本發(fā)明涉及一種多腔室基因分析反應裝置，屬于生物技術和機械電子交叉領域。
背景技術：
：基因的多重熒光分析從上世紀90年代開始在分子生物學領域應用，典型的是熒光聚合酶鏈反應（PolymeraseChainReaction，PCR）技術，也稱為實時熒光PCR技術，它基于熒光共振能量轉移（FluorescenceResonanceEnergyTransfer，F(xiàn)RET）原理，在PCR擴增過程中加入熒光基團或熒光探針，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后對未知基因模板進行定量或定性分析的方法，進行熒光PCR的熒光PCR儀主要部件包括產(chǎn)生溫度梯度的熱力學結構、進行熒光激發(fā)的激發(fā)光源、對發(fā)射光進行檢測的檢測系統(tǒng)以及數(shù)據(jù)獲取分析軟件工作站。市場上的主要熒光PCR儀品牌型號包括美國Lifetechnologies公司7500型、7300型、StepOnePlus、Viia7型熒光PCR儀，羅氏公司LightCycler480型、LightCycler96型熒光PCR儀，BioRad公司CFX96型熒光PCR儀，以及安捷倫Stratagene公司Mx3000P型、Mx3005P型熒光PCR儀。這些熒光PCR儀在分子生物學基礎研究的基因含量、單核苷酸多態(tài)性（singlenucleotidepolymorphism，SNP）或者基因突變測定，臨床檢驗中病原微生物或者致病基因定性、定量檢測，食品衛(wèi)生檢疫中的食品安全檢測，以及一些生物類恐怖襲擊檢測領域等，都有廣泛的應用。上述市場主流熒光PCR儀，通用反應管耗材是0.1或0.2ml容量的單個反應管、八聯(lián)管或者96孔板，用于盛放含有PCR組分和基因模板的反應液并用于擴增熒光信號檢測，但在單個反應管中由于儀器熒光檢測波長的限制，通常在520±15nm（FAM熒光報告基團、SYBRGreen染料）、558±12nm（VIC、HEX、JOE熒光報告基團）、587±10nm（NED、Cy3熒光報告基團）、623±14nm（ROX、TexasRed熒光報告基團）以及682±14nm（Cy5熒光報告基團）這5個波長檢測分別檢測1個基因（在沒有采用擴增產(chǎn)物熔解曲線分析條件下），因此最多最能分析5個基因；如果該樣本有更多的基因需要分析，則需要額外增加反應管，增加人工操作并降低一次檢測的樣本數(shù)量，這極大地限制了熒光PCR在更高通量基因分析中的應用。技術實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是克服上述現(xiàn)有技術不足，提供一種結構簡單、易于操作、節(jié)能環(huán)保的多腔室基因分析反應裝置，可以實現(xiàn)10～50個基因的高通量分析，適合在分子生物學基礎研究、臨床分子診斷、食品安全基因檢測以及生物恐怖襲擊類基因檢測領域應用。本發(fā)明的上述目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的：一種多腔室基因分析反應裝置，其特征在于，該反應裝置包含主管a、支管b、腔室c和封堵物質d結構，1個主管a連接2～10個支管b的一端，每一支管b的另一端連接反應腔室c，支管b和腔室c之間裝配有封堵物質d，每個腔室內含核酸擴增反應組分，用于核酸擴增反應和基因分析。所述基因分析反應裝置中的主管a、支管b、腔室c，為聚丙烯材料制備或者經(jīng)過蝕刻的微流控玻璃芯片，均為中空，可以容納液體或固體。所述基因分析反應裝置中的腔室c，在進行核酸擴增反應和基因分析時，不同基因采用不同熒光波長分析，這些波長為520±15nm、558±12nm、587±10nm、623±14nm以及682±14nm中的1～5個。所述基因分析反應裝置中的封堵物質d，為一種可計量微型閥門，能使定量體積液體通過管腔，或者將支管b和腔室c封閉隔斷。所述基因分析反應裝置腔室中的核酸擴增反應組分，含有有引物、熒光探針、脫氧核糖核苷三磷酸或者核糖核苷三磷酸、核酸聚合酶、核酸酶以及輔助酶作用的金屬離子，為液體狀態(tài)或玻璃化固體狀態(tài)；特別地，核酸擴增反應組分含有引物、熒光探針、脫氧核糖核苷三磷酸（即dNTPs，包括dATP、dGTP、dCTP、dUTP、dTTP）、TaqDNA聚合酶、尿嘧啶N糖基化酶（UNG酶）以及鎂離子。所述基因分析反應裝置的核酸擴增反應，是指PCR反應，或者轉錄介導擴增技術（Transcription-MediatedAmplification，TMA）、鏈替代擴增（StrandDisplacementAmplification，SDA）、連接酶鏈式反應（LigaseChainReaction，LCR）和依賴核酸序列的擴增（Nucleic-AcidSequenceBasedAmplification，NASBA）、環(huán)介導等溫擴增(Loop-MediatedIsothermalAmplification，LAMP)、支鏈核酸信號放大系統(tǒng)（BranchedDNA，bDNA）、滾環(huán)擴增（RollingCircleAmplification，RCA）這些核酸擴增方法。所述基因分析反應裝置使用時，當基因核酸模板在外界壓力或電場作用下從主管分別經(jīng)支管流到各個反應腔室中與核酸擴增反應組分混合，然后封堵物質將腔室封閉，整個裝置放在具有熒光分析功能的熱循環(huán)儀上反應，每個腔室中的基因核酸模板在熱循環(huán)或等溫擴增過程中進行實時熒光分析，能實現(xiàn)5個基因的定性或定量檢測。裝置連接2個反應腔室最多可以分析10個基因，連接10個腔室最多可以分析50個基因。所用基因核酸模板來源于動物、植物、微生物、人工合成制備或擴增獲得的DNA或者RNA。有益效果本發(fā)明根據(jù)上述設計的技術方案，在基因分析中使用設計的多腔室基因分析反應裝置，所具有的技術優(yōu)點和產(chǎn)生的有益效果如下：（1）高通量基因分析：傳統(tǒng)熒光PCR儀單個反應管囿于波長限制，一次檢測只能分析5個基因，而本發(fā)明反應裝置最多能分析50個基因，大大提高了熒光PCR的基因分析工作效率。（2）節(jié)能環(huán)保：本發(fā)明反應裝置體積小、結構簡單，在相同基因分析數(shù)量上，和傳統(tǒng)熒光PCR比較具有輕便的特點，大大降低了試劑和耗材的消耗，達到節(jié)能環(huán)保的目的。（3）適合即時檢驗（Point-of-caretesting，POCT）檢測：本發(fā)明裝置結合樣本核酸提取步驟，可以一步實現(xiàn)從樣本到檢測結果的全部過程，不僅操作簡單，而且報告結果時間短，適合POCT檢測。附圖說明附圖1為多腔室基因分析反應裝置示意圖，展示了主管a、支管b，腔室c、封閉物質d的連接順序，其中支管b，腔室c、封閉物質d的數(shù)目最少分別有2個、最多有10個，即分別有一個反應裝置有2～10個反應腔室。具體實施方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內容之后，本領域技術人員可以通過技術常識對本發(fā)明作各種技術性改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。實施例1：多腔室基因分析反應裝置的制備和應用（1）多腔室基因分析反應裝置的制備按照說明書附圖中主管a、支管b，腔室c、封閉物質d的連接順序設計模具，并采用聚丙烯材料制備帶有2個腔室的基因分析反應裝置。在2個腔室中分別裝入核酸擴增引物探針，dNTPs、逆轉錄酶、核酸聚合酶、UNG酶以及鎂離子，制備的2腔室基因分析反應裝置用于血清樣本乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）的基因分型檢測。HBV基因分型引物探針采用文獻（JClinMicrobiol.2010Apr;48(4):1105–1111）表1中的As、Bps、Cps、D引物探針序列（4對HBV基因型引物、4條HBV基因型探針），但探針序列5’端依次分別采用FAM、JOE、Cy3、ROX熒光基團標記、3’端采用BHQ淬滅基團標記，分別基于HBVS抗原基因檢測我國常見的HBV基因型A、B、C、D。HCV基因分型引物探針采用文獻（JClinVirol.2005Oct;34(2):108-14）中的基因亞型引物探針（4對HCV基因型引物、4條HCV基因型探針），但針對HCV1-4基因型的探針Gt1probe～Gt4probe序列5’端依次分別采用FAM、JOE、Cy3、ROX熒光基團標記、3’端采用BHQ淬滅基團標記，基于HCV基因組5’端非編碼區(qū)序列檢測HCV1、2、3、4基因亞型。同時，采用本申請人申請的發(fā)明專利（201310742857.6，一種含內參照的高靈敏Epstein-Barr病毒熒光定量PCR試劑盒）中采用的GAPDH基因引物探針作為內參照引物探針，探針序列5’端Cy5熒光基團標記、3’端采用BHQ淬滅基團標記。將上述設計使用的HBV基因分型的12條引物探針、HCV基因分析型的12條引物探針、以及3條內參照引物探針委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成，引物為PAGE純化，探針為HPLC純化。在上述2個腔室的基因分析反應裝置中，首先在2個腔室分別加入pH8.3的100mMTris-HCl3ul、500mMKCl3ul、10mMdNTPs（含有dATP、dGTP、dCTP、dUTP、dTTP各10mM）0.9ul、100mMMgCl21ul，TaqDNA聚合酶3U、UNG酶0.2U；然后在第1腔室加入8條濃度各10mMHBV基因型引物0.9ul、2條10mMGAPDH基因引物各0.45ul、4條濃度各10mMHBV基因型探針各0.6ul、10mMGAPDH基因探針0.3ul。第2個腔室加入SuperScript?III逆轉錄酶3U，8條濃度各10mMHCV基因型引物各0.9ul、2條10mMGAPDH基因引物各0.45ul、4條濃度各10mMHCV基因型探針各0.6ul、10mMGAPDH基因探針0.3ul。上述裝置放入臺式凍干機（Alpha1-4LSC型，德國Christ公司）凍干，此時核酸擴增反應混合物為無水玻璃化固體狀態(tài)，將反應裝置置于4℃保存。（2）多腔室基因分析反應裝置的在血清HBV/HCV基因分型中應用采集經(jīng)臨床核酸定量檢測確定為病毒性肝炎的患者血清5例，采用本申請人發(fā)明專利（ZL201010621890.X，一種用于生物樣品中核酸提取純化的細胞裂解試劑）中病毒DNA/RNA磁珠結合共提取方法，每例樣本提取獲得核酸100ul，立即進行檢測。取上述制備保存的2個腔室的基因分析反應裝置，平衡到室溫，在主管a加入上述提取的100ul核酸模板，在外界壓力作用下，液體模板分別流入2個腔室各30ul時，相應的微型閥關閉，腔室中固體反應組分被核酸模板液體溶解，反應體系為30ul。將反應裝置轉入帶熒光分析功能的熱循環(huán)儀擴增檢測，反應程序為50℃10min、94℃5min后，按照94℃15sec、60℃1min循環(huán)擴增40次，并在每次循環(huán)的60℃采集FAM、JOE、Cy3、ROX、Cy5五個波長（對應520±15nm、558±12nm、587±10nm、623±14nm以及682±14nm）熒光信號。反應結束后按照軟件分析，以有明顯擴增、呈現(xiàn)S型擴增曲線的結果判斷為陽性。5例樣本檢測結果如表1所示，上述制備的基因分析反應裝置對臨床病毒性肝炎患者樣本能完整地在一次檢測中完成HBV、HCV基因分型結果的測定，和目前常規(guī)使用的熒光PCR方法比較，具有操作簡便、檢測快速的優(yōu)點。表1本發(fā)明基因分析反應裝置對血清HBV/HCV基因分析結果結果血清1血清2血清3血清4血清5HBV基因型C型B型A型C型D型HCV基因型3型1型4型2型1型內參照陽性陽性陽性陽性陽性實施例2：多腔室基因分析反應裝置的制備和應用（1）多腔室基因分析反應裝置的制備按照說明書附圖中主管a、支管b，腔室c、封閉物質d的連接順序設計模具，并采用玻璃硅材料和微機電系統(tǒng)（MEMS，Micro-Electro-MechanicalSystem）技術，在硅片上刻蝕加工制備了帶有2個腔室的微流控芯片基因分析反應裝置。在2個腔室中分別裝入核酸擴增引物探針，dNTPs、逆轉錄酶、TaqDNA聚合酶、UNG酶以及鎂離子，制備的2腔室基因分析反應裝置用于泌尿生殖道樣本常見性傳播疾病病原體（沙眼衣原體，淋球菌，解脲支原體，生殖支原體，人乳頭瘤病毒6、11、16、18型）的核酸檢測檢測。沙眼衣原體（CT）、淋球菌（NG）、解脲支原體（UU）、生殖支原體（Mg）核酸檢測引物探針采用文獻（IntJMolEpidemiolGenet.2013Sep12;4(3):167-74）表1中的引物探針序列（CT-Plasmid-FP/CT-Plasmid-RP/CT-Plasmid-Probe、NG-FP/NG-RP/NG-Probe、UP-UU-FP/UP-UU-RP/UU-Probe、MG-FP/MG-RP/MG-Probe，共4對引物、4條探針），但探針序列5’端依次分別采用FAM、JOE、Cy3、ROX熒光基團標記、3’端采用BHQ淬滅基團標記，不同波長分別檢測臨床常見的CT、NG、UU、Mg病原體。HPV6/11兩個亞型，16/18兩個亞型引物探針分別采用本申請人申請的發(fā)明專利（201511007550.7，一種高靈敏人乳頭瘤病毒6,11型核酸檢測試劑盒；201110448224.5，人乳頭瘤病毒（HPV）16,18型多通道熒光PCR檢測方法與試劑盒）引物探針，其中6/11兩個亞型共用1對引物，6型探針序列5’端標記FAM熒光基團、11型探針序列5’端標記改為JOE熒光基團，16/18兩個亞型各有1對引物及探針，16型探針序列5’端標記改為Cy3熒光基團，18型探針序列5’端標記改為ROX熒光基團，HPV6/11/16/18檢測4條探針的3’端均采用BHQ淬滅基團標記。同時，采用本申請人申請的發(fā)明專利（201310742857.6，一種含內參照的高靈敏Epstein-Barr病毒熒光定量PCR試劑盒）中采用的GAPDH基因引物探針作為內參照引物探針，探針序列5’端Cy5熒光基團標記、3’端采用BHQ淬滅基團標記。將上述設計使用的CT、NG、UU、Mg核酸檢測的12條引物探針、HPV6/11/16/18型檢測10條引物探針、以及3條內參照引物探針委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成，引物為PAGE純化，探針為HPLC純化。在上述2個腔室的微流控芯片基因分析反應裝置中，首先在2個腔室分別加入pH8.3的100mMTris-HCl3ul、500mMKCl3ul、10mMdNTPs（含有dATP、dGTP、dCTP、dUTP、dTTP各10mM）0.9ul、100mMMgCl21ul，TaqDNA聚合酶3U、UNG酶0.2U；然后在第1腔室加入8條濃度各10mMCT、NG、UU、Mg引物各0.9ul、2條10mMGAPDH基因引物各0.45ul、4條濃度各10mMCT、NG、UU、Mg探針各0.6ul、10mMGAPDH基因探針0.3ul，加入去離子水補足體積到26ul，用微型閥門密封腔室。第2個腔室加入6條濃度各10mMHPV6/11/16/18基因型引物各0.9ul、2條10mMGAPDH基因引物各0.45ul、4條濃度各10mMHPV6/11/16/18基因型探針各0.6ul、10mMGAPDH基因探針0.3ul，加入去離子水補足體積到26ul，用微型閥門密封腔室。上述微流控芯片基因分析反應裝置置于-20℃保存。（2）多腔室基因分析反應裝置的在泌尿生殖道分泌物病原體檢測中應用收集臨床性病門診患者泌尿生殖道分泌物漂洗液樣本10例，取漂洗液樣本200ul，13000rpm離心10min后棄上清，在沉淀中加入50ul含有20mMNaOH、1%吐溫20的核酸裂解液，漩渦混勻后100℃保溫10min，13000rpm離心2min，每例樣本吸取上清獲得核酸提取物約50ul，立即進行檢測。取上述制備保存的2個腔室的基因分析反應裝置，平衡到室溫，在主管a加入上述提取的50ul核酸模板，在外界壓力作用下，液體模板分別流入2個腔室各4ul時，相應的微型閥關閉。將反應裝置轉入帶熒光分析功能的熱循環(huán)儀擴增檢測，反應程序為50℃2min、94℃5min后，按照94℃15sec、60℃1min循環(huán)擴增40次，并在每次循環(huán)的60℃采集FAM、JOE、Cy3、ROX、Cy5五個波長（對應520±15nm、558±12nm、587±10nm、623±14nm以及682±14nm）熒光信號。反應結束后按照軟件分析，以有明顯擴增、呈現(xiàn)S型擴增曲線的結果判斷為陽性。10例樣本檢測結果如表2所示，上述制備的基因分析反應裝置對臨床性病門診患者泌尿生殖道樣本中常見的8種性傳播疾病病原體（沙眼衣原體，淋球菌，解脲支原體，生殖支原體，人乳頭瘤病毒6、11、16、18型）一次檢測獲得信息，和目前常規(guī)使用的熒光PCR方法比較，具有體積微小、操作簡便快速、報告結果時間短的優(yōu)勢。表2本發(fā)明基因分析反應裝置對泌尿生殖道分泌物病原體基因分析結果樣本病原體內參照樣本病原體內參照分泌物1CT，UU，HPV6陽性分泌物6CT，UU，HPV6陽性分泌物2NG，HPV6/11陽性分泌物7HPV6/11/16/18陽性分泌物3UU，Mg，HPV6/11陽性分泌物8CT，HPV16陽性分泌物4HPV16/18陽性分泌物9UU，HPV6/11陽性分泌物5CT，NG，HPV11陽性分泌物10NG，Mg，HPV18陽性當前第1頁1 2 3