分子。本發(fā)明的多核苷酸中可存在但不必須存在另外的編碼或非編碼序列，且多核苷酸可以(但不必須)與其它分子和/或支撐材料連接。多核苷酸可包含天然序列(即，編碼分枝桿菌抗原或其部分的內(nèi)源性序列)或可包含該種序列的變體、生物或功能等價(jià)物。多核苷酸變體可包含一個(gè)或多個(gè)置換、添加、缺失和/或插入，如下文進(jìn)一步描述，優(yōu)選地使得所編碼多肽的免疫原性相對(duì)于參考蛋白未減小。對(duì)編碼多肽的免疫原性的影響可總體上通過(guò)下文所述方法評(píng)估。在另外的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了包含與本文所述序列的一個(gè)或多個(gè)相同或互補(bǔ)的序列的各種長(zhǎng)度的連續(xù)片段的多核苷酸和多肽。例如，本發(fā)明提供了包含本文所述的參考序列的至少約30、40、50、75、100、150、200、300、400、500或1000或者更多個(gè)連續(xù)核苷酸以及其中任意中間長(zhǎng)度的連續(xù)核苷酸的多核苷酸。可以容易地理解，上下文中的“中間長(zhǎng)度”指舉例數(shù)值之間的任意長(zhǎng)度，例如30、31、32等；50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包括所有200-500、500-1000中的整數(shù)，等等。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員將能理解，由于遺傳密碼簡(jiǎn)并的結(jié)果，存在多種編碼本文所述多肽的核苷酸序列。這些多核苷酸中一部分與任意天然基因的核苷酸序列的一致性相對(duì)低。然而，本發(fā)明特別預(yù)期了由于密碼子使用的不同而變化的多核苷酸，例如，對(duì)人和/或靈長(zhǎng)動(dòng)物密碼子選擇優(yōu)化的多核苷酸。此外，包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。等位基因是由于核苷酸的一個(gè)或多個(gè)突變(例如缺失、添加和/或置換)而被改變的內(nèi)源性基因。所得的mRNA和蛋白可以(但非必須)具有不同的結(jié)構(gòu)或功能。等位基因可采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)鑒定(例如雜交、擴(kuò)增和/或數(shù)據(jù)庫(kù)序列比較)。多核苷酸鑒定和表征多核苷酸可通過(guò)各種成熟技術(shù)中的任意一種進(jìn)行鑒定、制備和/或操作。例如，多核苷酸可通過(guò)篩選cDNA的微陣列(將在下文詳細(xì)描述)進(jìn)行鑒定。該種篩選可，例如，采用Synteni微陣列(PaloAlto，CA)參照生產(chǎn)商的說(shuō)明實(shí)施(且基本如Schena等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：10614-10619(1996)和Heller等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：2150-2155(1997)所述)。替代性地，多核苷酸可由cDNA擴(kuò)增得到，該cDNA從表達(dá)本文所述的蛋白的細(xì)胞(例如結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞)制備。該種多核苷酸可通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增。對(duì)于該種方法，序列特異性引物可基于本文提供的序列設(shè)計(jì)，以及可購(gòu)買(mǎi)或合成得到。多核苷酸的擴(kuò)增部分可用于通過(guò)公知技術(shù)從合適的文庫(kù)(例如，結(jié)核分枝桿菌cDNA文庫(kù))分離全長(zhǎng)基因。在該種技術(shù)中，可采用適于擴(kuò)增的一種或多種多核苷酸探針或引物篩選文庫(kù)(cDNA或基因組)。優(yōu)選地，文庫(kù)可經(jīng)大小選擇以包括更大的分子。隨機(jī)引物文庫(kù)也可優(yōu)選用于鑒定基因的5’和上游區(qū)域?；蚪M文庫(kù)優(yōu)選用于獲得內(nèi)含子和延伸5’序列。對(duì)于雜交技術(shù)，可采用公知技術(shù)標(biāo)記部分序列(例如，通過(guò)切口平移或以32P進(jìn)行末端標(biāo)記)。然后通過(guò)包含具有標(biāo)記探針的變性細(xì)菌集落(或包含噬菌斑的菌苔)的雜交過(guò)濾器(hybridisingfilters)總體篩選細(xì)菌或噬菌體文庫(kù)(參見(jiàn)Sambrook等人，MolecularClonmg：ALaboratoryManual(2000))。選擇和擴(kuò)增雜交菌落或噬菌斑，且分離DNA以供進(jìn)一步分析。通過(guò)例如采用來(lái)自該部分序列的引物和來(lái)自該載體的引物的PCR分析cDNA克隆以確定添加序列的量。可生成限制性圖譜和部分序列以鑒定一種或多種重疊克隆。然后可采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(可包括生成一系列缺失克隆)確定完整的序列。然后所得的重疊序列可被裝配入單個(gè)連續(xù)序列?？刹捎霉夹g(shù)通過(guò)連接適合的片段生成全長(zhǎng)cDNA分子。替代性地，有多種擴(kuò)增技術(shù)以從部分cDNA序列獲得全長(zhǎng)編碼序列。在這些技術(shù)中，擴(kuò)增通常通過(guò)PCR進(jìn)行。各種市售的試劑盒中的任意一種均可用于實(shí)施該擴(kuò)增步驟。引物可采用例如本領(lǐng)域已知的軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)。引物優(yōu)選具有22-30個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度，具有至少50％的GC含量且在約68℃-72℃的溫度下退火至目標(biāo)序列。擴(kuò)增區(qū)域可按上述方式測(cè)序，且重疊序列被裝配進(jìn)入連續(xù)序列。一種這樣的擴(kuò)增技術(shù)是反向PCR(參見(jiàn)Triglia等人，Nucl.AcidsRes.16：8186(1988))，其采用限制性?xún)?nèi)切酶生成該基因已知區(qū)域的片段。該片段然后通過(guò)分子內(nèi)連接環(huán)化，并用作PCR的模板，該P(yáng)CR采用從已知區(qū)域衍生的趨異(divergent)引物。在替代性的方法中，鄰近部分序列的序列可通過(guò)采用針對(duì)接頭序列的引物和特異性針對(duì)已知區(qū)域的引物的擴(kuò)增重新獲得。該擴(kuò)增的序列通常進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，該第二輪擴(kuò)增采用相同的接頭引物和特異性針對(duì)已知區(qū)域的第二引物。WO96/38591中描述了該步驟的一種變異，其中采用了從已知序列的相反方向啟動(dòng)延伸的兩種引物。另一種該類(lèi)技術(shù)被稱(chēng)為“cDNA末端快速擴(kuò)增”或RACE。該技術(shù)包括采用內(nèi)部引物和外部引物，其與polyA區(qū)域或載體序列雜交，以鑒定已知序列的5’和3’的序列。另外的技術(shù)包括捕捉PCR(Lagerstrom等人，PCRMethodsApplic.1：111-19(1991))和步行PCR(Parker等人，Nucl.Acids.Res.19：3055-60(1991))。采用擴(kuò)增的其它方法也被用于獲得全長(zhǎng)cDNA序列。在某些情況下，有可能通過(guò)在表達(dá)序列標(biāo)記(EST)數(shù)據(jù)庫(kù)(例如可從GenBank獲得)中提供的序列的分析獲得全長(zhǎng)cDNA序列。對(duì)重疊ESTs的檢索通?？刹捎霉绦?例如NCBIBLAST檢索)進(jìn)行，該ESTs可用于生成連續(xù)全長(zhǎng)序列。全長(zhǎng)DNA序列還可通過(guò)基因組片段分析獲得。多核苷酸在宿主細(xì)胞中的表達(dá)編碼多肽、或融合蛋白或其功能等價(jià)物的多核苷酸序列或其片段可用于重組DNA分子以引導(dǎo)多肽在合適的宿主細(xì)胞中的表達(dá)。由于遺傳密碼的固有簡(jiǎn)并，可生成編碼基本相同或功能等同的氨基酸序列的其它DNA序列，且這些序列可用于克隆或表達(dá)給定多肽。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能理解，生成具有非天然存在的密碼子的多肽編碼核苷酸序列在某些情況下是有利的。例如，可以選擇被特定的原核或真核宿主所優(yōu)選的密碼子以提高蛋白表達(dá)率或生成具有所需特性(例如具有比從天然存在的序列生成的轉(zhuǎn)錄物的半衰期更長(zhǎng)的半衰期)的重組RNA轉(zhuǎn)錄物。此外，該多核苷酸序列可通過(guò)本領(lǐng)域通常已知的方法工程改造，從而為了各種理由改變多肽編碼序列，該理由包括但不限于，調(diào)節(jié)基因產(chǎn)物的克隆、加工和/或表達(dá)的改變。例如，通過(guò)隨機(jī)片段化的DNA改組和基因片段的PCR重組以及合成寡核苷酸可用于對(duì)核苷酸序列進(jìn)行改造。此外，定點(diǎn)突變可用于插入新的限制性?xún)?nèi)切位點(diǎn)、改變糖基化模式、改變密碼子偏好、生成剪切變體或引入突變等等。天然、修飾或重組核酸序列可被連接至異源性序列以編碼融合蛋白。例如，為了在肽文庫(kù)篩選多肽活性的抑制劑，編碼能被市售的抗體識(shí)別的嵌合蛋白是有用的。融合蛋白還可通過(guò)工程改造以包含位于多肽編碼序列和異源性蛋白序列之間的裂解位點(diǎn)，使得該多肽可被裂解并從異源性部分純化。編碼所需多肽的序列可采用本領(lǐng)域公知的方法完全或部分合成(參見(jiàn)Caruthers，M.H.等人，Nucl.AcidsRes.Symp.Ser.pp215-223(1980)，Horn等人，Nucl.AcidsRes.Symp.Ser.pp225-232(1980))。替代性地，該蛋白本身可利用合成多肽的氨基酸序列或其部分的化學(xué)方法生產(chǎn)。例如，肽合成可利用各種固相技術(shù)(Roberge等人，Science269：202-204(1995))實(shí)現(xiàn)，且可例如利用ABI431A肽合成儀(PerkinElmer，PaloAlto，CA)實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化合成。新合成的肽可通過(guò)制備型高壓液相色譜(例如，Creighton，Proteins，StructuresandMolecularPrinciples(1983))或本領(lǐng)域其它相當(dāng)?shù)募夹g(shù)基本上純化。合成肽的組合物可通過(guò)氨基酸分析或測(cè)序(例如，Edman降解方法)確認(rèn)。另外，多肽或其任一部分的氨基酸序列可在直接合成中改變和/或通過(guò)化學(xué)方法與來(lái)自其它蛋白或其任意部分的序列合并，以生成變體多肽。為了表達(dá)所需的多肽，編碼該多肽或其功能等同物的核苷酸序列可被插入合適的表達(dá)載體，即，包含插入編碼序列轉(zhuǎn)錄和翻譯的必需元件的載體?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法構(gòu)建包含編碼目標(biāo)多肽的序列和適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄和翻譯控制元件的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、合成技術(shù)以及體內(nèi)遺傳重組。這些技術(shù)描述于Sambrook等人，MolecularCloning，ALaboratoryManual(2000)，以及Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology(每年更新)。各種表達(dá)載體/宿主系統(tǒng)可用于包含和表達(dá)多核苷酸序列。其包括，但不限于，微生物，例如用重組噬菌體、質(zhì)粒或粘粒DNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌；以酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的酵母；以病毒表達(dá)載體(如桿狀病毒)感染的昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)；以病毒表達(dá)載體(例如，花椰菜花葉病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)或以細(xì)菌表達(dá)載體(例如，Ti或pBR322質(zhì)粒)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞系統(tǒng)；或動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)。存在于表達(dá)載體中的“控制元件”或“調(diào)節(jié)序列”是載體的非翻譯區(qū)域--增強(qiáng)子、啟動(dòng)子、5’和3’未翻譯區(qū)域--其與宿主細(xì)胞蛋白相互作用以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。該元件可在強(qiáng)度和特異性上變化。根據(jù)所用的載體系統(tǒng)和宿主，可采用任意數(shù)量的合適轉(zhuǎn)錄和翻譯元件，包括組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。例如，在細(xì)菌系統(tǒng)中克隆時(shí)，可以使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子例如PBLUESCRIPT噬菌粒(Stratagene，LaJolla，Calif.)或PSPORT1質(zhì)粒(GibcoBRL，Gaithersburg，MD)等的雜交lacZ啟動(dòng)子。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中，通常優(yōu)選來(lái)自哺乳動(dòng)物基因或來(lái)自哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子。如果有必要生成包含編碼多肽的序列的多個(gè)拷貝的細(xì)胞系，基于SV40或EBV的載體可有利地與具有合適的可選擇標(biāo)記一起使用。在細(xì)菌系統(tǒng)中，根據(jù)被表達(dá)多肽的目標(biāo)用途，可選擇多種表達(dá)載體。例如，在需要較大的量時(shí)，例如對(duì)于抗體的誘導(dǎo)，可使用引導(dǎo)能被容易地純化的融合蛋白高水平表達(dá)的載體。該載體包括，但不限于，多功能大腸桿菌克隆和表達(dá)載體如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中該編碼目標(biāo)多肽的序列可被連接進(jìn)入載體，并與氨基末端Met和的β-半乳糖苷酶的后續(xù)7個(gè)殘基的序列同框，從而生成雜交蛋白；pIN載體(VanHeeke＆Schuster，J.Biol.Chem.264：5503-5509(1989))等；pGEX載體(Promega，Madison，Wis.)也可用于表達(dá)作為具有谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白的外源多肽。一般而言，該融和蛋白為可溶的，并能通過(guò)吸附至谷胱甘肽-瓊脂糖珠，然后在游離谷胱甘肽存在下洗脫從裂解的細(xì)胞容易地純化。在該系統(tǒng)中制備的蛋白可被設(shè)計(jì)為包括肝素、凝血酶或XA因子蛋白酶裂解位點(diǎn)，從而可根據(jù)需要使得克隆的目標(biāo)多肽從GST部分釋放。在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，可使用一些包含組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的載體，例如alpha因子、醇氧化酶和PGH。包含組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的其它載體包括GAP、PGK、GAL和ADH。綜述可參見(jiàn)Ausubel等人(同上)以及Grant等人，MethodsEnzymol.153：516-544(1987)和Romas等人Yeast8423-88(1992)。當(dāng)采用植物表達(dá)載體時(shí)，編碼多肽的序列的表達(dá)可通過(guò)多種啟動(dòng)子的任意一種驅(qū)動(dòng)。例如，CaMV的35S和19S啟動(dòng)子等病毒啟動(dòng)子可單獨(dú)使用或與來(lái)自TMV的omega前導(dǎo)序列合并使用(Takamatsu，EMBOJ.6：307-311(1987))。替代性地，可使用作為RUBISCO的小亞基或熱休克啟動(dòng)子等植物啟動(dòng)子(Coruzzi等人，EMBOJ.3：1671-1680(1984)；Broglie等人，Science224：838-843(1984)；和Winter等人，ResultsProbl.CellDiffer.17：85-105(1991))。這些構(gòu)建體可通過(guò)直接DNA轉(zhuǎn)化或病原體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染被引入植物細(xì)胞。這些技術(shù)描述于一些通?？色@得的綜述中(參見(jiàn)，例如，HobbsinMcGrawHillYearbookofScienceandTechnologypp191-196(1992))。昆蟲(chóng)系統(tǒng)也可用于表達(dá)目標(biāo)多肽。例如，在一個(gè)這樣的系統(tǒng)中，苜蓿銀紋夜蛾(Autographacalifornica)核多角體病毒(AcNPV)被用作載體來(lái)表達(dá)草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)細(xì)胞或粉紋夜蛾幼蟲(chóng)(Trichoplusialarvae)中的外源基因。編碼該多肽的序列可被克隆進(jìn)入病毒的非必需區(qū)，例如多角體蛋白基因，并置于多角體蛋白啟動(dòng)子的控制下。該多肽編碼序列的成功插入將使該多角體蛋白基因失活，并生成缺乏外殼蛋白的重組病毒。該重組病毒可隨后用于感染，例如，可表達(dá)目標(biāo)多肽的草地夜蛾細(xì)胞或粉紋夜蛾幼蟲(chóng)(Engelhard等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91：3224-3227(1994))。在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，通常可獲得一些基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)。例如，當(dāng)采用腺病毒作為表達(dá)載體時(shí)，可將編碼感興趣的多肽的序列連接進(jìn)入由晚期啟動(dòng)子和三聯(lián)前導(dǎo)序列組成的腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯復(fù)合物。在病毒基因組的非必需E1區(qū)和E3區(qū)中的插入可用于獲得能在感染宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)多肽的活病毒(Logan＆Shenk，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81：3655-3659(1984))。此外，轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子例如勞斯肉瘤病毒(RSV)增強(qiáng)子，可用于增強(qiáng)哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中的表達(dá)。用腺病毒載體進(jìn)行工作的方法和方案綜述于Wold，AdenovirusMethodsandProtocols，1998。有關(guān)腺病毒載體用途的其它參考可參見(jiàn)Adenovirus：AMedicalDictionary，Bibliography，andAnnotatedResearchGuidetoInternetReferences，2004。特定的起始信號(hào)也可用于實(shí)現(xiàn)編碼目標(biāo)多肽的序列的更有效翻譯。這類(lèi)信號(hào)包括ATG起始密碼子和鄰近序列。當(dāng)序列編碼該多肽時(shí)，其起始密碼子和上游序列被插入合適的表達(dá)載體，可無(wú)需另外的轉(zhuǎn)錄或翻譯控制信號(hào)。然而，當(dāng)僅插入了編碼序列或其部分時(shí)，應(yīng)當(dāng)提供包含ATG起始密碼子的外源性翻譯控制信號(hào)。此外，該起始密碼子應(yīng)當(dāng)位于正確的閱讀框內(nèi)以確保整個(gè)插入物的翻譯。外源性翻譯元件和起始密碼子可來(lái)自天然和合成的各種來(lái)源?？赏ㄟ^(guò)包含適用于所用的特定細(xì)胞系統(tǒng)的增強(qiáng)子來(lái)增強(qiáng)表達(dá)效力，該增強(qiáng)子如描述于文獻(xiàn)中的那些(Scharf.等人，ResultsProbl.CellDiffer.20：125-162(1994))。此外，可選擇宿主細(xì)胞菌株的調(diào)節(jié)插入序列表達(dá)或者以所需方式加工表達(dá)蛋白的能力。這些多肽的修飾包括，但不限于，乙?；Ⅳ然?、糖基化、磷酸化、酯化和?；?。裂解該蛋白的“prepro”形式的翻譯后加工也可用于促進(jìn)正確插入、折疊和/或功能。不同的宿主細(xì)胞細(xì)胞(例如，CHO、HeLa、MDCK、HEK293和WI38)對(duì)該種翻譯后活動(dòng)具有特定的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和特征機(jī)制，可經(jīng)選擇以確保該外源蛋白的正確修飾和加工。通常優(yōu)選穩(wěn)定表達(dá)以進(jìn)行重組蛋白的長(zhǎng)期高產(chǎn)量生產(chǎn)。例如，穩(wěn)定表達(dá)目標(biāo)多核苷酸的細(xì)胞系可用表達(dá)載體轉(zhuǎn)化，該表達(dá)載體可能包含病毒復(fù)制起點(diǎn)和/或外源性表達(dá)元件以及在相同或不同載體上的選擇性標(biāo)記基因。在導(dǎo)入載體后，可將細(xì)胞在富集培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1-2天，然后轉(zhuǎn)入選擇性培養(yǎng)基。該選擇性標(biāo)記的目的在于賦予對(duì)選擇的耐受性，其存在允許成功表達(dá)該導(dǎo)入序列的細(xì)胞的生長(zhǎng)和回收。穩(wěn)定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的耐受性克隆可采用適于該細(xì)胞類(lèi)型的組織培養(yǎng)技術(shù)增殖。任意數(shù)量的選擇系統(tǒng)可用于回收轉(zhuǎn)化細(xì)胞系。這些選擇系統(tǒng)包括，但不限于，可分別應(yīng)用于tk.sup.-或aprt.sup-細(xì)胞的單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，Cell11：223-32(1977))和腺嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Lowy等人，Cell22：817-23(1990))基因。此外，抗代謝產(chǎn)物、抗生素或除草劑抗性可用作選擇的基礎(chǔ)；例如，賦予對(duì)氨甲喋呤的抗性的dhfr(Wigler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77：3567-70(1980))；賦予對(duì)氨基糖苷類(lèi)、新霉素和G-418的抗性的npt(Colbere-Garapin等人，J.Mol.Biol.150：1-14(1981))；以及分別賦予對(duì)氯磺隆(chlorsulfuron)和膦絲菌素乙?；D(zhuǎn)移酶的抗性的als和pat(Murry，同上文)。其它的可選擇基因已有描述，例如，trpB，其允許細(xì)胞利用吲哚來(lái)代替色氨酸，或者h(yuǎn)isD，其允許細(xì)胞利用組氨醇來(lái)代替組氨酸(Hartman＆Mulligan，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：8047-51(1988))。最近，可見(jiàn)標(biāo)記的使用已經(jīng)得到普及，其中這些標(biāo)記物如花青素、β-葡糖醛酸酶及其底物GUS以及螢光素酶及其底物螢光素不僅被廣泛用于識(shí)別轉(zhuǎn)化體，還被廣泛用于對(duì)由特定載體系統(tǒng)得到的瞬時(shí)或穩(wěn)定蛋白表達(dá)進(jìn)行定量(Rhodes等人，MethodsMol.Biol.55：121-131(1995))。盡管標(biāo)記基因表達(dá)的存在/缺失表明目標(biāo)基因也存在，它的存在和表達(dá)可能需要確認(rèn)。例如，如果編碼多肽的序列被插入標(biāo)記基因序列內(nèi)，包含序列的重組細(xì)胞可通過(guò)標(biāo)記基因功能的缺失進(jìn)行鑒定。替代性地，標(biāo)記基因可與多肽編碼序列在單個(gè)啟動(dòng)子的控制下串聯(lián)。該標(biāo)記基因響應(yīng)誘導(dǎo)或選擇的表達(dá)通常還指示了該串聯(lián)基因的表達(dá)。替代性地，包含和表達(dá)所需多核苷酸序列的宿主細(xì)胞可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種方法進(jìn)行鑒別。這些方法包括，但不限于，DNA-DNA或DNA-RNA雜交和蛋白生物測(cè)定或免疫測(cè)定技術(shù)，其包括用于核酸或蛋白的檢測(cè)和/或定量的基于膜、溶液或芯片的技術(shù)。本領(lǐng)域已知采用特異性針對(duì)多核苷酸編碼產(chǎn)物的多克隆或單克隆抗體檢測(cè)和測(cè)量該產(chǎn)物表達(dá)的各種方案。實(shí)施例包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)、放射免疫測(cè)定(RIA)和熒光激活細(xì)胞分類(lèi)(FACS)。在一些應(yīng)用中優(yōu)選采用對(duì)在給定多肽上的兩個(gè)非干擾表位具有活性的單克隆抗體的二位的、基于單克隆的免疫測(cè)定，但也可采用競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定。這些和其它測(cè)定描述于，其中包括，Hampton等人，SerologicalMethods，aLaboratoryManual(1990)和Maddox等人，J.Exp.Med.158：1211-1216(1983)。各種標(biāo)記和結(jié)合技術(shù)已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，并可用于各種核酸和氨基酸測(cè)定。生成用于檢測(cè)與多核苷酸相關(guān)的序列的標(biāo)記的雜交或PCR探針的方法包括低聚標(biāo)記、切口平移、末端標(biāo)記或采用標(biāo)記核苷酸的PCR擴(kuò)增。替代性地，該序列或其任意部分可被克隆進(jìn)入載體以生成mRNA探針。該載體在本領(lǐng)域已知，并且已有市售，其可用于通過(guò)添加合適的RNA聚合酶例如T7、T3或SP6以及標(biāo)記的核苷酸體外合成RNA探針。這些方法可采用各種市售的試劑盒進(jìn)行?？梢允褂玫暮线m的報(bào)道分子或標(biāo)記包括放射性核素、酶、熒光的、化學(xué)發(fā)光的或者生色的試劑以及底物、輔因子、抑制劑、磁性顆粒等。用目標(biāo)多核苷酸序列轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞可在適于蛋白從細(xì)胞培養(yǎng)物中表達(dá)和回收的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)所用的序列和/或載體，通過(guò)重組細(xì)胞生成的蛋白可被分泌或包含在胞內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員將能理解，包含多核苷酸的表達(dá)載體可被設(shè)計(jì)為包含信號(hào)序列，該信號(hào)序列引導(dǎo)編碼的多肽通過(guò)原核或真核細(xì)胞膜分泌。其它重組構(gòu)建體可用于將編碼目標(biāo)多肽的序列連接至編碼能促進(jìn)可溶性蛋白純化的多肽結(jié)構(gòu)域的核苷酸序列。該種有助純化的結(jié)構(gòu)域包括，但不限于，金屬鰲合肽(例如允許在固定化金屬上純化的組氨酸-色氨酸模塊，允許在固定化免疫球蛋白上純化的蛋白A結(jié)構(gòu)域，以及在FLAGS伸展/親和純化系統(tǒng)使用的結(jié)構(gòu)域(ImmunexCorp，SeattleWash.))。在該純化結(jié)構(gòu)域和編碼多肽之間包含的可裂解接頭序列例如特異性針對(duì)XA因子或腸激酶(Invitrogen.SanDiego，Calif.)可用于促進(jìn)純化。一種該類(lèi)表達(dá)載體提供了包含目標(biāo)多肽和在硫氧還蛋白或腸激酶裂解位點(diǎn)之前的核酸編碼6個(gè)組氨酸殘基的融合蛋白的表達(dá)。該組氨酸殘基促進(jìn)了如Porath等人，Prot.Exp.Purif.3：263-281(1992)所述的在IMIAC(固定化金屬親和層析)上的純化，該腸激酶裂解位點(diǎn)提供了從該融合蛋白純化所需多肽的方法。Kroll等人，DNACellBiol.12：441-453(1993))提供了包含融合蛋白的載體的討論。體內(nèi)多核苷酸傳遞技術(shù)在另外的實(shí)施方式中，包含本發(fā)明的一種或多種多核苷酸的遺傳構(gòu)建體被體內(nèi)導(dǎo)入細(xì)胞。這可通過(guò)本領(lǐng)域公知的任意多種技術(shù)實(shí)現(xiàn)，下文概述了其中一些技術(shù)以進(jìn)行說(shuō)明。1.腺病毒用于體內(nèi)傳遞一種或多種核酸序列的優(yōu)選方法中的一種包括使用腺病毒表達(dá)載體?！跋俨《颈磉_(dá)載體”意在包括如下構(gòu)建體，該構(gòu)建體包含了足以(a)支持構(gòu)建體的包裝和(b)以正義和反義方向表達(dá)已經(jīng)克隆在構(gòu)建體中的多核苷酸的腺病毒序列。當(dāng)然，在反義構(gòu)建體方面，表達(dá)不需要該基因產(chǎn)物被合成。該表達(dá)載體包含腺病毒的遺傳工程改造的形式。有關(guān)腺病毒，一種36kb的線性雙鏈DNA病毒的遺傳結(jié)構(gòu)的知識(shí)允許用高達(dá)7kb的外源序列置換大部分的腺病毒DNA(Grunhaus＆Horwitz，1992)。與逆轉(zhuǎn)錄病毒不同，宿主細(xì)胞的腺病毒感染并不導(dǎo)致染色體整合，因?yàn)橄俨《綝NA可以游離方式復(fù)制而沒(méi)有潛在的基因毒性。此外，腺病毒是結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的，且在廣泛擴(kuò)增后未檢測(cè)到基因組重排。腺病毒可實(shí)際感染所有上皮細(xì)胞，而與其細(xì)胞周期階段無(wú)關(guān)。目前為止，腺病毒感染似乎僅與輕微的疾病有關(guān)(例如人的急性呼吸道疾病)。腺病毒特別適合用作基因轉(zhuǎn)移載體，因?yàn)樗哂兄械却笮〉幕蚪M、容易操作、高效價(jià)、廣泛的靶細(xì)胞范圍以及高傳染性。病毒基因組的兩端均含有100-200堿基對(duì)反向重復(fù)(ITRs)，它們是病毒DNA復(fù)制和包裝所必需的順式元件?；蚪M的早期(E)和晚期(L)區(qū)包含了被病毒DNA復(fù)制的起始所分開(kāi)的不同轉(zhuǎn)錄單元。E1區(qū)(E1A和E1B)編碼負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)病毒基因組和少量細(xì)胞基因的轉(zhuǎn)錄的蛋白。E2區(qū)(E2A和E2B)區(qū)的表達(dá)導(dǎo)致用于病毒DNA復(fù)制的蛋白的合成。這些蛋白涉及DNA復(fù)制、晚期基因表達(dá)和宿主細(xì)胞關(guān)閉(Renan，1990)。晚期基因的產(chǎn)物(包括大部分病毒衣殼蛋白)僅在主要的晚期啟動(dòng)子(MLP)形成的單個(gè)主要轉(zhuǎn)錄物的重要加工后表達(dá)。MLP(位于16.8m.u.)在感染晚期特別有效，從該啟動(dòng)子形成的所有mRNA具有5‘-三聯(lián)前導(dǎo)(TPL)序列，這使得它們成為翻譯的優(yōu)選mRNA。在當(dāng)前的系統(tǒng)中，重組腺病毒是從穿梭載體和前病毒載體之間的同源重組生成的。由于兩個(gè)前病毒載體之間可能的重組，可從該過(guò)程生成野生型的腺病毒。因此，重要的是從單個(gè)噬菌斑分離單個(gè)的病毒克隆，并檢驗(yàn)其基因組結(jié)構(gòu)。目前復(fù)制缺陷性的腺病毒載體的生成和繁殖取決于代號(hào)293的獨(dú)特的輔助細(xì)胞系，它是通過(guò)Ad5DNA片段和組成表達(dá)E1蛋白由人胚胎腎細(xì)胞轉(zhuǎn)化得到(Graham等人，1977)。由于E3區(qū)在腺病毒基因組中是非必需的(Jones＆Shenk，1978)，目前的腺病毒載體在293細(xì)胞的幫助下攜帶E1、D3或兩個(gè)區(qū)中的外源DNA(Graham＆Prevec，1991)。腺病毒在性質(zhì)上可以包裝約105％的野生型基因組(Ghosh-Choudhury等人，1987)，提供約額外2kBDNA的容量。結(jié)合E1和E3區(qū)中約5.5kB的可置換DNA，目前的腺病毒載體的最大容量在7.5kB以下，或者是載體總長(zhǎng)的約15％。超過(guò)80％的腺病毒的病毒基因組保留在載體骨架中，并且是載體攜帶的細(xì)胞毒性的來(lái)源。此外，E1-缺失病毒的復(fù)制缺陷是不完整的。例如，在高多重性感染(MOI)下現(xiàn)有載體中觀察到了病毒基因表達(dá)的遺漏(Mulligan，1993)。輔助細(xì)胞系可來(lái)自于人胚胎腎細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、造血細(xì)胞或其它人胚胎間充質(zhì)或上皮細(xì)胞等人類(lèi)細(xì)胞。替代性地，該輔助細(xì)胞可來(lái)自于人腺病毒允許的其它哺乳動(dòng)物種類(lèi)的細(xì)胞。這些細(xì)胞包括，例如，Vero細(xì)胞或其它猴胚胎間充質(zhì)或上皮細(xì)胞。如上所述，目前優(yōu)選的輔助細(xì)胞系是293。Racher等人(1995)披露了培養(yǎng)293細(xì)胞和繁殖腺病毒的改良方法。在一種形式下，可通過(guò)將單個(gè)細(xì)胞接種進(jìn)入含100-200ml培養(yǎng)基的1升硅化轉(zhuǎn)瓶(Techne，Cambridge，UK)中生長(zhǎng)天然細(xì)胞聚集物。在40rpm下攪拌后，用臺(tái)盼藍(lán)評(píng)估細(xì)胞活性。在另一形式中，F(xiàn)ibra-Cel微載體(BibbySterlin，Stone，UK)(5g/l)按如下應(yīng)用。將重新懸浮于5ml培養(yǎng)基的細(xì)胞接種物添加至250mlErlenmeyer燒瓶中的載體(50ml)并靜置，偶爾攪拌，持續(xù)1至4小時(shí)。然后用50ml新鮮培養(yǎng)基更換該培養(yǎng)基并開(kāi)始振蕩。為了生成病毒，將細(xì)胞生長(zhǎng)至約80％匯合，然后更換培養(yǎng)基(至25％的終體積)，并以0.05的MOI添加腺病毒。將培養(yǎng)物靜置過(guò)夜，然后將體積增加至100％，并開(kāi)始振蕩另外72小時(shí)。除了該腺病毒載體是復(fù)制缺陷型或者至少條件性缺陷的要求之外，腺病毒載體的性質(zhì)對(duì)于本發(fā)明成功實(shí)施并不認(rèn)為是關(guān)鍵的。腺病毒可以是42種不同的已知血清型或亞組A-F的任意一種。亞組C的5型腺病毒是優(yōu)選的起始材料，以獲得用于本發(fā)明的條件性復(fù)制缺陷型腺病毒載體，因?yàn)?型腺病毒是人腺病毒，人們已知有關(guān)于它的大量生化和遺傳信息，且已經(jīng)被歷史性地用于以腺病毒為載體的大多數(shù)構(gòu)建體中。如上所述，根據(jù)本發(fā)明的典型載體是復(fù)制缺陷型的，且不具有腺病毒E1區(qū)。因此，可極為方便地將編碼目標(biāo)基因的多核苷酸導(dǎo)入該E1-編碼序列被去除的位置。然而，該構(gòu)建體在腺病毒序列內(nèi)的插入位置對(duì)于本發(fā)明而言并非關(guān)鍵。編碼目標(biāo)基因的多核苷酸也可被插入Karlsson等人(1986)所述的E3替換載體中替代缺失的E3區(qū)或者插入輔助細(xì)胞系或輔助病毒與E4缺陷互補(bǔ)的E4區(qū)。腺病毒易于生長(zhǎng)和操作，并顯示了廣泛的體外和體內(nèi)宿主范圍。該組病毒可以高效價(jià)獲得，例如109-1011噬菌斑形成單位/ml，且它們具有高感染性。腺病毒的生命周期不要求整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組。由腺病毒載體傳遞的外源基因是游離的，且因此對(duì)于宿主細(xì)胞具有低基因毒性。在用野生型腺病毒接種的研究中未有副作用的報(bào)導(dǎo)(Couch等人，1963；Top等人，1971)，證明了它們作為體內(nèi)基因傳遞載體的安全性和治療潛力。腺病毒載體已用于真核基因表達(dá)(Levrero等人，1991；Gomez-Foix等人，1992)和疫苗開(kāi)發(fā)(Grunhaus＆Horwitz，1992；Graham＆Prevec，1992)。最近，動(dòng)物研究顯示，重組腺病毒可用于基因療法(Stratfbrd-Perricaudet＆Perricaudet，1991；Stratford-Perricaudet等人，1990；Rich等人，1993)。向不同組織施用重組腺病毒的研究包括氣管滴注(Rosenfeld等人，1991；Rosenfeld等人，1992)、肌肉注射(Ragot等人，1993)、外周靜脈注射(Herz＆Gerard，1993)以及立體定向接種至腦中(LeGalLaSalle等人，1993)。腺病毒載體可來(lái)源于人腺病毒。替代性地，它們可來(lái)源于其它物種的腺病毒，例如，黑猩猩，其可具有一定優(yōu)勢(shì)，即該病毒載體不會(huì)被針對(duì)許多人類(lèi)對(duì)象體內(nèi)循環(huán)的人腺病毒的抗體所中和(參見(jiàn)，例如：TatsisN等人GeneTherapy200613：421-429)。35型腺病毒相對(duì)不常見(jiàn)，因此它們對(duì)于載體本身具有低水平的預(yù)存免疫，且已被用作正在開(kāi)發(fā)中的某些結(jié)核病疫苗的傳遞系統(tǒng)(參見(jiàn)，例如，Radosevic等人InfectionandImmunity200775(8)：4105-4115)。35型腺病毒在本發(fā)明中作為傳遞載體也具有特定的價(jià)值。2.逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄病毒是一組單鏈RNA病毒，其特征在于通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程在感染細(xì)胞內(nèi)將它們的RNA轉(zhuǎn)化為雙鏈DNA的能力(Coffin，1990)。然后所得的DNA作為前病毒穩(wěn)定地整合進(jìn)入細(xì)胞染色體并引導(dǎo)病毒蛋白的合成。該整合導(dǎo)致病毒基因序列保留在接受者細(xì)胞及其后代中。該逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包含三個(gè)基因，gag、pol和env，其分別編碼衣殼蛋白、聚合酶和包膜成分。在gag基因上游發(fā)現(xiàn)的序列包含了將基因組包裝進(jìn)入病毒體的信號(hào)。兩個(gè)長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)序列存在于病毒基因組的5’和3’末端。它們包含強(qiáng)啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列，且也為宿主細(xì)胞基因組的整合所需(Coffin，1990)。為了構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，編碼一種或多種目標(biāo)寡核苷酸或多核苷酸序列的核酸被插入病毒基因組中某些病毒序列的位置，以生成具有復(fù)制缺陷的病毒。為了生成病毒體，構(gòu)建了包含gag、po1和env基因但不包含LTR和包裝成分的包裝細(xì)胞系(Mann等人，1983)。當(dāng)包含cDNA以及逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR和包裝序列的重組質(zhì)粒被導(dǎo)入該細(xì)胞系時(shí)(例如通過(guò)磷酸鈣沉淀導(dǎo)入)，該包裝序列允許該重組質(zhì)粒的RNA轉(zhuǎn)錄物被包裝進(jìn)入病毒顆粒，后者可隨后分泌進(jìn)入培養(yǎng)基(Nicolas＆Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等人，1983)。然后收集包含重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)基，任選地進(jìn)行濃縮，并用于基因轉(zhuǎn)移。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠感染各種各樣的細(xì)胞類(lèi)型。然而，整合和穩(wěn)定表達(dá)需要宿主細(xì)胞的分裂(Paskind等人，1975)。最近已開(kāi)發(fā)設(shè)計(jì)用于允許特異性靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的新型方法，該方法基于通過(guò)向該病毒包膜化學(xué)添加乳糖殘基對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行化學(xué)修飾。該修飾可允許通過(guò)唾液酸糖蛋白受體特異性感染肝細(xì)胞。還設(shè)計(jì)了靶向重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的不同方法，其中使用了針對(duì)逆轉(zhuǎn)錄病毒包膜蛋白和針對(duì)特異性細(xì)胞受體的生物素化抗體。該抗體通過(guò)采用鏈霉親和素與生物素成分偶聯(lián)(Roux等人，1989)。采用針對(duì)主要組織相容性復(fù)合物I或II類(lèi)抗原的抗體，它們證明了親嗜性病毒對(duì)攜帶這些表面抗原的各種人細(xì)胞的體外感染(Roux等人，1989)。3.腺相關(guān)病毒AAV(Ridgeway，1988；Hermonat＆Muzycska，1984)是一種細(xì)小病毒，其作為腺病毒儲(chǔ)藏中的污染被發(fā)現(xiàn)。它是一種未與任何疾病關(guān)聯(lián)的獨(dú)特病毒(85％US人群中存在抗體)。它還被分類(lèi)為依賴(lài)病毒，因?yàn)樗膹?fù)制依賴(lài)于輔助病毒(例如腺病毒)的存在。已分離出五種血清型，其中AAV-2得到了最好的鑒定。AAV具有單鏈線性DNA，其被衣殼化進(jìn)入衣殼蛋白VP1、VP2和VP3，以形成直徑為20-24nm的二十面體病毒體(Muzyczka＆McLaughlin，1988)。AAVDNA大約為4.7千堿基長(zhǎng)。它包含兩個(gè)閱讀框，并且側(cè)翼有兩個(gè)ITR。在AAV基因組中有兩個(gè)主要的基因：rep和cap。rep基因編碼負(fù)責(zé)病毒復(fù)制的蛋白，而cap編碼衣殼蛋白VP1-3。每個(gè)ITR形成T-形發(fā)夾結(jié)構(gòu)。這些末端重復(fù)為染色體整合唯一必需的AAV順式元件。因此，AAV可被用作載體，該載體去除了所有病毒編碼序列并由用于傳遞的基因盒取代。已鑒定了三個(gè)病毒啟動(dòng)子，并根據(jù)它們的圖譜位置命名為p5、p19和p40。p5和p19的轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致了rep蛋白的生成，p40的轉(zhuǎn)錄生成衣殼蛋白(Hermonat＆Muzyczka，1984)。有多個(gè)因素激發(fā)研究人員研究以rAAV作為表達(dá)載體的可能性。其中一個(gè)因素是傳遞基因以整合進(jìn)入宿主染色體的要求令人吃驚的少。其必須有145-bpITR，這僅是AAV基因組的6％。這為在載體中裝配4.5-kbDNA插入物提供了空間。盡管這種攜帶能力可能阻止AAV傳遞大的基因，它十分適于傳遞反義構(gòu)建體。由于其安全性，AAV也是傳遞載體的良好選擇。存在一種相對(duì)復(fù)雜的援救機(jī)制：移動(dòng)rAAV不僅需要野生型腺病毒，還需要AAV基因。同樣地，AAV不具有病原性，并且不與任何疾病相關(guān)。病毒編碼序列的去除使得對(duì)病毒基因表達(dá)的免疫反應(yīng)最小化，因此，rAAV不會(huì)激發(fā)炎癥反應(yīng)。4.作為表達(dá)構(gòu)建體的其它病毒載體其它的病毒載體可在本發(fā)明中用作表達(dá)構(gòu)建體以將寡核苷酸或多核苷酸序列傳遞至宿主細(xì)胞?？刹捎脧呐６徊《?Ridgeway，1988；Coupar等人，1988)、慢病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒和皰疹病毒等病毒衍生的載體。其它的痘病毒衍生載體，例如雞痘衍生載體，也預(yù)期可被使用。它們提供了對(duì)于各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞的多個(gè)具有吸引力的特征(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；Coupar等人，1988；Horwich等人，1990)。隨著最近對(duì)缺陷型肝炎B病毒的認(rèn)識(shí)，對(duì)于不同病毒序列的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系已經(jīng)有了新的認(rèn)識(shí)。體外研究顯示，即使刪除了基因組的多達(dá)80％，該病毒仍能保留輔助依賴(lài)性包裝和反轉(zhuǎn)錄的能力(Horwich等人，1990)。這提示了該基因組的大部分可被外源性遺傳材料替換。嗜肝性和持續(xù)性(整合)對(duì)于肝定向基因轉(zhuǎn)移而言是特別有吸引力的特性。Chang等人(1991)將氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因?qū)滕喐窝譈病毒基因組中聚合酶、表面和前表面(pre-surface)編碼序列處。它與野生型病毒共轉(zhuǎn)柒進(jìn)入鳥(niǎo)類(lèi)肝癌細(xì)胞系。包含高效價(jià)重組病毒的培養(yǎng)基用于感染原始小鴨肝細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后至少24天檢測(cè)到了穩(wěn)定的CAT基因表達(dá)(Chang等人，1991)。另外的“病毒”載體包括類(lèi)病毒顆粒(VLPs)和噬菌體。5.非病毒載體為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的寡核苷酸或多核苷酸序列的表達(dá)，該表達(dá)構(gòu)建體必須被傳遞進(jìn)入細(xì)胞。該傳遞可如在轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)室步驟中在體外實(shí)現(xiàn)，或者如某些疾病階段的治療在體內(nèi)或離體實(shí)現(xiàn)。如上所述，一種優(yōu)選的用于傳遞的機(jī)制是通過(guò)病毒感染，其中該表達(dá)構(gòu)建體被包裝進(jìn)入感染性病毒顆粒中。一旦該表達(dá)構(gòu)建體被傳遞進(jìn)入細(xì)胞，編碼所需寡核苷酸或多核苷酸序列的核酸可在不同的位置定位和表達(dá)。在某些實(shí)施方式中，編碼該構(gòu)建體的核酸可被穩(wěn)定整合進(jìn)入該細(xì)胞的基因組中。這種整合可通過(guò)同源性重組(基因替換)特定地定位和定向或者可整合進(jìn)入隨機(jī)的非特異性位置(基因增強(qiáng))。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，該核酸可作為單獨(dú)的附加型DNA片段被穩(wěn)定維持在細(xì)胞中。這些核酸片段或“附加體”編碼足以允許獨(dú)立于宿主細(xì)胞周期或與宿主細(xì)胞周期同步的維持和復(fù)制的序列。表達(dá)構(gòu)建體如何傳遞進(jìn)入細(xì)胞和該核酸在細(xì)胞內(nèi)的位置取決于所用的表達(dá)構(gòu)建體的類(lèi)型。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，包含一個(gè)或多個(gè)寡核苷酸或多核苷酸序列的表達(dá)構(gòu)建體可由裸重組DNA或質(zhì)粒簡(jiǎn)單組成。該構(gòu)建體的傳遞可通過(guò)，例如，物理或化學(xué)透過(guò)細(xì)胞膜的任意方法實(shí)施。這特別適用于體外傳遞，但也可用于體內(nèi)傳遞。Dubensky等人(1984)以磷酸鈣沉淀的形式成功地將多瘤病毒DNA注入了成年和新生小鼠的肝和脾，顯示了活性病毒復(fù)制和急性感染。Benvenisty＆Reshef(1986)還證實(shí)了直接腹腔內(nèi)注射磷酸鈣沉淀質(zhì)粒導(dǎo)致轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)?？梢灶A(yù)期編碼目標(biāo)基因的DNA也可以類(lèi)似方式體內(nèi)傳遞并表達(dá)基因產(chǎn)物。用于將裸DNA表達(dá)構(gòu)建體傳遞進(jìn)入細(xì)胞的本發(fā)明的另一實(shí)施方式可包括粒子轟擊。該方法取決于將DNA-包被的微粒加速至高速以允許它們穿透細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞而不殺傷細(xì)胞的能力(Klein等人，1987)。已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種用于加速小顆粒的裝置。其中一種這樣的裝置依靠高壓放電生成電流，并進(jìn)而提供推動(dòng)力(Yang等人，1990)。所用的微粒包含生物惰性物質(zhì)如鎢或金珠。所選的器官包括已經(jīng)被體內(nèi)轟擊的大鼠和小鼠的肝、皮膚和肌肉組織(Yang等人，1990；Zelenin等人，1991)。這可能要求手術(shù)暴露該組織或細(xì)胞，以消除槍和靶器官之間的任何干擾組織，即，離體處理。又，編碼特定基因的DNA可通過(guò)該方法被傳遞并仍然被引入。細(xì)菌也可用作傳遞方法(例如，李斯特菌，參見(jiàn)WO2004/11048)，特別是BCG。多肽組合物在其它方面，本發(fā)明提供了多肽組合物。一般地，本發(fā)明的多肽是分離多肽(即，與其通常發(fā)現(xiàn)天然伴隨的那些成分相分離)。例如，當(dāng)與天然系統(tǒng)中部分或所有共存物質(zhì)相分離時(shí)，天然存在的蛋白是分離的。優(yōu)選地，該種多肽的純度為至少約90％，更優(yōu)選至少約95％，最優(yōu)選至少約99％。當(dāng)例如多核苷酸被克隆進(jìn)入并非天然環(huán)境一部分的載體時(shí)，該多核苷酸被認(rèn)為是分離的。多肽可通過(guò)各種公知技術(shù)中的任意一種制備。由上述DNA序列編碼的重組多肽可利用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的各種表達(dá)載體中的任意一種由該DNA序列容易地制備。表達(dá)可在以包含了編碼重組多肽的DNA分子的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的任意合適宿主細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)。合適的宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞、酵母和更高級(jí)的真核細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞。優(yōu)選地，所用的宿主細(xì)胞為大腸桿菌、酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞系如COS或CHO。來(lái)自于將重組蛋白或多肽分泌進(jìn)入培養(yǎng)基的合適宿主/載體系統(tǒng)的上清液可首先通過(guò)已有市售的過(guò)濾器濃縮。濃縮后，該濃縮物可被應(yīng)用至合適的純化基質(zhì)如親和基質(zhì)或離子交換樹(shù)脂。最后，可采用一個(gè)或多個(gè)反相HPLC步驟來(lái)進(jìn)一步純化重組多肽。本發(fā)明的多肽、其免疫原性片段以及其它的變體具有小于約100個(gè)氨基酸，且通常小于約50個(gè)氨基酸，并且還能利用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的技術(shù)采用合成手段生成。例如，這些多肽可采用市售的固相技術(shù)的任意一種合成，例如Merrifield固相合成法，其中氨基酸被順序添加至生長(zhǎng)中的氨基酸鏈。參見(jiàn)Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2146(1963)。自動(dòng)化合成多肽的設(shè)備可從如PerkinElmer/AppliedBioSystemsDivision(FosterCity，CA)等供應(yīng)商處購(gòu)得，并可參照生產(chǎn)商的說(shuō)明進(jìn)行操作。在某些特定實(shí)施方式中，多肽可以是包含多個(gè)本文所述的多肽的融合蛋白，或者是包含至少一個(gè)本文所述的多肽和一個(gè)不相關(guān)序列的融合蛋白，該種蛋白的范例包括破傷風(fēng)、結(jié)核病和肝炎蛋白(參見(jiàn)，例如，Stoute等人，NewEngl.J.Med.336：86-91(1997))。融合伙伴可以，例如，協(xié)助提供T輔助表位(免疫原性融合伙伴)，優(yōu)選為被人識(shí)別的T輔助表位，或者可協(xié)助以比天然重組蛋白更高的產(chǎn)率表達(dá)該蛋白(表達(dá)增強(qiáng)子)。某些優(yōu)選的融合伙伴既是免疫原性的也是表達(dá)增強(qiáng)的融合伙伴?？蛇x擇其它的融合伙伴，以增強(qiáng)該蛋白的溶解度或者使該蛋白靶向所需的胞內(nèi)區(qū)室。其它進(jìn)一步的融合伙伴包括親和標(biāo)記，其促進(jìn)該蛋白的純化。融合蛋白通?？刹捎冒ɑ瘜W(xué)綴合的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備。優(yōu)選地，融合蛋白作為重組蛋白表達(dá)，允許在表達(dá)系統(tǒng)中相對(duì)于非融合蛋白以更高水平生成。簡(jiǎn)言之，編碼該多肽成分的DNA序列可被單獨(dú)裝配，并連接進(jìn)入合適的表達(dá)載體。編碼一個(gè)多肽成分的DNA序列的3’端經(jīng)過(guò)或不經(jīng)過(guò)肽接頭被連接至編碼第二多肽成分的DNA序列的5’端，使得該序列的閱讀框架協(xié)調(diào)(inphase)。這允許翻譯成為保留了兩種成分多肽的生物活性的單個(gè)融合蛋白。肽接頭序列可用于通過(guò)足以確保每個(gè)多肽能折疊成為其二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的距離來(lái)分隔該第一和第二多肽成分。該種肽接頭序列通過(guò)本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)被結(jié)合進(jìn)入融合蛋白。合適的肽接頭序列可根據(jù)如下因素選擇：(1)它們采用靈活延伸構(gòu)象的能力；(2)不會(huì)形成與第一和第二多肽的功能性表位相互作用的二級(jí)結(jié)構(gòu)；以及(3)不具有可能與多肽功能性表位相互反應(yīng)的疏水或帶電殘基。優(yōu)選的肽接頭序列包含Gly、Asn和Ser殘基。其它接近中性的氨基酸，例如Thr和Ala也可用于接頭序列。有可能用作接頭的氨基酸序列包括披露于Maratea等人，Gene40：39-46(1985)；Murphy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83：8258-8262(1986)；美國(guó)專(zhuān)利4,935,233和美國(guó)專(zhuān)利4,751，180中的那些。接頭序列的長(zhǎng)度通?？蔀?至約50個(gè)氨基酸。當(dāng)?shù)谝缓偷诙嚯木哂锌捎糜诜指艄δ芙Y(jié)構(gòu)域和防止空間干擾的非必需N末端氨基酸區(qū)時(shí)，不要求有接頭序列。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，免疫原性融合伙伴來(lái)自于蛋白D，這是一種革蘭氏陰性菌B型流感嗜血桿菌的表面蛋白(WO91/18926)。優(yōu)選地，蛋白D衍生物包含了該蛋白的約首三分之一(例如，N末端首100-110氨基酸)，且蛋白D衍生物可被脂化。在某些優(yōu)選的實(shí)施方式中，脂蛋白D融合伙伴的首109個(gè)殘基被包括在N末端以提供具有另外的外源性T細(xì)胞表位的多肽并提高在大腸桿菌中的表達(dá)水平(因此被用作表達(dá)增強(qiáng)子)。脂質(zhì)尾端確保了對(duì)抗原呈遞細(xì)胞最好的抗原呈遞。其它的融合伙伴包括來(lái)自流感病毒NS1(血凝素蛋白)的非結(jié)構(gòu)性蛋白。典型地，可采用N末端81個(gè)氨基酸，盡管可采用包括了T輔助表位的不同片段。在另一實(shí)施方式中，該免疫原性融合伙伴是已知為L(zhǎng)YTA或其部分(優(yōu)選C末端部分)的蛋白。LYTA來(lái)自于肺炎鏈球菌，其合成已知為酰胺酶LYTA的N-乙酰基-L-丙氨酸酰胺酶(由LytA基因編碼；Gene43：265-292(1986))。LYTA是一種特異性降解肽聚糖骨架中的某些鍵的自溶素。LYTA蛋白的C-末端結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)對(duì)膽堿或?qū)Σ糠帜憠A類(lèi)似物如DEAE的親和性。這種特性已被利用來(lái)開(kāi)發(fā)用于表達(dá)融合蛋白的大腸桿菌C-LYTA表達(dá)質(zhì)粒。在氨基末端包含C-LYTA片段的雜交蛋白的純化已有描述(參見(jiàn)Biotechnology10：795-798(1992))。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，LYTA的重復(fù)部分可被結(jié)合進(jìn)入融合蛋白。重復(fù)部分發(fā)現(xiàn)于C末端區(qū)，起始于殘基178。特別優(yōu)選的重復(fù)部分結(jié)合殘基188-305。T細(xì)胞免疫治療性組合物還可包含，或者替代性地包含，特異性針對(duì)分枝桿菌抗原的T細(xì)胞。該種細(xì)胞通常可采用標(biāo)準(zhǔn)方法在體外或離體制備。例如，T細(xì)胞可采用已有市售的細(xì)胞分離系統(tǒng)，例如可由NexellTherapeutics，Inc.(Irvine，CA)獲得的IsolexTM系統(tǒng)，從患者骨髓、外周血或者骨髓或外周血的部分分離得到(還可參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5,240,856、美國(guó)專(zhuān)利5,215,926、WO89/06280、WO91/16116以及WO92/07243)。替代性地，T細(xì)胞可由相關(guān)或不相關(guān)的人、非人哺乳動(dòng)物、細(xì)胞系或培養(yǎng)物中獲得。T細(xì)胞可以本發(fā)明的多肽、編碼該種多肽的多核苷酸和/或表達(dá)該種多肽的抗原呈遞細(xì)胞(APC)進(jìn)行刺激。在一定條件下進(jìn)行該種刺激并進(jìn)行一段足以允許生成特異性針對(duì)該多肽的T細(xì)胞的時(shí)間。優(yōu)選地，該多肽或多核苷酸存在于傳遞載體中，例如微球體中，從而促進(jìn)特異性T細(xì)胞的生成。當(dāng)T細(xì)胞特異性增殖、分泌細(xì)胞因子或者殺死涂覆該多肽或者表達(dá)編碼該多肽的基因的目標(biāo)細(xì)胞時(shí)，該T細(xì)胞被認(rèn)為特異性針對(duì)本發(fā)明的多肽。T細(xì)胞的特異性可利用多種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)中的任意一種進(jìn)行評(píng)估。例如，在鉻釋放測(cè)定或增殖測(cè)定中，與陰性對(duì)照相比在裂解和/或增殖上超過(guò)兩倍的刺激指數(shù)表示T細(xì)胞特異性。這些測(cè)定可例如，如Chen等人，CancerRes.54：1065-1070(1994))所述實(shí)施。替代性地，T細(xì)胞的增殖的檢測(cè)可通過(guò)多種已知技術(shù)實(shí)現(xiàn)。例如，T細(xì)胞增殖可通過(guò)測(cè)量DNA合成的增加率進(jìn)行檢測(cè)(例如，通過(guò)氚化胸腺嘧啶對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行脈沖標(biāo)記培養(yǎng)并測(cè)量結(jié)合進(jìn)入DNA的氚化胸腺嘧啶的數(shù)量)。與本發(fā)明的多肽(100ng/ml-100μg/ml，優(yōu)選200ng/ml-25μg/ml)接觸3-7天應(yīng)導(dǎo)致T細(xì)胞增殖至少上升兩倍。如上所述接觸2-3小時(shí)應(yīng)導(dǎo)致T細(xì)胞的激活，這可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞因子測(cè)定測(cè)得，其中細(xì)胞因子(例如，TNF或IFN-γ)釋放水平上升兩倍是T細(xì)胞激活的指征(參見(jiàn)Coligan等人，CurrentProtocolsinImmunology，vol.1(1998))。在響應(yīng)多肽、多核苷酸或多肽表達(dá)APC中已被激活的T細(xì)胞可以是CD4+和/或CD8+。蛋白特異性T細(xì)胞可采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)擴(kuò)增。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該T細(xì)胞來(lái)自于患者、相關(guān)供體或不相關(guān)供體，且在刺激和擴(kuò)增后被施用至患者。為治療目的，在響應(yīng)多肽、多核苷酸或APC中增殖的CD4+或CD8+T細(xì)胞可在體外或體內(nèi)大量擴(kuò)增。該種T細(xì)胞的體外增殖可通過(guò)多種方式實(shí)現(xiàn)。例如，該種T細(xì)胞可被重新暴露至多肽，或暴露至對(duì)應(yīng)于該多肽的免疫原性部分的短肽，暴露時(shí)添加或不添加T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，例如，白介素-2，和/或合成多肽的刺激細(xì)胞。替代性地，在該蛋白存在下增殖的一種或多種T細(xì)胞可通過(guò)克隆大量擴(kuò)增?？寺〖?xì)胞的方法已為本領(lǐng)域公知，且包括有限稀釋。藥物組合物在另外的實(shí)施方式中，本文所述的多核苷酸、多肽、T細(xì)胞和/或抗體組合物將在藥學(xué)可接受或生理可接受的溶液中配制，以單獨(dú)或聯(lián)合一種或多種其它治療形式向細(xì)胞或動(dòng)物給藥。還應(yīng)當(dāng)理解，如果需要，表達(dá)本文所述的多肽的核酸片段(例如，RNA或DNA)可與其它試劑以及例如，其它蛋白或多肽或各種藥學(xué)活性試劑，包括有效抗結(jié)核分枝桿菌感染的化療劑聯(lián)合給藥。事實(shí)上，對(duì)可以包含的其它成分實(shí)際上沒(méi)有限制，只要該另外的藥劑在與靶細(xì)胞或宿主組織接觸時(shí)不引起明顯的副作用。該組合物因此可根據(jù)具體實(shí)例中的需求與各種其它試劑一同傳遞。該種組合物可從宿主細(xì)胞或其它生物來(lái)源純化，或者替代性地按本文所述進(jìn)行化學(xué)合成。同樣地，該種組合物可進(jìn)一步包含取代的或衍生化的RNA或DNA組合物。正如將本文所述的特定組合物用于各種治療方案的合適的給藥和治療方案的開(kāi)發(fā)，藥學(xué)可接受的賦形劑和載體溶液的制劑已為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，包括，例如，口服、腸胃外、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)和肌肉內(nèi)給藥和制劑。其它的給藥途徑包括通過(guò)粘膜表面給藥。典型地，包含治療有效量的制劑每次給藥傳遞約0.1μg至約1000μg的多肽，更典型地每次給藥傳遞約2.5μg至約100μg多肽。對(duì)于多核苷酸組合物，這些制劑典型地每次給藥傳遞約10μg至約20mg本發(fā)明的多核苷酸，更典型地每次給藥傳遞約0.1mg至約10mg本發(fā)明的多核苷酸。自然地，在每種治療有用的組合物中活性化合物的量可以如下方式制備：以化合物的任意給定單位劑量獲得合適的劑量。制備該種藥物制劑的本領(lǐng)域技術(shù)人員將預(yù)期例如溶解性、生物利用度、生物半衰期、給藥途徑、產(chǎn)品保質(zhì)期以及其它藥理方面等因素，這樣，可期望各種劑量和治療方案。1.口服傳遞在某些應(yīng)用中，本文披露的藥物組合物可通過(guò)口服給藥傳遞給動(dòng)物。這樣，這些組合物可聯(lián)合惰性稀釋劑或聯(lián)合可吸收食用載體配制，或者它們可被包封在硬殼或軟殼凝膠膠囊中，或者它們可被壓縮為片劑，或者它們可被直接混入日常食物中。該活性化合物甚至可混入賦形劑并以可攝取片劑、口腔片劑、糖錠、膠囊、酏劑、懸浮劑、糖漿、圓片等形式使用(Mathiowitz等人，1997；Hwang等人，1998；美國(guó)專(zhuān)利5,641,515；美國(guó)專(zhuān)利5,580,579和美國(guó)專(zhuān)利5,792,451，每一個(gè)在此全文特別引入作為參考)。這些片劑、糖錠、丸劑、膠囊等還可包含如下成分：粘合劑，如黃芪樹(shù)膠、阿拉伯膠、玉米淀粉或明膠；賦形劑，如磷酸氫鈣；崩解劑，例如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、海藻酸等；潤(rùn)滑劑，例如硬脂酸鎂；以及甜味劑，例如可加入蔗糖、乳糖或糖精，或者調(diào)味劑，例如薄荷、冬青樹(shù)油或櫻桃調(diào)味劑。當(dāng)該劑量單位形式為膠囊時(shí)，它可在上述類(lèi)型的物質(zhì)外包含液體載體。各種其它的材料可作為涂層存在，或以調(diào)節(jié)該劑量單位的物理形式。例如，片劑、丸劑或膠囊可以蟲(chóng)膠、糖或兩者涂覆。酏劑的糖漿可包含活性成分、作為甜味劑的蔗糖、作為防腐劑的甲基和丙基苯甲酸酯、染料和調(diào)味劑如櫻桃或柑橘口味。當(dāng)然，用于制備任意劑量單位形式的任意材料應(yīng)當(dāng)是制藥純的，且在所用的量下基本無(wú)毒。此外，該活性成分可被混合進(jìn)入緩釋制劑和配方。對(duì)于口服給藥，本發(fā)明的組合物可替代性地以漱口液、潔牙劑、口腔片劑、口服噴霧或舌下口服給藥制劑的形式混合一種或多種賦形劑。例如，漱口液可通過(guò)將所需量的活性成分混合進(jìn)入合適的溶劑如硼酸鈉溶液(Dobell溶液)中進(jìn)行制備。替代性地，該活性成分可被混合進(jìn)入口服溶液，例如包含硼酸鈉、甘油和碳酸氫鉀的口服溶液中，或者分散在潔牙劑中，或者以治療有效量添加至可能包含水、粘合劑、研磨料、調(diào)味劑、起泡劑和潤(rùn)濕劑的組合物中。替代性地，該組合物可被制成可置于舌下或以其他方式溶解于口中的片劑或溶液形式。2.可注射傳遞在某些情況下，將需要腸胃外、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮內(nèi)或甚至腹腔傳遞本文所述的藥物組合物，如美國(guó)專(zhuān)利5,543,158、美國(guó)專(zhuān)利5,641,515和美國(guó)專(zhuān)利5,399,363所述(每一個(gè)在此全文具體引入作為參考)。作為游離堿或藥學(xué)上可接受的鹽的活性化合物的溶液可在與表面活性劑(例如羥丙基纖維素)適當(dāng)混合的水中制備。還可在甘油、液體聚乙二醇及其混合物以及在油中制備分散劑。在常規(guī)貯存和使用條件下，這些制劑包含防腐劑以防止微生物生長(zhǎng)。適于注射用途的藥物形式包括無(wú)菌水溶液或分散液以及用于可無(wú)菌注射溶液或分散液的臨時(shí)制劑的無(wú)菌粉末(美國(guó)專(zhuān)利5,466,468，特別在此全文引入作為參考)。在所有情況下，該形式應(yīng)當(dāng)無(wú)菌且就容易注射而言應(yīng)當(dāng)是液體。它在生產(chǎn)和貯存條件下應(yīng)保持穩(wěn)定，并應(yīng)當(dāng)抗微生物(例如細(xì)菌和真菌)的污染。該載體可以是一種溶劑或分散介質(zhì)，其包含，例如，水、乙醇、多羥基化合物(例如，甘油，丙二醇，以及液體聚乙二醇等)及其適當(dāng)?shù)幕旌衔锖?或植物油。適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性可通過(guò)多種方式維持，例如，通過(guò)使用如卵磷脂等涂層，通過(guò)針對(duì)分散劑時(shí)對(duì)所需的粒度的維持，以及通過(guò)表面活性劑的使用。微生物作用的預(yù)防可通過(guò)各種抗菌和抗真菌劑(例如，對(duì)羥基苯甲酸酯，氯丁醇，苯酚，山梨酸，硫柳汞等)實(shí)現(xiàn)。在許多情況下，該組合物中優(yōu)選包含等張劑，例如，糖或氯化鈉?？勺⑸浣M合物的延長(zhǎng)吸收可通過(guò)在組合物中使用延緩吸收的試劑(例如，單硬脂酸鋁和明膠)來(lái)實(shí)現(xiàn)。對(duì)于在水溶液中進(jìn)行腸胃外給藥，例如，該溶液應(yīng)當(dāng)在需要時(shí)適當(dāng)緩沖，且液體稀釋劑先用足量的鹽水或葡萄糖成為等張液體。這些特定的水溶液特別適用于靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)給藥。就此而言，根據(jù)本披露，可以使用的無(wú)菌水性介質(zhì)將為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知。例如，一個(gè)劑量可溶解于1ml等張NaCl溶液中，并被添加至1000ml的皮下灌注液體中或者在預(yù)期灌注部位注射(參見(jiàn)，例如，Remington’sPharmaceuticalSciences，第15版，pp1035-1038和1570-1580)。根據(jù)待治療對(duì)象的狀況，在劑量上可能需要發(fā)生一些變化。在任意情況下，負(fù)責(zé)給藥的人員將確定針對(duì)個(gè)體對(duì)象的合適劑量。此外，對(duì)于人類(lèi)給藥，制劑應(yīng)滿(mǎn)足FDA生物制品標(biāo)準(zhǔn)辦公室所要求的無(wú)菌性、致熱性和總體安全性和純度標(biāo)準(zhǔn)。無(wú)菌可注射溶液可通過(guò)將含于合適溶劑的所需量的活性化合物混合進(jìn)入各種上述列舉的其它成分后根據(jù)要求過(guò)濾滅菌制備得到。一般而言，分散劑可通過(guò)將各種無(wú)菌活性成分與包含基礎(chǔ)分散介質(zhì)和上述列舉的所需其它成分的無(wú)菌載體結(jié)合得到。對(duì)于用于制備無(wú)菌可注射溶液的無(wú)菌粉末，其優(yōu)選制備方法為真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，其得到的粉末包含活性成分和從其之前無(wú)菌過(guò)濾溶液得到的任何附加所需成分。本文披露的組合物可配制為中性或鹽的形式。藥學(xué)可接受的鹽包括酸加成鹽(與蛋白的游離氨基形成)，其可與無(wú)機(jī)酸(例如，氫氯酸、磷酸)或有機(jī)酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成。也可由無(wú)機(jī)堿(例如，氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銨、氫氧化鈣或氫氧化鐵)和有機(jī)堿(例如異丙胺、三乙胺、組氨酸、普魯卡因等)衍生得到與游離羧酸基團(tuán)形成的鹽。在配制時(shí)，溶液將以與劑型相容的方式和治療有效的量給藥。該制劑可以各種劑型(例如可注射溶液、藥物釋放膠囊等)容易地給藥。本文所用的“載體”包括任意和所有的溶劑、分散介質(zhì)、溶媒、涂層、稀釋劑、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等張和吸收延緩劑、緩沖劑、載體溶液、懸浮液、膠體等。用于藥物活性物質(zhì)的該種介質(zhì)和試劑的使用為本領(lǐng)域公知。除了與該活性成分不相容的任意傳統(tǒng)介質(zhì)或試劑外，其在治療性組合物中的用途在預(yù)期之內(nèi)。補(bǔ)充性活性成分也可混合進(jìn)入該組合物。短語(yǔ)“藥學(xué)上可接受的”指在給藥給人時(shí)不生成過(guò)敏性或類(lèi)似不良反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。包含作為活性成分的蛋白的水性組合物的制備已被本領(lǐng)域充分理解。典型地，該種組合物被制備為可注射的，既可作為液體溶液也可作為懸浮液；也可制備在注射前溶解于或懸浮于液體中的固體形式。該制劑也可被乳化。3.鼻部和口腔傳遞在某些實(shí)施方式中，該藥物組合物可通過(guò)鼻內(nèi)噴霧、口腔噴霧、吸入和/或其它氣溶膠傳遞載體傳遞。用于直接向肺傳遞基因、核酸和肽組合物的方法，例如通過(guò)鼻和口腔氣溶膠噴霧傳遞已描述于，例如，美國(guó)專(zhuān)利5,756,353和美國(guó)專(zhuān)利5,804,212(每一個(gè)特別在此全文引入作為參考)。同樣地，采用鼻內(nèi)微粒樹(shù)脂(Takenaga等人，1998)和溶血磷脂甘油化合物(美國(guó)專(zhuān)利5,725,871，特別在此全文引入作為參考)的藥物傳遞也已為制藥領(lǐng)域公知。同樣地，以聚四氟乙烯支撐基質(zhì)形式的穿粘膜藥物傳遞描述于美國(guó)專(zhuān)利5,780,045(特別地在此全文引入作為參考)。4.脂質(zhì)體、納米膠囊和微粒介導(dǎo)的傳遞在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明人預(yù)期采用脂質(zhì)體、納米膠囊、微粒、微球體、脂質(zhì)顆粒、囊泡等將本發(fā)明的組合物導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞。具體而言，本發(fā)明的組合物可被配制為包封于脂質(zhì)顆粒、脂質(zhì)體、囊泡、納米球體或納米顆粒等進(jìn)行傳遞。該種制劑對(duì)本文披露的核酸或構(gòu)建體的藥學(xué)上可接受的制劑引入而言是優(yōu)選的。脂質(zhì)體的形成和使用通常已為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知(參見(jiàn)，例如，Couvreur等人，1977；Couvreur，1988；Lasic，1998；其描述了用于胞內(nèi)細(xì)菌感染和疾病的靶向抗生素療法中脂質(zhì)體和納米膠囊的使用)。最近開(kāi)發(fā)了具有改進(jìn)的血清穩(wěn)定性和循環(huán)半衰期的脂質(zhì)體(Gabizon＆Papahadjopoulos，1988；Allen和Choun，1987；美國(guó)專(zhuān)利5,741,516，特別地在此全文引入作為參考)。此外，對(duì)于作為潛在藥物載體的脂質(zhì)體和類(lèi)脂質(zhì)體制劑的各種方法已有綜述(Takakura，1998；Chandran等人，1997；Margalit，1995；美國(guó)專(zhuān)利5,567,434；美國(guó)專(zhuān)利5,552,157；美國(guó)專(zhuān)利5,565,213；美國(guó)專(zhuān)利5,738,868和美國(guó)專(zhuān)利5,795,587，每一篇特別地在此全文引入作為參考)。脂質(zhì)體已成功地用于一系列通常耐受其它方法轉(zhuǎn)染(包括T細(xì)胞懸浮液、原代肝細(xì)胞培養(yǎng)物和PC12細(xì)胞)的細(xì)胞類(lèi)型(Renneisen等人，1990；Muller等人，1990)。此外，脂質(zhì)體不受到DNA長(zhǎng)度限制，而基于病毒的傳遞系統(tǒng)受到這種限制。脂質(zhì)體已被用于有效地將基因、藥物(Heath＆Martin，1986；Heath等人，1986；Balazsovits等人，1989；Fresta＆Puglisi，1996)、放射性治療劑(Pikul等人，1987)、酶(Imaizumi等人，1990a；Imaizumi等人，1990b)、病毒(Faller＆Baltimore，1984)、轉(zhuǎn)錄因子和別構(gòu)劑(Nicolau＆Gersonde，1979)引入各種培養(yǎng)的細(xì)胞系和動(dòng)物中。此外，多個(gè)成功的臨床試驗(yàn)已考察了脂質(zhì)體介導(dǎo)的藥物傳遞的效力(Lopez-Berestein等人，1985a；1985b；Coune，1988；Sculier等人，1988)。進(jìn)一步地，多個(gè)研究顯示脂質(zhì)體的使用與全身傳遞后的自身免疫應(yīng)答、毒性或性腺局部化不相關(guān)(Mori＆Fukatsu，1992)。脂質(zhì)體是由分散在水性介質(zhì)中并自發(fā)地形成多層同心雙層囊泡(也稱(chēng)為多層囊泡(MLVs))的磷脂形成的。MLVs通常具有25nm至4μm的直徑。對(duì)MLVs進(jìn)行超聲可形成在核內(nèi)包含水溶液的直徑在范圍內(nèi)的小單層囊泡(SUVs)。脂質(zhì)體與細(xì)胞膜具有相似性，且預(yù)期在本發(fā)明中被用作肽組合物的載體。它們可被廣泛適用，因?yàn)樗苄院椭苄晕镔|(zhì)均可被包埋在內(nèi)，即，分別包埋在水性空間內(nèi)和其自身雙層內(nèi)。該攜帶藥物的脂質(zhì)體甚至有可能通過(guò)選擇性調(diào)整該脂質(zhì)體制劑而被用于活性藥劑的定點(diǎn)傳遞。除Couvreur等人(1977；1988)的教導(dǎo)外，如下信息可被用于生成脂質(zhì)體制劑。根據(jù)脂質(zhì)和水的摩爾比，當(dāng)分散在水中時(shí)，磷脂可形成多種脂質(zhì)體以外的結(jié)構(gòu)。在較低的比例下，脂質(zhì)體是優(yōu)選的結(jié)構(gòu)。脂質(zhì)體的物理特征取決于pH、離子強(qiáng)度以及二價(jià)陽(yáng)離子的存在。脂質(zhì)體可對(duì)離子和極性物質(zhì)顯示較低的穿透性，但在升高的溫度下則會(huì)經(jīng)歷相變，從而顯著改變它們的穿透性。該相變包括由緊密堆積的有序的結(jié)構(gòu)(稱(chēng)為凝膠態(tài))轉(zhuǎn)變?yōu)樗缮⒍逊e的、較為無(wú)序的結(jié)構(gòu)(稱(chēng)為液態(tài))。這發(fā)生在特征相變溫度下，并導(dǎo)致對(duì)離子、糖和藥物的穿透性的提高。除溫度外，暴露至蛋白可改變脂質(zhì)體的穿透性。一些可溶性蛋白，例如細(xì)胞色素c，結(jié)合、變形和穿透該雙層，從而引起穿透性的變化。膽固醇顯然通過(guò)使磷脂更為緊密堆積而抑制蛋白的穿透。預(yù)期用于抗生素和抑制劑傳遞的最有用的脂質(zhì)體形式將包含膽固醇。不同類(lèi)型的脂質(zhì)體具有不同的包埋溶解物的能力。例如，MLVs對(duì)于包埋溶解物較為有效，而SUVs則極為無(wú)效。SUVs可提供在粒度分布上的均勻性和重現(xiàn)性的優(yōu)勢(shì)，然而，大的單層囊泡(LUVs)提供了粒度和包埋效率之間的折中。這些大單層囊泡通過(guò)醚蒸發(fā)制備，且比MLVs具有高三至四倍的溶解物包埋效率。除脂質(zhì)體特征外，在包埋化合物中的一個(gè)重要的決定因素在于該化合物本身的理化特性。極性化合物被包埋在水性空間內(nèi)，而非極性化合物結(jié)合至囊泡的脂質(zhì)雙層。極性化合物通過(guò)穿透或在雙層破裂時(shí)被釋放，而非極性化合物則會(huì)保持與雙層連接，直至其被溫度或暴露至脂蛋白破壞。兩種類(lèi)型均在相變溫度下顯示最大流出速率。脂質(zhì)體通過(guò)四種不同的機(jī)制與細(xì)胞相互作用：通過(guò)網(wǎng)狀內(nèi)皮組織系統(tǒng)的吞噬細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的胞吞作用；通過(guò)非特異性弱疏水或靜電力或通過(guò)與細(xì)胞表面成分的特異性相互作用吸附至細(xì)胞表面；通過(guò)脂質(zhì)體的脂質(zhì)雙層插入質(zhì)膜與漿細(xì)胞膜融合，同時(shí)將脂質(zhì)體內(nèi)容釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)；以及通過(guò)將脂質(zhì)體的脂質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞或亞細(xì)胞膜或者反向轉(zhuǎn)移，而不與脂質(zhì)體內(nèi)容關(guān)聯(lián)。通常難以確定哪種機(jī)制在運(yùn)作，且可能有一種以上的機(jī)制同時(shí)運(yùn)作。靜脈注射的脂質(zhì)體的去向和處理取決于它們的物理特性，例如大小、流動(dòng)性和表面電荷。它們可在組織中存在數(shù)小時(shí)或數(shù)天，這取決于它們的組成，而在血液中的半衰期可有數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)。更大的脂質(zhì)體，例如MLVs和LUVs，迅速被網(wǎng)狀內(nèi)皮組織系統(tǒng)的吞噬細(xì)胞攝取，但循環(huán)系統(tǒng)的生理學(xué)在多數(shù)部位保留了該種大脂質(zhì)體。它們僅存在于毛細(xì)血管內(nèi)皮中具有大開(kāi)口或孔隙處，例如肝或脾的竇狀隙排出。因此，這些器官成為主要的攝取部位。另一方面，SUVs顯示了更廣的組織分布，但仍然在肝臟和脾臟高度集中。一般而言，這種體內(nèi)表現(xiàn)將脂質(zhì)體限制為僅潛在靶向它們的大尺寸可到達(dá)的器官和組織。其包括血液、肝、脾、骨髓和淋巴器官。就本發(fā)明而言，靶向通常不是限制。然而，當(dāng)需要特異性靶向時(shí)，可存在實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)的方法。抗體可用于結(jié)合至脂質(zhì)體表面，并將抗體及其藥物成分引導(dǎo)至位于特定細(xì)胞類(lèi)型表面上的特異性抗原受體。碳水化合物決定簇(在細(xì)胞-細(xì)胞識(shí)別、相互作用和吸附中具有作用的糖蛋白或糖脂類(lèi)細(xì)胞-表面成分)也可被用作識(shí)別位點(diǎn)，因?yàn)樗鼈冇袧摿⒅|(zhì)體引導(dǎo)至特定的細(xì)胞類(lèi)型。通常預(yù)期采用脂質(zhì)體制劑的靜脈注射，但也可采用其它給藥途徑。替代性地，本發(fā)明提供了本發(fā)明的組合物的藥學(xué)上可接受的納米膠囊制劑。納米膠囊通?？梢苑€(wěn)定和可重現(xiàn)的方式包埋化合物(Henry-Michelland等人，1987；Quintanar-Guerrero等人，1998；Douglas等人，1987)。為了避免由于胞內(nèi)聚合過(guò)載的副作用，應(yīng)采用能夠體內(nèi)降解的聚合物設(shè)計(jì)超細(xì)顆粒(尺寸約為0.1μm)。滿(mǎn)足這些需求的可生物降解的聚烷基-氰基丙烯酸酯納米顆粒預(yù)期用于本發(fā)明。該種顆?？筛鶕?jù)描述容易地制備(Couvreur等人，1980；1988；zurMuhlen等人，1998；Zambaux等1998；Pinto-Alphandry等人，1995以及美國(guó)專(zhuān)利5,145,684，特別全文引入作為參考)。皮膚貼劑也可用于經(jīng)皮傳遞。免疫原性組合物在本發(fā)明某些優(yōu)選的實(shí)施方式中提供了免疫原性組合物。該免疫原性組合物通常包含一種或多種多肽或多核苷酸(例如上述多肽和多核苷酸)，并聯(lián)合免疫刺激劑。免疫刺激劑可以是增強(qiáng)或加強(qiáng)對(duì)外源性抗原的免疫應(yīng)答(抗體和/或細(xì)胞介導(dǎo))的任意物質(zhì)。免疫刺激劑的實(shí)例包括佐劑、可生物降解的微球體(例如，polylacticgalactide)和脂質(zhì)體(化合物合并入其中；參見(jiàn)，例如，F(xiàn)ullerton，美國(guó)專(zhuān)利4,235,877)。免疫原性組合物的制備總體描述于，例如，Powell＆Newman，編輯，VaccineDesign(thesubunitandadjuvantapproach)(1995)。在本發(fā)明范圍內(nèi)的藥物組合物和免疫原性組合物還可包含其它化合物，其可具有生物活性或不具活性。例如，在藥物或免疫原性組合物中可存在其它結(jié)核分枝桿菌抗原的一個(gè)或多個(gè)免疫原性部分，其或者結(jié)合在融合多肽內(nèi)，或者作為單獨(dú)的化合物。示范性的免疫原性組合物可包含編碼一種或多種本文所述多肽的多核苷酸(例如，DNA)，從而原位生成該多肽(以誘發(fā)免疫應(yīng)答)。如上文指出，DNA可存在于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的各種傳遞系統(tǒng)(包括核酸表達(dá)系統(tǒng)、細(xì)菌和病毒表達(dá)系統(tǒng))的任意一種內(nèi)。各種基因傳遞技術(shù)已在本領(lǐng)域公知，例如描述于Rolland，Crit.Rev.Therap.DrugCarrierSystems15：143-198(1998)(在此引用)。合適的核酸表達(dá)系統(tǒng)包含了在患者體內(nèi)表達(dá)的必需DNA序列(例如合適的啟動(dòng)子和終止信號(hào))。細(xì)菌傳遞系統(tǒng)包括施用表達(dá)該多肽(例如，在細(xì)胞表面或分泌該多肽)的細(xì)菌宿主細(xì)胞(例如，分枝桿菌、桿菌或乳酸菌菌株，包括Calmette-Guerrin桿菌或乳酸乳球菌)(參見(jiàn)，例如，F(xiàn)erreira，等人，AnAcadBrasCignc(2005)77：113-124；和Raha，等人，ApplMicrobiolBiotechnol(2005)PubMedID15635459)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，該DNA可利用病毒表達(dá)系統(tǒng)(例如，牛痘或其它水痘病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒)引入，其可包括采用非病原性(缺陷型)、可復(fù)制病毒。合適的系統(tǒng)披露于，例如，F(xiàn)isher-Hoch等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：317-321(1989)；Flexner等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.569：86-103(1989)；Flexner等人，Vaccine8：17-21(1990)；美國(guó)專(zhuān)利4,603,112、4,769,330和5,017,487；WO89/01973；美國(guó)專(zhuān)利4,777,127；GB2,200,651；EP0,345,242；WO91/02805；Berkner，Biotechniques6：616-627(1988)；Rosenfeld等人，Science252：431-434(1991)；Kolls等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：215-219(1994)；Kass-Eisler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：11498-11502(1993)；Guzman等人，Circulation88：2838-2848(1993)；以及Guzman等人，Cir.Res.73：1202-1207(1993)。將DNA結(jié)合進(jìn)入該種表達(dá)系統(tǒng)的技術(shù)為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知。該DNA可以是“裸”DNA，例如，如Ulmer等人，Science259：1745-1749(1993)所述和Cohen，Science259：1691-1692(1993)綜述?？赏ㄟ^(guò)將該DNA涂覆在可被有效運(yùn)輸進(jìn)入細(xì)胞的可生物降解的珠子上提高裸DNA的攝入。顯而易見(jiàn)地，免疫原性組合物可同時(shí)包含多核苷酸和多肽成分。該種免疫原性組合物可提供增強(qiáng)的免疫應(yīng)答。顯而易見(jiàn)地，免疫原性組合物可包含本文提供的多核苷酸和多肽的藥學(xué)上可接受的鹽。該種鹽可由藥學(xué)上可接受的無(wú)毒性堿制備，該無(wú)毒性堿包括有機(jī)堿(例如，伯、仲和叔胺和堿性氨基酸的鹽)和無(wú)機(jī)堿(例如，鈉、鉀、鋰、銨、鈣和鎂鹽)。盡管本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的任意合適的載體可被用于本發(fā)明的免疫原性組合物，載體的類(lèi)型將取決于給藥的模式。本發(fā)明的組合物可配制為用于任意合適的給藥方式，包括，例如，局部、口服、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、顱內(nèi)、腹腔內(nèi)、皮下或肌肉內(nèi)給藥。對(duì)于腸胃外給藥，如皮下注射，該載體優(yōu)選包含水、鹽水、醇、脂肪、蠟或緩沖液。對(duì)于口服給藥，可采用任意上述載體或固體載體，例如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖以及碳酸鎂。可生物降解的微球體(例如，聚乳酸聚乙二醇)也可被用作本發(fā)明的藥物組合物的載體。合適的可生物降解微球體披露于，例如，美國(guó)專(zhuān)利4,897,268；5,075,109；5,928,647；5,811，128；5,820,883；5,853,763；5,814,344和5,942,252。還可采用包含美國(guó)專(zhuān)利5,928,647中所述的微粒-蛋白復(fù)合物的載體，其能在宿主中誘導(dǎo)I類(lèi)限制性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞應(yīng)答。該種組合物還可包含緩沖液(例如，中性緩沖鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水)、碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖)、甘露醇、蛋白、多肽或氨基酸如甘氨酸、抗氧化劑、抑菌劑、螯合劑如EDTA或谷胱甘肽、佐劑(例如，氫氧化鋁)、使得該制劑與接受者血液等張、低滲或弱高滲的溶解物、懸浮劑、增稠劑和/或防腐劑。替代性地，本發(fā)明的組合物可配制為凍干制品?；衔镞€可利用公知技術(shù)被包封在脂質(zhì)體內(nèi)。各種免疫刺激劑的任意一種可用于本發(fā)明的免疫原性組合物。例如，可以包含佐劑。大部分佐劑包含經(jīng)設(shè)計(jì)用于防止抗原快速分解的物質(zhì)，例如氫氧化鋁或礦物油，以及免疫應(yīng)答的刺激劑，例如脂質(zhì)A、百日咳桿菌或分枝桿菌種類(lèi)或分枝桿菌衍生的蛋白。例如，可使用去脂化、去糖脂化的牝牛分枝桿菌(“pVac”)。合適的佐劑已有市售，例如，弗氏不完全佐劑和完全佐劑(DifcoLaboratories，Detroit，MI)；Merck佐劑65(MerckandCompany，Inc.，Rahway，NJ)；AS01B、AS02A、AS15、AS-2及其衍生物(GlaxoSmithKline，Philadelphia，PA)；CWS(來(lái)自結(jié)核桿菌的細(xì)胞壁骨架)，TDM(海藻糖二白喉菌酸(dicorynomycolate))，Leif(利什曼原蟲(chóng)延長(zhǎng)起始因子)，鋁鹽例如氫氧化鋁凝膠(明礬)或磷酸鋁；鈣、鐵或鋅鹽；?；野彼岬牟蝗苄詰腋∫?；?；牵魂?yáng)離子或陰離子衍生化的多糖；聚膦腈；可生物降解的微球體；單磷酰脂質(zhì)A；以及quilA(例如，QS-21)。細(xì)胞因子如GM-CSF或白介素-2、-7或-12也可用作佐劑。佐劑指疫苗或治療性組合物中提高針對(duì)抗原的特異性免疫應(yīng)答的成分(參見(jiàn)，例如Edelman，AIDSRes.HumRetroviruses8：1409-1411(1992))。佐劑誘導(dǎo)Th1-型和Th2-型免疫應(yīng)答。Th1-型細(xì)胞因子(例如，IFN-γ、IL-2和IL-12)易于誘導(dǎo)針對(duì)施用抗原的細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，而Th2-型細(xì)胞因子(例如，IL-4、IL-5、IL-6、IL-10)易于誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答。優(yōu)選能刺激Th-1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答的佐劑描述于WO94/00153和WO95/17209。在本文提供的免疫原性組合物中，該佐劑組合物優(yōu)選設(shè)計(jì)為主要誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答。在應(yīng)用本文提供的免疫原性組合物后，患者通常支持包括Th1-型和Th2-型應(yīng)答的免疫應(yīng)答。在應(yīng)答主要是Th1-型的優(yōu)選實(shí)施方式中，Th1-型細(xì)胞因子的水平將增加至遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于Th2-型細(xì)胞因子的水平。這些細(xì)胞因子的水平可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定容易地評(píng)估。該族細(xì)胞因子的綜述可參見(jiàn)Janeway，等人，Immunobiology，第5版，2001。該Rv2386c組合物通常可在脂質(zhì)體制劑中包含一種或多種佐劑，例如，AS01B(3-去-O-酰化單磷酰脂質(zhì)A(3D-)和QS21；參見(jiàn)，美國(guó)專(zhuān)利公布2003/0143240)；AS02A(3D-和QS21以及水包油乳液；參見(jiàn)，Bojang，等人，Lancet(2001)358：1927)；，(Detox)；3D-皂甙，包括QuilA及其成分，例如QS21和皂甙類(lèi)似物；CWS(來(lái)自結(jié)核桿菌的細(xì)胞壁骨架)；TDM(海藻糖二白喉菌酸)；氨基烷基葡糖苷4-磷酸酯(AGPs)；免疫刺激性寡核肽，例如CPG；Leif(利什曼原蟲(chóng)延長(zhǎng)起始因子)；及其衍生物。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，Rv2386c多肽與一種或多種佐劑一起給藥，所述佐劑選自在脂質(zhì)體制劑例如AS01B中的3D-和QS21以及3D-和QS21和水包油乳液(例如AS02A)。佐劑系統(tǒng)AS01B和AS02A進(jìn)一步描述于Pichyangkul，等人，Vaccine(2004)22：3831-40。在作為核酸傳遞Rv2386c抗原時(shí)，其可在病毒載體(即，腺病毒載體)或突變細(xì)菌宿主細(xì)胞(即，突變體，無(wú)毒性分枝桿菌，乳酸桿菌或桿菌宿主細(xì)胞，包括卡介桿菌(BCG)和乳酸乳球菌)中傳遞。用于誘發(fā)主要的Th1-型應(yīng)答的優(yōu)選佐劑包括，例如，單磷酰脂質(zhì)A優(yōu)選3-O-去酰化單磷酰脂質(zhì)A(3D-)任選地與鋁鹽的組合(參見(jiàn)，例如Ribi，等人，1986，ImmunologyandImmunopharmacologyofBacterialEndotoxins，PlenumPubl.Corp.，NY，pp407-419；GB2122204B；GB2220211；以及US4,912,094)。優(yōu)選的3D-形式為具有直徑小于0.2mm的小顆粒尺寸的乳液形式，其生產(chǎn)方法披露于WO94/21292。包含單磷酰脂質(zhì)A和表面活性劑的水性制劑披露于WO98/43670。示范性的優(yōu)選佐劑包括可從GlaxoSmithKline獲得的AS01B(含于脂質(zhì)體制劑的和QS21)、在脂質(zhì)體制劑內(nèi)的3D-和QS21、AS02A(和QS21和水包油乳液)、3D-和QS21和水包油乳液以及AS15。佐劑可從GlaxoSmithKline獲得(參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094)。含CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸是未甲基化的)也誘導(dǎo)主要的Th1應(yīng)答。CpG是存在于DNA中的胞苷-鳥(niǎo)苷二核苷酸基序的縮寫(xiě)。該種寡核苷酸眾所周知，并描述于，例如，WO96/02555、WO99/33488和美國(guó)專(zhuān)利6,008,200和5,856,462。免疫刺激DNA序列還描述于，例如，Sato等人，Science273：352(1996)。在配制進(jìn)入免疫原性組合物中時(shí)，CpG通常在自由溶液中與游離抗原(WO96/02555；McCluskie和Davis，見(jiàn)上文)一起給藥，或者與抗原共價(jià)綴合(WO98/16247)，或者與氫氧化鋁等載體配制((肝炎表面抗原)Davis等人見(jiàn)上；Brazolot-Millan等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1998，95(26)，15553-8)。在本領(lǐng)域中已知CpG是能通過(guò)全身和粘膜途徑給藥的佐劑(WO96/02555，EP468520，Davis等人，J.Immunol，1998，160(2)：870-876；McCluskie和Davis，J.Immunol.，1998，161(9)：4463-6)。另一優(yōu)選的佐劑是皂苷或皂苷類(lèi)似物或衍生物，例如，QuilA，優(yōu)選QS21(AquilaBiopharmaceuticalsInc.，F(xiàn)ramingham，MA)，其可單獨(dú)使用或與其它佐劑組合使用。例如，強(qiáng)化的系統(tǒng)包括了單磷酰脂質(zhì)A和皂苷衍生物的組合，例如WO94/00153所述的QS21和3D-的組合，或者反應(yīng)原性更低的組合物，其中QS21用膽固醇淬火，如WO96/33739所述。其它優(yōu)選的制劑包含水包油乳液和生育酚。一種特別有效的佐劑制劑包含了含于水包油乳液的QS21、3D-和生育酚，其描述于WO95/17210。本發(fā)明使用的其它皂苷佐劑包括QS7(描述于WO96/33739和WO96/11711)和QS17(描述于美國(guó)專(zhuān)利5,057,540和EP0362279B1)。替代性地，該皂苷制劑可與疫苗載體合并，所述疫苗由殼聚糖或其它聚陽(yáng)離子聚合物、聚交酯和聚交酯-共-乙交酯顆粒、聚-N-乙酰基葡糖胺基聚合物基質(zhì)、由多糖或化學(xué)修飾的多糖構(gòu)成的顆粒、基于脂質(zhì)體和脂質(zhì)的顆粒、由甘油單酯組成的顆粒等組成。該皂苷還可在膽固醇存在下配制形成微粒結(jié)構(gòu)，例如脂質(zhì)體或此外，該皂苷可與聚氧乙烯醚或酯一起配制于非微粒溶液或懸浮液中，或配制在微粒結(jié)構(gòu)如paucilamelar脂質(zhì)體或中。皂苷還可與賦形劑如配制以提高粘度，或者與粉狀賦形劑如乳糖配制為干粉形式。在一個(gè)實(shí)施方式中，該佐劑系統(tǒng)包括了單磷酰脂質(zhì)A和皂苷衍生物的組合，例如WO94/00153所述的QS21和3D-的組合，或者反應(yīng)原性更低的組合物，其中QS21用含膽固醇的脂質(zhì)體淬火，如WO96/33739所述。其它合適的制劑包含水包油乳液和生育酚。另一合適的佐劑制劑采用WO95/17210中所述的含于水包油乳液的QS21、3D-佐劑和生育酚。另一強(qiáng)化佐劑系統(tǒng)包含含有CpG寡核苷酸和皂苷衍生物的組合，特別是WO00/09159中所述的CpG和QS21的組合。該制劑適當(dāng)?shù)亓硗獍腿橐汉蜕印Ｆ渌线m的佐劑包括ISA720(Seppic，F(xiàn)rance)、SAF(Chiron，Califomia，UnitedStates)，(CSL)、MF-59(Chiron)、SBAS系列佐劑(SmithKlineBeecham，Rixensart，Belgium)、Detox(Corixa)、RC-529(Corixa)以及其它氨基烷基葡糖苷4-磷酸酯類(lèi)(AGPs)，例如在待審美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)08/853,826和09/074,720中披露的那些，其披露在此全文引入作為參考，以及如WO99/52549A1中所述的聚氧乙烯醚佐劑。SmithKlineBeecham和CorixaCorporation現(xiàn)在屬于GlaxoSmithKline的一部分。其它合適的佐劑包括通式(I)的佐劑分子：HO(CH2CH2O)n-A-R其中，n為1-50，A是鍵或-C(O)-，R是C1-50烷基或苯基C1-50烷基。其它感興趣的佐劑是志賀毒素b鏈，其使用例如，如WO2005/112991所述。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式由免疫原性組合物組成，該免疫原性組合物包含通式(I)的聚氧乙烯醚，其中n介于1和50之間，優(yōu)選4-24，最優(yōu)選9；R成分為C1-50，優(yōu)選C4-C20烷基，最優(yōu)選C12烷基，且A為鍵。聚氧乙烯醚的濃度應(yīng)當(dāng)在0.1-20％范圍內(nèi)，優(yōu)選在0.1-10％范圍內(nèi)，最優(yōu)選在0.1-1％范圍內(nèi)。優(yōu)選的聚氧乙烯醚選自如下：聚氧乙烯-9-月桂醚、聚氧乙烯-9-steoryl醚、聚氧乙烯-8-steoryl醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚以及聚氧乙烯-23-月桂醚。聚氧乙烯醚例如聚氧乙烯月桂醚描述于Merck目錄(第12版：entry7717)。這些佐劑分子描述于WO99/52549。本文提供的任何免疫原性組合物可通過(guò)公知的獲得抗原、免疫應(yīng)答增強(qiáng)劑和合適載體或賦形劑的組合的方法進(jìn)行制備。本文所述的組合物可作為緩釋制劑(即，可使化合物在給藥后緩慢釋放的制劑，例如膠囊、海綿體或凝膠(例如，由多糖組成))的一部分進(jìn)行給藥。該種制劑通?？刹捎霉夹g(shù)(參見(jiàn)，例如，Coombes等人，Vaccine14：1429-1438(1996))制備，并通過(guò)，例如，口服、直腸或皮下灌輸或者通過(guò)在所需的靶點(diǎn)灌輸進(jìn)行給藥。緩釋制劑可包含分散在載體基質(zhì)和/或包含在被控速膜圍繞的儲(chǔ)器內(nèi)的多肽、多核苷酸或抗體。用于該種制劑內(nèi)的載體是生物相容的，并且也是可生物降解的；優(yōu)選地，該制劑提供相對(duì)恒定的活性成分釋放水平。該種載體包括聚(丙交酯-乙交酯)共聚物、聚丙烯酸酯、乳膠、淀粉、纖維素、葡聚糖等的微粒。其它的緩釋載體包括超分子生物載體，其包含非液體親水核(例如，交聯(lián)多糖或寡糖)，以及，可選地，包含兩親化合物如磷脂的外層(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專(zhuān)利5,151,254和PCT申請(qǐng)WO94/20078、WO/94/23701和WO96/06638)。在緩釋制劑內(nèi)包含的活性化合物的量取決于灌輸?shù)牟课弧⑨尫诺乃俾屎皖A(yù)期時(shí)間。多種傳遞載體中的任意一種可用于藥物組合物和免疫原性組合物中以促進(jìn)生成抗原特異性免疫應(yīng)答。傳遞載體包括抗原呈遞細(xì)胞(APCs)，例如樹(shù)突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞以及可被工程改造為有效APCs的其它細(xì)胞。該種細(xì)胞可以(但非必須)被工程改造以提高呈遞抗原的能力，以改善T細(xì)胞應(yīng)答的激活和/或維持，和/或與接受者免疫原性相容(即，匹配的HLA單元型)。APCs通?？蓮母鞣N生物液體和器官的任意一種分離，并可以是自體的、同種異體的、同基因的或異種細(xì)胞。本發(fā)明的某些優(yōu)選的實(shí)施方式采用樹(shù)突細(xì)胞或其祖細(xì)胞作為抗原呈遞細(xì)胞。樹(shù)突細(xì)胞是高度有效的APCs(Banchereau＆Steinman，Nature392：245-251(1998))，且顯示為誘發(fā)預(yù)防性或治療性免疫性的有效的生理學(xué)佐劑(參見(jiàn)Timmerman＆Levy，Ann.Rev.Med.50：507-529(1999))。總體而言，樹(shù)突細(xì)胞可基于其典型的形狀(原位星形、在體外有可見(jiàn)的顯著胞質(zhì)突(樹(shù)突))、它們高效攝取、處理和呈遞抗原的能力以及激活幼稚T細(xì)胞應(yīng)答的能力進(jìn)行鑒定。樹(shù)突細(xì)胞當(dāng)然可以被工程改造以表達(dá)在體內(nèi)或離體樹(shù)突細(xì)胞上不常見(jiàn)的特異性細(xì)胞表面受體或配體，且該種改造的樹(shù)突細(xì)胞在本發(fā)明的預(yù)期之中。作為樹(shù)突細(xì)胞的替代，分泌囊泡抗原負(fù)載樹(shù)突細(xì)胞(稱(chēng)為外染色體)可用于免疫原性組合物(參見(jiàn)Zitvogel等人，NatureMed.4：594-600(1998))。樹(shù)突細(xì)胞和祖細(xì)胞可從外周血、骨髓、淋巴結(jié)、脾、皮膚、臍帶血或任意其它合適的組織或液體獲得。例如，樹(shù)突細(xì)胞可通過(guò)將細(xì)胞因子如GM-CSF、IL-4、IL-13和/或TNFα的組合添加至從外周血收獲的單核細(xì)胞的培養(yǎng)物以離體分化。替代性地，從外周血、臍帶血或骨髓收獲的CD34陽(yáng)性細(xì)胞可通過(guò)向培養(yǎng)基中添加GM-CSF、IL-3、TNFα、CD40配體、LPS、flt3配體和/或誘導(dǎo)樹(shù)突細(xì)胞分化、成熟和增殖的其它化合物的組合以分化成為樹(shù)突細(xì)胞。樹(shù)突細(xì)胞可方便地分類(lèi)為“不成熟”和“成熟”細(xì)胞，這允許在兩種充分鑒定的表型之間以簡(jiǎn)單方式進(jìn)行區(qū)分。然而，這種命名法不應(yīng)解釋為排除所有可能的分化中間階段。不成熟的樹(shù)突細(xì)胞表征為具有高抗原攝取和處理能力的APC，其與Fcγ受體和甘露糖受體的高表達(dá)相關(guān)。成熟表型通常通過(guò)這些標(biāo)記物的低表達(dá)，負(fù)責(zé)T細(xì)胞激活的細(xì)胞表面分子如I類(lèi)和II類(lèi)MHC、吸附分子(例如，CD54和CD11)和共刺激分子(例如，CD40、CD80、CD86和4-1BB)的高表達(dá)進(jìn)行表征。APCs通?？捎镁幋a蛋白(或其部分或其它變體)的多核苷酸轉(zhuǎn)染，從而使多肽在細(xì)胞表面表達(dá)。該種轉(zhuǎn)染可離體進(jìn)行，且包含該種轉(zhuǎn)染細(xì)胞的藥物組合物或免疫原性組合物可按照本文所述使用。替代性地，靶向樹(shù)突或其它抗原呈遞細(xì)胞的基因傳遞載體可被給藥至患者，從而形成體內(nèi)轉(zhuǎn)染。例如，樹(shù)突細(xì)胞的體內(nèi)和離體轉(zhuǎn)染通?？衫帽绢I(lǐng)域已知的任何方法(例如描述于WO97/24447中的那些)進(jìn)行，或者通過(guò)Mahvi等人，ImmunologyandCellBiology75：456-460(1997)所述的基因槍方法進(jìn)行。樹(shù)突細(xì)胞的抗原負(fù)載可通過(guò)用多肽、DNA(裸DNA或在質(zhì)粒載體內(nèi))或RNA孵育樹(shù)突細(xì)胞或祖細(xì)胞實(shí)現(xiàn)，或者通過(guò)抗原表達(dá)重組細(xì)菌或病毒(例如，痘苗、禽痘、腺病毒或慢病毒載體)實(shí)現(xiàn)。在負(fù)載之前，多肽可被共價(jià)綴合至提供T細(xì)胞輔助的免疫原性伙伴(例如，載體分子)。替代性地，樹(shù)突細(xì)胞可單獨(dú)的或在多肽存在下用非綴合免疫原性伙伴進(jìn)行脈沖。免疫原性組合物和藥物組合物可存在于單位劑量或多劑量容器內(nèi)，例如密封的安瓿或小瓶。該種容器優(yōu)選嚴(yán)密密封，以將制劑保持無(wú)菌至使用。總體而言，制劑可作為懸浮液、溶液或含于油性或水性溶媒中的乳液儲(chǔ)存。替代性地，免疫原性組合物或藥物組合物可儲(chǔ)存在冷凍干燥條件下，僅需要在使用前添加無(wú)菌液體載體。在一些實(shí)施方式中，“引發(fā)”或第一次施用Rv2386c多肽(包括變體、免疫原性片段或融合蛋白)或編碼所述多肽的多核苷酸，然后進(jìn)行一次或多次“促進(jìn)”或后續(xù)施用Rv2386c多肽(包括變體、免疫原性片段或融合蛋白)或編碼所述多肽的多核苷酸(“引發(fā)和促進(jìn)”法)。例如，第一次施用Rv2386c多肽(包括變體、免疫原性片段或融合蛋白)或編碼所述多肽的多核苷酸，然后一次或多次后續(xù)施用Rv2386c多肽(包括變體、免疫原性片段或融合蛋白)或編碼所述多肽的多核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方式中，首次施用Rv2386c多肽或多核苷酸，然后一次或多次后續(xù)施用Rv2386c多肽。在一個(gè)實(shí)施方式中，首次施用Rv2386c多肽或多核苷酸，然后一次或多次后續(xù)施用Rv2386c多核苷酸。通常該首次或“引發(fā)”施用和該第二次或“促進(jìn)”施用的間隔約2-12周，或長(zhǎng)達(dá)4-6月。后續(xù)的“促進(jìn)”施用可相隔約6個(gè)月，或者相隔長(zhǎng)達(dá)1、2、3、4或5年。傳統(tǒng)的促進(jìn)治療(例如，蛋白引發(fā)施用，然后進(jìn)行蛋白促進(jìn)施用)也可用于預(yù)防或治療結(jié)核病(例如，預(yù)防或治療潛伏結(jié)核病，特別是預(yù)防或延緩結(jié)核病再活化)?？贵w“抗體”指包含來(lái)自免疫球蛋白基因或其片段的框架區(qū)的多肽，其特異性結(jié)合和識(shí)別抗原。該識(shí)別的免疫球蛋白基因包括kappa、lambda、alpha、gamma、delta、epsilon和mu恒定區(qū)基因，以及眾多免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈被分類(lèi)為kappa或lambda。重鏈被分類(lèi)為gamma、mu、alpha、delta或epsilon，其分別依次定義了免疫球蛋白類(lèi)別IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。示范性的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單元包含四聚物。每個(gè)四聚物由兩個(gè)相同的多肽鏈對(duì)組成，每個(gè)對(duì)具有一條“輕”鏈(約25kDa)和一條重”鏈(約50-70kDa)。每條鏈的N-末端定義了約100至110或更多氨基酸的可變區(qū)，其主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別。術(shù)語(yǔ)可變輕鏈(VL)和可變重鏈(VH)分別指輕鏈和重鏈。抗體作為例如完整免疫球蛋白或多個(gè)充分鑒定的以各種肽酶消化生成的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶消化鉸鏈區(qū)中的二硫鍵下的抗體以生成Fab的二聚物F(ab)’2，其自身是通過(guò)二硫鍵連接至VH-CH1的輕鏈。該F(ab)’2可在溫和條件下還原以打斷鉸鏈區(qū)中的二硫鍵，從而將F(ab)’2二聚物轉(zhuǎn)化為Fab’單體。該Fab’單體基本是具有鉸鏈區(qū)部分的Fab(參見(jiàn)FundamentalImmunology(Paul編輯，第3版，1993)。盡管各種抗體片段可從完整抗體的消化進(jìn)行定義，本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，該種片段可通過(guò)化學(xué)方法或重組DNA方法從頭合成。因此，本文所用的術(shù)語(yǔ)抗體還包括通過(guò)全抗體修飾、或采用重組DNA方法從頭合成(例如，單鏈Fv)、或采用噬菌體展示庫(kù)鑒定的抗體片段(參見(jiàn)，例如，McCafferty等人，Nature348：552-554(1990))。為制備單克隆或多克隆抗體，可采用本領(lǐng)域已知的任意技術(shù)(參見(jiàn)，例如，Kohler＆Milstein，Nature256：495-497(1975)；Kozbor等人，ImmunologyToday4：72(1983)；Cole等人，pp77-96，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy(1985))。用于生成單鏈抗體的技術(shù)(美國(guó)專(zhuān)利4,946,778)可適用于生成針對(duì)本發(fā)明多肽的抗體。此外，轉(zhuǎn)基因小鼠，或其它生物如其它哺乳動(dòng)物，可用于表達(dá)人源化抗體。替代性地，噬菌體展示技術(shù)可用于鑒定特異性結(jié)合所選抗原的抗體和異聚Fab片段(參見(jiàn)，例如，McCafferty等人，Nature348：552-554(1990)；Marks等人，Biotechnology10：779-783(1992))。對(duì)于蛋白或肽，短語(yǔ)與抗體的“特異性(或選擇性)結(jié)合”或“特異性(或選擇性)免疫反應(yīng)”指在蛋白和其它生物質(zhì)的異種群體中確定該蛋白存在的結(jié)合反應(yīng)。因此，在指定的免疫測(cè)定條件下，該特異性抗體與特定蛋白的結(jié)合是背景的至少兩倍，且基本不會(huì)與樣本中存在的其它蛋白大量結(jié)合。在該種條件下特異性結(jié)合至抗體可能需要選擇對(duì)特定蛋白具有特異性的抗體。例如，可選擇針對(duì)融合蛋白的多克隆抗體，從而僅獲得與融合蛋白特異性免疫反應(yīng)且不與該融合蛋白的單獨(dú)成分特異性免疫反應(yīng)的多克隆抗體。這種選擇可通過(guò)減去與單個(gè)抗原交叉反應(yīng)的抗體實(shí)現(xiàn)。多種免疫測(cè)定形式可用于選擇能與特定蛋白進(jìn)行特異性免疫反應(yīng)的抗體。例如，固相ELISA免疫測(cè)定可常規(guī)用于選擇與蛋白特異性免疫反應(yīng)的抗體(可用于確定特異性免疫反應(yīng)性的免疫測(cè)定形式和條件的描述可參見(jiàn)，例如，Harlow＆Lane，Antibodies，ALaboratoryManual(1988)以及UsingAntibodies：ALaboratoryManual(1998))。典型地，特異性或選擇性反應(yīng)將是背景信號(hào)或噪聲的至少兩倍，更典型地，是背景(例如，結(jié)合至其它分枝桿菌蛋白，例如其它結(jié)核分枝桿菌蛋白)的10、20或100倍以上。診斷在另一方面，本發(fā)明提供了用一種或多種上述多肽診斷結(jié)核病的方法(例如采用常規(guī)形式的基于T細(xì)胞應(yīng)答的測(cè)定或基于抗體的測(cè)定)。例如，提供了一種測(cè)定個(gè)體中先前的結(jié)核分枝桿菌感染的方法，該方法包括：(a)從該個(gè)體獲得樣本；(b)用分離多肽接觸所述樣本，該分離多肽包括：(i)Rv2386c蛋白序列；(ii)Rv2386c蛋白序列的變體；或者(iii)Rv2386c蛋白序列的免疫原性片段；(c)對(duì)樣本的應(yīng)答進(jìn)行定量。該樣本可以是例如全血或純化細(xì)胞。適當(dāng)?shù)兀摌颖緦庵苎獑魏思?xì)胞(PBMC)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，該個(gè)體血清反應(yīng)呈陽(yáng)性。在本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方式中，該個(gè)體血清反應(yīng)呈陰性。合適地，該個(gè)體之前未針對(duì)結(jié)核分枝桿菌感染進(jìn)行接種(例如，合適地，該個(gè)體之前未用BCG接種)。該樣本的應(yīng)答可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的一系列手段進(jìn)行定量，包括監(jiān)測(cè)淋巴細(xì)胞增殖或特異性細(xì)胞因子或抗體的生成。例如，T-細(xì)胞ELISPOT可用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞因子例如干擾素gamma(IFNγ)、白介素2(IL2)和白介素5(IL5)。B-細(xì)胞ELLISPOT可用于監(jiān)測(cè)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原的刺激。細(xì)胞應(yīng)答還可通過(guò)使用胞內(nèi)和胞外染色并通過(guò)流式細(xì)胞儀分析來(lái)進(jìn)行表征。對(duì)樣本增殖應(yīng)答的定量方法包括：(i)用放射性標(biāo)記(例如，氚化胸腺嘧啶)對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行脈沖，并監(jiān)測(cè)氚的攝取(例如，氣體閃爍)。(ii)二醋酸羧基熒光素琥珀酰亞胺酯(CFSE)標(biāo)記并用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞分裂進(jìn)行熒光監(jiān)測(cè)。對(duì)樣本細(xì)胞因子應(yīng)答的定量具體包括對(duì)干擾素gamma生成的監(jiān)測(cè)。在使用該種定量方法時(shí)，對(duì)抗原的陽(yáng)性應(yīng)答可通過(guò)至少2∶1(例如，至少3∶1或至少5∶1)的信噪比(S/N比)進(jìn)行定義。在本發(fā)明進(jìn)一步的方面提供了采用皮試診斷結(jié)核分枝桿菌感染的方法。本文所用的“皮試”是直接對(duì)患者進(jìn)行的任意測(cè)定，其中在皮內(nèi)注射上述Rv153c多肽(或其變體、免疫原性片段或編碼它們的核苷酸)后測(cè)量延緩型超敏(DTH)反應(yīng)(例如腫脹、發(fā)紅或皮膚炎)。該種注射可用足以將抗原組合與患者真皮細(xì)胞接觸的任意裝置實(shí)現(xiàn)，例如結(jié)核菌素注射器或1mL注射器。該反應(yīng)在一定時(shí)間后測(cè)量，例如在注射后至少48小時(shí)，特別是48-72小時(shí)。DTH反應(yīng)是一種細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，這種應(yīng)答在之前曾暴露至受試抗原的患者中更大。該應(yīng)答可采用尺子肉眼測(cè)量?？傮w而言，直徑大于約0.5cm，特別是直徑大于約1.0cm的應(yīng)答為陽(yáng)性應(yīng)答，是之前有結(jié)核分枝桿菌感染的指征，其可能顯示或不顯示為活動(dòng)性疾病。為用于皮試，該Rv2386c成分合適地被配制為包含生理可接受載體的藥物組合物。合適地，在該種藥物組合物中使用的載體是具有合適防腐劑(例如苯酚和/或Tween80TM)的鹽水溶液。本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于任意上述診斷方法的試劑盒。該種試劑盒通常包含進(jìn)行診斷測(cè)定所必需的兩種或更多種成分。該成分可以是化合物、試劑、容器和/或裝置。例如，試劑盒內(nèi)的一個(gè)容器可包含特異性結(jié)合蛋白的單克隆抗體或其片段。該種抗體或片段可連接至上述支持材料。一個(gè)或多個(gè)另外的容器可包含用于該測(cè)定的元素，如試劑或緩沖液。該種試劑盒還可以(或者替代性地)包含上述檢測(cè)試劑，該檢測(cè)試劑包含適用于直接或間接檢測(cè)抗體結(jié)合的報(bào)告基團(tuán)。替代性地，試劑盒可被設(shè)計(jì)為檢測(cè)生物樣本中編碼蛋白的mRNA的水平。該種試劑盒通常包含至少一種與編碼蛋白的多核苷酸雜交的上述寡核苷酸探針或引物。該種寡核苷酸可用于，例如，PCR或雜交測(cè)定中?？纱嬖谟谠摲N試劑盒內(nèi)的其它成分包括用于促進(jìn)編碼本發(fā)明蛋白的多核苷酸檢測(cè)的第二寡核苷酸和/或診斷試劑或容器。其它的診斷試劑盒包括設(shè)計(jì)用于檢測(cè)細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答(其可以，例如，用于本發(fā)明的診斷方法)的試劑盒。該種試劑盒通常包含：(i)從對(duì)象獲得合適細(xì)胞樣本的設(shè)備；(ii)用Rv2386c多肽(或其變體、其免疫原性片段或編碼該多肽的DNA)刺激所述細(xì)胞樣本的裝置；(iii)對(duì)刺激的細(xì)胞應(yīng)答進(jìn)行檢測(cè)和定量的裝置。用于定量細(xì)胞應(yīng)答的合適裝置包括B-細(xì)胞ELISPOT試劑盒或替代性地T-細(xì)胞ELISPOT試劑盒，其為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。一種可能的試劑盒包含：(a)本發(fā)明的多肽；和(b)適于直接或間接檢測(cè)抗體結(jié)合的檢測(cè)試劑。特別感興趣的是對(duì)T細(xì)胞應(yīng)答的定量所定制的診斷試劑盒：診斷試劑盒，其包含：(a)本發(fā)明的多肽；和(b)使所述多肽與個(gè)體的真皮細(xì)胞充分接觸的設(shè)備。診斷試劑盒，其包含：(a)本發(fā)明的多肽；(b)使所述多肽與來(lái)自個(gè)體的樣本(例如，全血或更合適的PBMC)充分接觸的設(shè)備；和(c)對(duì)T細(xì)胞應(yīng)答(例如，增殖或IFN-生成)定量的裝置。實(shí)施例以下的實(shí)施例僅為闡述目的提供，并非對(duì)本發(fā)明構(gòu)成限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地理解，可改變或調(diào)整多種非關(guān)鍵參數(shù)以獲得基本類(lèi)似的結(jié)果。實(shí)施例1-作為潛伏TB疫苗靶標(biāo)的Rv2386c的鑒別基因Rv2386c也稱(chēng)為MbtI，其編碼參與含羥苯噁唑啉鐵載體分枝桿菌素的生物起源的蛋白，其中它將分支酸鹽轉(zhuǎn)化為水楊酸鹽(分枝菌鐵載體合成的起始單元)。Rv2386c可基于與如Murphy和BrownBMC.Infect.Dis.20077：84-99中的休眠期維持和傳染性相關(guān)的結(jié)核分枝桿菌基因的全基因組分析進(jìn)行選擇。結(jié)核分枝桿菌中的潛在休眠期基因靶標(biāo)通過(guò)在模擬休眠條件下細(xì)菌基因表達(dá)的公開(kāi)的全基因組DNA微陣列數(shù)據(jù)組的生物信息學(xué)meta分析中是優(yōu)先的(prioritised)。然后在整個(gè)基因組進(jìn)行由基因編碼的結(jié)核分枝桿菌蛋白的亞細(xì)胞定位以鑒別疫苗靶標(biāo)。簡(jiǎn)言之，休眠模型中的實(shí)驗(yàn)條件變化很大，因此開(kāi)發(fā)了零至五的評(píng)分系統(tǒng)，以根據(jù)兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)歸一化這些數(shù)據(jù)：1)實(shí)驗(yàn)條件與休眠狀態(tài)的相關(guān)性和2)表達(dá)的排位順序。特定實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)組中的最大評(píng)分可基于與休眠期結(jié)核分枝桿菌感染的臨床發(fā)生率潛在關(guān)聯(lián)性進(jìn)行調(diào)整。表1顯示了為步驟1采集的數(shù)據(jù)組以及對(duì)每個(gè)數(shù)據(jù)組調(diào)整的最大評(píng)分。對(duì)于生長(zhǎng)必需的基因的附加數(shù)據(jù)組可采用基于轉(zhuǎn)座子的敲除實(shí)驗(yàn)(TraSH)從公開(kāi)研究獲得。對(duì)于生長(zhǎng)沒(méi)有作用的基因的評(píng)分為零。表1-結(jié)核分枝桿菌DNA微陣列基因表達(dá)和全基因組敲除(生長(zhǎng)期必需)的來(lái)源、實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃驮u(píng)分標(biāo)準(zhǔn)a基于休眠模型相關(guān)性的最大評(píng)分；h＝小時(shí)；d＝天。b在28d的充氣培養(yǎng)物中來(lái)自Balb/c肺部的結(jié)核分枝桿菌與MTB的比例。#WayneLG和HayesLGInfect.Immun.199664：2062-2069步驟2-在應(yīng)用第二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，基因表達(dá)的等級(jí)次序、來(lái)自每個(gè)數(shù)據(jù)組的基因評(píng)分可在表達(dá)比例(實(shí)驗(yàn)條件表達(dá)相對(duì)于對(duì)數(shù)期液體培養(yǎng)物中的細(xì)胞的倍數(shù))的基礎(chǔ)上由最高到最低排序。最高評(píng)分的基因可得到特定基因組的最大評(píng)分(在表1第3列中列舉(例如，5、4......1點(diǎn)))。每個(gè)基因的評(píng)分依次降低0.005點(diǎn)直至零，或者達(dá)到數(shù)據(jù)組末。因此當(dāng)最大評(píng)分是4點(diǎn)時(shí)，第100個(gè)等級(jí)的基因的評(píng)分為3.500。對(duì)于5點(diǎn)的最大評(píng)分，1000個(gè)基因或者結(jié)核分枝桿菌基因組的25％具有評(píng)分。對(duì)于采集多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)的實(shí)驗(yàn)，在所有時(shí)間點(diǎn)中最大的評(píng)分被用作最終評(píng)分。在步驟3中，將每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下每個(gè)基因的評(píng)分采集進(jìn)入MicrosoftAccess數(shù)據(jù)庫(kù)。加入?yún)⒖加?例如RefseqID、Genbank功能、Genbank注解、Tuberculist分類(lèi)以及KEGG和SangerCenterlinks)以促進(jìn)優(yōu)先排序。通過(guò)合并來(lái)自不同研究和來(lái)源的數(shù)據(jù)，對(duì)在休眠狀態(tài)中存活最關(guān)鍵的特定基因和途徑達(dá)成了共識(shí)。在步驟4，采用評(píng)分最高的400個(gè)基因(約基因組的10％)并輔以對(duì)生物化學(xué)途徑、酶學(xué)、藥物易處理性、與人基因的同源性以及其它已有知識(shí)的專(zhuān)家計(jì)算和人工分析得出治療靶標(biāo)的優(yōu)先列表。高評(píng)分基因大部分來(lái)自于該組中的兩個(gè)或三個(gè)的相交的子集。在步驟5，在整個(gè)基因組進(jìn)行對(duì)基因編碼的結(jié)核分枝桿菌蛋白的亞細(xì)胞定位的鑒定。用于膜蛋白預(yù)測(cè)的啟發(fā)法描述于Chalker等人J.Bacteriol.2001183：1259-1268。采用以梯形窗加權(quán)的GES親水性值(EngelmanDM等人Annu.Rev.Biophys.Biophys.Chem.198615：321-353)生成平均親水性圖(H)(vonHeijneGJ.Mol.Biol.1992225：487-494)。采用與TopPredII算法(ClarosMG等人Comput.Appl.Biosci.199410：685-686)的初始步驟類(lèi)似的方法，通過(guò)選擇集中在最高H值(MaxH)的19個(gè)氨基酸、使其不受進(jìn)一步考慮并重復(fù)該方法直至不剩下H＞0.5的峰，為每個(gè)肽序列預(yù)測(cè)螺旋跨膜區(qū)段(TMS)?；诜錗axH值、H＞1.0的區(qū)段的數(shù)量以及推定TMS的分布和峰H值給定亞細(xì)胞定位。選擇1.15的MaxH截?cái)嘁允狗謩e包含跨膜和細(xì)胞質(zhì)蛋白的兩個(gè)SwissProteinrelease34測(cè)試數(shù)據(jù)組之間的差別最大化(BoydD等人ProteinSci.19987：201-205)。將MaxH＜1.15的蛋白分類(lèi)為細(xì)胞質(zhì)蛋白，而MaxH＞1.15以及至少三種可能的TMS分類(lèi)為膜蛋白。錨蛋白被定義為具有正好兩個(gè)TMS，一個(gè)在氨基酸(aa)35之前起始，且一個(gè)H＞1.15，另一個(gè)的H不小于0.5。革蘭氏陽(yáng)性設(shè)置的SignalP被特別地用于M.Bacterium以在啟發(fā)分析中被分類(lèi)為細(xì)胞質(zhì)蛋白或“未知”蛋白的那些蛋白中鑒定分泌的蛋白(NielsenH等人ProteinEng.199710：1-6)。根據(jù)數(shù)個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，Rv2386c作為疫苗抗原的評(píng)分很高：(i)Rv2386c在所有休眠模型中均一致性地上調(diào)。在meta分析中評(píng)分的3999個(gè)基因的整個(gè)組合中，Rv2386c作為所有休眠模型中過(guò)量表達(dá)基因最高的10％中的一個(gè)，排位第120位。Rv2386c的上調(diào)評(píng)分為13.165，比最高基因評(píng)分22.28有利。Rv2386c最低限度地下調(diào)，評(píng)分僅略低于0(-2.316，與最大下調(diào)基因的-18.13相比)。(ii)從巨噬細(xì)胞清除鐵對(duì)于結(jié)核分枝桿菌存活和感染性是關(guān)鍵的。稱(chēng)為鐵載體的小分子在細(xì)菌中能夠結(jié)合鐵以進(jìn)行胞內(nèi)攝取，MbtI催化第一步驟以形成唯一的結(jié)核分枝桿菌鐵載體，分枝桿菌素T，其生物合成取決于從分支酸鹽生成水楊酸鹽(Harrison等人J.Bacteriol.2006188：6081-6091)。在人THP-1巨噬細(xì)胞的結(jié)核分枝桿菌感染中誘導(dǎo)MbtI的表達(dá)(Gold等人Mol.Microbiol.200142：851-865)。該3D蛋白結(jié)構(gòu)已知，且MbtI的酶作用機(jī)制已得到了充分研究(Zwahlen等人Biochemistry200746：954-964)。Rv2386c在必要性評(píng)分中排名很高，且為結(jié)核分枝桿菌在體外生長(zhǎng)模型中的存活所需(在可能評(píng)分5中得分2.6)。(iii)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分泌Rv2386c蛋白，因此具有明顯的胞外暴露，表明其作為疫苗靶標(biāo)的合適性。實(shí)施例2-Rv2386c表位鑒別方法基于如下方法進(jìn)行細(xì)胞T表位預(yù)測(cè)：結(jié)果表2-推定Rv2386c人CD4+T細(xì)胞表位表3-推定的Rv2386c人CD8+T細(xì)胞表位由表2和3可見(jiàn)，Rv2386c包含一些預(yù)測(cè)的CD4+和CD8+的T細(xì)胞表位。此外，該信息提示該蛋白攜帶了能被在全世界存在的HLAs所識(shí)別的表位(即，來(lái)自白種人、非洲、亞洲或拉丁美洲個(gè)體的HLAs，參見(jiàn)網(wǎng)址www.allelefrequencies.net)。實(shí)施例3-H37Rv同源物利用GenBank的BLASTP檢索鑒定來(lái)自一系列結(jié)核分枝桿菌菌株和BCG的Rv2386c序列(H37Rv參考序列的索引號(hào)YP_177877.1)。菌株索引號(hào)一致性％CDC1551NP_336935.1100F11YP_001288342.1100HaarlemZP_02247771.1100CZP_00878160.199BCGCAL72388.1100同源物序列的比對(duì)顯示了很高水平的一致性。生物測(cè)定對(duì)Rv2386c的T細(xì)胞應(yīng)答的定量可就激活T細(xì)胞(誘導(dǎo)增殖和/或生成細(xì)胞因子)的能力在感染(例如潛伏感染)個(gè)體的外周血單核細(xì)胞(PBMC)或全血制備物中篩選多肽。潛伏感染個(gè)體通?？赏ㄟ^(guò)直徑大于10mm的皮試、無(wú)癥狀、無(wú)Mtb陽(yáng)性培養(yǎng)物、痰菌陰性且無(wú)病變(通過(guò)胸部X射線檢測(cè))進(jìn)行鑒定。一系列的體外測(cè)定可基于PBMC樣本或全血使用：在抗原(或其適當(dāng)?shù)淖凅w/免疫原性片段)存在下再刺激后，可測(cè)定細(xì)胞的增殖(通過(guò)CFSE/流式細(xì)胞儀測(cè)定)或?qū)?xì)胞因子的生成進(jìn)行定量(存在于培養(yǎng)細(xì)胞的上清液中并通過(guò)ELISA測(cè)定，或者在CD4和CD8T細(xì)胞胞內(nèi)染色后通過(guò)流式細(xì)胞儀分析)。例如，PBMC樣本可通過(guò)Ficoll-Hypaque密度梯度離心后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)步驟從肝素化全血中獲得?？呻S后洗滌該細(xì)胞，并冷凍保存在液氮中直至測(cè)試(進(jìn)一步的細(xì)節(jié)可參見(jiàn)LalvaniA等人J.Infect.Dis.1999180：1656-1664)。T細(xì)胞增殖特異性免疫應(yīng)答可通過(guò)采用氚化胸腺嘧啶進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖分析進(jìn)行表征。該技術(shù)評(píng)估了對(duì)抗原體外刺激時(shí)的細(xì)胞擴(kuò)增。事實(shí)上，細(xì)胞增殖可通過(guò)評(píng)估氚化胸腺嘧啶在DNA中的結(jié)合進(jìn)行確定，該過(guò)程與細(xì)胞數(shù)量的根本變化緊密相關(guān)。更合適地，可采用二醋酸羧基熒光素的琥珀酰亞胺酯(CFSE)進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖。CFSE通過(guò)與賴(lài)氨酸側(cè)鏈和其它可獲得胺基團(tuán)的反應(yīng)自發(fā)和不可逆地偶聯(lián)至胞內(nèi)和細(xì)胞表面蛋白。當(dāng)淋巴細(xì)胞分裂時(shí)，CFSE標(biāo)記在子細(xì)胞中平均分布，因此后者具有親代細(xì)胞一半的熒光。結(jié)果，增殖細(xì)胞群體的每一個(gè)后代中的細(xì)胞熒光強(qiáng)度對(duì)分，并可容易地通過(guò)流式細(xì)胞儀跟蹤(進(jìn)一步的細(xì)節(jié)參見(jiàn)Hodgkins，PD等人J.Exp.Med.1996184：277-281)。實(shí)際上，在凍融后，可洗滌PMBC并用CFSE染色，然后以10μg/ml抗原在培養(yǎng)基(RPMI-1640，添加了谷氨酰胺、非必需氨基酸、丙酮酸鹽和熱滅活人AB血清)中培養(yǎng)(2x105細(xì)胞)72小時(shí)。然后可收獲細(xì)胞，通過(guò)表面染色表征其表型以鑒定記憶CD8和CD4+T-細(xì)胞。然后，流式細(xì)胞儀分析可用于顯示響應(yīng)每種抗原的淋巴細(xì)胞的增殖程度(在體外刺激時(shí)具有CFSE強(qiáng)度下降的細(xì)胞部分)。細(xì)胞因子生成IFN-γ生成(或者其它細(xì)胞因子的生成，例如IL2、TNF-alpha、IL5、IL12等)可采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)進(jìn)行測(cè)量。室溫下可將含于PBS的針對(duì)人IFN-γ(PharMingen，SanDiego，CA)的小鼠單克隆抗體涂覆ELISA板達(dá)四小時(shí)。然后用含5％(W/V)脫脂奶粉的PBS室溫封閉孔1小時(shí)。然后洗滌板，例如，用PBS/0.2％TWEEN-20洗滌六次，并在ELISA板中以1∶2稀釋于培養(yǎng)基中的樣本在室溫下孵育過(guò)夜。再次洗滌該板，并向每個(gè)孔添加多克隆兔抗人IFN-γ血清(例如，在PBS/10％普通山羊血清以1∶3000稀釋)。然后將該板室溫孵育兩小時(shí)，洗滌并可添加辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的抗兔IgG(SigmaChemicalSo.，St.Louis，MO)，例如其在PBS/5％脫脂奶粉中以1∶2000稀釋。進(jìn)一步室溫孵育兩小時(shí)后，洗滌該板并添加TMB底物。該反應(yīng)可在20分鐘后用1N硫酸終止。然后在450nm下以570nm作為參考波長(zhǎng)測(cè)定光密度。典型地，使兩個(gè)重復(fù)樣本得到比單獨(dú)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞的平均OD大兩倍的OD的部分可被認(rèn)為陽(yáng)性。實(shí)施例4-CB6F1小鼠中的免疫原性在CB6F1小鼠(BALB/c和C57BL/6小鼠雜交后的第一代)中評(píng)估抗原的免疫原性。用0.5μg或2μg蛋白抗原聯(lián)合佐劑系統(tǒng)AS01E(包含3D-MPL和QS21的脂質(zhì)體佐劑制劑)肌肉內(nèi)三次(在第0天、第14天和第28天)免疫CB6F1小鼠。該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：組第0天第14天第28天12μgRv2386c/AS01E2μgRv2386c/AS01E2μgRv2386c/AS01E20.5μgRv2386c/AS01E0.5μgRv2386c/AS01E0.5μgRv2386c/AS01E每個(gè)方案組中使用了總共24只小鼠。在21天(即，第二次免疫后7天)和第35天(即，第三次免疫后7天)收集并匯集外周血淋巴細(xì)胞(PBL)，并在用覆蓋目標(biāo)序列的15聚肽集合體外再刺激過(guò)夜后通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)量抗原特異性CD4＆CD8T細(xì)胞應(yīng)答(通過(guò)CD4或CD8T細(xì)胞生成IL-2和/或IFN-gamma和/或TNF-alpha測(cè)定)。表達(dá)IL-2和/或IFN-gamma和/或TNF-alpha的小鼠T細(xì)胞的檢測(cè)通過(guò)使用在細(xì)胞因子表達(dá)的短期抗原驅(qū)動(dòng)體外擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)。簡(jiǎn)言之，將PharmLyse溶液(BD-Pharmingen)添加至肝素化小鼠外周血中以裂解紅細(xì)胞。洗滌所得的PBLs(外周血淋巴細(xì)胞)，然后在覆蓋了目標(biāo)抗原序列的15-聚肽(11個(gè)氨基酸重疊)集合和1μg/ml針對(duì)CD28和CD49d的抗體(BD-Pharmingen)存在下進(jìn)行孵育。每種15-聚肽使用的終濃度為1μg/ml。培養(yǎng)基對(duì)照也以針對(duì)CD28和CD49d的抗體進(jìn)行刺激。在37℃，5％CO2下，培養(yǎng)開(kāi)始后2小時(shí)添加細(xì)胞因子分泌阻斷化合物布雷菲德菌素-A(BD-Pharmingen)，并繼續(xù)在37℃，5％CO2下培養(yǎng)細(xì)胞4小時(shí)，然后在+4℃下孵育過(guò)夜。然后收獲細(xì)胞并用海洋藍(lán)偶聯(lián)的抗-CD4抗體(BD-克隆RM4-5，BD-Pharmingen)和多甲藻黃素葉綠素A蛋白(PerCp)花青苷(Cy5.5)-偶聯(lián)的抗-CD8alpha抗體(克隆53-6.7，BD-Pharmingen)染色。然后洗滌細(xì)胞，固定，滲透(Cytofix-cytoperm試劑盒，BD-Pharmingen)并用別藻藍(lán)蛋白偶聯(lián)抗-IFN-g抗體(克隆XMG1.2，BDPharmingen)、異硫氰酸熒光素(FITC)-偶聯(lián)抗-IL-2抗體(克隆JES6-5H4，BeckmanCoulter)和藻紅蛋白(PE)-偶聯(lián)抗-TNFalpha抗體(克隆MP6-XT22，BDPharmingen)染色。最后的洗滌后，在LSRII流式細(xì)胞儀(Beckton-Dickinson)上分析染色細(xì)胞。在CD8+子集中獲得最少10,000個(gè)細(xì)胞。進(jìn)一步的背景參見(jiàn)WalzerT等人CellImmunol.2000206(1)：16-25和MaeckerHT等人J.Immunol.Methods2001255(1-2)：27-40。作為陰性對(duì)照，一些細(xì)胞也在培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)過(guò)夜(未刺激)?？乖禺愋詰?yīng)答可通過(guò)從肽刺激細(xì)胞生成的平均細(xì)胞因子應(yīng)答減去未刺激細(xì)胞生成的平均細(xì)胞因子應(yīng)答計(jì)算得到。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)于每個(gè)組，該數(shù)據(jù)可從4個(gè)集合(pool)中獲得，每個(gè)集合具有6只小鼠。如下數(shù)據(jù)顯示為生成IL-2和/或IFN-gamma和/或TNF-alpha的CD4或CD8T細(xì)胞的百分比。對(duì)每個(gè)單獨(dú)小鼠集合(三角)，以及該組的平均值(條形)繪圖。圖1顯示了在第21天(即，第二次免疫后7天)在以任一Rv2386c/AS01E劑量免疫的小鼠中測(cè)得的Rv2386c-特異性CD4和CD8T細(xì)胞應(yīng)答。與Rv2386的免疫劑量無(wú)關(guān)，Rv2386c-特異性CD4T細(xì)胞應(yīng)答水平相近。不同地，用2μgRv2386c/AS01E免疫的小鼠顯示了比用0.5μgRv2386c/AS01E免疫小鼠更高的Rv2386c-特異性CD8T細(xì)胞應(yīng)答。圖2顯示了在第21天(即，第二次免疫后7天)從Rv2386c肽集合刺激PBL(未除去培養(yǎng)基)獲得的CD4T細(xì)胞應(yīng)答的細(xì)胞因子分布。圖3顯示了在第21天(即，第二次免疫后7天)從Rv2386c肽集合刺激PBL(未除去培養(yǎng)基)獲得的CD8T細(xì)胞應(yīng)答的細(xì)胞因子分布。圖4顯示了在第35天(即，第三次免疫后7天)在以任一Rv2386c/AS01E劑量免疫的小鼠中測(cè)得的Rv2386c-特異性CD4和CD8T細(xì)胞應(yīng)答。與Rv2386的免疫劑量無(wú)關(guān)，Rv2386c-特異性CD4T細(xì)胞應(yīng)答水平相近。不同地，用2μgRv2386c/AS01E免疫的小鼠顯示了比用0.5μgRv2386c/AS01E免疫小鼠更高的Rv2386c-特異性CD8T細(xì)胞應(yīng)答。第三次免疫劑量提高了CD4T細(xì)胞應(yīng)答，但未提高CD8T細(xì)胞應(yīng)答。圖5顯示了在第35天(即，第三次免疫后7天)從Rv2386c肽集合刺激PBL(未除去培養(yǎng)基)獲得的CD4T細(xì)胞應(yīng)答的細(xì)胞因子分布。圖6顯示了在第35天(即，第三次免疫后7天)從Rv2386c肽集合刺激PBL(未除去培養(yǎng)基)獲得的CD8T細(xì)胞應(yīng)答的細(xì)胞因子分布。實(shí)施例5-C57BL/6小鼠中的免疫原性C57BL/6小鼠中的抗原免疫原性也進(jìn)行了評(píng)估。用1μg或4μg蛋白抗原聯(lián)合佐劑系統(tǒng)AS01E(包含3D-MPL和QS21的脂質(zhì)體佐劑制劑)肌肉內(nèi)三次(在第0天、第14天和第28天)免疫C57BL/6小鼠。該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：組第0天第14天第28天14μgRv2386c/AS01E4μgRv2386c/AS01E4μgRv2386c/AS01E21μgRv2386c/AS01E1μgRv2386c/AS01E1μgRv2386c/AS01E在21天(即，第二次免疫后7天)和第35天(即，第三次免疫后7天)收集并匯集外周血淋巴細(xì)胞(PBL)，并在用覆蓋目標(biāo)序列的15聚肽集合體外再刺激過(guò)夜后通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)量抗原特異性CD4＆CD8T細(xì)胞應(yīng)答(通過(guò)CD4或CD8T細(xì)胞生成IL-2和/或IFN-gamma和/或TNF-alpha測(cè)定)。該步驟如上所述。作為陰性對(duì)照，一些細(xì)胞也在培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)過(guò)夜(未刺激)?？乖禺愋詰?yīng)答可通過(guò)從肽刺激細(xì)胞生成的平均細(xì)胞因子應(yīng)答減去未刺激細(xì)胞生成的平均細(xì)胞因子應(yīng)答計(jì)算得到。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，對(duì)于每個(gè)組，該數(shù)據(jù)可從4個(gè)集合中獲得，每個(gè)集合具有6只小鼠。如下數(shù)據(jù)顯示為生成IL-2和/或IFN-gamma和/或TNF-alpha的CD4或CD8T細(xì)胞的百分比。對(duì)每個(gè)單獨(dú)小鼠集合(三角)，以及該組的平均值(條形)繪圖。圖7顯示了在第21天(即，第二次免疫后7天)在以任一Rv2386c/AS01E劑量免疫的小鼠中測(cè)得的Rv2386c-特異性CD4和CD8T細(xì)胞應(yīng)答。與Rv2386c的免疫劑量無(wú)關(guān)，Rv2386c-特異性CD4T細(xì)胞應(yīng)答水平相近。不同地，用4μgRv2386c/AS01E免疫的小鼠顯示了比用1μgRv2386c/AS01E免疫的小鼠更高的Rv2386c-特異性CD8T細(xì)胞應(yīng)答。由于技術(shù)上的障礙，在4μg劑量下的第一細(xì)胞集合的數(shù)據(jù)不可得。圖8顯示了在第21天(即，第二次免疫后7天)從Rv2386c肽集合刺激PBL(未除去培養(yǎng)基)獲得的CD4T細(xì)胞應(yīng)答的細(xì)胞因子分布。由于技術(shù)上的障礙，在4μg劑量下的第一細(xì)胞集合的數(shù)據(jù)不可得。圖9顯示了在第21天(即，第二次免疫后7天)從Rv2386c肽集合刺激PBL(未除去培養(yǎng)基)獲得的CD8T細(xì)胞應(yīng)答的細(xì)胞因子分布。由于技術(shù)上的障礙，在4μg劑量下的第一細(xì)胞集合的數(shù)據(jù)不可得。在準(zhǔn)備本申請(qǐng)時(shí)，第35天的免疫學(xué)數(shù)據(jù)仍未得到。綜上所述，應(yīng)注意Rv2386c抗原能夠同時(shí)誘發(fā)CB6F1和C57BL/6小鼠的免疫應(yīng)答。此外，細(xì)胞因子生成的分布表明了大部分抗原特異性T細(xì)胞表達(dá)了多種Th1相關(guān)的細(xì)胞因子(即，誘發(fā)了多功能T-細(xì)胞應(yīng)答)。重要的是，CD4和CD8抗原特異性T細(xì)胞均在免疫后存在，CD8細(xì)胞對(duì)于潛伏TB的情況特別重要。因此，可預(yù)期Rv2386c對(duì)預(yù)防、治療和診斷潛伏結(jié)核病感染具有重要的價(jià)值。盡管前述發(fā)明已通過(guò)闡釋目的的圖示和實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)描述，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)應(yīng)當(dāng)能夠容易地理解，可在不脫離附加權(quán)利要求的精神和范圍的情況下對(duì)其進(jìn)行一定的更改和調(diào)整。本申請(qǐng)中所涉及的所有參考文獻(xiàn)，包括專(zhuān)利和專(zhuān)利申請(qǐng)，均最大程度引用作為參考，其引用程度如同每一個(gè)單獨(dú)的公布和專(zhuān)利申請(qǐng)均為特定的單獨(dú)的引用作為參考。在整個(gè)說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中，除非另行指明，用語(yǔ)“包含”及其變體“包括”將理解為包含所述整數(shù)、節(jié)距、整數(shù)組或節(jié)距組，但不排除任意其它的整數(shù)、節(jié)距、整數(shù)組或節(jié)距組。序列表<110>葛蘭素史密絲克萊恩生物有限公司葛蘭素集團(tuán)有限公司P.梅滕斯J.布朗D.墨菲<120>新型組合物和方法<130>VB63088PCT<150>US61/083699<151>2008-07-25<160>156<170>PatentInversion3.5<210>1<211>450<212>PRT<213>結(jié)核分枝桿菌<220><221>MISC_FEATURE<223>菌株H37Rv<400>1MetSerGluLeuSerValAlaThrGlyAlaValSerThrAlaSerSer151015SerIleProMetProAlaGlyValAsnProAlaAspLeuAlaAlaGlu202530LeuAlaAlaValValThrGluSerValAspGluAspTyrLeuLeuTyr354045GluCysAspGlyGlnTrpValLeuAlaAlaGlyValGlnAlaMetVal505560GluLeuAspSerAspGluLeuArgValIleArgAspGlyValThrArg65707580ArgGlnGlnTrpSerGlyArgProGlyAlaAlaLeuGlyGluAlaVal859095AspArgLeuLeuLeuGluThrAspGlnAlaPheGlyTrpValAlaPhe100105110GluPheGlyValHisArgTyrGlyLeuGlnGlnArgLeuAlaProHis115120125ThrProLeuAlaArgValPheSerProArgThrArgIleMetValSer130135140GluLysGluIleArgLeuPheAspAlaGlyIleArgHisArgGluAla145150155160IleAspArgLeuLeuAlaThrGlyValArgGluValProGlnSerArg165170175SerValAspValSerAspAspProSerGlyPheArgArgArgValAla180185190ValAlaValAspGluIleAlaAlaGlyArgTyrHisLysValIleLeu195200205SerArgCysValGluValProPheAlaIleAspPheProLeuThrTyr210215220ArgLeuGlyArgArgHisAsnThrProValArgSerPheLeuLeuGln225230235240LeuGlyGlyIleArgAlaLeuGlyTyrSerProGluLeuValThrAla245250255ValArgAlaAspGlyValValIleThrGluProLeuAlaGlyThrArg260265270AlaLeuGlyArgGlyProAlaIleAspArgLeuAlaArgAspAspLeu275280285GluSerAsnSerLysGluIleValGluHisAlaIleSerValArgSer290295300SerLeuGluGluIleThrAspIleAlaGluProGlySerAlaAlaVal305310315320IleAspPheMetThrValArgGluArgGlySerValGlnHisLeuGly325330335SerThrIleArgAlaArgLeuAspProSerSerAspArgMetAlaAla340345350LeuGluAlaLeuPheProAlaValThrAlaSerGlyIleProLysAla355360365AlaGlyValGluAlaIlePheArgLeuAspGluCysProArgGlyLeu370375380TyrSerGlyAlaValValMetLeuSerAlaAspGlyGlyLeuAspAla385390395400AlaLeuThrLeuArgAlaAlaTyrGlnValGlyGlyArgThrTrpLeu405410415ArgAlaGlyAlaGlyIleIleGluGluSerGluProGluArgGluPhe420425430GluGluThrCysGluLysLeuSerThrLeuThrProTyrLeuValAla435440445ArgGln450<210>2<211>1353<212>DNA<213>結(jié)核分枝桿菌<220><221>misc_feature<223>菌株H37Rv<400>2atgtccgagctcagcgtcgcgacaggcgccgtcagcaccgcgtcgtcgtccatcccgatg60cccgccggtgtcaaccccgccgacctggcagcggagctggcggcggtggttaccgagtcc120gtcgacgaggattacctgctctacgagtgcgacggccaatgggtcctggccgccggtgtg180caggcgatggtggagctagacagcgacgaactgcgcgtcatccgtgatggcgttacgcgg240cgacagcaatggtcgggtcgcccgggagcggccctgggcgaagccgtcgatcggctgttg300ctggaaaccgatcaagcttttggctgggtcgccttcgaattcggcgtgcaccgctatggg360ttgcagcagcggctggcgccgcacaccccactggcccgggtgttttcgccccgaacccgg420atcatggtgagcgaaaaggagattcgcctgttcgatgctgggattcgccaccgcgaggcc480atcgaccgattactcgccaccggggtgcgagaggtgccgcagtcccgctccgtcgacgtc540tccgacgatccatccggcttccgccgtcgggtggcggtagccgtcgatgaaatcgctgcc600ggccgctaccacaaggtgattctgtcccgttgtgtcgaagtgcctttcgcgatcgacttt660ccgttgacctaccggctggggcgtcggcacaacaccccggtgaggtcgtttttgttgcag720ttgggcggaatccgtgctctgggttacagccccgaactcgtcacggcggtgcgcgccgac780ggagtggtgatcaccgagccgttggccggtacccgcgccttgggccgtggtcccgccatt840gaccgactggctcgtgatgacctggaatcaaactccaaagaaattgtcgagcacgccatt900tcagtgcgctcttcgcttgaggagattaccgacatcgccgaaccagggagtgctgcggtc960atcgatttcatgacggtgcgcgagcgcggcagtgtgcagcacctcggctccaccatcaga1020gcacggttggatccatcgagcgaccggatggccgccctggaagccctttttcctgctgtc1080actgcatccggaatcccgaaagcagctggcgttgaggccatctttcgcctcgatgagtgc1140ccacgtgggctgtattccggtgcggtggtgatgctttcggcggatggcgggctagacgcc1200gcgctgacgctgcgggcggcataccaggtcggcgggcggacttggctgcgggccggcgcc1260ggcatcatcgaagaatcggagccagagcgcgaattcgaggagacttgcgaaaagctatcc1320acattgacgccttatctggttgcacgccagtaa1353<210>3<211>450<212>PRT<213>結(jié)核分枝桿菌<220><221>MISC_FEATURE<223>菌株CDC1551<400>3MetSerGluLeuSerValAlaThrGlyAlaValSerThrAlaSerSer151015SerIleProMetProAlaGlyValAsnProAlaAspLeuAlaAlaGlu202530LeuAlaAlaValValThrGluSerValAspGluAspTyrLeuLeuTyr354045GluCysAspGlyGlnTrpValLeuAlaAlaGlyValGlnAlaMetVal505560GluLeuAspSerAspGluLeuArgValIleArgAspGlyValThrArg65707580ArgGlnGlnTrpSerGlyArgProGlyAlaAlaLeuGlyGluAlaVal859095AspArgLeuLeuLeuGluThrAspGlnAlaPheGlyTrpValAlaPhe100105110GluPheGlyValHisArgTyrGlyLeuGlnGlnArgLeuAlaProHis115120125ThrProLeuAlaArgValPheSerProArgThrArgIleMetValSer130135140GluLysGluIleArgLeuPheAspAlaGlyIleArgHisArgGluAla145150155160IleAspArgLeuLeuAlaThrGlyValArgGluValProGlnSerArg165170175SerValAspValSerAspAspProSerGlyPheArgArgArgValAla180185190ValAlaValAspGluIleAlaAlaGlyArgTyrHisLysValIleLeu195200205SerArgCysValGluValProPheAlaIleAspPheProLeuThrTyr210215220ArgLeuGlyArgArgHisAsnThrProValArgSerPheLeuLeuGln225230235240LeuGlyGlyIleArgAlaLeuGlyTyrSerProGluLeuValThrAla245250255ValArgAlaAspGlyValValIleThrGluProLeuAlaGlyThrArg260265270AlaLeuGlyArgGlyProAlaIleAspArgLeuAlaArgAspAspLeu275280285GluSerAsnSerLysGluIleValGluHisAlaIleSerValArgSer290295300SerLeuGluGluIleThrAspIleAlaGluProGlySerAlaAlaVal305310315320IleAspPheMetThrValArgGluArgGlySerValGlnHisLeuGly325330335SerThrIleArgAlaArgLeuAspProSerSerAspArgMetAlaAla340345350LeuGluAlaLeuPheProAlaValThrAlaSerGlyIleProLysAla355360365AlaGlyValGluAlaIlePheArgLeuAspGluCysProArgGlyLeu370375380TyrSerGlyAlaValValMetLeuSerAlaAspGlyGlyLeuAspAla385390395400AlaLeuThrLeuArgAlaAlaTyrGlnValGlyGlyArgThrTrpLeu405410415ArgAlaGlyAlaGlyIleIleGluGluSerGluProGluArgGluPhe420425430GluGluThrCysGluLysLeuSerThrLeuThrProTyrLeuValAla435440445ArgGln450<210>4<211>450<212>PRT<213>結(jié)核分枝桿菌<220><221>MISC_FEATURE<223>菌株F11<400>4MetSerGluLeuSerValAlaThrGlyAlaValSerThrAlaSerSer151015SerIleProMetProAlaGlyValAsnProAlaAspLeuAlaAlaGlu202530LeuAlaAlaValValThrGluSerValAspGluAspTyrLeuLeuTyr354045GluCysAspGlyGlnTrpValLeuAlaAlaGlyValGlnAlaMetVal505560GluLeuAspSerAspGluLeuArgValIleArgAspGlyValThrArg65707580ArgGlnGlnTrpSerGlyArgProGlyAlaAlaLeuGlyGluAlaVal859095AspArgLeuLeuLeuGluThrAspGlnAlaPheGlyTrpValAlaPhe100105110GluPheGlyValHisArgTyrGlyLeuGlnGlnArgLeuAlaProHis115120125ThrProLeuAlaArgValPheSerProArgThrArgIleMetValSer130135140GluLysGluIleArgLeuPheAspAlaGlyIleArgHisArgGluAla145150155160IleAspArgLeuLeuAlaThrGlyValArgGluValProGlnSerArg165170175SerValAspValSerAspAspProSerGlyPheArgArgArgValAla180185190ValAlaValAspGluIleAlaAlaGlyArgTyrHisLysValIleLeu195200205SerArgCysValGluValProPheAlaIleAspPheProLeuThrTyr210215220ArgLeuGlyArgArgHisAsnThrProValArgSerPheLeuLeuGln225230235240LeuGlyGlyIleArgAlaLeuGlyTyrSerProGluLeuValThrAla245250255ValArgAlaAspGlyValValIleThrGluProLeuAlaGlyThrArg260265270AlaLeuGlyArgGlyProAlaIleAspArgLeuAlaArgAspAspLeu275280285GluSerAsnSerLysGluIleValGluHisAlaIleSerValArgSer290295300SerLeuGluGluIleThrAspIleAlaGluProGlySerAlaAlaVal305310315320IleAspPheMetThrValArgGluArgGlySerValGlnHisLeuGly325330335SerThrIleArgAlaArgLeuAspProSerSerAspArgMetAlaAla340345350LeuGluAlaLeuPheProAlaValThrAlaSerGlyIleProLysAla355360365AlaGlyValGluAlaIlePheArgLeuAspGluCysProArgGlyLeu370375380TyrSerGlyAlaValValMetLeuSerAlaAspGlyGlyLeuAspAla385390395400AlaLeuThrLeuArgAlaAlaTyrGlnValGlyGlyArgThrTrpLeu405410415ArgAlaGlyAlaGlyIleIleGluGluSerGluProGluArgGluPhe420425430GluGluThrCysGluLysLeuSerThrLeuThrProTyrLeuValAla435440445ArgGln450<210>5<211>450<212>PRT<213>結(jié)核分枝桿菌<220><221>MISC_FEATURE<223>菌株HaarlemA<400>5MetSerGluLeuSerValAlaThrGlyAlaValSerThrAlaSerSer151015SerIleProMetProAlaGlyValAsnProAlaAspLeuAlaAlaGlu202530LeuAlaAlaValValThrGluSerValAspGluAspTyrLeuLeuTyr354045GluCysAspGlyGlnTrpValLeuAlaAlaGlyValGlnAlaMetVal505560GluLeuAspSerAspGluLeuArgValIleArgAspGlyValThrArg65707580ArgGlnGlnTrpSerGlyArgProGlyAlaAlaLeuGlyGluAlaVal859095AspArgLeuLeuLeuGluThrAspGlnAlaPheGlyTrpValAlaPhe100105110GluPheGlyValHisArgTyrGlyLeuGlnGlnArgLeuAlaProHis115120125ThrProLeuAlaArgValPheSerProArgThrArgIleMetValSer130135140GluLysGluIleArgLeuPheAspAlaGlyIleArgHisArgGluAla145150155160IleAspArgLeuLeuAlaThrGlyValArgGluValProGlnSerArg165170175SerValAspValSerAspAspProSerGlyPheArgArgArgValAla180185190ValAlaValAspGluIleAlaAlaGlyArgTyrHisLysValIleLeu195200205SerArgCysValGluValProPheAlaIleAspPheProLeuThrTyr210215220ArgLeuGlyArgArgHisAsnThrProValArgSerPheLeuLeuGln225230235240LeuGlyGlyIleArgAlaLeuGlyTyrSerProGluLeuValThrAla245250255ValArgAlaAspGlyValValIleThrGluProLeuAlaGlyThrArg260265270AlaLeuGlyArgGlyProAlaIleAspArgLeuAlaArgAspAspLeu275280285GluSerAsnSerLysGluIleValGluHisAlaIleSerValArgSer290295300SerLeuGluGluIleThrAspIleAlaGluProGlySerAlaAlaVal305310315320IleAspPheMetThrValArgGluArgGlySerValGlnHisLeuGly325330335SerThrIleArgAlaArgLeuAspProSerSerAspArgMetAlaAla340345350LeuGluAlaLeuPheProAlaValThrAlaSerGlyIleProLysAla355360365AlaGlyValGluAlaIlePheArgLeuAspGluCysProArgGlyLeu370375380TyrSerGlyAlaValValMetLeuSerAlaAspGlyGlyLeuAspAla385390395400AlaLeuThrLeuArgAlaAlaTyrGlnValGlyGlyArgThrTrpLeu405410415ArgAlaGlyAlaGlyIleIleGluGluSerGluProGluArgGluPhe420425430GluGluThrCysGluLysLeuSerThrLeuThrProTyrLeuValAla435440445ArgGln450<210>6<211>450<212>PRT<213>結(jié)核分枝桿菌<220><221>MISC_FEATURE<223>菌株C<400>6MetSerGluLeuSerValAlaThrGlyAlaValSerThrAlaSerSer151015SerIleProMetProAlaGlyValAsnProAlaAspLeuAlaAlaGlu202530LeuAlaAlaValValThrGluSerValAspGluAspTyrLeuLeuTyr354045GluCysAspGlyGlnTrpValLeuAlaAlaGlyValGlnAlaMetVal505560GluLeuAspSerAspGluLeuArgValIleArgAspGlyValThrArg65707580ArgGlnGlnTrpSerGlyArgProGlyAlaAlaLeuGlyGluAlaVal859095AspArgLeuLeuLeuGluThrAspGlnAlaPheGlyTrpValAlaLeu100105110GluPheGlyValHisArgTyrGlyLeuGlnGlnArgLeuAlaProHis115120125ThrProLeuAlaArgValPheSerP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