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重組核酸片段RecCR012080及其檢測方法與流程

文檔序號:12167263閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.重組核酸片段,其選自:

i)包含SEQ ID NO:1所示序列第987-1664位核苷酸的序列或其片段或其變體或其互補序列;

ii)包含SEQ ID NO:1所示序列的序列或其片段或其變體或其互補序列;

iii)包含SEQ ID NO:2所示序列第640-969位核苷酸的序列或其片段或其變體或其互補序列;

iv)包含SEQ ID NO:2所示序列的序列或其片段或其變體或其互補序列;以及

以上片段的組合。

2.檢測權(quán)利要求1所述片段的引物,其中所述引物選自:

(I)特異性識別SEQ ID NO:1所示序列第1-987位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:1所示序列第1664-1769位核苷酸的序列的反向引物;

(II)以下第一組引物對與第二組引物對的組合,其包含

(a)第一組引物對:特異性識別SEQ ID NO:1所示序列第1-987位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:1所示序列第988-1663位核苷酸的序列的反向引物;和

(b)第二組引物對:特異性識別SEQ ID NO:1所示序列第988-1663位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:1所示序列第1664-1769位核苷酸的序列的反向引物;

(III)特異性識別包含SEQ ID NO:1所示序列第987-988位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別包含SEQ ID NO:1所示序列第1663-1664位核苷酸的序列的反向引物;

(IV)特異性識別包含SEQ ID NO:1所示序列第987-988位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:1所示序列第1664-1769位核苷酸的序列的反向引物;

(V)特異性識別SEQ ID NO:1所示序列第1-987位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別包含SEQ ID NO:1所示序列第1663-1664位核苷酸的序列的反向引物;和/或任選地,

(VI)特異性識別SEQ ID NO:2所示序列第1-640位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:2所示序列第968-4260位核苷酸的序列的反向引物;

(VII)以下第三組引物對與第四組引物對的組合,其包含

(c)第三組引物對:特異性識別SEQ ID NO:2所示序列第1-640位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:2所示序列第641-967位核苷酸的序列的反向引物;和

(d)第四組引物對:特異性識別SEQ ID NO:2所示序列第641-967位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:2所示序列第968-4260位核苷酸的序列的反向引物;

(VIII)特異性識別包含SEQ ID NO:2所示序列第640-641位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別包含SEQ ID NO:2所示序列第968-969位核苷酸的序列的反向引物;

(IX)特異性識別包含SEQ ID NO:2所示序列第640-641位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:2所示序列第968-4260位核苷酸的序列的反向引物;

(X)特異性識別SEQ ID NO:2所示序列第1-640位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別包含SEQ ID NO:2所示序列第968-969位核苷酸的序列的反向引物。

3.檢測權(quán)利要求1所述片段的引物,其中所述引物選自:

(I)擴增SEQ ID NO:1所示序列的引物對

5’-GCATTATCGTTGATTCTTGGAGG-3’,

5’-AACTAGACGCAAACAGGGCAGTA-3’;以及

(II)測序SEQ ID NO:1所示序列的引物

5’-GCATTATCGTTGATTCTTGGAGG-3’;

5’-GATTTCGGAGTTGATGTGAT-3’;

5’-AACTAGACGCAAACAGGGCAGTA-3’;和/或任選地,

(III)擴增SEQ ID NO:2所示序列的引物對

5’-TCGGTTGGAAAGTGACAATAGG-3’,

5’-TTGGGACATAGGACGTTAGATG-3’;以及

(IV)測序SEQ ID NO:2所示序列的引物

5’-TCGGTTGGAAAGTGACAATAGG-3’;

5’-TGGTGGTTCTGGCAGCGATT-3’;

5’-TGGGTGCGGAGGTAGAGGTG-3’;

5’-CCTAGTCCCGATTGTGCCG-3’;

5’-TGCGGCTATGCGTAGTTTGG-3’;

5’-CCGTCTTCCCGACCGTGTCC-3’;

5’-TTGGGACATAGGACGTTAGATG-3’。

4.選育含有權(quán)利要求1所述的重組核酸片段的水稻植株的方法,其包括以不含目的基因組片段的水稻受體植物親本作為輪回親本,將其與含有目的基因組片段的水稻供體植物進行雜交,然后將所得到的雜交種與輪回親本進行回交,再將所得到的回交種進行自交的步驟,其中利用分子標(biāo)記對重組植株進行前景選擇和背景選擇。

5.如權(quán)利要求4所述的方法,其中用于所述前景選擇的分子標(biāo)記選自Pi2-4、Pi2S67和Pi2S122中的一種或多種;和/或

任選地,利用水稻全基因組育種芯片進行所述背景選擇。

6.如權(quán)利要求4或5所述的方法,其中所述重組核酸片段含有抗稻瘟病基因,并且所述方法包括以下步驟:

1)將輪回親本與供體植物進行雜交,將所得到的雜交種與輪回親本進行回交,獲得回交一代,利用正向選擇標(biāo)記Pi2-4和負(fù)向選擇標(biāo)記Pi2S67、Pi2S122對其進行抗稻瘟病基因組片段的單側(cè)同源重組片段篩選,并利用水稻全基因組育種芯片對其進行背景選擇;

2)選擇背景回復(fù)較好的重組單株與輪回親本再次進行回交,獲得回交二代,利用正向選擇標(biāo)記Pi2-4對其進行檢測,選擇含有抗稻瘟 病基因組片段的重組單株,然后利用水稻全基因組育種芯片對其進行背景選擇;

3)選擇背景回復(fù)好的重組單株與輪回親本又一次進行回交,獲得回交三代,利用正向選擇標(biāo)記Pi2-4和負(fù)向標(biāo)記Pi2S67、Pi2S122對其進行抗稻瘟病基因組片段的另一側(cè)同源重組片段篩選,并利用水稻全基因組育種芯片對其進行背景選擇;以及

4)選擇導(dǎo)入片段小,且背景回復(fù)好的重組單株,將選中的重組單株自交一次,獲得自交種,利用正向選擇標(biāo)記Pi2-4對其進行檢測,并利用水稻全基因組育種芯片對其進行背景選擇,最終獲得含純合抗稻瘟病基因組重組核酸片段且背景回復(fù)的水稻植株。

7.如權(quán)利要求4至6中任一項所述的方法,其中利用分子標(biāo)記對重組植株進行前景選擇時采用的擴增引物如下:

擴增分子標(biāo)記Pi2-4的引物對,其包括:

正向引物:5’-CGGTAAGAGTAACACCAAGC-3’,

反向引物:5’-GACGTGCGAGTTGTGACAGCT-3’;

擴增分子標(biāo)記Pi2S67的引物對,其包括:

正向引物:5’-CCGATGCAAGAACAAGCTAA-3’,

反向引物:5’-CCACCACATCACCAGTGTTT-3’;以及

擴增分子標(biāo)記Pi2S122的引物對,其包括:

正向引物:5’-GACTTGAAAACCAGTGCGTG-3’,

反向引物:5’-CCTACCTAATGGAAAGGATTGC-3’。

8.檢測權(quán)利要求1所述的重組核酸片段的方法,其包括采用權(quán)利要求2或3所述的引物,以待測基因組為模板進行PCR反應(yīng),并分析PCR產(chǎn)物的步驟。

9.檢測權(quán)利要求1所述的重組核酸片段的試劑盒,其包括權(quán)利要求2或3所述的引物。

10.篩選含有權(quán)利要求1所述的重組核酸片段的水稻植株或種子的方法,其包括檢測待測水稻植株或種子的基因組中是否含有權(quán)利要求1所述的重組核酸片段的步驟;

優(yōu)選地,采用權(quán)利要求2或3所述的引物,或者采用權(quán)利要求8所述的方法,或者采用權(quán)利要求9所述的試劑盒來進行檢測。

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