專利名稱：在植物生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在植物中生產(chǎn)抗體以及其它復(fù)合蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
為了某些有利益的目的，重組DNA技術(shù)是以特定DNA片段修改生物體的基因構(gòu)造所必須的技術(shù)。這項(xiàng)技術(shù)導(dǎo)致以微生物、細(xì)胞培養(yǎng)、植物及動(dòng)物的工程學(xué)來生產(chǎn)可廣泛應(yīng)用的有用產(chǎn)物。進(jìn)行此項(xiàng)工程的重要之處在于以最經(jīng)濟(jì)(與先前通過標(biāo)準(zhǔn)方法達(dá)到相同目的相比)的方式生產(chǎn)所需產(chǎn)物的能力。本質(zhì)上，基因工程已擴(kuò)大產(chǎn)物的價(jià)值，現(xiàn)今可通過最適合及最經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)系統(tǒng)來生產(chǎn)產(chǎn)物。
雖然此項(xiàng)技術(shù)最初是在細(xì)菌系統(tǒng)中進(jìn)行的，而現(xiàn)今于培養(yǎng)中可依照固定程序來改變多種生物體(包含各種微生物的真核細(xì)胞(酵母菌及其它真菌)、植物以及動(dòng)物細(xì)胞)以及生產(chǎn)所有轉(zhuǎn)基因的植物及動(dòng)物。于通過任何轉(zhuǎn)基因的方式來生產(chǎn)產(chǎn)物方面，仍需面對(duì)許多挑戰(zhàn)。盡管微生物系統(tǒng)往往在克隆及生產(chǎn)轉(zhuǎn)化細(xì)胞速度方面提供先進(jìn)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，但在自實(shí)驗(yàn)室規(guī)模提升至大型發(fā)酵槽上經(jīng)常遭遇到困難。此外，雖然細(xì)菌可有效地合成及分泌重組蛋白質(zhì)及酶，但大體而言，細(xì)菌無機(jī)制去執(zhí)行所有所需的翻譯后修飾。某些真菌可生產(chǎn)經(jīng)分泌的糖蛋白質(zhì)類；然而，聚糖的型式及制造并不同于動(dòng)物系統(tǒng)。
哺乳動(dòng)物及昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)已廣泛使用于生產(chǎn)各種蛋白質(zhì)，最顯著進(jìn)步可能是翻譯作用后程序。其它方面，培養(yǎng)基、設(shè)備及特殊培養(yǎng)環(huán)境使生產(chǎn)成本提高而此明顯地成為這些系統(tǒng)的缺點(diǎn)。與微生物培養(yǎng)的情形相似，由于由實(shí)驗(yàn)室規(guī)模提升至大量制造時(shí)，往往無法直接進(jìn)行翻譯作用，所以使大量制造成為顯著的問題。這些系統(tǒng)的另一缺點(diǎn)為考慮到培養(yǎng)病毒或病原性蛋白顆粒(prion)時(shí)，對(duì)人類健康具有潛在性的危險(xiǎn)。
已說明利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可于牛乳中、分泌至尿中或通過鳥類的蛋來生產(chǎn)人類蛋白質(zhì)。一般，仍有動(dòng)物病毒及造成生物體疾病等潛在問題。此外，大量生產(chǎn)及維持生產(chǎn)族群(細(xì)菌或細(xì)胞群)的成本高且耗費(fèi)時(shí)間。與動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)類似，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物應(yīng)提供帶有需要的翻譯后修飾的蛋白質(zhì)。
已討論過利用植物作為重組蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)或″生物反應(yīng)器″的引人注目的方式來替代以細(xì)菌、酵母菌、昆蟲、動(dòng)物及細(xì)胞為主的生產(chǎn)系統(tǒng)。于植物中生產(chǎn)蛋白質(zhì)有許多好處且使用植物來生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因的蛋白質(zhì)正獲得廣泛的支持。
植物生產(chǎn)系統(tǒng)可容易予以純化而免于動(dòng)物病原的污染。已存在多種植物種類的轉(zhuǎn)化方法。在許多種子植物及農(nóng)作物的例子中，已存在收集及控制大量物質(zhì)的方法及基礎(chǔ)設(shè)備。大量生產(chǎn)相當(dāng)簡(jiǎn)單且純粹地基于種子的生產(chǎn)及種植區(qū)域。因此，與通過哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)類似物質(zhì)的方法相比，以植物生產(chǎn)類似物質(zhì)的方法具有實(shí)質(zhì)上減少商品成本的優(yōu)點(diǎn)、降低哺乳動(dòng)物的病毒或病原性蛋白顆粒污染的風(fēng)險(xiǎn)，以及相對(duì)低的原料及生產(chǎn)設(shè)備的資本需求。
一般，以植物生產(chǎn)所需的蛋白質(zhì)的方法僅有一個(gè)顯著的缺點(diǎn)，即在于蛋白質(zhì)于翻譯后糖化作用方面。然而，于許多例子中已證實(shí)，植物中替代的糖修飾作用對(duì)糖蛋白質(zhì)不會(huì)造成有毒的作用或不需要的免疫基因特性。
已發(fā)展出許多在植物中表達(dá)蛋白質(zhì)的生產(chǎn)系統(tǒng)。這些系統(tǒng)包含于油體(oil bodies)上(Rooijen等人的Plant Physiology 1091353-1361(1995)；Liu等人的Molecular Breeding 3463-470(1997))、通過根分泌(rhizosecretion)(Borisjuk等人的Nature Biotechnology 17466-469(1999))、于種子中(Hood等人的Molecular Breeding 3291-306(1997)；Hood等人的In Chemicals via Higher Plant Bioengineering[由Shahidi等人編輯]Plenum Publishing Corp.pp 127-148(1999)；Kusnadi等人的Biotechnology and Bioengineering 56473-484(1997)；Kusnadi等人的Biotechnology and Bioengineering 6044-52(1998)；Kusnadi等人的Biotechnology Progress 14149-155(1998)；Witcher等人的MolecularBreeding 4301-312(1998))、以病毒表面的抗原決定部位(epitopes)(Verch等人的Journal of Virology 73930-938(1999)；Brennan等人的Microbiology 145211-220(1999))以及于馬鈴薯塊莖中穩(wěn)定的表達(dá)蛋白質(zhì)(Arakawa等人的Transgenic Research 6403-413(1997)；Arakawa等人的Nature Biotechnology 16292-297(1998)；Tacket等人的Nature Medicine 4607-609(1998))。重組蛋白質(zhì)亦可標(biāo)記至種子、葉綠體或細(xì)胞外間隔上，以辨別可提供蛋白質(zhì)累積最高程度的位置。
通常，所采用的可編碼出產(chǎn)物的DNA基礎(chǔ)功能片段包含啟動(dòng)子、接著為蛋白質(zhì)編碼區(qū)域以及終結(jié)基因。于任何生物體中，這些基礎(chǔ)的、單一的順反子(cistronic)(亦稱為″單順反子″)為表達(dá)基因的標(biāo)準(zhǔn)型式。根據(jù)核糖體掃描模型(典型為大多數(shù)真核生物的mRNA)，40S核糖體亞單位會(huì)結(jié)合至mRNA的5′-端且沿著非翻譯的5′序列移動(dòng)直到40S核糖體亞單位到達(dá)AUG密碼子(Kozak，Adv.Virus Res.31229-292(1986)；Kozak，J.Mol.Biol.108229-241(1989))。雖然對(duì)大多數(shù)真核生物的mRNA而言，只有第一個(gè)開放閱讀框(，ORF)具有翻譯活性，但仍有其它不同的機(jī)制(mRNA具有多順反子功能(Kozak，Adv.Virus Res.31229-292(1986)))，不需以分離的啟動(dòng)子控制各個(gè)編碼區(qū)域而可表達(dá)多數(shù)個(gè)編碼區(qū)域。
專利公開第WO98/54342號(hào)教示于植物中利用植物病毒驅(qū)動(dòng)核糖體內(nèi)進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)以同時(shí)表達(dá)期望的基因的方法。該公開案亦揭示煙草花葉病毒屬的IRES要件對(duì)3′近側(cè)基因表達(dá)(于植物、動(dòng)物、人類以及酵母菌中，自雙順反子假想的mRNA轉(zhuǎn)錄)提供一種內(nèi)翻譯途徑，且可將外來基因插入至IRES下游而表達(dá)。專利公開第WO 00/789085號(hào)描述利用基因構(gòu)建中所設(shè)計(jì)的IRES片段以允許作物中多重作物保護(hù)特性(即除草劑抗藥性以及殺蟲毒素(Bt)的表達(dá))的累積或表達(dá)可改變植物的代謝物的基因使植物生產(chǎn)聚羥基愛康酯(polyhydroxyalconates，PHA′s)，其可作為塑料的某種型式的前驅(qū)物。
發(fā)明概要本發(fā)明提供一種在植物中用以生產(chǎn)蛋白質(zhì)的組成及方法，尤其是于自然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)為了成為具有生物活性的蛋白質(zhì)，需要多數(shù)個(gè)結(jié)構(gòu)基因來協(xié)同表達(dá)。典型地最終產(chǎn)物具有治療、診斷或產(chǎn)業(yè)上用途。
此外，本發(fā)明的一方面是針對(duì)重組核酸分子或表達(dá)單元，由5′至3′包含轉(zhuǎn)錄起始物及多個(gè)結(jié)構(gòu)基因，并通過核糖體內(nèi)結(jié)合序列(internalribosome binding sequence，IRES)分開各個(gè)重組核酸分子或表達(dá)單元。于一優(yōu)選具體實(shí)施例中，該轉(zhuǎn)錄起始物為植物細(xì)胞中具有功能的啟動(dòng)子(其不必為植物中自然發(fā)現(xiàn)的啟動(dòng)子)。該轉(zhuǎn)錄起始物可另外包括加強(qiáng)序列或其它調(diào)節(jié)要件以調(diào)整表達(dá)及/或特異性表達(dá)(例如提供轉(zhuǎn)錄作用的暫時(shí)性及/或空間性調(diào)節(jié))的程度。
結(jié)構(gòu)基因以可編碼出多-亞單位蛋白質(zhì)的亞單位為佳。本文中所使用的″多-亞單位蛋白質(zhì)″系一種蛋白質(zhì)，其含有多個(gè)分離的多肽或蛋白質(zhì)鏈，彼此結(jié)合后可形成單一球狀蛋白質(zhì)，其中至少兩個(gè)分離的多肽系由不同的基因所編碼。在另一優(yōu)選的觀點(diǎn)中，多-亞單位蛋白質(zhì)至少包括一個(gè)抗體的免疫活性部分，因此可與抗原專一地結(jié)合。例如，該多-單元蛋白質(zhì)可包括抗體分子的重鏈(heavy chains)及輕鏈(light chains)或部分重鏈及輕鏈。多重抗原結(jié)合部分可通過不同的結(jié)構(gòu)基因而編碼出以產(chǎn)生多價(jià)抗體。
然而，任何多-亞單位蛋白質(zhì)系包含于本發(fā)明的范疇中。多亞單位蛋白質(zhì)的實(shí)例包含，但非限于異二聚或異多聚蛋白質(zhì)，例如T細(xì)胞受體、MHC分子、免疫球蛋白家族的蛋白質(zhì)、核酸結(jié)合蛋白質(zhì)(例如復(fù)制因子、轉(zhuǎn)錄因子等)、酶、催化性抗體(abzymes)、受體(尤其是可溶性受體)、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞膜蛋白質(zhì)、分化因子、似血紅素蛋白質(zhì)、多聚激酶等。
于另一方面，該結(jié)構(gòu)基因可編碼帶有同等功能的蛋白質(zhì)復(fù)合物的成分，例如酶復(fù)合物、分化因子復(fù)合物、復(fù)制復(fù)合物等。
于一方面，本發(fā)明提供第一表達(dá)單元，包括于植物細(xì)胞中具有功能的轉(zhuǎn)錄起始物、可編碼出第一多-亞單位蛋白質(zhì)(例如包括抗體分子的重鏈或輕鏈)中一個(gè)亞單位的結(jié)構(gòu)基因以及可編碼出于植物中具有活性的選擇性標(biāo)記的第一報(bào)導(dǎo)基因。亦可提供第二表達(dá)單元，其含有于植物細(xì)胞中具有功能的轉(zhuǎn)錄起始物、一或多個(gè)結(jié)構(gòu)基因(其可編碼出第二多-亞單位蛋白質(zhì)(例如抗體分子的重鏈或輕鏈)的其它亞單位)以及可編碼出不同于第一表達(dá)單元的選擇性標(biāo)記且其于植物細(xì)胞中亦具有活性的第二報(bào)導(dǎo)基因。一或多個(gè)表達(dá)單元可包括復(fù)制源、原核生物源及真核生物源。例如可提供多重不同型式的真核生物源，使表達(dá)單元的復(fù)制作用可于一或多個(gè)植物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、酵母菌、昆蟲細(xì)胞等中進(jìn)行。
于另一優(yōu)選具體實(shí)施例中，表達(dá)單元中的結(jié)構(gòu)基因可編碼出一或多個(gè)蛋白質(zhì)，其為將不成熟的蛋白質(zhì)加工成具有成熟生物活性型式的蛋白質(zhì)所需。例如，該結(jié)構(gòu)基因可編碼出蛋白酶(其系通過切割蛋白質(zhì)來加工不成熟蛋白質(zhì)(例如前胰島素原)成為成熟型式蛋白質(zhì)(胰島素)所需)。可以部分相同表達(dá)單元或部分不相同的表達(dá)單元提供可編碼出不成熟蛋白質(zhì)的基因。
于又一優(yōu)選具體實(shí)施例中，該重組核酸分子或表達(dá)單元包含至少一個(gè)5′結(jié)構(gòu)基因，其序列為可編碼出靶肽(例如轉(zhuǎn)移肽)的序列，該肽系指引基因的表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)移至植物細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外某些位置。于一方面，各個(gè)結(jié)構(gòu)基因(包括5′靶序列)系用以指引結(jié)構(gòu)基因至所選擇的位置。該5′靶序列可相同或不同，例如基因產(chǎn)物的某些結(jié)合作用可靶至相同或不同位置。該重組核酸分子進(jìn)一步包括可選擇性標(biāo)記基因及/或多腺苷序列。優(yōu)選為該多腺苷序列系位于表達(dá)單元的3′端部分。
本發(fā)明的另一方面系針對(duì)于植物中生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，包括制備包括重組核酸分子的載體；將載體引入植物細(xì)胞中，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；以及選擇衍生自轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞(可表達(dá)多數(shù)個(gè)編碼序列)的植物。于一優(yōu)選具體實(shí)施例中，表達(dá)的產(chǎn)物系標(biāo)記至特定位置，例如細(xì)胞膜、細(xì)胞外間隔或細(xì)胞器，例如細(xì)質(zhì)體(葉綠體)。于另一優(yōu)選具體實(shí)施例中，該植物細(xì)胞為阿拉伯芥(arabidopsis)細(xì)胞。亦提供經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、含有重組核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物、包含由經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生的植物、植物的一部分以及衍生自轉(zhuǎn)基因植物的種子。
本發(fā)明提供用于植物及植物細(xì)胞中可暫時(shí)或穩(wěn)定表達(dá)的基因構(gòu)建，以及造成活性生物分子(非植物之內(nèi)生性生產(chǎn))的表達(dá)。
附圖描述參考以下詳細(xì)描述和附圖可以更好地理解本發(fā)明的目的與特征。


圖1是本發(fā)明核酸構(gòu)建圖示；圖2是本發(fā)明核酸構(gòu)建的圖示；圖3是來自煙草核酮糖-1，5二磷酸羧化酶小亞單位(GenBankACCESSION X023 53)的葉綠素靶肽；圖4表示植物鈣調(diào)蛋白的氨基末端部分與各種抗體基因的氨基末端區(qū)域比較的序列比較；圖5是pICP1176的質(zhì)粒圖譜；圖6是pICP1221的質(zhì)粒圖譜；圖7是pICP1177的質(zhì)粒圖譜；圖8是pICGHpolyAb1的質(zhì)粒圖譜；圖9是pICGHpolyAb4的質(zhì)粒圖譜；圖10是Pxb1500的質(zhì)粒圖譜。
圖11A和11B是本發(fā)明核酸構(gòu)建在產(chǎn)生胰島素中的示意圖。
發(fā)明詳述依照本發(fā)明的各種基因構(gòu)建系圖示地說明于第1及2圖中。第1圖說明DNA構(gòu)成，其中啟動(dòng)子會(huì)驅(qū)動(dòng)一系列基因中的第一基因，各基因系由IRES要件將其分開。IRES序列會(huì)于經(jīng)選擇的植物細(xì)胞中起始帽-獨(dú)立(cap-independent)翻譯作用。于一優(yōu)選具體實(shí)施例中，多腺苷信號(hào)系緊接的插入需要表達(dá)的最后一個(gè)基因序列的3′端以使轉(zhuǎn)錄出的mRNA可有效地加工。該DNA構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄作用可形成聚順反子mRNA。核糖體系獨(dú)立地結(jié)合至RNA的5′端以及各IRES要件上，使聚順反子mRNA中所有蛋白質(zhì)可獨(dú)立但同等重要的表達(dá)。
第2圖說明本發(fā)明的另一具體實(shí)施例，其中，IRES要件系位于DNA構(gòu)成的5′端，而不位于啟動(dòng)子。如此使得DNA構(gòu)成上的基因可利用一種通過宿主位點(diǎn)(該宿主位點(diǎn)是在轉(zhuǎn)化期間插入DNA構(gòu)成的位點(diǎn))的轉(zhuǎn)錄活性加以調(diào)節(jié)的方法而表達(dá)。于一相關(guān)的具體實(shí)施例中，該DNA構(gòu)成包含一段可允許特定位置整合至先前所定義的染色體的位點(diǎn)的序列(該染色體的位點(diǎn)具有所需要的轉(zhuǎn)錄表達(dá)的能力)。因此，由第2圖所示的具體實(shí)施例中，基于基因位點(diǎn)(基因構(gòu)建插入處)的轉(zhuǎn)錄作用的控制，利用5′IRES要件使基因表達(dá)。
植物的啟動(dòng)子該啟動(dòng)子可為結(jié)構(gòu)性、組織特異性、發(fā)育調(diào)節(jié)或其它誘發(fā)性或抑制性調(diào)節(jié)基因，且所提供的啟動(dòng)子于植物細(xì)胞中具有功能。大多數(shù)植物的啟動(dòng)子(如前述)可引導(dǎo)基因表達(dá)(不論是結(jié)構(gòu)性或其它形式調(diào)節(jié))。調(diào)節(jié)作用可基于暫時(shí)性、空間性或發(fā)育信號(hào)、環(huán)境的訊息或通過化學(xué)性誘導(dǎo)物或抑制物的手段來控制，以及這些制劑的來源可為自然或合成而來，即該啟動(dòng)子可由自然的來源或由基因重組工程而得到。轉(zhuǎn)錄作用的起始區(qū)域包括啟動(dòng)子以及一或多個(gè)添加的調(diào)節(jié)要件，例如增強(qiáng)子。啟動(dòng)子亦可為嵌合的基因序列，即來自利用二或多個(gè)不同的自然或合成的啟動(dòng)子的序列要件。
植物的啟動(dòng)子可經(jīng)選擇，以于不同的植物組織中通過熟習(xí)此技藝的人士所知悉的方法(Gasser & Fraley，Science 2441293-99(1989)來控制轉(zhuǎn)殖基因的表達(dá)?；ㄒ髓偳恫《?5S啟動(dòng)子(CaMv)、經(jīng)加強(qiáng)的CaMv啟動(dòng)子的衍生物(Odell等人的Nature，3(13)810(1985))、肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(McElroy等人的Plant Cell 2163-71(1990))、AdhI啟動(dòng)子(Fromm等人的Bio/Technology 8833-39(1990)，Kyozuka等人的Mol.Gen.Genet.22840-48(1991))、泛素(ubiquitin)啟動(dòng)子、玄參(Figwort)鑲嵌病毒啟動(dòng)子、甘露堿(mannopine)合成酶啟動(dòng)子、諾巴林(nopaline)合成酶啟動(dòng)子以及章魚堿(octopine)合成酶啟動(dòng)子及其衍生物等為熟知的基本的啟動(dòng)子。經(jīng)調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子系描述為光誘發(fā)(例如核酮糖雙磷酸羧基酶啟動(dòng)子的小亞單位)、熱沖擊啟動(dòng)子、硝酸鹽及其它化學(xué)性誘發(fā)啟動(dòng)子(參見，例如美國(guó)專利第5,364,780以及5,777,200號(hào))。
當(dāng)需要于植物中的特定部位表達(dá)蛋白質(zhì)時(shí)，可使用組織特異性啟動(dòng)子。葉子的特異性啟動(dòng)子可包含因前接35S增強(qiáng)子的C4PPDK啟動(dòng)子(Sheen，15 MBO，123497-505(1993))或其它于葉子中具特異性表達(dá)的啟動(dòng)子。至于欲在種子中表達(dá)蛋白質(zhì)時(shí)，則可使用下列啟動(dòng)子柰平(napin)基因的啟動(dòng)子(美國(guó)專利第5,420,034以及5,608,152號(hào))、乙?；?CoA羧基酶啟動(dòng)子(美國(guó)專利第5,420,034以及5,608,152號(hào))、2S白蛋白啟動(dòng)子、種子貯存蛋白質(zhì)啟動(dòng)子、腰豆蛋白(phaseolin)啟動(dòng)子(Slightom等人的Proc.Natl.Acad Sci.USA 801897-1901(1983))、油膜蛋白啟動(dòng)子(Plant等人的Plant Mol.Bio.25193-205(1994)；Rowley等人的1997，Biochim.Biophys.Acta.13451-4(1997)；美國(guó)專利第5,650,554號(hào)；PCT WO 93/20216)、玉米膠蛋白質(zhì)(zein)啟動(dòng)子、堿溶性蛋白質(zhì)(glutelin)啟動(dòng)子、淀粉合成酶啟動(dòng)子以及分枝淀粉酶啟動(dòng)子。
植物中的IRES要件該IRES要件可為先前所敘述中一者或于植物細(xì)胞中具有活性的人造IRES(即合成的或由基因工程制造的IRES)。至于含有多-IRES的DNA構(gòu)成，其可使用具有不同DNA序列的IRES要件。近年來已由Oleracia officinalis L.植物中分離出一種新的煙草花葉病毒，crTMV，且該crTMV的基因體已完成定序(6312個(gè)核酸)(Dorokhov等人的Dokladyof Russian Academy of Sciences 332518-522(1993)；Dorokhov等人的FEBS Lett.3505-8(1994))。
crTMV的RNA與典型的煙草花葉病毒的RNA不同處為crTMV的RNA的3′近側(cè)的CP基因的翻譯作用系通過核糖體內(nèi)進(jìn)入(由特定序列要件(IREScp)所調(diào)節(jié)，Ivanov等人的Virology 232，32-43(1997))機(jī)制而發(fā)生于試管以及植物界中。該結(jié)果指出，crTMV的RNA中的CP基因上游于148-核酸區(qū)域含有IREScp，該IREScp可促進(jìn)于試管及生物體(原生質(zhì)粒及轉(zhuǎn)基因植物)中翻譯作用之內(nèi)起始。
近年來，已證實(shí)煙草花葉病毒的基因體RNA含有一序列(該序列位于MP基因之上游)，其可促進(jìn)3′近側(cè)基因的表達(dá)(于試管中，以帽-獨(dú)立的方式翻譯連接至該序列上嵌合的mRNA)。crTMV的RNA中的MP基因上游的228-核酸序列(IRESMP228CR)可調(diào)節(jié)3′近側(cè)GUS基因(其系由雙順反子轉(zhuǎn)錄)的翻譯。另外，crTMV的RNA中的MP基因上游的75-核酸序列與228-核酸序列具有一樣的效力。因此，75-核酸序列含有一IRESMP要件(IRESMP75CR)。已發(fā)現(xiàn)類似于crTMV RNA，與煙草花葉病毒為同一群(TMV UI)的病毒其基因體RNA上游的75-核酸序列亦含有IRESMP75UI要件，該IRESMP75UI要件可調(diào)節(jié)3′近側(cè)基因的帽-獨(dú)立翻譯作用。
該煙草花葉病毒提供了一種新的內(nèi)起始翻譯作用的實(shí)例，其與小RNA病毒及其它病毒以及真核細(xì)胞的mRNA顯示的IRES顯然不同?？烧{(diào)節(jié)帽-獨(dú)立翻譯作用的IRESMP要件不僅存在于crTMV的RNA中，也存在于與煙草花葉病毒為同一群病毒(TMV UI)及其它草嵌紋病毒(胡瓜綠斑嵌紋病毒)的基因體中。也就是說，草嵌紋病毒群中不同的病毒成員亦含有IRESMP。
由實(shí)施例可知，使用兩種特異性的IRES要件來驗(yàn)證本發(fā)明。下列為由十字花科煙草花葉病毒(crTMV)的基因體而來的兩種IRES的核酸序列IRESmp75cr5′TTCGTTTGCTTTTTGTAGTATAATTAAATATTTGTCAGATAAGAGATTGTTTAGAGATTTGTTCTTTGTTTGATA3′(SEQ ID NO.1)IREScp148cr5′GAATTCGTCGATTCGGTTGCAGCATTTAAAGCGGTTGACAACTTTAAAAGAAGGAAAAAGAAGGTTGAAGAAAAGGGTGTAGTAAGTAAGTATAAGTACAGACCGGAGAAGTACGCCGGTCCTGATTCGTTTAATTTGAAAGAAGAAA3′(SEQ ID NO.2)由結(jié)構(gòu)基因編碼的蛋白質(zhì)于一方面中，通過本發(fā)明的表達(dá)方法以及表達(dá)單元所編碼出的蛋白質(zhì)為原始形式的蛋白質(zhì)，為了使該蛋白質(zhì)具有生物活性，其基因需要與數(shù)個(gè)結(jié)構(gòu)基因協(xié)同表達(dá)。于一例子中，該蛋白質(zhì)需要與數(shù)個(gè)亞單位組合才能具有活性。于另一例子中，該蛋白質(zhì)生產(chǎn)出來后，為未成熟的形式，其需要經(jīng)過加工(例如由一或多個(gè)其它蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白水解切割)或經(jīng)過蛋白質(zhì)修飾(例如，磷酸化、蛋白質(zhì)糖化、異戊烯化(prenylation)、核糖基化(ribosylation)等)而變成具有活性的蛋白質(zhì)。
用以驗(yàn)證本發(fā)明的非限制實(shí)例為抗體(例如單株抗體)以及胰島素。于此兩種蛋白質(zhì)中，本發(fā)明不僅證明出可通過協(xié)同表達(dá)的方法來生產(chǎn)該功能性分子的能力且亦可通過細(xì)胞蛋白質(zhì)的分泌器以正確地辨識(shí)于植物細(xì)胞中較不尋常、本文揭示的基因體構(gòu)建及其后的多順反子mRNA。尤其，可通過該基因構(gòu)建以及本發(fā)明的方法生產(chǎn)單株抗體而不需要產(chǎn)生融合瘤細(xì)胞。
單株抗體的基因可由鼠科動(dòng)物、人類或其它動(dòng)物來源獲得。此外，亦可合成該基因，例如可編碼出組成抗體分子的重鏈或輕鏈的基因，其為嵌合或經(jīng)修飾的基因型式。編碼區(qū)域的順序(例如重鏈然后輕鏈，或輕鏈然后重鏈)并不重要。重鏈以及輕鏈多肽(例如可變重鏈及可變輕鏈多肽)的基因編碼可來自細(xì)胞產(chǎn)生的IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。制備基因體DNA片段(由此免疫球蛋白變異區(qū)域的基因可經(jīng)克隆)的方法為此技藝中所熟知的技術(shù)。參見例如，Herrmann等人的Methods inEnzymol.，152180-183(1987)；Frischauf的Methods in Enzymol.，152183-190(1987)；Frischauf的Methods in Enzymol.，152199-212(1987)。
用于分離可編碼出免疫球蛋白產(chǎn)物的基因的探針包含編碼VH的恒定部分的序列、編碼VH及VL的骨架區(qū)域的序列以及完全重組的免疫球蛋白基因的恒定區(qū)域的探針，這些序列系由可利用的來源獲得。參見，例如，Early and Hood，Genetic Engineering，Setlow and Hollaendereds.，Vol.3157-188，Plenum Publishing Corporation，New York(1981)；以及Kabat等人的Sequences of Immunological Interests，National Institutesof Health，Bethesda，Md.(1987)。
蛋白質(zhì)的實(shí)例為胰島素，于其自然的環(huán)境中，編碼及翻譯出的胰島素為前驅(qū)物形式，然后通過一或多個(gè)蛋白水解切割步驟以形成成熟且具有功能性的蛋白質(zhì)。翻譯作用之后，前胰島素原蛋白質(zhì)的加工(以獲得成熟形式的胰島素)包含蛋白水解切割步驟(包含移除胺基端的分泌作用信號(hào)序列(此為真核生物的分泌作用途徑的一般步驟))，以及通過枯草菌素(subtilisin)家族的蛋白酶(例如PC2以及PC1/PC3蛋白酶)于內(nèi)位置進(jìn)行加工及通過羧肽酶E進(jìn)行修飾。切割作用會(huì)使內(nèi)肽(C-肽以及A及B肽)釋出。該A及B肽在形成肽鏈內(nèi)及肽鏈間的雙硫鍵后，才會(huì)形成熟成的胰島素蛋白質(zhì)。
真核生物的分泌作用途徑的細(xì)胞內(nèi)區(qū)間提供了優(yōu)選的環(huán)境使適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)進(jìn)行成熟作用、折疊作用以及雙硫鍵的形成，于植物中以此方式表達(dá)人類或動(dòng)物的蛋白質(zhì)將同樣地顯示有利于生產(chǎn)適當(dāng)成熟形式的蛋白質(zhì)。其它合成成熟胰島素的方法包含分別地表達(dá)各個(gè)A及B肽，然后于試管中提供一個(gè)適合進(jìn)行還原作用的環(huán)境以利雙硫鍵的形成(美國(guó)專利第4,421,685以及4,559,300號(hào))。
依照本發(fā)明，可制備許多型式的多順反子基因構(gòu)建以生產(chǎn)胰島素。于一具體實(shí)施例中，一多順反子基因構(gòu)建包含胰島素編碼區(qū)域與其本身的分泌作用信號(hào)或植物的分泌作用信號(hào)，以及可編碼出蛋白水解加工酶的結(jié)構(gòu)基因?？墒褂酶鞣N為熟知此技藝的人士所知悉的方法克隆出人類的胰島素基因(GenBank Accession J00265)。該克隆的優(yōu)選型式為來自成熟mRNA的cDNA，以此方式可排除內(nèi)含子以及減少期望克隆的基因的整體大小。同樣地，可利用已知DNA序列的信息(例如于一或多個(gè)如上述的表達(dá)單元中包括下列一或多個(gè)序列)克隆出編碼蛋白水解酶(PC2、PC1/PC3以及羧肽酶E)的基因。
結(jié)構(gòu)基因 于GenBank中的說明人類胰島素 定義人類胰島素基因，完整的cds。
編號(hào)J00265(GenBank)PC2前蛋白轉(zhuǎn)換酶 定義現(xiàn)代人(homo sapiens)的蛋酶白原轉(zhuǎn)變，枯草菌素/第2型科星(kexin)(PCSK2)，mRNA。
編號(hào)XM_012963(GenBank)PC3(PC1)前蛋白轉(zhuǎn)換酶 定義現(xiàn)代人的前蛋白轉(zhuǎn)換酶，枯草菌素/第1型科星(PCSK1)，mRNA。
編號(hào)XM_003674CPE羧肽酶E酶 定義現(xiàn)代人的羧肽酶E(CPE)，mRNA。
編號(hào)XM_003479(GenBank)于這些例子中，優(yōu)選型式的基因?yàn)閬碜猿墒靘RNA或與其DNA序列同等的cDNA。該基因可產(chǎn)生多個(gè)多順反子載體以使這些所有構(gòu)成成熟蛋白質(zhì)的組份以所需的比例來達(dá)成于植物中成熟胰島素的高階表達(dá)。因此，本發(fā)明提供一種在植物中通過將所有所需的基因結(jié)合于多順反子載體中以完整的合成具有治療作用的經(jīng)加工的成熟的蛋白質(zhì)。
于一優(yōu)選的具體實(shí)施例中，該核酸構(gòu)建或表達(dá)單元由5′至3′的順序包括驅(qū)動(dòng)人類胰島素基因表達(dá)的啟動(dòng)子、接著為IRES(優(yōu)選為cp148或mp75)、CP2的編碼區(qū)域、第二個(gè)IRES、CP3的編碼區(qū)域、第三個(gè)IRES以及CPE的編碼區(qū)域。整個(gè)的片段結(jié)束于帶有適當(dāng)?shù)闹参镛D(zhuǎn)錄作用終止處以及多腺苷酸作用信號(hào)的3′端以確保轉(zhuǎn)錄出的mRNA可進(jìn)行最有效的加工作用。參見第3A圖。雖然所述的基因?yàn)閱我豁樞颍摼幋a區(qū)域(編碼區(qū)域中所給予的任何序列系為了生產(chǎn)出治療性蛋白質(zhì))最理想的順序可依照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)而決定以及具有不同基因順序的表達(dá)單元皆包括于本發(fā)明范疇中。
于其它具體實(shí)施例中，本發(fā)明的基因構(gòu)建及方法可以下述方式修改例如，于引入含有編碼加工蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因的基因構(gòu)建后，分別將編碼未成熟形式胰島素的結(jié)構(gòu)基因引入植物細(xì)胞中。因此，制備出一種″宿主″加工植物且使其增殖到引入包括胰島素基因的表達(dá)單元。于此例中的胰島素，該多順反子基因構(gòu)建未包含胰島素編碼區(qū)域且該啟動(dòng)子會(huì)驅(qū)動(dòng)第一個(gè)加工酶(PC2)的表達(dá)，接著由IRES驅(qū)動(dòng)PC3及PCE基因的表達(dá)。然后以穩(wěn)定的基因片段或通過暫時(shí)性表達(dá)(transientexpression)將胰島素基因引入植物中。此基因構(gòu)建的圖標(biāo)說明顯示于第3B圖。這些基因的各個(gè)產(chǎn)物系定位于適當(dāng)?shù)拇渭?xì)胞間隔中，此與人類細(xì)胞中發(fā)生的加工作用最為相似。
靶序列當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)于細(xì)胞中合成時(shí)，其可通過靶序列的功效靶至特定的亞細(xì)胞或細(xì)胞外位置。于一些例子中，氨基酸的序列系以多肽的胺基端部分合成，以及于移位或定位過程之后或期間通過蛋白酶加以切割。例如，于真核細(xì)胞中，蛋白質(zhì)分泌途徑的模型為隨著核糖體結(jié)合至mRNA以及翻譯作用起始后，開始出現(xiàn)剛合成的多肽鏈。如果該蛋白質(zhì)系預(yù)定用于分泌，該蛋白質(zhì)暴露出的胺基端會(huì)為信號(hào)辨識(shí)粒子(signalrecognition particle，SRP)所辨識(shí)，使得當(dāng)mRNA、核糖體以及SRP復(fù)合體?？坑趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)時(shí)短暫地中止翻譯作用。?？亢?，翻譯作用重新開始，雖然此時(shí)的多肽鏈為一邊進(jìn)行翻譯作用一邊移位至ER內(nèi)部。蛋白質(zhì)亦可于翻譯作用后再移位；但于生物體中此種過程較不具效率且通常不將其視為進(jìn)入ER的正常途徑。
美國(guó)專利第5,474,925號(hào)描述利用信號(hào)肽的基因表達(dá)構(gòu)成，該肽可經(jīng)翻譯融合成重組蛋白質(zhì)，使該蛋白質(zhì)靶至細(xì)胞壁的纖維素基質(zhì)。如此使可回復(fù)的纖維素基質(zhì)與蛋白質(zhì)分離出特別有助于在棉屬植物中表達(dá)蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明的一具體實(shí)施例中，該表達(dá)單元可包括一結(jié)構(gòu)基因，其系融合至編碼這些信號(hào)肽的序列的主干中。
于另一方面，該蛋白質(zhì)可靶至植物的間液(interstitial fluids)而允許蛋白質(zhì)(例如抗體，優(yōu)選為單株抗體)可自間液中直接分離。自間液分離蛋白質(zhì)的一示范方法系描述于美國(guó)專利第6,284,875號(hào)。因此，于一具體實(shí)施例中，該表達(dá)單元包括一結(jié)構(gòu)基因，其系融合至靶序列(由蛋白質(zhì)分泌至間隙液體)的主干中。此種蛋白質(zhì)系描述于例如，美國(guó)專利第6,284,875號(hào)。
本發(fā)明中，特佳的具體實(shí)施例為，例如，該結(jié)構(gòu)基因可編碼抗體分子的重鏈及輕鏈者，該結(jié)構(gòu)基因包含用以指引表達(dá)產(chǎn)物至分泌途徑的靶肽。如同抗體系一種正常分泌的蛋白質(zhì)-該分泌過程于成熟抗體分子的生產(chǎn)中扮演一重要角色。為了于植物中達(dá)成上述目的，該基因系經(jīng)合成(例如克隆)，且該基因具有其本身哺乳動(dòng)物的信號(hào)肽編碼區(qū)域或以融合型式取代植物的分泌作用信號(hào)肽。該信號(hào)肽及該蛋白質(zhì)間的融合應(yīng)使植物進(jìn)行加工時(shí)，所得的蛋白質(zhì)的胺基端與于人類宿主中所產(chǎn)生的胺基端相同。
將蛋白質(zhì)靶至植物內(nèi)膜系統(tǒng)為本發(fā)明的優(yōu)選具體實(shí)施例，其對(duì)蛋白質(zhì)的胺基端提供適當(dāng)?shù)某墒熳饔?。如果期望的蛋白質(zhì)不論是具有附加的靶信息或是利用基因工程的方式使該蛋白質(zhì)包含附加的靶信息，則可實(shí)現(xiàn)將其進(jìn)一步定位至內(nèi)膜系統(tǒng)的特定區(qū)域。
靶至胞器(例如細(xì)質(zhì)體(如葉綠體)以及線粒體)亦有利于達(dá)成期望的胺基端成熟，靶至這兩個(gè)位置系由胺基端的信號(hào)序列指定，接著則進(jìn)行蛋白質(zhì)切割。于一優(yōu)選具體實(shí)施例，該作為信號(hào)的肽可指引表達(dá)產(chǎn)物至細(xì)質(zhì)體(如葉綠體)或其它亞細(xì)胞器。一實(shí)例為紫花苜蓿核酮糖-雙磷酸羧基酶的小亞單位的轉(zhuǎn)移肽(transit peptide)(Khoudi等人的Gene197343-5(1997))。過氧化物酶體的(peroxisomal)靶序列系有關(guān)肽序列(不論系N-端序列，內(nèi)部序列或C-端序列)，其可使蛋白質(zhì)靶至過氧化物酶體上，例如植物的C-端靶三肽SKL(Banjoko等人的Plant Physiol.1071201-08(1995))。
另一方面，細(xì)胞核定位信號(hào)并不一定是限制在5′端位置(胺基端)且無法通過任何已知的細(xì)胞機(jī)制將其蛋白水解移除。第3圖顯示葉綠體靶肽的序列，它是來自煙草細(xì)胞核基因編碼的核酮糖-雙磷酸羧基酶的小亞單位(GenBank ACCESSION X02353)。于進(jìn)入胞器期間，該信號(hào)或轉(zhuǎn)移肽會(huì)通過胞器的蛋白酶的作用而移除。于基因融合體的5′端包括此序列，該基因融合至這段序列(起始于期望的成熟形式蛋白質(zhì)(即抗體的重鏈或輕鏈)的第一個(gè)氨基酸)有助于生產(chǎn)成熟形式的蛋白質(zhì)。
為了于液泡中定位或分泌蛋白質(zhì)，用以將蛋白質(zhì)靶至內(nèi)膜系統(tǒng)的信號(hào)序列在植物及動(dòng)物中是相似的。第4圖顯示植物鈣調(diào)蛋白蛋白質(zhì)的胺基端部分與一些抗體基因的胺基端部分的比較。該比較的序列包含抗體蛋白質(zhì)的部分，該抗體蛋白質(zhì)系制造成前蛋白質(zhì)原的部分，但不存在于最終成熟蛋白質(zhì)(經(jīng)過分泌途徑的加工)。一般，此種信號(hào)序列在長(zhǎng)度上可有些許改變，如實(shí)施例中，植物的信號(hào)肽比哺乳動(dòng)物的序列長(zhǎng)10至11個(gè)氨基酸，但它們都具有共同的特征，該特征已知為與真核細(xì)胞的分泌信號(hào)肽有關(guān)。為了使信號(hào)肽適用于本發(fā)明，可依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)加以改變(例如制備帶有適合用于與其它任何基因克隆的端基)。
融合蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)基因亦可編碼融合蛋白質(zhì)。例如，結(jié)構(gòu)基因(其可編碼出需經(jīng)加工的多聚體蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的多肽亞單位)包括可編碼出效應(yīng)物多肽的序列。本文中所使用的″效應(yīng)物分子″系指氨基酸序列，例如蛋白質(zhì)、多肽或肽，以及可包含，但非限于調(diào)節(jié)因子、酶、抗體、毒素等。由效應(yīng)物分子產(chǎn)生所需的效應(yīng)的非限制實(shí)例包含，引起細(xì)胞增生或細(xì)胞死亡、起始免疫反應(yīng)或作為診斷目的的偵測(cè)分子(例如該融合體可編碼出螢光多肽，例如GFP、EGFP、BFP、YFP、EBFP等)。
選擇性標(biāo)記以及報(bào)導(dǎo)基因(Reporter genes)由報(bào)導(dǎo)基因編碼出的選擇性標(biāo)記(例如抗抗生素基因(例如卡那霉素(kanamycin)以及抗潮霉素(hygromycin))、抗除草劑(固殺草(glufosinate)、伊米達(dá)璘諾(imidazlinone)或嘉磷塞(glyphosate))基因或生理上標(biāo)記(可見或生物化學(xué)上))系用于篩選經(jīng)本發(fā)明的核酸構(gòu)建轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。另一方面，非轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞(即非轉(zhuǎn)化株)系經(jīng)撲殺或優(yōu)先地在選擇性的條件下無法生長(zhǎng)。報(bào)導(dǎo)基因可包含于基因構(gòu)建中或載體中，最后將該基因構(gòu)建運(yùn)送至植物細(xì)胞。本文中所使用的″報(bào)導(dǎo)基因″系指可提供細(xì)胞一種經(jīng)表達(dá)后為可見的或可測(cè)量的表型的任何基因。
優(yōu)選地，報(bào)導(dǎo)基因的表達(dá)會(huì)產(chǎn)生一種可偵測(cè)的結(jié)果，例如，提供視覺上的比色、螢光、冷光或生物化學(xué)上可分析的產(chǎn)物；以及/或選擇性標(biāo)記，其可基于生理反應(yīng)(例如生長(zhǎng)差異、增殖速率的改變、分化狀態(tài)等)選擇轉(zhuǎn)化體。細(xì)胞中報(bào)導(dǎo)基因的表達(dá)會(huì)造成該細(xì)胞展現(xiàn)出視覺生理上或生物化學(xué)的特征。一般使用的報(bào)導(dǎo)基因包含lacZ(β-半乳糖)、GUS(β-尿酸化)、GFP(綠色螢光蛋白質(zhì))、螢光酶或CAT(綠霉素乙酰基轉(zhuǎn)移)，這些特征可容易地觀察到或測(cè)量。此種基因可組合使用或取代選擇性標(biāo)記而可輕易地挑出所想要的克隆。選擇性標(biāo)記亦可包含有助于分離出表達(dá)該標(biāo)記的細(xì)胞的分子。例如，選擇性標(biāo)記可編碼出抗原(該抗原可由抗體所辨識(shí))而通過以親合性為主的純化技術(shù)或流式細(xì)胞技術(shù)(flow cytometry)分離出經(jīng)轉(zhuǎn)型的細(xì)胞。報(bào)導(dǎo)基因亦包括可通過對(duì)植物細(xì)胞為外來者的優(yōu)點(diǎn)而偵測(cè)到的序列(例如，由PCR偵測(cè))。于此具體實(shí)施例中，該報(bào)導(dǎo)基因不需表達(dá)蛋白質(zhì)或造成表型可見的改變。
植物轉(zhuǎn)化作用將DNA分子轉(zhuǎn)移以及整合至植物宿主基因體中的方法為已知。例如以阿拉伯芥的真空-滲透或浸漬為優(yōu)選的方法，因?yàn)樵S多植物可于小空間中進(jìn)行轉(zhuǎn)化作用，而產(chǎn)生大量的種子以篩選轉(zhuǎn)化體。典型地，定氮菌屬(agrobacterium)可以經(jīng)界定端(T-DNA邊緣)轉(zhuǎn)移線形DNA片段(T-DNA)亦使其成為優(yōu)選的方法?？衫蔑@微注射法、化學(xué)處理或粒子槍法(microprojectile bombardment，biolistics)進(jìn)行直接DNA轉(zhuǎn)化作用。除了任何重組DNA構(gòu)成的尺寸上的限制外，多順反子基因(依據(jù)本發(fā)明的編碼序列)可利用病毒載體傳送至植物內(nèi)。該經(jīng)轉(zhuǎn)型的植物細(xì)胞可能存在于原生質(zhì)粒、細(xì)胞培養(yǎng)、愈合組織、懸浮培養(yǎng)、葉、花粉或分生組織的型式中。
于適宜的情形下，經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞會(huì)再生至整個(gè)植物中，其新的細(xì)胞核材料系穩(wěn)定的合并至基因體內(nèi)。以此方式可獲得經(jīng)轉(zhuǎn)化的單子葉及雙子葉植物。尚有多種植物類型可以本發(fā)明的核酸構(gòu)建加以轉(zhuǎn)化。其它經(jīng)基因修飾且可生產(chǎn)的植物的實(shí)例包含農(nóng)藝作物、谷類、水果以及蔬菜(例如油菜、煙草、甜菜、棉花、大豆、玉蜀黍、小麥、大麥、稻谷、高梁、西紅柿、芒果、桃子、蘋果、洋梨、草莓、香蕉、甜瓜、馬鈴薯、胡蘿卜、萵苣、甘藍(lán)菜、洋蔥)。優(yōu)選的植物為阿拉伯芥、蕓薹類、玉蜀黍、紫花苜蓿、大豆、煙草、十字花科(crucifera)、棉子、向日葵以及豆科植物。
蛋白質(zhì)的分離耕種后，采收轉(zhuǎn)基因植物以回收經(jīng)生產(chǎn)的多-亞單位蛋白質(zhì)或經(jīng)加工的蛋白質(zhì)(及/或其它依照本發(fā)明，通過結(jié)構(gòu)基因生產(chǎn)的蛋白質(zhì))。采收的步驟包括采收整株植物，或只采收植物的葉子、根或細(xì)胞。這個(gè)步驟會(huì)砍殺植物或只采收轉(zhuǎn)基因植物中的部分，只采收轉(zhuǎn)基因植物中的部分可使該植物其余部分繼續(xù)生長(zhǎng)。
采收后，可利用此技藝中習(xí)知的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)分離。例如，將至少一部分的植物均質(zhì)化，以及萃取蛋白質(zhì)然后將其進(jìn)一步純化。萃取包括于適當(dāng)溶劑中浸泡或浸漬該均質(zhì)物。如上述，蛋白質(zhì)亦可由植物之間隙液體中分離，例如，通過真空浸透法(描述于美國(guó)專利第6,284,875號(hào))。
純化方法包含，但非限于免疫親合性純化法以及根據(jù)蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)復(fù)合體的特定尺寸、電泳移動(dòng)性、生物活性以及/或欲分離的多聚體蛋白質(zhì)的凈電荷等的純化方法。
以下將通過數(shù)個(gè)可行的實(shí)施例說明本發(fā)明。這些實(shí)施例的目的系用以說明本發(fā)明而不欲于任何方面限制本發(fā)明。
實(shí)施例1質(zhì)粒ICP1176(第6圖)包含IgG1亞種單株抗體(pspHCIgG1)的重鏈編碼區(qū)域，該抗體可辨識(shí)哺乳動(dòng)物組織因子蛋白質(zhì)。質(zhì)粒ICP1221(第7圖)含有κ輕鏈編碼區(qū)域(pspLCIgG1/4)，其可與上述的重鏈形成帶有所需特性的完整鏈的單株抗體。在兩克隆中使用標(biāo)準(zhǔn)的方法產(chǎn)生限制端以有助于進(jìn)行克隆。兩克隆區(qū)域系釋放為NcoI至XbaI限制片段。于該實(shí)施例(第8圖)中顯示該輕鏈區(qū)域系克隆至植物的表達(dá)載體中，與(OCS)3MAS啟動(dòng)子相鄰并接著將IRES(cp148)及重鏈插入至其3′處，且接著為Nos轉(zhuǎn)錄作用終止信號(hào)。該相同的載體于2x35S啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下帶有植物選擇性標(biāo)記(BAR)(pICGHpolyAb1，第8圖)。
于第1圖中，DNA構(gòu)成與所述的分子相似，其中輕鏈基因系Gene1以及重鏈基因系Gene 2。另外構(gòu)成一個(gè)類似的質(zhì)粒，其重鏈及輕鏈的順序與上述相反。接著將此載體轉(zhuǎn)移至定氮菌屬而用以進(jìn)行暫時(shí)性表達(dá)及阿拉伯芥(Arabidopsis thaliana)、煙草(N.benthamiana)、芥菜(Brassica juncea)以及小油菜(B.campestris)的轉(zhuǎn)化作用。雖然已確定有多種方法可進(jìn)行定氮菌屬引導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化作用，而本發(fā)明中阿拉伯芥的定氮菌屬轉(zhuǎn)化作用系利用真空滲透法進(jìn)行。暫時(shí)性表達(dá)試驗(yàn)系利用葉子移植片段以及整株幼苗的真空滲透物而進(jìn)行。
于第9圖中顯示的實(shí)施例，該結(jié)構(gòu)基因可編碼出抗體的輕鏈。該基因系克隆至植物的表達(dá)載體，與(OCS)3MAS啟動(dòng)子相鄰，如圖所示，該IRES(cp148)及植物的可選擇性標(biāo)記(NPTII)系插入該結(jié)構(gòu)基因的3′端。于此基因構(gòu)建的3′端提供CaMV35S轉(zhuǎn)錄作用終止信號(hào)。于相同的載體中也帶有可編碼出抗體的重鏈的基因，該基因克隆至與(OCS)3MAS啟動(dòng)子相鄰的位置。IRES(cp148)及植物的可選擇性標(biāo)記(NPTII)系插入重鏈基因的3′端，且接著為CaMV 35S轉(zhuǎn)錄作用終止信號(hào)(pXB1500，第9圖)。于此形式中，該DNA構(gòu)成與第1圖所述的分子相似，其中抗體鏈基因系Gene 1以及可選擇性標(biāo)記基因系Gene 2。
另外構(gòu)成一個(gè)類似的質(zhì)粒，其重鏈及輕鏈的順序與上述相反。接著將此載體轉(zhuǎn)移至定氮菌屬而用以進(jìn)行暫時(shí)性表達(dá)及如上述的阿拉伯芥、煙草、芥菜以及小油菜的轉(zhuǎn)化作用。雖然已確定有多種方法可進(jìn)行定氮菌屬引導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化作用，而本發(fā)明中阿拉伯芥的定氮菌屬轉(zhuǎn)化作用系利用真空滲透法進(jìn)行。眾所周知的暫時(shí)性表達(dá)試驗(yàn)系利用葉子移植片段以及整株幼苗的真空滲透物而進(jìn)行。
于定氮菌屬的轉(zhuǎn)化作用的例，T1種子是在含有選擇性試劑的培養(yǎng)基上發(fā)芽，然后將存活的植物通過PCR分析篩選出存在有重鏈及輕鏈編碼區(qū)域者。于此試驗(yàn)中呈陽性的材料使其進(jìn)一步繁殖以及通過西方點(diǎn)墨(western blot)分析法及ELISA加以測(cè)試。
實(shí)施例2此實(shí)施例系描述單株抗體的生產(chǎn)。
質(zhì)粒ICP1177(第9圖)包含IgG4亞種單株抗體(pspHCIgG4)的重鏈編碼區(qū)域。質(zhì)粒ICP1221(第7圖)含有κ輕鏈編碼區(qū)域(pspLCIgG1/4)，其與上述的重鏈一起形成一個(gè)帶有所需特性的完整鏈的單株抗體。
克隆的程序(產(chǎn)生pICGHpolyAb4，第10圖)、植物的轉(zhuǎn)化作用、篩選以及產(chǎn)物的分析實(shí)質(zhì)上與實(shí)施例1所述相同。
實(shí)施例3實(shí)施例3。于此實(shí)施例中有3個(gè)編碼區(qū)域系由單一個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。此例子中，植物選擇性標(biāo)記已直接包含在DNA構(gòu)建中，其系與啟動(dòng)子相鄰的基因中最5′端的基因，而重鏈的5′端系插入至cp148 IRES的下游。輕鏈基因的5′端系插入至mp75 IRES的下游，最后為終止信號(hào)/多A位置。另一種構(gòu)形可使多順反子重鏈及輕鏈基因通過實(shí)施例1及2的啟動(dòng)子而驅(qū)動(dòng)，且于相同DNA構(gòu)建上，該選擇性標(biāo)記帶有自己的啟動(dòng)子。此型式中該抗體基因系置于一種型式的啟動(dòng)子的控制下，而選擇性基因系置于另一種型式的啟動(dòng)子的控制下。與實(shí)施例1及2所述的共-轉(zhuǎn)化作用法相比，實(shí)施例3提供標(biāo)記及該抗體基因較緊密的連接，但仍可分離及區(qū)別基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。
于本說明書中所舉例的所有專利及非專利的公開案是指本領(lǐng)域技術(shù)人員普通水平程度。所有這些公開案及專利申請(qǐng)均合并于本文作為參考，即個(gè)別的公開案或?qū)＠暾?qǐng)案系明確地及分別地以參考方式合并于本文。
那些熟知此技藝的人士者可僅利用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)法確定或察明與本文所述等同的多種特定物質(zhì)及程序。此種等同物質(zhì)及方法系視為本發(fā)明的范圍且包含于下列權(quán)利要求中。
權(quán)利要求
1.一種核酸構(gòu)建物，它含有在植物細(xì)胞中具有功能的以下要件、并且由5′至3′可操作連接轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)要件、可編碼出包括可專一性地與抗原結(jié)合的抗體中具有免疫活性的第一部分的第一多肽的第一編碼區(qū)域、IRES要件、可編碼出包括可專一性地與抗原結(jié)合的抗體中具有免疫活性的第二部分的第二多肽的第二編碼區(qū)域，其中當(dāng)該第一及第二部分經(jīng)表達(dá)后，它們會(huì)互相結(jié)合以形成可專一性地與抗原結(jié)合的多-亞單位多肽。
2.一種核酸構(gòu)建物，它含有在植物細(xì)胞中具有功能的以下要件、并且由5′至3′可操作連接轉(zhuǎn)錄作用調(diào)節(jié)要件、編碼多-亞單位蛋白質(zhì)的第一多肽亞單位的第一編碼區(qū)域、IRES要件、編碼多-亞單位蛋白質(zhì)的第二多肽亞單位的第二編碼區(qū)域，其中所述的第一及第二編碼區(qū)域不會(huì)編碼出相同的亞單位。
3.一種核酸構(gòu)建物，它含有在植物細(xì)胞中具有功能的以下要件、并且由5′至3′可操作連接轉(zhuǎn)錄作用調(diào)節(jié)要件、至少一個(gè)第一編碼區(qū)域，其可編碼出用以加工不成熟蛋白質(zhì)使其成為成熟蛋白質(zhì)的加工蛋白質(zhì)、于植物細(xì)胞中具有功能的IRES要件、第二編碼區(qū)域，其可編碼出不成熟蛋白質(zhì)，其中于相同植物細(xì)胞中，該第一及第二編碼區(qū)域的表達(dá)會(huì)造成將不成熟蛋白質(zhì)加工成為成熟形式的蛋白質(zhì)，IRES要件位于編碼區(qū)域之間，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)要件轉(zhuǎn)錄編碼第一和第二編碼區(qū)域的多順反子片段。
4.一種在宿主植物細(xì)胞中用于表達(dá)外源性多-亞單位多肽的核酸構(gòu)建物，它包括編碼外源性多-亞單位蛋白的多順反子mRNA的編碼序列，其中所述的外源性多肽是在宿主植物細(xì)胞中非天然表達(dá)的多肽。
5.一種在宿主植物細(xì)胞中表達(dá)多肽的核酸構(gòu)建，它包括編碼單鏈T細(xì)胞受體、單鏈MHC分子、單鏈免疫球蛋白超家族或其融合物的多順反子mRNA的編碼序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建物，其中所述的第一編碼區(qū)域及第二編碼區(qū)域可編碼抗體的重鏈或輕鏈，且其中所述的第一及第二編碼區(qū)域不會(huì)編碼出相同的鏈。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建物，它還包括終止信號(hào)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建物，其中所述的第一及第二編碼區(qū)域還包括靶序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建物，其中所述的轉(zhuǎn)錄作用調(diào)節(jié)要件為啟動(dòng)子。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建物，其中所述的轉(zhuǎn)錄作用調(diào)節(jié)要件是用植物細(xì)胞中具有功能的IRES要件替代以及該整合的基因體位點(diǎn)對(duì)經(jīng)基因工程的基因構(gòu)建提供轉(zhuǎn)錄控制。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建物，其中所述的抗體系單克隆抗體。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建物，其中所述的IRES要件系IRESmp75。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建物，其中所述的IRES要件系IREScp148。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建物，其中所述的靶序列將第一及第二編碼區(qū)域的多肽產(chǎn)物靶向至植物細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。
15.根據(jù)權(quán)利要求8所述的核酸構(gòu)建物，其中所述的靶序列系轉(zhuǎn)移肽，其將第一及第二編碼區(qū)域的多肽產(chǎn)物靶向至植物細(xì)胞的質(zhì)體。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的核酸構(gòu)建物，其中所述的質(zhì)體系葉綠體。
17.根據(jù)權(quán)利要求8任意一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建物，其中所述的靶序列系轉(zhuǎn)移肽，其將第一及第二編碼區(qū)域的多肽產(chǎn)物靶向至植物細(xì)胞的線粒體。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建物，其中所述的第一編碼區(qū)域可編碼出該抗體分子的重鏈以及該第二編碼區(qū)域可編碼出該抗體分子的輕鏈。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建物，其中所述的第一編碼區(qū)域可編碼出該抗體分子的輕鏈以及該第二編碼區(qū)域可編碼出該抗體分子的重鏈。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建物，其中所述的抗體系人類的抗體或人類屬性的抗體。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建物，還包括編碼可選擇標(biāo)記的基因。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的核酸構(gòu)建物，其中所述的編碼可選擇標(biāo)記的基因可操作連接至啟動(dòng)子，而該啟動(dòng)子可驅(qū)動(dòng)標(biāo)記的表達(dá)。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建物，還包括至少一個(gè)真核細(xì)胞的復(fù)制作用起始點(diǎn)。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建物，還包括原核細(xì)胞的復(fù)制作用起始點(diǎn)。
25.根據(jù)權(quán)利要求23所述的核酸構(gòu)建物，還包括原核細(xì)胞的復(fù)制作用起始點(diǎn)。
26.根據(jù)權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建物，還包括一種或多種在一或多種附加結(jié)構(gòu)基因的5′處包括IRES要件的附加的結(jié)構(gòu)基因。
27.根據(jù)權(quán)利要求3所述的核酸構(gòu)建物，其中所述的不成熟蛋白質(zhì)系前胰島素原。
28.根據(jù)權(quán)利要求8所述的核酸構(gòu)建物，其中所述的靶序列可靶至非質(zhì)粒、液泡、葉綠體、質(zhì)體、線粒體、過氧化物酶體或細(xì)胞核，或者靶至細(xì)胞壁。
29.一種包括第一表達(dá)單元以及第二表達(dá)單元的組合物，其中所述的第一表達(dá)單元包括根據(jù)權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建物，以及該第二表達(dá)單元包括第三編碼區(qū)域，該第三編碼區(qū)域可操作連接至啟動(dòng)子或IRES要件。
30.一種包括根據(jù)權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建物的植物或其部分。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的植物或其部分，其中所述的植物系選自阿拉伯芥、蕓薹類、玉蜀黍、紫花苜蓿、大豆、煙草、十字花科、棉子、向日葵以及豆科植物。
32.一種生產(chǎn)可表達(dá)外源性蛋白質(zhì)的宿主植物細(xì)胞的方法，包括引入如權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述的核酸構(gòu)建物至宿主植物細(xì)胞中。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，還包括由該植物細(xì)胞繁殖出植物。
34.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，還包括栽培該植物的后代。
35.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述的植物細(xì)胞系由選自原生質(zhì)粒、細(xì)胞、愈合組織、懸浮培養(yǎng)、葉子、根、莖、胚軸、花粉、種子以及分生組織等組織而來。
36.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，還包括表達(dá)蛋白質(zhì)的步驟。
37.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述的蛋白質(zhì)系選自抗體、T細(xì)胞受體、MHC蛋白質(zhì)、免疫球蛋白超家族的蛋白質(zhì)、干擾素、白介素、激素、抗原、受體以及治療性蛋白質(zhì)。
38.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述的蛋白質(zhì)系融合蛋白質(zhì)。
39.根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其中所述的融合蛋白質(zhì)包括效應(yīng)物分子。
40.一種宿主植物或其部分，包括至少一個(gè)細(xì)胞，該細(xì)胞包括可編碼出多順反子mRNA的核酸，該多順反子mRNA可編碼出外源性多-亞單位蛋白質(zhì)，而該外源性蛋白質(zhì)為宿主植物中非自然表達(dá)者。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的植物或其部分，其中所述的植物系F0植物。
42.根據(jù)權(quán)利要求40所述的植物或其部分，其中所述的植物系阿拉伯芥。
43.根據(jù)權(quán)利要求40-42任一所述的植物或其部分，其中所述的多-亞單位蛋白質(zhì)包括選自由T細(xì)胞受體、MHC分子、免疫球蛋白超家族的蛋白質(zhì)或共-受體、核酸結(jié)合蛋白質(zhì)、催化性抗體(abzymes)、受體、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞膜蛋白質(zhì)、分化因子、類血紅素蛋白質(zhì)以及多聚激酶異二聚體或異多聚體蛋白質(zhì)。
44.一種植物或其部分，包括至少一個(gè)細(xì)胞，該細(xì)胞包括可編碼出多順反子mRNA的核酸，而該多順反子mRNA可編碼出無活性的多肽，該無活性的多肽可經(jīng)修飾而成為活性形式以及包括可加工該無活性的蛋白質(zhì)成為活性形式的加工蛋白質(zhì)。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的植物或其部分，其中所述的加工蛋白質(zhì)系蛋白酶。
46.根據(jù)權(quán)利要求44-45中任一所述的植物或其部分，其中所述的無活性的蛋白質(zhì)系前胰島素原。
47.根據(jù)權(quán)利要求44所述的植物或其部分，其中所述的加工蛋白質(zhì)系修飾蛋白質(zhì)用的酶。
48.根據(jù)權(quán)利要求47所述的植物或其部分，其中所述的酶系激酶。
49.一種生產(chǎn)可表達(dá)于宿主植物細(xì)胞中非自然表達(dá)的外源性多-亞單位蛋白質(zhì)的宿主植物細(xì)胞的方法，包括于植物細(xì)胞中表達(dá)可編碼出多順反子mRNA的核酸，而該多順反子mRNA可編碼出多-亞單位蛋白質(zhì)。
50.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述的植物細(xì)胞系得自F0植物。
51.根據(jù)權(quán)利要求49所述的方法，其中所述的植物細(xì)胞系阿拉伯芥細(xì)胞。
52.根據(jù)權(quán)利要求49-51中任一所述的方法，其中所述的多-亞單位蛋白質(zhì)包括選自由T細(xì)胞受體、MHC分子、免疫球蛋白超家族的蛋白質(zhì)或共-受體、核酸結(jié)合蛋白質(zhì)、催化性抗體、受體、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞膜蛋白質(zhì)、分化因子、類血紅素蛋白質(zhì)以及多聚激酶的異二聚體或異多聚體蛋白質(zhì)。
53.一種于植物中生產(chǎn)活性形式的外源性蛋白質(zhì)的方法，包括表達(dá)可編碼出多順反子mRNA的核酸，該多順反子mRNA可編碼出無活性的多肽，該無活性的多肽可經(jīng)修飾而成為活性形式以及包括可加工該無活性的蛋白質(zhì)成為活性形式的加工蛋白質(zhì)。
54.根據(jù)權(quán)利要求53所述的方法，其中所述的加工蛋白質(zhì)系蛋白酶。
55.根據(jù)權(quán)利要求53或54所述的方法，其中所述的無活性的蛋白質(zhì)系前胰島素原。
56.根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中所述的加工蛋白質(zhì)系修飾蛋白質(zhì)用的酶。
57.根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中所述的酶系激酶。
全文摘要
本發(fā)明提供一種在植物中用以生產(chǎn)蛋白質(zhì)的組合物及方法，尤其是于自然狀態(tài)下的蛋白質(zhì)為了成為具有生物活性的蛋白質(zhì)，需要多數(shù)個(gè)結(jié)構(gòu)基因來協(xié)同表達(dá)。典型地最終產(chǎn)物具有治療、診斷或產(chǎn)業(yè)上用途。
文檔編號(hào)C12P21/02GK1533438SQ02802025
公開日2004年9月29日 申請(qǐng)日期2002年6月7日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月8日
發(fā)明者G·赫爾, N·拜斯可, M·波西, G 赫爾, 箍 申請(qǐng)人:愛康遺傳科技公司