本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多肽，尤其涉及一種結(jié)合多種淀粉樣蛋白單體和聚集體的多肽及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

淀粉樣蛋白疾病是由淀粉樣蛋白聚集引起的二十多種疾病的總稱，它包括阿爾茨海默病(俗稱老年性癡呆)(Alzheimer’disease,AD)、帕金森病(Parkinson’disease,PD)、舞蹈病(Huntington’s disease，HD)等。不同淀粉樣蛋白疾病發(fā)生病變的部位有所不同，主要涉及神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、肝臟、腎臟等。某些蛋白質(zhì)單體本身無毒性或毒性很小，但它們可聚集成具有毒性作用的寡聚物(oligomer)或纖維狀物(fibril)而引起一系列疾病，如β-amyloid(Aβ)可引起AD，α-synuclein可引起PD，朊病毒蛋白(Prion protein PrP)可引起包括瘋牛病在內(nèi)的人和動物的至少十余種腦病，含有多聚谷氨酰胺(PolyQ)的多肽可引起包括HD在內(nèi)的至少9種遺傳性神經(jīng)退行性疾病，胰島淀粉樣多肽(islet amyloid polypeptide，IAPP,amylin)可引起II型糖尿病及長時(shí)間透析導(dǎo)致的溶菌酶(lysozyme)聚集沉積所引起的疾病等。其中，對人類健康危害最大的為AD、PD及II型糖尿病。醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)表明，我國和歐美國家中65歲以上老年人中5～6％患有AD，并且發(fā)病率逐年上升。該病已被列為導(dǎo)致死亡的第四大疾病，僅次于心臟病、癌癥和中風(fēng)。另有約1％的65歲以上老年人患有PD。而患有II型糖尿病的人數(shù)可達(dá)總?cè)丝诘?％以上。這些疾病對人類的健康造成了很大危害，其發(fā)病的根本原因(或部分原因)在于某些蛋白質(zhì)自身的聚集。

研究表明，不同蛋白質(zhì)的聚集最先始于錯(cuò)誤折疊或變性的蛋白質(zhì)單體，單體多肽鏈間氫鍵的形成導(dǎo)致了蛋白分子的聚合。首先形成由電子或原子力顯微鏡可觀察到的大小約為3-10nm的可溶性球形寡聚物，某些寡聚物進(jìn)一步可聚集成彎曲柔韌的絲狀物(protofibril)，進(jìn)而形成直徑為6-10nm的表面光滑或呈螺旋狀的纖維。非同源性的蛋白質(zhì)最終可形成具有相似結(jié)構(gòu)的蛋白聚合物。由Aβ、α-synuclein、PrP、IAPP、胰島素和溶菌酶等各種各樣的蛋白聚集形成的纖維都含有“cross-Beta”結(jié)構(gòu)，其中β片層構(gòu)成的骨架與纖維縱軸垂直，而骨架中的氫鍵網(wǎng)與縱軸平行。多肽在β片層中排列為平行的β鏈，在β片層中，氨基酸都有精確的位置。不同來源的寡聚物也具有相似的結(jié)構(gòu)特征，寡聚物特異性識別抗體可以與由不同來源的蛋白質(zhì)單體形成的寡聚物結(jié)合，而不與它們的單體和纖維結(jié)合。這表明淀粉樣蛋白多肽骨架可形成獨(dú)立于其氨基酸一級序列之外的共同的寡聚物特有的抗原表位。Glabe實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用連接有Aβ40的金膠顆粒模擬Aβ40寡聚物制備出了不僅可與Aβ40和Aβ42寡聚物結(jié)合，并且還可與α-synuclein、IAPP、PolyQ、PrP、胰島素、溶菌酶等形成的寡聚物結(jié)合的多克隆抗體(A11)，該抗體還能夠有效地抑制所有這些寡聚物的細(xì)胞毒性。

過去人們一直認(rèn)為淀粉樣蛋白疾病的發(fā)生是由蛋白質(zhì)聚集成的不溶性的纖維狀物引起 的。近年來大量的研究表明，引起致病的關(guān)鍵因素是體積較小的水溶性的寡聚物。由蛋白寡聚物引起的退行性疾病存在著相似的機(jī)理，即細(xì)胞膜損傷、氧化應(yīng)激、線粒體功能失調(diào)、信號傳遞異常、細(xì)胞死亡等。寡聚物形成的機(jī)理及怎樣才能有效地抑制其細(xì)胞毒性等都是人們亟待探討和解決的問題。對于Aβ來說，它可以形成不同的寡聚體形式，如纖維性寡聚體(FO)、前纖維性寡聚體(PFO)。前者可以進(jìn)一步聚集形成纖維，而后者則不可。FO和PFO可分別被構(gòu)象依賴性抗體OC和A11識別。Aβ還可以形成另外的寡聚體形式，如可被單鏈抗體W20識別而不被OC和A11識別的寡聚體。研究發(fā)現(xiàn)，這3類抗體不僅與Aβ結(jié)合，還可以與α-synuclein、amylin、胰島素、溶菌酶等淀粉樣蛋白的寡聚體結(jié)合，表明多種淀粉樣蛋白寡聚體可形成獨(dú)立于蛋白以及序列以外的相同結(jié)構(gòu)。同樣地，各淀粉樣蛋白聚集形成的纖維也可形成共同的空間結(jié)構(gòu)，并與同一抗體相結(jié)合。但是，各淀粉樣蛋白單體、寡聚體及纖維之間是否存在有相同的與蛋白一級序列無關(guān)的結(jié)構(gòu)尚未見報(bào)道。

AD是由Aβ聚集引起的老年人以記憶力漸進(jìn)性喪失、腦內(nèi)形成老年斑為特征的神經(jīng)退行性疾病。Aβ寡聚體可以富集在神經(jīng)突觸，引起突觸退化、胰島素抵抗及tau蛋白的過度磷酸化?；贏β及其它淀粉樣蛋白致病的機(jī)理，對淀粉樣蛋白疾病治療的策略一般為：抑制淀粉樣蛋白的產(chǎn)生、聚集或細(xì)胞毒性，加快淀粉樣蛋白的清除。在淀粉樣蛋白導(dǎo)致疾病的發(fā)生發(fā)展中還與其引起的氧化應(yīng)激、一氧化氮產(chǎn)生、炎癥因子的形成有關(guān)。

因此，成功的淀粉樣蛋白疾病治療藥物應(yīng)該是多功能的。多肽類藥物近十多年來一直受到醫(yī)藥界的廣泛關(guān)注，它具有免疫原性低、毒性低、并可以較容易地以生物技術(shù)方法增進(jìn)其特異性、穩(wěn)定性和穿透性等特點(diǎn)。CN 104277105 A公開了一種抑制β淀粉樣蛋白聚集和毒性的多肽或其具有所述多肽功能的變體。本發(fā)明的多肽與Aβ蛋白存在強(qiáng)結(jié)合力，可以大大降低Aβ達(dá)到聚集平衡狀態(tài)時(shí)β折疊結(jié)構(gòu)的有效含量，改變Aβ在溶液環(huán)境中的二級結(jié)構(gòu)，使得β折疊結(jié)構(gòu)的含量大大降低甚至消失，并在極低的濃度下就可以明顯降低Aβ對SH-SY5Y細(xì)胞的毒性并能夠大大抑制Aβ誘導(dǎo)的活性氧的產(chǎn)生，從而為β淀粉樣蛋白引起的阿爾茲海默癥的治療提供可行方法。該發(fā)明中的多肽只能特異性的識別和結(jié)合Aβ蛋白，結(jié)合淀粉樣蛋白單體，抑制淀粉樣蛋白聚集、細(xì)胞毒性和氧化應(yīng)激及神經(jīng)炎癥等，但不能同時(shí)識別多種淀粉樣蛋白單體、寡聚體和纖維。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種多肽及其應(yīng)用，特別是一種結(jié)合多種淀粉樣蛋白單體和聚集體的多肽及其應(yīng)用，該多肽不僅能與Aβ蛋白結(jié)合，還能與其他淀粉樣蛋白包括amylin、胰島素和溶菌酶等結(jié)合。

為達(dá)到此發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供了一種結(jié)合多種淀粉樣蛋白單體和聚集體的多肽，所述的多肽包 含(a)和/或(b)所示的氨基酸序列：

(a)所述氨基酸序列的通式為：Ser-X₁-Phe-X₂-Asn-Lys-Arg，其中，X₁和X₂獨(dú)立的為20種氨基酸中的任意一種；

(b)或具有所述多肽功能的對所示的氨基酸序列的通式(a)進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加修飾的變體。

本發(fā)明中，所述多肽分子量小，可特異性結(jié)合Aβ42、amylin、胰島素和溶菌酶的寡聚體及Aβ42和amylin的單體和纖維，抑制Aβ42和溶菌酶的聚集，并抑制Aβ42、amylin、胰島素和溶菌酶的細(xì)胞毒性，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受Aβ42毒性的影響。

優(yōu)選地，所述多肽的氨基酸序列為SEQ ID NO.1-2所示的氨基酸序列或具有所述多肽功能的對SEQ ID NO.1-2所示的氨基酸序列進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加修飾的變體。

優(yōu)選地，所述變體的序列選自但不限于重點(diǎn)列舉的SEQ ID NO.3-6。

氨基酸序列如下：

SEQ ID NO.1：Ser-X₁-Phe-X₂-Asn-Lys-Arg；

SEQ ID NO.2：Ser-Phe-Phe-Asn-Asn-Lys-Arg；(ZR多肽)

SEQ ID NO.3：Ser-Phe-Phe-Asn-Lys-Arg；

SEQ ID NO.4：Ser-Ala-Phe-Gln-Asn-Lys-Arg；

SEQ ID NO.5：Ser-Phe-Phe-Asn-Asn-Asn-Lys-Arg；

SEQ ID NO.6：Ser-Phe-Phe-Asn-Asn-Lys-Arg-Lys。

第二方面，本發(fā)明提供一種DNA片段，其包含編碼第一方面所述多肽的核苷酸序列。

第三方面，本發(fā)明提供一種重組載體，所述重組載體包含至少一個(gè)拷貝的如第二方面所述的DNA片段。

第四方面，本發(fā)明提供一種重組細(xì)胞，所述重組細(xì)胞包含第三方面所述的重組載體。

第五方面，本發(fā)明提供一種淀粉樣蛋白細(xì)胞毒性抑制劑，所述抑制劑包含如第一方面所述的多肽、第二方面所述的DNA片段、第三方面所述的重組載體或第四方面所述的重組細(xì)胞中的任意一種或至少兩種的組合。

優(yōu)選地，所述抑制劑在抑制Aβ、amylin、胰島素和溶菌酶的細(xì)胞毒性上的應(yīng)用。

優(yōu)選地，所述細(xì)胞為SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞。

第六方面，本發(fā)明提供一種淀粉樣蛋白聚集抑制劑，所述促進(jìn)劑包含如第一方面所述的多肽、第二方面所述的DNA片段、第三方面所述的重組載體或第四方面所述的重組細(xì)胞中的任意一種或至少兩種的組合。

優(yōu)選地，所述抑制劑在抑制Aβ和溶菌酶的聚集上的應(yīng)用。

第七方面，本發(fā)明提供一種細(xì)胞清除Aβ促進(jìn)劑，所述促進(jìn)劑包含如第一方面所述的多肽、第二方面所述的DNA片段、第三方面所述的重組載體或第四方面所述的重組細(xì)胞中的任意一種或至少兩種的組合。

優(yōu)選地，所述細(xì)胞為小膠質(zhì)細(xì)胞，優(yōu)選為BV-2細(xì)胞。

優(yōu)選地，所述Aβ為Aβ42。

本發(fā)明中，所述Aβ促進(jìn)劑能增加小膠質(zhì)細(xì)胞對Aβ的吞噬作用。

第八方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，包含如第一方面所述的多肽、第二方面所述的DNA片段、第三方面所述的重組載體或第四方面所述的重組細(xì)胞中的任意一種或至少兩種的組合。

優(yōu)選地，所述藥物組合物還包含藥學(xué)上接受的輔料。

優(yōu)選地，所述輔料為賦形劑、稀釋劑、載體、調(diào)味劑、粘合劑和填充劑中的任意一種或至少兩種的組合。

優(yōu)選地，所述藥物組合物在制備檢測、診斷和/或治療與淀粉樣蛋白相關(guān)的疾病的藥物中的應(yīng)用。

優(yōu)選地，所述疾病包括阿爾茨海默病(AD)、帕金森病(PD)、亨廷頓舞蹈病(HD)或II型糖尿病(T2DM)中的任意一種或至少兩種的組合。

本發(fā)明中，所述多肽能提高AD轉(zhuǎn)基因小鼠的空間記憶能力、減少小鼠腦內(nèi)老年斑的數(shù)量和/或降低小鼠腦內(nèi)Aβ40和Aβ42的水平和腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)；所述多肽能改善PD轉(zhuǎn)基因小鼠的行為協(xié)調(diào)能力，降低PD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的α-synuclein蛋白水平；所述多肽還能改善HD轉(zhuǎn)基因小鼠的行為協(xié)調(diào)能力，降低HD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)的HTT蛋白水平。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明多肽分子量小，可特異性結(jié)合Aβ42、amylin、胰島素和溶菌酶的寡聚體及Aβ42和amylin的單體和纖維，抑制Aβ42和溶菌酶的聚集，并抑制Aβ42、amylin、胰島素和溶菌酶的細(xì)胞毒性，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受Aβ42毒性的影響；

(2)本發(fā)明多肽在AD、PD、HD和T2DM等淀粉樣蛋白疾病的預(yù)防和治療方面具有廣泛的應(yīng)用前景，為AD、PD、HD和T2DM等淀粉樣蛋白疾病的治療診斷奠定了基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為本發(fā)明ELISA檢測ZR多肽與多種淀粉樣蛋白結(jié)合圖；

圖2為本發(fā)明Dot-blot檢測ZR多肽與多種淀粉樣蛋白結(jié)合圖，其中，圖2(A)ZR多肽與各時(shí)間點(diǎn)的Aβ42結(jié)合圖，圖2(B)ZR多肽與各時(shí)間點(diǎn)的Aβ42結(jié)合的形態(tài)圖，圖2(C)ZR多肽與各時(shí)間點(diǎn)的amylin結(jié)合圖，圖2(D)ZR多肽與各時(shí)間點(diǎn)的amylin結(jié)合的形態(tài)圖，圖2(E)ZR多肽與各時(shí)間點(diǎn)的溶菌酶結(jié)合圖，圖2(F)ZR多肽與各時(shí)間點(diǎn)的溶菌酶結(jié)合圖的形態(tài)圖， 圖2(G)ZR多肽與各時(shí)間點(diǎn)的胰島素結(jié)合圖，圖2(H)ZR多肽與各時(shí)間點(diǎn)的胰島素結(jié)合的形態(tài)圖；

圖3為本發(fā)明ELISA檢測ZR多肽衍生物與Aβ42寡聚體的結(jié)合，其中，圖3(A)為序列1-8與Aβ42寡聚體結(jié)合的檢測結(jié)果，圖3(B)為序列1、9-12與Aβ42寡聚體結(jié)合的檢測結(jié)果；

圖4(A)為本發(fā)明ZR多肽抑制Aβ42的聚集的熒光密度圖，圖4(B)為本發(fā)明ZR多肽抑制amylin的聚集的熒光密度圖，圖4(C)為本發(fā)明ZR多肽抑制溶菌酶的聚集的熒光密度圖，圖4(D)為本發(fā)明ZR多肽抑制胰島素的聚集的熒光密度圖，圖4(E)為本發(fā)明ZR多肽抑制Aβ42的聚集的掃描電鏡形態(tài)圖，圖4(F)為本發(fā)明ZR多肽抑制amylin的聚集的掃描電鏡形態(tài)圖，圖4(G)為本發(fā)明ZR多肽抑制溶菌酶的聚集的掃描電鏡形態(tài)圖，圖4(H)為本發(fā)明ZR多肽抑制胰島素的聚集的掃描電鏡形態(tài)圖；

圖5(A)多肽ZR體外抑制Aβ42的細(xì)胞毒性，圖5(B)多肽ZR體外抑制amylin的細(xì)胞毒性，圖5(C)多肽ZR體外抑制溶菌酶的細(xì)胞毒性，圖5(D)多肽ZR體外抑制胰島素的細(xì)胞毒性；

圖6為本發(fā)明多肽改善AD轉(zhuǎn)基因小鼠的記憶能力，其中，圖6(A)AD轉(zhuǎn)基因小鼠到達(dá)平臺的潛伏期，圖6(B)探索實(shí)驗(yàn)中AD轉(zhuǎn)基因小鼠到達(dá)平臺的潛伏期，圖6(C)AD轉(zhuǎn)基因小鼠穿過平臺的次數(shù)，圖5(D)AD轉(zhuǎn)基因小鼠在目標(biāo)象限中所停留的時(shí)間；

圖7為本發(fā)明多肽降低AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)老年斑的數(shù)量，其中，圖7(A)小鼠老年斑ThS染色情況，圖7(B)小鼠老年斑所占切片面積比例，圖7(C)小鼠老年斑所占切片面積數(shù)量，圖7(D)小鼠老年斑6E10染色情況，圖7(E)小鼠海馬內(nèi)老年斑面積，圖7(F)小鼠皮層內(nèi)老年斑面積，圖7(G)小鼠海馬內(nèi)老年斑數(shù)量，圖7(H)小鼠皮層內(nèi)老年斑數(shù)量；

圖8為本發(fā)明多肽降低AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ40和Aβ42水平，其中，圖8(A)AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦中不溶性Aβ40水平，圖8(B)AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦中不溶性Aβ42水平，圖8(C)AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦中可溶性Aβ40水平，圖8(D)AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦中可溶性Aβ42水平；

圖9為本發(fā)明多肽降低AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，其中，圖9(A)AD小鼠腦內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞染色情況，圖9(B)AD小鼠腦內(nèi)的星形細(xì)胞染色情況，圖9(C)AD小鼠腦內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞占腦切片面積，圖9(D)AD小鼠腦內(nèi)的星形細(xì)胞占腦切片面積；

圖10為本發(fā)明多肽促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞對Aβ的吞噬；

圖11為本發(fā)明多肽改善PD轉(zhuǎn)基因小鼠的行為協(xié)調(diào)能力，其中，圖11(A)PD小鼠轉(zhuǎn)頭時(shí)間，圖11(B)PD小鼠爬至籠內(nèi)時(shí)間，圖11(C)PD小鼠后肢緊抱程度；

圖12為本發(fā)明多肽降低PD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)α-synuclein水平；

圖13為本發(fā)明多肽改善HD轉(zhuǎn)基因小鼠的行為協(xié)調(diào)能力，其中，圖13(A)HD小鼠在轉(zhuǎn)棒上的持續(xù)時(shí)間，圖13(B)9次試驗(yàn)中HD小鼠在轉(zhuǎn)棒上的持續(xù)時(shí)間的平均值；

圖14為本發(fā)明多肽降低HD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)HTT水平。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施方式來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所述實(shí)施例僅僅是幫助理解本發(fā)明，不應(yīng)視為對本發(fā)明的具體限制。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的PBS緩沖液PH值為7.2的緩沖液，配方為：5.84g NaCl，4.72g Na2HPO4，2.64g NaH2PO4.2H20，用水配成1升，調(diào)pH為7.2。

下述實(shí)施例中的多肽及其衍生物由上海吉爾生化有限公司合成制備，用以實(shí)驗(yàn)的多肽SEQ ID NO.2(ZR多肽)及其衍生物純度為大于或等于95％，ZR多肽及其衍生物保存于-20℃，避免反復(fù)凍融。

下述實(shí)施例中的所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)除了水迷宮記憶實(shí)驗(yàn)外都是通過3次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)獲得的，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析是應(yīng)用One-way ANOVA軟件進(jìn)行，對于多組重復(fù)記憶力測定數(shù)據(jù)的比較分析則應(yīng)用重復(fù)數(shù)據(jù)的Two-way ANOVA。

下述實(shí)施例中小鼠分為注射多肽ZR(AD+ZR)組、注射PBS組(AD con)、野生型(WT)組。

實(shí)施例1 ZR多肽及其衍生物的制備

根據(jù)淀粉樣蛋白疾病的發(fā)病原理，治療該類疾病的根本方法應(yīng)是減少淀粉樣蛋白的產(chǎn)生、抑制其聚集和細(xì)胞毒性或加快淀粉樣蛋白的清除。應(yīng)用噬菌體顯示技術(shù)，以amylin寡聚體為篩選底物，將1×108種七肽進(jìn)行了四輪淘選，應(yīng)用噬菌體ELISA從中篩選出了多條可與amylin寡聚體明顯結(jié)合的多肽，通過比對多條肽鏈與amylin、Aβ42、PrP、胰島素、溶菌酶的結(jié)合特性以及對淀粉樣蛋白聚集和細(xì)胞毒性的影響，最終篩選出多肽ZR。

ZR多肽(SEQ ID NO.2)的序列為：Ser-Phe-Phe-Asn-Asn-Lys-Arg。

ZR的衍生物為將ZR的氨基酸經(jīng)置換、缺失或插入其它氨基酸得到的多肽，序列2-8為將序列1中的氨基酸依次置換為丙氨酸進(jìn)行的丙氨酸掃描；序列9-12為將ZR的氨基酸置換、缺失或插入其它氨基酸得到的多肽具體如下：

序列1：Ser-Phe-Phe-Asn-Asn-Lys-Arg；

序列2：Ala-Phe-Phe-Asn-Asn-Lys-Arg；(對照組1)

序列3：Ser-Ala-Phe-Asn-Asn-Lys-Arg；

序列4：Ser-Phe-Ala-Asn-Asn-Lys-Arg；(對照組2)

序列5：Ser-Phe-Phe-Ala-Asn-Lys-Arg；

序列6：Ser-Phe-Phe-Asn-Ala-Lys-Arg；(對照組3)

序列7：Ser-Phe-Phe-Asn-Asn-Ala-Arg；(對照組4)

序列8：Ser-Phe-Phe-Asn-Asn-Lys-Ala；(對照組5)

序列9(ZR4-ΔN)：Ser-Phe-Phe-Asn-Lys-Arg；

序列10(ZR4-FN/AQ)：Ser-Ala-Phe-Gln-Asn-Lys-Arg；

序列11(ZR+N)：Ser-Phe-Phe-Asn-Asn-Asn-Lys-Arg；

序列12(ZR+K)：Ser-Phe-Phe-Asn-Asn-Lys-Arg-Lys。

實(shí)驗(yàn)例2 ZR與多種淀粉樣蛋白的特異性結(jié)合

將100μL Aβ42、PrP、amylin、胰島素、溶菌酶單體、寡聚體和纖維分別包被96孔酶聯(lián)免疫微孔板1μg/孔，BSA為陰性對照，置37℃ 2h，以3％BSA 37℃封閉2h，200μL/孔。以PBS洗板3次，加入帶有組氨酸標(biāo)簽的ZR多肽溶液100μL，室溫孵育1h后，用含有0.1％Tween-20的PBS洗滌三次。每孔加入100μL連接有HRP的識別組氨酸標(biāo)簽的抗體9E10，室溫孵育1h后，用含有0.1％Tween-20的PBS洗滌3次。每孔加入底物溶液TMB 100μL，放置37℃ 20min，然后每孔加入50μL 1mmol/L硫酸終止反應(yīng)，于酶聯(lián)免疫檢測儀上測定OD450值。在相同的條件下重復(fù)三次，結(jié)果見圖1。

ZR與陰性對照BSA結(jié)合的OD450為0.06；ZR與Aβ42單體、寡聚體和纖維結(jié)合后的OD450分別為0.34、0.38、0.35；ZR與amylin單體、寡聚體和纖維結(jié)合后的OD450分別為0.41、0.50、0.18；ZR與溶菌酶單體、寡聚體和纖維結(jié)合后的OD450分別為0.11、0.18、0.08；ZR與胰島素單體、寡聚體和纖維結(jié)合后的OD450分別為0.07、0.14、0.06；

圖1表明ZR多肽可與Aβ42、amylin、PrP、溶菌酶等多種淀粉樣蛋白的寡聚體結(jié)合，也可以與Aβ42和amylin的單體和纖維結(jié)合，但與PrP和溶菌酶的單體和纖維結(jié)合不明顯。由于這些淀粉樣蛋白氨基酸一級序列無任何同源性，因而，能夠同時(shí)結(jié)合ZR多肽的各種形態(tài)的淀粉樣蛋白應(yīng)具有相似的結(jié)構(gòu)特征。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證ZR多肽與各淀粉樣蛋白結(jié)合的情況，將Aβ42、PrP、amylin、胰島素、溶菌酶孵育一定時(shí)間后分別點(diǎn)到醋酸纖維膜1.8μg/點(diǎn)。室溫干燥后，以8％milk 37℃封閉2h；加入帶有組氨酸標(biāo)簽的ZR多肽溶液，室溫孵育1h后，用含有0.1％Tween-20的PBS洗滌三次。加入鼠源抗組氨酸標(biāo)簽的抗體1:3000，37℃孵育2h；0.1％PBST洗膜3遍，每遍5min，加入聯(lián)接HRP的羊抗鼠二抗1:5000，37℃孵育1h；0.1％PBST洗膜3遍，每遍10min。然后用ECL發(fā)光試劑盒檢測膜上發(fā)光斑點(diǎn)，曝光3min，顯影30s。以可與各淀粉樣蛋白多種形態(tài)結(jié)合的抗體及只與淀粉樣蛋白寡聚體結(jié)合的抗體W20為對照，以透射掃描電鏡檢測各時(shí)間點(diǎn)時(shí)淀粉樣蛋白的形態(tài)結(jié)果如圖2(A)-(H)所示。

圖2(A)和圖2(B)中可見ZR多肽可與各時(shí)間點(diǎn)的Aβ42結(jié)合，即與Aβ42單體、寡聚體和纖維結(jié)合。同樣地，圖2(C)和圖2(D)中ZR多肽可與各時(shí)間點(diǎn)的amylin結(jié)合，即與amylin 單體、寡聚體和纖維結(jié)合。但是，圖2(E)和圖2(F)中ZR只與24和36小時(shí)孵育形成的溶菌酶寡聚體結(jié)合，而不與其單體和纖維結(jié)合。相似地，圖2(G)和圖2(H)ZR只與9小時(shí)孵育形成的胰島素寡聚體結(jié)合，而不與其單體和纖維結(jié)合。

實(shí)驗(yàn)例3 ZR的衍生物與Aβ42寡聚體的結(jié)合

分別將實(shí)施例1得到的序列1-12連接組氨酸標(biāo)簽，然后按實(shí)施例2中的ELISA實(shí)驗(yàn)方法檢測與Aβ42寡聚體的結(jié)合特性，各多肽每孔加入1μg/孔，用ELISA方法測定OD450值，結(jié)果如圖3(A)-(B)所示。

圖3(A)看出ZR多肽序列中第2位的苯丙氨酸和第4位的天冬氨酸置換為丙氨酸后分別成為多肽序列3和5，此2種多肽與Aβ42寡聚體的結(jié)合相似于ZR與Aβ42寡聚體的結(jié)合，丙氨酸的置換對其結(jié)合特性影響不明顯，OD450分別為0.48和0.57，表明第2位的苯丙氨酸和第4位的天冬氨酸對ZR多肽的結(jié)合活性起著較小的作用。當(dāng)ZR中其它位置的氨基酸置換為丙氨酸后，其與Aβ42寡聚體的結(jié)合活性明顯喪失。第1、3、5、6和7位氨基酸分別置換為丙氨酸后他們的OD450分別為0.22、0.15、0.18、0.14、0.14和0.13，表明ZR中的第1位的絲氨酸、第3位的苯丙氨酸、第5位的天冬酰胺、第6位的賴氨酸及第7位的精氨酸多ZR的結(jié)合活性起著重要的作用，Ser-X-Phe-X-Asn-Lys-Arg結(jié)構(gòu)是ZR保持活性必須的基本框架結(jié)構(gòu)。

圖3(B)為ZR的衍生物序列ZR4-ΔN、ZR4-FN/AQ、ZR+N和ZR+K與Aβ42寡聚體結(jié)合的檢測結(jié)果，它們與Aβ42寡聚體結(jié)合后的OD450分別為0.49、0.47、0.54和0.56。表明ZR某個(gè)氨基酸經(jīng)置換、缺失或在多肽中增加氨基酸后仍保留與Aβ42結(jié)合的能力。

實(shí)驗(yàn)例4 ZR多肽體外抑制Aβ42和溶菌酶的聚集

1)將Aβ42、amylin以六氟異丙醇(HFIP)溶解至1mg/mL，室溫超聲波處理10min，分裝到eppendorf管中，與真空中揮發(fā)HFIP，然后于-20℃保存。用前將HFIP處理過的各蛋白在室溫放置20min，然后加入DMSO，使各蛋白濃度為5mg/mL，然后以0.02M pH 7.4的PBS緩沖液進(jìn)行稀釋至所需濃度。PrP、溶菌酶則直接用0.02M pH 7.4PBS制備到所需濃度。

2)將ZR多肽溶解于0.02M pH 7.4的PBS緩沖液中，然后加入到Aβ42、amylin、胰島素、溶菌酶溶液中(溶菌酶為pH2.5的醋酸緩沖液，其余為pH7.4的PBS緩沖液)，使各蛋白的終濃度分別為10、20、100、1000μM。各蛋白與ZR多肽的摩爾比分別為1:1和1:10。將Aβ42、amylin、胰島素于37℃，溶菌酶于65℃環(huán)境分別放置1天、5天、5小時(shí)和6天。

3)將硫黃素(ThT)溶解在pH 6.5、50mM的磷酸鹽緩沖液使其濃度為5μM。將孵育后的樣品20μL加入到含有180μL ThT溶液的黑色酶標(biāo)板中?；靹蚝笤诙喙δ苊笜?biāo)儀上以450nm激發(fā)波長和482nm的發(fā)射波長測定ThT的熒光強(qiáng)度。將各樣品的熒光強(qiáng)度減去ThT本身的背景熒光。

圖4(A)-(D)所示，未加入ZR多肽的Aβ42及加入ZR多肽后Aβ42與ZR的摩爾比分別為1:1和1:10時(shí)，其熒光值分別為：26500、22000、17000；未加入ZR多肽的溶菌酶及加入ZR多肽后溶菌酶與ZR的摩爾比分別為1:1和1:10時(shí)，其熒光值分別為：310000、220000、170000；未加入ZR多肽的amylin及加入ZR多肽后amylin與ZR的摩爾比分別為1:1和1:10時(shí)，其熒光值分別為：38000、41000、43000；未加入ZR多肽的胰島素及加入ZR多肽后胰島素與ZR的摩爾比分別為1:1和1:10時(shí)，其熒光值分別為：305000、305000、310000。

結(jié)果表明加入ZR后Aβ42和溶菌酶熒光強(qiáng)度顯著低于其蛋白自身的對照。由于ThT是與淀粉樣蛋白聚集后的聚集物中的β-片層結(jié)合后才可激發(fā)出熒光，熒光越強(qiáng)，表明淀粉樣蛋白聚集越多。因此，ZR可明顯抑制Aβ42和溶菌酶的聚集，但ZR對amylin和胰島素的聚集無顯著影響。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述結(jié)果，如圖4(E)-(H)應(yīng)用掃描透射電鏡檢測了ThT試驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)的各淀粉樣蛋白的形態(tài)特征。結(jié)果表明加入ZR多肽后的Aβ42和溶菌酶聚集形成的纖維明顯減少，而ZR的加入對amylin和胰島素的聚集沒有明顯影響。

實(shí)驗(yàn)例5 ZR多肽體外抑制淀粉樣蛋白的細(xì)胞毒性

用含10％胎牛血清的培養(yǎng)基(DMEM)將SH-SY5Y細(xì)胞配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔10000個(gè)細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔體積100μL。細(xì)胞于37℃培養(yǎng)24小時(shí)，培養(yǎng)箱CO₂濃度為5％。

每孔加入如下樣品：

Aβ42：Aβ42蛋白的終濃度是4μM；Aβ42與ZR的混合物(Aβ：ZR＝1:0.5)：Aβ42蛋白的終濃度是4μM，ZR的終濃度是2μM；Aβ42與ZR的混合物(Aβ：ZR＝1:1)：Aβ42蛋白的終濃度是4μM，ZR的終濃度是4μM；

Amylin：amylin蛋白的終濃度是4μM；Amylin與ZR的混合物(Amylin：ZR＝1:1)：Amylin蛋白的終濃度是4μM，ZR的終濃度是4μM；Amylin與ZR的混合物(Amylin：ZR＝1:10)：Amylin蛋白的終濃度是4μM，ZR的終濃度是40μM；

溶菌酶：溶菌酶蛋白的終濃度是20μM；溶菌酶與ZR的混合物(溶菌酶：ZR＝1:1)：溶菌酶蛋白的終濃度是20μM，ZR的終濃度是20μM；溶菌酶與ZR的混合物(溶菌酶：ZR＝1:10)：溶菌酶蛋白的終濃度是20μM，ZR的終濃度是200μM；

胰島素：胰島素蛋白的終濃度是60μM；胰島素與ZR的混合物(胰島素：ZR＝1:1)：胰島素蛋白的終濃度是60μM，ZR的終濃度是60μM；胰島素與ZR的混合物(胰島素：ZR＝1:5)：胰島素蛋白的終濃度是60μM，ZR的終濃度是300μM；以PBS為對照；

細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，每孔加MTT溶液10μL，37℃孵育3小時(shí)，終止培養(yǎng)，每孔加100μL晶體溶解液(10％SDS和5％異丁醇溶解在0.01M HCL中)，37℃孵育過夜，使結(jié)晶物充分溶解。在多功能酶聯(lián)免疫檢測儀上以570nm波長測定各孔光吸收值。減去本底后，以 樣品的吸光度除以不加樣品的細(xì)胞的吸光度作為細(xì)胞的活性指標(biāo)，并分析樣品之間的差異顯著情況，結(jié)果如圖5(A)-(D)。

Aβ42組的細(xì)胞活性為71％；Aβ：ZR＝1:0.5組細(xì)胞活性為：80％；Aβ：ZR＝1:1組細(xì)胞活性為：82％；Amylin組細(xì)胞活性為：61％；Amylin：ZR＝1:1組細(xì)胞活性為：70％；Amylin：ZR＝1:10組細(xì)胞活性為：75％；溶菌酶組的細(xì)胞活性：55％；溶菌酶：ZR＝1:1組的細(xì)胞活性：85％；溶菌酶：ZR＝1:10組的細(xì)胞活性：93％；胰島素組的細(xì)胞活性：77％；胰島素：ZR＝1:1組的細(xì)胞活性：92％；胰島素：ZR＝1:5組的細(xì)胞活性：102％。

結(jié)果表明，各淀粉樣蛋白在一定濃度下對SH-SY5Y細(xì)胞都具有細(xì)胞毒性。ZR的加入可以顯著降低各淀粉樣蛋白的細(xì)胞毒性，并呈現(xiàn)數(shù)量依賴性。當(dāng)ZR與Aβ42、amylin、溶菌酶、胰島素的摩爾比分別為1:1、1:10、1:10、1:5時(shí)，可分別抑制Aβ42、amylin、溶菌酶、胰島素所致細(xì)胞毒性的37.8％、45.4％、117.6％和89.8％。因此，無論ZR多肽對各淀粉樣蛋白聚集時(shí)的影響有何不同，ZR都能夠顯著抑制Aβ42、amylin、溶菌酶、胰島素的細(xì)胞毒性。

實(shí)驗(yàn)例6 ZR多肽改善AD轉(zhuǎn)基因小鼠的記憶能力

1)腦側(cè)室注射：將8月齡大的轉(zhuǎn)APP和PS1基因的AD雌性小鼠隨機(jī)分為注射多肽ZR(AD+ZR)和PBS組(AD con)，每組8只。同時(shí)以8只年齡相同的同窩野生型小鼠做為對照組(WT)，將上述三組小鼠進(jìn)行如下處理：

腦內(nèi)注射前12h對小鼠禁食不禁水。首先將小鼠麻醉，麻醉劑量為：25g小鼠腹腔注射0.1mL濃度為10％的水合氯醛。將小鼠固定在立體定位儀上，參照標(biāo)準(zhǔn)圖譜進(jìn)行腦立體定位側(cè)室注射給藥。小鼠腦室注射定位參數(shù)為：前囪后1.8mm，中線旁開±1.8mm，硬膜下2.5mm。用無菌水溶解ZR至1mg/ml，注射速度0.2μl/min，注射劑量為5μL。注射完留針5min。每隔7天注射一次，共注射4次。于最后一次注射后5天，對小鼠進(jìn)行水迷宮記憶能力檢測。

2)記憶力訓(xùn)練：小鼠水迷宮訓(xùn)練之前放在室溫25℃，濕度46％的環(huán)境適應(yīng)3天。所有行為學(xué)檢測試驗(yàn)中均采用隨機(jī)雙盲的方式。訓(xùn)練前，除去平臺，在水槽中央輕輕放入，讓其自由游動60s。測定每組小鼠游泳象限偏好，選擇對面水槽的壁，作為該小鼠初始釋放位置。第一次訓(xùn)練前讓小鼠站在平臺(平臺直徑10厘米)上15s，讓它記憶一下池(直徑1.1米)中臺的空間位置。平臺放在第二象限中部，并且平臺的上表面距水面1.5厘米。池水中加入奶粉，以增加動物的視覺反差，利于圖像記錄。將小鼠面朝池壁，輕輕放入水中，讓其在水槽中游泳。小鼠在臺上站立2s就停止計(jì)時(shí)，認(rèn)為上臺，訓(xùn)練時(shí)間每次最長為60s。期間應(yīng)用軟件記錄其軌跡以及從入水到爬上平臺的時(shí)間，即潛伏期。如果小鼠在60s內(nèi)找到平臺則讓其在平臺上停留10s。如果小鼠在60s內(nèi)找不到平臺，則在60s后由實(shí)驗(yàn)人員引導(dǎo)其上平臺，并讓其在平臺上停留10s。連續(xù)訓(xùn)練5天，每天訓(xùn)練2次，兩次之間的間隔為3-4h。然后間隔24h，撤掉平臺，讓小鼠在水中尋找平臺60s。以錄像和軟件系統(tǒng)記錄5天訓(xùn)練和探索試 驗(yàn)的結(jié)果，并以重復(fù)量數(shù)二因子變異數(shù)分析，處理試驗(yàn)結(jié)果。

試驗(yàn)結(jié)果如圖6(A)-(D)所示，隨著訓(xùn)練時(shí)間的增長，各組小鼠找到平臺的潛伏期逐漸縮短；具體如下：

注射ZR的AD小鼠找到平臺的潛伏期在訓(xùn)練到第3、4、5天時(shí)，與注射PBS對照的AD小鼠相比具有顯著差異，圖6(A)注射ZR后的AD小鼠空間記憶能力明顯好于注射PBS的對照組；圖6(B)撤掉臺后注射ZR的AD小鼠找到平臺的潛伏期也明顯小于AD對照組，野生型(WT)小鼠、AD對照鼠和ZR治療的AD鼠潛伏期分別為16s、24s和17s；圖6(C)注射ZR的AD小鼠穿過平臺所在位置的次數(shù)顯著高于AD對照組，野生型(WT)小鼠、AD對照鼠和ZR治療的AD鼠穿臺次數(shù)分別為4.2、1.8和3.7；圖6(D)注射ZR后的AD小鼠在目標(biāo)象限中所在的時(shí)間顯著高于AD對照小鼠，野生型(WT)小鼠、AD對照鼠和ZR治療的AD鼠在目標(biāo)象限中所在的時(shí)間分別為20s、11s和19s。這些結(jié)果表明注射ZR后的AD小鼠空間記憶能力明顯好于未注射ZR的AD對照組。

實(shí)驗(yàn)例7 ZR多肽降低AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)老年斑的數(shù)量

1)將上述的注射多肽ZR(AD+ZR)組、注射PBS組(AD con)、野生型(WT)組小鼠心臟灌流，取腦組織，應(yīng)用組織冷凍液及液氮進(jìn)行冷凍處理。并保存于-80℃。用時(shí)以冷凍切片機(jī)進(jìn)行切片，切片厚度16μm，每隔9個(gè)切片取一個(gè)進(jìn)行染色觀察。

2)應(yīng)用1mg/mL ThS浸染切片10min，然后以70％乙醇沖洗3次。

3)應(yīng)用熒光顯微鏡采集圖像激發(fā)波長488nm，4×物鏡觀察，結(jié)果如圖7(A)-(C)。

圖7(A)為野生型小鼠、注射多肽ZR(AD+ZR)組(n＝8)、注射PBS組(AD con)(n＝8)的腦切片(每只動物每個(gè)部位檢測10-12張切片)中老年斑面積。注射ZR后AD小鼠腦內(nèi)的老年斑數(shù)量明顯減少。圖7(B)和(C)表明注射多肽ZR(AD+ZR)組的腦切片老年斑面積所占切片面積比例和老年斑數(shù)量分別為0.3％和4個(gè)/mm²，而注射PBS組(AD con)腦切片中老年斑面積所占切片面積比例和數(shù)量分別為1.7％和17個(gè)/mm²。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，注射ZR后AD小鼠腦內(nèi)的老年斑數(shù)量和所占面積都有顯著下降。

將上述冷凍切片置于0.3％的過氧化氫中，然后應(yīng)用10％的羊血清對切片進(jìn)行封閉。加入1:3000稀釋的Aβ抗體6E1037℃作用1h，加入生物素化的羊抗鼠二抗37℃作用1h，最后加入聯(lián)接HRP的鏈霉親和素，以二氨基聯(lián)苯胺(DAB)為底物顯色，應(yīng)用顯微鏡采集圖像。

圖7(D)可以看出，注射PBS的AD小鼠腦海馬和皮層中的老年斑數(shù)量明顯多于注射多肽ZR的AD小鼠中老年斑數(shù)量。應(yīng)用系統(tǒng)visiopharm測定注射多肽ZR(AD+ZR)組(n＝8)、注射PBS組(AD+con或control)(n＝8)的腦切片(每只動物每個(gè)部位檢測10-12張切片)中老年斑面積，結(jié)果為圖7(E)-(H)：

注射多肽ZR的小鼠海馬中老年斑面積為0.7％，注射PBS的小鼠海馬中老年斑面積為 2.4％；注射多肽ZR的小鼠皮層中老年斑面積為1.3％，注射PBS的小鼠皮層中老年斑面積為2.9％；注射多肽ZR的小鼠海馬中老年斑數(shù)量為7個(gè)/mm²，注射PBS的小鼠海馬老年斑數(shù)量為18個(gè)/mm²；注射多肽ZR的小鼠皮層中老年斑數(shù)量為9個(gè)/mm²，注射PBS的小鼠皮層老年斑數(shù)量為30個(gè)/mm²；統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，注射ZR后AD小鼠腦海馬和皮層中的老年斑數(shù)量和所占面積都有顯著下降。

實(shí)驗(yàn)例8 ZR多肽降低AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ40和Aβ42水平

上述注射多肽ZR(AD+ZR)組、注射PBS組(AD對照)試驗(yàn)小鼠的腦組織在含有蛋白酶抑制劑的pH7.2PBS中勻漿。然后以15000rpm離心30min，收集上清。沉淀加入5M的鹽酸胍(以tris-HCl緩沖液配制，pH8.0)，然后離心處理，收集上清，可溶性和不溶性Aβ40和Aβ42水平由試劑盒以ELISA方法測定OD值和Aβ標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖8(A)-(D)。

圖8(A)注射ZR多肽的腦內(nèi)Aβ40水平為17pg/μg，注射PBS的腦內(nèi)Aβ40水平為56pg/μg；圖8(B)注射ZR多肽的腦內(nèi)Aβ42水平為23pg/μg，注射PBS的腦內(nèi)Aβ42水平為97pg/μg；圖8(C)注射ZR多肽的腦內(nèi)Aβ40水平為4pg/μg，注射PBS的腦內(nèi)Aβ40水平為7.4pg/μg；圖8(D)注射ZR多肽的腦內(nèi)Aβ42水平為2.4pg/μg，注射PBS的腦內(nèi)Aβ42水平為5.1pg/μg。

統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，AD小鼠注射ZR后腦內(nèi)可溶性Aβ40和Aβ42水平及不溶性Aβ40和Aβ42水平都明顯低于注射PBS的小鼠。

實(shí)驗(yàn)例9 ZR多肽降低AD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)炎癥水平

將冷凍的腦切片置于0.3％的過氧化氫中處理，然后應(yīng)用10％的羊血清對切片進(jìn)行封閉。分別加入1:200稀釋的抗Iba-1抗體和1:100稀釋的抗GFAP抗體37℃作用1h，加入生物素化的羊抗鼠二抗37℃作用1h，最后加入聯(lián)接HRP的鏈霉親和素，以二氨基聯(lián)苯胺(DAB)為底物顯色，應(yīng)用顯微鏡采集圖像。應(yīng)用系統(tǒng)visiopharm測定注射多肽ZR(AD+ZR)組(n＝8)、注射PBS組(AD con)(n＝8)的腦切片(每只動物每個(gè)部位檢測10-12張切片)中小膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞面積。

圖9(A)和(B)分別顯示注射ZR后AD小鼠腦內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量顯著減少。圖9(C)和(D)顯示注射ZR多肽的AD小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞所占腦切片面積1.2％，注射PBS的AD小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞所占腦切片面積5.7％；注射ZR多肽的腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞所占腦切片面積1.8％，注射PBS的腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞所占腦切片面積4.9％。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果表明，注射ZR后的AD小鼠腦內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量均顯著減少。

實(shí)驗(yàn)例10 ZR多肽促進(jìn)細(xì)胞對Aβ的吞噬

用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基將BV-2細(xì)胞配成單個(gè)細(xì)胞懸液，以每孔10000個(gè)細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔體積100μL。細(xì)胞于37℃培養(yǎng)24小時(shí)，培養(yǎng)箱CO₂濃度 為5％，然后分別加入如下物質(zhì)：

Aβ42：Aβ42蛋白的終濃度是0.1μM；Aβ42：ZR摩爾比＝1:50：Aβ42蛋白的終濃度是0.1μM；ZR的終濃度為5μM；Aβ42：ZR摩爾比＝1:100：Aβ42蛋白的終濃度是0.1μM；ZR的終濃度為10μM；Aβ42：ZR摩爾比＝1:200：Aβ42蛋白的終濃度是0.1μM；ZR的終濃度為20μM。

細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后，收集細(xì)胞。用含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞，收集細(xì)胞提取液。應(yīng)用Aβ檢測盒測定細(xì)胞內(nèi)的Aβ42水平，結(jié)果如圖10：

Aβ42：ZR摩爾比＝1:0：Aβ42蛋白的濃度是26ng/g；Aβ42：ZR摩爾比＝1:50：Aβ42蛋白的濃度是28ng/g；Aβ42：ZR摩爾比＝1:100：Aβ42蛋白的濃度是33ng/g；Aβ42：ZR摩爾比＝1:200：Aβ42蛋白的濃度是38ng/g。

隨著加入的ZR濃度升高，BV-2細(xì)胞內(nèi)的Aβ42水平逐步升高，表明ZR具有促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬Aβ的作用。

實(shí)驗(yàn)例11 ZR多肽改善PD轉(zhuǎn)基因小鼠的行為協(xié)調(diào)能力

1)腦側(cè)室注射：將9月齡大的PD轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為注射多肽ZR(PD+ZR)和PBS組(PD control)，每組8只。同時(shí)以8只年齡相同的同窩野生型小鼠做為對照組(WT)，將上述三組小鼠進(jìn)行如下處理：

腦內(nèi)注射前12h對小鼠禁食不禁水。小鼠的注射方式同實(shí)施例6，對小鼠進(jìn)行爬桿試驗(yàn)和后肢緊抱程度試驗(yàn)的檢測。

2)爬桿試驗(yàn)：所用桿是一個(gè)表面粗糙、帶有基座的木質(zhì)桿直徑1厘米，長度50厘米。將木桿平穩(wěn)放在小鼠籠內(nèi)，小鼠頭部朝上放在木桿頂部，使其自動轉(zhuǎn)頭然后頭部向下順桿爬至籠內(nèi)。分別記錄小鼠轉(zhuǎn)頭以及爬至籠內(nèi)所用時(shí)間。如果小鼠跌落、滑落，或不能完成任務(wù)，則轉(zhuǎn)頭時(shí)間記為30秒，爬回籠內(nèi)記為60秒。每天連續(xù)進(jìn)行5次，前兩天為訓(xùn)練期，第三天為測試期。統(tǒng)計(jì)分析各組小鼠測試期的轉(zhuǎn)頭以及爬至籠內(nèi)所用時(shí)間，結(jié)果如圖11(A)-(B)所示：

野生型(WT)小鼠、PD對照鼠和ZR治療的PD鼠轉(zhuǎn)頭時(shí)間分別為1.38秒，21.87秒和13.9秒，爬至籠內(nèi)所用時(shí)間分別為6.02秒，45.48秒和19.74秒。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，注射ZR的PD小鼠轉(zhuǎn)頭以及爬至籠內(nèi)所用時(shí)間明顯低于PD對照組小鼠。

3)后肢緊抱程度試驗(yàn)：將小鼠頭部向下懸至空中，觀察15秒以判斷小鼠的后肢緊抱程度分級。分級標(biāo)準(zhǔn)如下：0級＝兩后肢外張，遠(yuǎn)離腹部；1級＝至少半數(shù)觀察期內(nèi)，有一條后肢向腹部內(nèi)收；2級＝至少半數(shù)觀察期內(nèi)，兩條后肢不完全向腹部內(nèi)收；3級＝至少半數(shù)觀察期內(nèi)，兩條后肢完全向腹部內(nèi)收。適當(dāng)情況可采用0.5分分級。連續(xù)觀察3天，后肢緊抱程度評分為3次實(shí)驗(yàn)等級評分的總和，結(jié)果如圖11(C)所示：

野生型(WT)小鼠、PD對照鼠和ZR治療的PD鼠后肢緊抱程度等級分?jǐn)?shù)分別為0，1.78 和1.08.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，注射ZR的PD小鼠后肢緊抱程度等級分?jǐn)?shù)明顯低于PD對照組小鼠。

實(shí)驗(yàn)例12 ZR多肽降低PD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)α-synuclein水平

將注射多肽ZR(PD+ZR)組、注射PBS組(PD control)、野生型(WT)組小鼠進(jìn)行心臟灌流，取腦干和小腦，稱重。將腦組織按1:5(V/W)的比例加入含有1×蛋白水解酶抑制劑和0.5％NP40的TNE緩沖液(10mM Tris HCl pH 7.4；150mM NaCl；5mM EDTA)，放置冰上研磨5min，靜置20min后于4℃以100,000g離心力離心5min，收集上清。

將總體系為10μL的LDS緩沖液、還原劑及一定量的可溶性組分充分混勻，于70℃金屬浴10min，然后以12000rpm室溫離心5min即得樣品。使用4-12％Bis-Tris NuPAGE膠，每孔上樣10μL，150V電泳80min。然后以300mA濕法轉(zhuǎn)膜2小時(shí)。按目的蛋白分子量大小剪下包含目的蛋白的NC膜。含5％脫脂牛奶的PBS室溫封閉2h；加入抗α-synuclein抗體1:1000，室溫孵育2h；0.1％PBST洗膜3遍，每遍5min，加入IR染色的羊抗鼠/兔二抗1:15000，室溫避光孵育1h；0.1％PBST洗膜3遍，每遍10min。然后用紅外激光成像系統(tǒng)檢測膜上發(fā)光條帶光密度值，結(jié)果如圖12所示：

可見，WT小鼠腦中可溶性α-synuclein/α-tubulin比值為0.19；注射多肽ZR的PD轉(zhuǎn)基因小鼠腦中可溶性α-synuclein/α-tubulin比值為1.44；注射PBS的PD轉(zhuǎn)基因小鼠腦中可溶性α-synuclein/α-tubulin比值為1.84；統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，PD轉(zhuǎn)基因小鼠注射ZR后腦內(nèi)可溶性α-synuclein水平明顯低于PD對照組小鼠。

實(shí)驗(yàn)例13 ZR多肽改善HD轉(zhuǎn)基因小鼠的行為協(xié)調(diào)能力

腦側(cè)室注射：將12月齡大的HD轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為注射多肽ZR(HD+ZR)和PBS組，每組8只，同時(shí)以8只年齡相同的同窩野生型小鼠做為對照組。

將上述三組小鼠進(jìn)行如下處理：

腦內(nèi)注射前12h對小鼠禁食不禁水，小鼠的注射方式同實(shí)施例6，對小鼠進(jìn)行轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)檢測。

轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)：轉(zhuǎn)棒試驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行3天，每天由兩個(gè)階段組成：訓(xùn)練階段和測試階段。訓(xùn)練階段：轉(zhuǎn)棒轉(zhuǎn)速為4轉(zhuǎn)/分，小鼠在轉(zhuǎn)棒上訓(xùn)練5分鐘后放回籠內(nèi)，1小時(shí)之后進(jìn)入測試階段。測試階段：轉(zhuǎn)棒轉(zhuǎn)速為5分鐘內(nèi)由靜止勻加速至40轉(zhuǎn)/分，記錄小鼠在轉(zhuǎn)棒上的持續(xù)時(shí)間，不跌落記為300秒。每天測試3次，每次間隔30分鐘。統(tǒng)計(jì)分析每組小鼠3天內(nèi)總計(jì)9次測試，每次在轉(zhuǎn)棒儀上的持續(xù)時(shí)間。結(jié)果如圖13(A)-(B)所示：野生型(WT)小鼠、HD對照鼠和ZR治療的HD鼠在轉(zhuǎn)棒上的持續(xù)時(shí)間分別為295秒，176.72秒和233.64秒。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，注射ZR的HD小鼠在轉(zhuǎn)棒上的持續(xù)時(shí)間明顯高于HD對照組小鼠。

實(shí)驗(yàn)例14 ZR多肽降低HD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)HTT水平

應(yīng)用western方法檢測ZR對HD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)HTT的影響。

將上述注射多肽ZR(HD+ZR)組、注射PBS組、野生型(WT)組小鼠的心臟灌流，取大腦并稱重。將腦組織按1:5(V/W)的比例加入含有1×蛋白水解酶抑制劑的RIPA裂解液中，放置冰上研磨5min，靜置20min后于4℃以12000rpm離心5min，收集上清。

將總體系為10μL的LDS緩沖液、還原劑及一定量的可溶性組分充分混勻，于70℃金屬浴10min，然后以12000rpm室溫離心5min即得樣品。使用3-8％Tris-acetate NuPAGE膠，每孔上樣10μL，150V電泳80min。然后以300mA，濕法轉(zhuǎn)膜2小時(shí)。按目的蛋白分子量大小剪下包含目的蛋白的NC膜。含5％脫脂牛奶的PBS室溫封閉2h；加入抗HTT抗體2166(1:1000)，或α-tubulin抗體(1:1000)，室溫孵育2h；0.1％PBST洗膜3遍，每遍5min，加入IR染色的羊抗鼠/兔二抗1:15000，室溫避光孵育1小時(shí)；0.1％PBST洗膜3遍，每遍10min。然后用紅外激光成像系統(tǒng)檢測膜上發(fā)光條帶光密度值，結(jié)果如圖14所示。

圖14表明WT小鼠腦中可溶性HTT/α-tubulin比值為0.955；注射多肽ZR的HD轉(zhuǎn)基因小鼠腦中可溶性HTT/α-tubulin比值為2.17；注射PBS的HD轉(zhuǎn)基因小鼠腦中可溶性HTT/α-tubulin比值為2.79；統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果表明，HD轉(zhuǎn)基因小鼠注射ZR后腦內(nèi)可溶性HTT水平明顯低于對照小鼠。

申請人聲明，本發(fā)明通過上述實(shí)施例來說明本發(fā)明的工藝方法，但本發(fā)明并不局限于上述工藝步驟，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述工藝步驟才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進(jìn)，對本發(fā)明所選用原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。