本發(fā)明涉及微流控和生物細胞培養(yǎng)領域，具體來說，涉及微流控培養(yǎng)裝置及應用其培養(yǎng)細胞或微生物的方法。

背景技術：

在自然界中，存在許多氣液界面交替分布的微環(huán)境，如土壤間隙、湖泊和海洋，人類的支氣管等。一些微生物和細胞如絲狀真菌、放線菌、藻類、支氣管上皮細胞等在氣液界面表現(xiàn)出與環(huán)境相適應的特殊的分化形態(tài)。天藍色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)是存在于土壤中的絲狀細菌，有著復雜的生命周期，成為研究多細胞分化的模式原核生物(K.et al.Streptomyces morphogenetics:dissecting differentiation in a filamentous bacterium.Nature Rev.Microbiol.2009.7(1):p.36-49)，全基因組測序已經(jīng)完成。鏈霉菌能夠產(chǎn)生一系列復雜的次級代謝產(chǎn)物，如抗生素、抗腫瘤制劑、免疫抑制劑等(S.D.Bentley,et al.Complete genome sequence of the model actinomycete Streptomyces coelicolor A3(2).Nature.2002.417(6885):p.141-7.)，次級代謝產(chǎn)物分泌的起始往往與菌絲的分化相一致。因此，研究鏈霉菌的生長分化對次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生、應用具有重要的指導意義。

傳統(tǒng)實驗室所用的絲狀真菌及放線菌的培養(yǎng)觀察方法主要是平板插片法，其主要缺陷在于無法實時動態(tài)地觀察生物體生長發(fā)育的過程，且操作較為復雜，無法對其生長條件進行精確的控制。

微流控學(Microfluidics)是利用微米尺度的通道網(wǎng)絡來操縱皮納升體積流體的科學與技術。微流控芯片可以對極微量樣品和試劑進行處理和分析，實現(xiàn)高分辨率、高靈敏度的分離和檢測，成本低，縮短分析時間(G.M.Whitesides,et al.The origins and the future of microfluidics.Nature.2006.442(7101):p.368-373)。在微流控芯片上進行功能單元集成的芯片實驗室(Lab-On-a-Chip)技術應用于生物學研究可以使復雜的實驗流程簡單化， 大幅度減少樣品體積，減少試劑的消耗，從珍貴的樣品中獲取盡可能多的信息，規(guī)?；奶幚砗蜋z測大批樣品，對細胞微環(huán)境的時空變化提供更大的控制性和預見性(E.K.Sackmann,et al.The present and future role of microfluidics in biomedical research.Nature.2014.507(7491):p.181-189)。

利用微流控芯片進行微米尺度氣液界面的控制需要對氣液界面張力和微結構進行精確的設計和控制。難點在于對于液面的定位控制。對于放線菌等具有氣液界面分化的細胞生物學研究，曾有報道利用皮升體積的液滴高通量的培養(yǎng)和篩選來自土壤的放線菌(E.Zang,et al.Real-time image processing for label-free enrichment of Actinobacteria cultivated in picolitre droplets.Lab Chip.2013.13(18):p.3707)。目前還未見用于實現(xiàn)氣液界面分化生長和孢子收集的微流控裝置的報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種微流控培養(yǎng)裝置及應用其培養(yǎng)細胞或微生物的方法，可用于培養(yǎng)細胞或微生物在氣液界面分化生長并可觀察其生長情況。

本發(fā)明的一個方面，提供一種微流控培養(yǎng)裝置，包括基片和蓋片，所述蓋片一面開設有凹槽，所述蓋片設有凹槽的一面蓋設在所述基片之上；

所述基片的上表面與所述蓋片的凹槽之間形成液體輸送通道、氣體輸送通道及氣體腔室，所述氣體腔室環(huán)繞所述液體輸送通道設置，所述液體輸送通道與所述氣體輸送通道通過所述氣體腔室相連通，所述液體輸送通道與所述氣體腔室之間設有用于限制液體流出所述液體輸送通道的圍堰；

所述氣體輸送通道開設有與外界相連通的通氣孔及排氣孔；所述液體輸送通道開設有與外界相連通的輸液孔及排液孔；

所述液體輸送通道開設有培養(yǎng)微室。

以上所述的微流控培養(yǎng)裝置，所述圍堰結構環(huán)繞所述培養(yǎng)微室以及所述液體輸送通道設置，所述圍堰的頂部距離所述基片上表面0.5μm至5μm。

以上所述的微流控培養(yǎng)裝置，所述氣體腔室的高度為0.5μm-1mm。

以上所述的微流控培養(yǎng)裝置，所述培養(yǎng)微室在所述液體輸送通道的兩側或一側陣列分布。

以上所述的微流控培養(yǎng)裝置，所述培養(yǎng)微室與所述液體輸送通道連通 的一側的口徑逐漸縮小。

以上所述的微流控培養(yǎng)裝置，所述培養(yǎng)微室內(nèi)可容納的溶液體積為0.01nL～100μL。

以上所述的微流控培養(yǎng)裝置，所述液體輸送通道的長度為5mm～200mm，通道的寬度為50μm-10mm，深度為10μm-1mm。

以上所述的微流控培養(yǎng)裝置，所述氣體輸送通道的寬度為50-10mm，深度為10μm～2mm。

以上所述的微流控裝置，設有可用于觀察所述培養(yǎng)微室與所述氣體腔室連接部分的結構。

以上所述的微流控裝置，所述蓋片與所述基片為可拆卸連接。

本發(fā)明的另一個方面，提供一種可觀察細胞或微生物在氣液界面生長分化的培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

a)細胞或微生物懸液接種于液體輸送通道或培養(yǎng)微室：將細胞或微生物懸液從以上任一所述的裝置的輸液孔注入所述液體輸送通道及所述培養(yǎng)微室中，細胞或微生物在培養(yǎng)微室內(nèi)芯片上貼壁或者懸浮生長；

b)通入培養(yǎng)基：將細胞或微生物培養(yǎng)所需的液體培養(yǎng)基通過所述輸液孔注入所述液體輸送通道；

c)通入氣體：將細胞或微生物培養(yǎng)所需的氣體通過通氣孔注入氣體輸送通道和氣體腔室；對于依靠空氣即可生長的細胞或微生物不做通氣處理；

d)細胞或微生物生長發(fā)育過程實時的觀察與記錄：引入所述培養(yǎng)微室的細胞或微生物在所述培養(yǎng)微室中生長，長到一定階段后在所述培養(yǎng)微室與所述氣體腔室的氣液界面進行分化，細胞或微生物的氣生部分會長入所述氣體腔室中，觀察記錄生長情況。

本發(fā)明提供的微流控裝置可以容納細胞或微生物在裝置的液體輸送通道以及培養(yǎng)微室中，通過液體輸送通道持續(xù)供應液體培養(yǎng)基，使細胞或微生物可在充足的營養(yǎng)供應下，持續(xù)生長和發(fā)育分化。在液體輸送通道和培養(yǎng)微室周圍的氣體腔室中充滿空氣或培養(yǎng)所需的特殊配比氣體，細胞可通過培養(yǎng)微室邊緣的圍堰與基片間的空隙穿過氣液界面，在氣體腔室中生長，完成其完整的氣生發(fā)育分化過程。微流控裝置可采用透明的玻璃、有機玻璃、聚碳酸酯等材質(zhì)，方便利用光學顯微鏡進行成像，實現(xiàn)細胞或微生物 完整生命周期的觀察；可以通過對培養(yǎng)基進行精確的調(diào)節(jié)和控制，通過改變不同碳源、氮源、pH值或測試用的液體以及不同氣體的條件，研究液體及氣體對細胞或微生物生長分化的影響。

本發(fā)明的裝置在細胞或微生物培養(yǎng)成熟后還可以通過液體輸入通道通入戊二醛等固定液，對細胞進形態(tài)固定，打開蓋片，利用電子顯微鏡對細胞或微生物進行高分辨率形態(tài)學分析與納米級表面結構分析。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1提供的微流控培養(yǎng)裝置結構示意圖；

圖2是本發(fā)明的微流控培養(yǎng)裝置沿圖1的A-A方向的縱剖圖；

圖3是本發(fā)明圖2所示的微流控培養(yǎng)裝置中細胞或微生物生長情況示意圖；

圖4是本發(fā)明實施例1的實驗流程示意圖；

圖5為本發(fā)明實施例1的微流控培養(yǎng)裝置實物的微室及液體輸送通道中充滿色素溶液的顯微放大照片；

圖6A為本發(fā)明實施例1的微流控培養(yǎng)裝置的微室中天藍色鏈霉菌0小時生長的明場顯微成像觀察；

圖6B為本發(fā)明實施例1的微流控培養(yǎng)裝置的微室中天藍色鏈霉菌培養(yǎng)20小時生長的明場顯微成像觀察；

圖6C為本發(fā)明實施例1的微流控培養(yǎng)裝置的微室中天藍色鏈霉菌培養(yǎng)45小時生長的明場顯微成像觀察；

圖7是本發(fā)明實施例2的微流控培養(yǎng)裝置的結構示意圖；

圖8為本發(fā)明實施例2的微流控培養(yǎng)裝置的局部放大圖；

圖9為本發(fā)明實施例2的微流控培養(yǎng)裝置的實物圖。

以上附圖中，1為基片，2為蓋片；

21為液體輸送通道，211為輸液孔，212為排液孔，213為培養(yǎng)微室；

22為氣體輸送通道，221為通氣孔，222為排氣孔；

23為氣體腔室；

24為圍堰；

25為第二液體輸送通道。

具體實施方式

以下結合附圖和實施例，對本發(fā)明的具體實施方式進行更加詳細的說明，以便能夠更好地理解本發(fā)明的方案以及其各個方面的優(yōu)點。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1

圖1所示，本發(fā)明實施例1的微流控裝置的結構示意圖，包括基片1和蓋片2，蓋片2一面開設有凹槽，蓋片2設有凹槽的一面蓋設在基片1之上。

基片1的上表面與蓋片2的凹槽之間形成液體輸送通道21、氣體輸送通道22及氣體腔室23，氣體輸送通道22環(huán)繞液體輸送通道21設置，液體輸送通道21與氣體輸送通道22通過氣體腔室23相連通。液體輸送通道寬度為500μm，長度為20mm，深度為40μm。

本實施例中基片1與蓋片2之間設有微柱組成的陣列，是許多個長寬為50μm，高為1.5μm的微柱，可以起到支撐蓋片2的作用，在基片1與蓋片2之間形成一個1.5μm的狹縫，即形成了氣體腔室23。

氣體輸送通道22開設有與外界相連通的通氣孔221及排氣孔222；液體輸送通道21開設有與外界相連通的輸液孔211及排液孔212，輸液孔211的直徑為0.8mm。溶液接口直徑為0.6mm左右，能夠直接與連接外徑0.8mm的特氟龍泵管的注射器通過泵管連接。

液體輸送通道21開設有培養(yǎng)微室213，培養(yǎng)微室213的長度為150μm，寬度為100μm，最大高度為15μm，培養(yǎng)微室213與液體輸送通道21相連接的一側口徑逐漸縮小。

微流控裝置的基片1和蓋片2均為玻璃(全氟硅烷化)材質(zhì)，整體透明，便于觀察記錄。

本實施例中的基片1和蓋片2表面均做了硅烷化處理，表面疏水，溶液表面張力較大，表面疏水化處理及培養(yǎng)微室213縮小的口徑保證溶液能被保留在培養(yǎng)微室內(nèi)的圍堰區(qū)域之內(nèi)，不存在泄漏。培養(yǎng)微室213的規(guī)格沒有固定要求，可根據(jù)要培養(yǎng)的細胞進行調(diào)節(jié)。培養(yǎng)微室213縮小的口徑 還可以保證細胞在微室中生長時不受輸送通道中液體流動所產(chǎn)生的剪切力的影響。

本發(fā)明的微流控裝置使用的簡要步驟如圖4所示，主要包括：

細胞或微生物懸液接種于微室：選取天藍色鏈霉菌A3(2)作為模式菌株。天藍色鏈霉菌具有復雜的生命周期，包括機基內(nèi)菌絲、氣生菌絲及孢子絲階段，是研究多細胞分化的模式生物。將A3(2)從固體平板中刮下，置于MM(Minimal Medium)培養(yǎng)基中，用棉花過濾掉氣生菌絲，只剩下孢子，測量OD＝0.1左右，制成孢子懸液；用10μL移液器吸取孢子懸液從輸液孔211注入到液體輸送通道21及培養(yǎng)微室213中，隨后從排液孔212將通道中的溶液吸出，培養(yǎng)微室213由于具有收口構型，液體輸送通道內(nèi)的液流對微室內(nèi)的沖激作用微弱，可保留引入的鏈霉菌孢子。

通入培養(yǎng)基：將液體培養(yǎng)基裝載到1mL的注射器中，并將注射器固定到可編程控制的注射泵上，以100nL/min的速度將液體培養(yǎng)基注入液體輸送通道21中，持續(xù)72小時。

通入氣體：本實施例中的氣體為空氣，由于空氣的擴散速度很快，只需保持空氣通入通道的入口敞開，即可保證氣體微室內(nèi)氣生菌絲的生長。

天藍色鏈霉菌生長發(fā)育過程實時觀察與記錄：將微流控裝置放置于顯微鏡恒溫培養(yǎng)罩內(nèi)，通過倒置熒光顯微鏡觀察鏈霉菌的生長情況，并連續(xù)拍照記錄。圖6A為0小時：在培養(yǎng)微室成功接種單個天藍色鏈霉菌的孢子(白色箭頭所指)。圖6B為20小時：孢子經(jīng)過20小時的生長，長出了基內(nèi)菌絲(白色箭頭所指)；圖6C為45小時：溶液菌絲透過圍堰結構，向空氣微室中生長出氣生菌絲和孢子絲(白色箭頭所指)。利用本微流控芯片，可以清楚地觀察到天藍色鏈霉菌在不同階段的完整的生長發(fā)育情況。

需要說明的是，當細胞或微生物生長成熟時，可通過溶液輸入通道21打入戊二醛，對菌絲進行固定，再將微流控裝置的蓋片打開，利用電子顯微鏡觀察細胞和微生物的高分辨率結構或表面細微結構。

為了進一步說明以上微流控裝置的操作，圖5展示了本發(fā)明實施例1的微流控裝置的實物圖。通道內(nèi)通入紅色素溶液。

需要說明的是，可以根據(jù)需要向液體輸送通道中注入不同成分的培養(yǎng)基，研究不同的碳源、氮源、無機鹽離子及pH對原核或真核細胞生長分化 的影響。

也可以根據(jù)需要向氣體輸送通道注入不同成分的氣體，研究氧氣、二氧化碳等氣體對細胞或微生物生長分化的影響。

實施例2

本發(fā)明也可以實現(xiàn)多次氣液交替界面的控制，以實現(xiàn)對自然環(huán)境中的土壤等復雜相界面中微生物和細胞生長狀態(tài)的模擬。圖7是本發(fā)明的實施例2的結構示意圖。

裝置的通道結構與實施例1類似，從中間較寬的液體輸送通道21入口處通入放線菌孢子懸液，并持續(xù)流入培養(yǎng)基，在第二液體輸送通道25中可以通入培養(yǎng)基或含有其他不同組分的溶液，需要說明的是，第二液體輸送通道25可以根據(jù)需要設有多個，各液體輸送通道周圍設置有與實施例1結構相同的圍堰，以避免通道內(nèi)的液體漏出，第二液體輸送通道25外側還設置了氣體輸送通道22，各液體輸送通道之間形成氣體腔室23，并通過氣體腔室23分隔開，形成多個氣液界面的交替分布。孢子在培養(yǎng)微室213中生長發(fā)育，長出基內(nèi)菌絲，接觸到空氣后分化為氣生菌絲，再次遇到培養(yǎng)基后可以長入其中，并發(fā)生可逆分化。通道的寬度范圍是200μm-1000μm。周圍的液體通道寬度為100μm，培養(yǎng)微室213長度為350μm，寬度為200μm，最大高度為15μm。

利用第二液體輸送通道25，可以在氣生菌絲發(fā)育分化到一定階段后，通入培養(yǎng)基、水、重金屬溶液、有機油性液體或其它試劑溶液，觀察放線菌的氣生菌絲在遇到不同液體時的生長分化行為。本方法的優(yōu)勢在于，可以連續(xù)創(chuàng)造多個氣液界面，并可對溶液成分進行精確控制，實時觀察放線菌的生長行為。

圖9是本發(fā)明的實施例2的微流控裝置的實物圖，為了演示功能，其中液體輸送通道21以及培養(yǎng)微室213通入紅色色素溶液、第二液體輸送通道25通入了綠色色素溶液。在各液體輸送通道之間，為氣體腔室。

最后應說明的是：顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也 無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引申出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明的保護范圍之中。