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重組核酸片段RecCR020352及其檢測方法與流程

文檔序號:12167225閱讀:470來源:國知局
重組核酸片段RecCR020352及其檢測方法與流程

本申請涉及全基因組選擇育種技術(shù)。具體而言,本申請涉及利用全基因組選擇育種技術(shù)選育含重組核酸片段的水稻植株,及由此而獲得的重組核酸片段及其檢測方法。



背景技術(shù):

褐飛虱,學(xué)名Nilaparvata lugens屬同翅目,飛虱科。褐飛虱是單食性害蟲,僅取食水稻,具有喜溫、抗寒能力弱、生長周期短、遠(yuǎn)距離遷飛、暴發(fā)性和猖獗性等特征。褐飛虱是典型的刺吸式害蟲,以取食韌皮部和木質(zhì)部汁液為生,取食量大、繁殖快,一旦大爆發(fā),可造成受害區(qū)域顆粒無收。此外,還可以傳播水稻病毒病(如:草狀叢矮病和齒葉矮縮病),對水稻生產(chǎn)也造成嚴(yán)重危害。

自20世紀(jì)80年代以來,從野生稻和栽培稻中已經(jīng)鑒定超過30個抗褐飛虱位點(diǎn)。由于褐飛虱表型鑒定的復(fù)雜性,導(dǎo)致近幾年才克隆Bph14、Bph26和Bph3等個別基因(Du等,PNAS.2009,106(52):22163-22168;Tamura等,Sci Rep.2014,4:5872;Liu等,Nature Biotechnology.2015,33:301-305)。另外,隨著抗褐飛虱品種在生產(chǎn)中的不斷利用,褐飛虱對品種的適應(yīng)能力逐漸增強(qiáng)。一些在生產(chǎn)上廣泛利用的抗性品種正逐漸喪失對褐飛虱的抗性(Deen等,Rice Genet Newsl.2010,25:70-72)。目前,褐飛虱防治仍依靠化學(xué)農(nóng)藥,不僅增加生產(chǎn)成本,污染環(huán)境,而且促使褐飛虱抗藥性增強(qiáng)。

由此可見,抗褐飛虱新品種的培育需求非常迫切。



技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

一方面,本申請?zhí)峁┝酥亟M核酸片段,其選自:i)包含SEQ ID NO:1所示序列720-2175位核苷酸的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序 列;ii)包含SEQ ID NO:1所示序列的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列;iii)包含SEQ ID NO:2所示序列636-888位核苷酸的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列;或iv)包含SEQ ID NO:2所示序列的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列;以及以上片段的組合。在一實(shí)施方案中,所述重組核酸片段為基因組重組核酸片段。

此外,本申請?zhí)峁┝藱z測所述重組核酸片段的引物,其選自:(I)特異性識別SEQ ID NO:1所示序列1-720位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:1所示序列2175-2859位核苷酸的序列的反向引物;(II)以下第一組引物對與第二組引物對的組合,其包含(a)第一組引物對:特異性識別SEQ ID NO:1所示序列第1-720位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:1所示序列第721-2174位核苷酸的序列的反向引物;和(b)第二組引物對:特異性識別SEQ ID NO:1所示序列第721-2174位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:1所示序列第2175-2859位核苷酸的序列的反向引物;(III)特異性識別包含SEQ ID NO:1所示序列第720-721位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別包含SEQ ID NO:1所示序列第2174-2175位核苷酸的序列的反向引物;(IV)特異性識別包含SEQ ID NO:1所示序列第720-721位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:1所示序列第2175-2859位核苷酸的序列的反向引物;(V)特異性識別SEQ ID NO:1所示序列第1-720位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別包含SEQ ID NO:1所示序列第2174-2175位核苷酸的序列的反向引物;和/或任選地,(VI)特異性識別SEQ ID NO:2所示序列1-636位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:2所示序列888-1050位核苷酸的序列的反向引物;(VII)以下第三組引物對與第四組引物對的組合,其包含(c)第三組引物對:特異性識別SEQ ID NO:2所示序列第1-636位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:2所示序列第637-887位核苷酸的序列的反向引物;和(d)第四組引物對:特異性識別SEQ ID NO:2所示序列第637-887位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:2所示序列第888-1050位核苷酸的序列的反向引物;(VIII)特異性識別包含SEQ ID NO:2所示序 列第636-637位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別包含SEQ ID NO:2所示序列第887-888位核苷酸的序列的反向引物;(IX)特異性識別包含SEQ ID NO:2所示序列第636-637位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:2所示序列第888-1050位核苷酸的序列的反向引物;(X)特異性識別SEQ ID NO:2所示序列第1-636位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別包含SEQ ID NO:2所示序列第887-888位核苷酸的序列的反向引物。

在一實(shí)施方案中,用于擴(kuò)增SEQ ID NO:1所示序列的引物對為,例如,5’-AGAACACCGTGAAGTTCGCAAGGAA-3’,和5’-CGGCAGGAAACAGAAGAAACAAAGG-3’。用于檢測SEQ ID NO:1所示序列的測序引物為,例如,5’-TCTGTCTGGCCCTTCTAATT-3’;5’-GAGACATAGACCAACAACCC-3’;5’-GTTGCTTCGTAATGGGTTAG-3’;5’-TCGTGCCGTATAAAGAACAG-3’;5’-CACCAAACACGGTGGATGAG-3’;和5’-ATGCTGTTGTCCTCCTCTT-3’。

在另一實(shí)施方案中,用于擴(kuò)增SEQ ID NO:2所示序列的引物對為,例如,5’-GCCATCAGCCTGTCCAATAC-3’,和5’-CAAGGCCAACGGAACTAACT-3’。用于檢測SEQ ID NO:2所示序列的測序引物為,例如,5’-GCCATCAGCCTGTCCAATAC-3’;5’-GAGATGCCGACATGAGTGGT-3’;和5’-CACTACTAAGGTCCCGTTCT-3’。

另一方面,本申請?zhí)峁┝诉x育含有重組核酸片段的水稻植株的方法,其包括以不含目的基因組片段的水稻受體植物親本作為輪回親本,將其與含有目的基因組片段的水稻供體植物進(jìn)行雜交,然后將所得到的雜交種與輪回親本進(jìn)行回交,再將所得到的回交種進(jìn)行自交的步驟,其中利用分子標(biāo)記對重組水稻植株進(jìn)行前景選擇和背景選擇。例如,所述重組核酸片段如前所述。

在上述方法中,用于所述前景選擇的分子標(biāo)記選自BphC04ID06、RM6659和BphC04S08中的一種或多種;和/或利用水稻全基因組育種芯片進(jìn)行所述背景選擇。

在一實(shí)施方案中,本申請?zhí)峁┑倪x育含有抗褐飛虱基因組重組核酸片段的水稻植株的方法,其包括以下步驟:1)將輪回親本與供體植 物進(jìn)行雜交,再將所得到的雜交種與輪回親本進(jìn)行回交,獲得回交一代,利用正向選擇標(biāo)記BphC04ID06和負(fù)向選擇標(biāo)記RM6659、BphC04S08對其進(jìn)行抗褐飛虱基因組片段的單側(cè)同源重組片段篩選,并利用水稻全基因組育種芯片,例如RICE6K,對其進(jìn)行背景選擇;2)選擇背景回復(fù)較好的重組單株(此世代背景回復(fù)值超過75%)與輪回親本再次進(jìn)行回交,獲得回交二代,利用正向選擇標(biāo)記BphC04ID06對其進(jìn)行檢測,選擇含有抗褐飛虱基因組片段的重組單株,然后利用水稻全基因組育種芯片,例如RICE6K,對其進(jìn)行背景選擇;3)選擇背景回復(fù)好的重組單株(此世代背景回復(fù)值超過87.5%)與輪回親本又一次進(jìn)行回交,獲得回交三代,利用正向選擇標(biāo)記BphC04ID06和負(fù)向選擇標(biāo)記RM6659、BphC04S08對其進(jìn)行抗褐飛虱基因組片段的另一側(cè)同源重組片段篩選,并利用水稻全基因組育種芯片,例如RICE60K,對其進(jìn)行背景選擇;以及4)選擇導(dǎo)入片段小,且背景回復(fù)好的重組單株(背景回復(fù)值超過93.75%),將選中的重組單株自交一次,獲得自交種,利用正向選擇標(biāo)記BphC04ID06對其進(jìn)行檢測,并利用水稻全基因組育種芯片,例如RICE60K,對其進(jìn)行背景選擇,最終獲得含純合抗褐飛虱基因組重組核酸片段且背景回復(fù)(背景回復(fù)值超過99%)的水稻植株。

在另一實(shí)施方案中,利用分子標(biāo)記對重組植株進(jìn)行前景選擇時采用的擴(kuò)增引物,包括:用于擴(kuò)增分子標(biāo)記BphC04ID06的引物對,其中正向引物為5’-CCTAGCCGTCAGGTTAATAGATCAT-3’,反向引物為5’-ACCAGGTCTACTAGCTTTTACGGAG-3’;用于擴(kuò)增分子標(biāo)記RM6659的引物對,其中正向引物為5’-TGTGGAGGCTTAGGAAATTCTGG-3’,反向引物為5’-TGTGAAACATGCCACGATACTGC-3’;用于擴(kuò)增分子標(biāo)記BphC04S08的引物對,其中正向引物為5’-GAGCGATCCATTAGCACGTGACT-3’,反向引物為5’-GTTTCTAGGTGTTCCCAACTCTCCC-3’。

又一方面,本申請?zhí)峁┝藱z測重組核酸片段的方法,其包括根據(jù)如前所述的重組核酸片段設(shè)計特異性引物,以待測基因組為模板進(jìn)行PCR反應(yīng),并分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的步驟。具體地,例如,所述引物如前所述??蛇x擇地,利用Sanger測序法分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

具體而言,本申請?zhí)峁┑臋z測重組核酸片段的方法中,用于擴(kuò)增及檢測SEQ ID NO:1所示序列的引物組合如下:擴(kuò)增引物,包括正向引物:5’-AGAACACCGTGAAGTTCGCAAGGAA-3’,和反向引物:5’-CGGCAGGAAACAGAAGAAACAAAGG-3’;測序引物,包括正向引物:5’-TCTGTCTGGCCCTTCTAATT-3’,反向引物:5’-GAGACATAGACCAACAACCC-3’,正向引物:5’-GTTGCTTCGTAATGGGTTAG-3’,正向引物:5’-TCGTGCCGTATAAAGAACAG-3’,正向引物:5’-CACCAAACACGGTGGATGAG-3’,和正向引物:5’-ATGCTGTTGTCCTCCTCTT-3’。所述方法以待測樣品基因組DNA為模板,利用上述擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后利用上述測序引物對獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序,若測序結(jié)果與SEQ ID NO:1序列一致或互補(bǔ),則待測樣品中含有SEQ ID NO:1所示同源重組片段。

另外,在本申請?zhí)峁┑臋z測重組核酸片段的方法中,用于擴(kuò)增及檢測SEQ ID NO:2所示序列的引物組合如下:擴(kuò)增引物,包括正向引物:5’-GCCATCAGCCTGTCCAATAC-3’,和反向引物:5’-CAAGGCCAACGGAACTAACT-3’;測序引物,包括正向引物:5’-GCCATCAGCCTGTCCAATAC-3’,反向引物:5’-GAGATGCCGACATGAGTGGT-3’,和反向引物:5’-CACTACTAAGGTCCCGTTCT-3’。所述方法以待測樣品基因組DNA為模板,利用上述擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后利用上述測序引物對獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序,若測序結(jié)果與SEQ ID NO:2序列一致或互補(bǔ),則待測樣品中含有SEQ ID NO:2所示同源重組片段。

通過檢測確定了待測樣品中含有SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示序列的重組核酸片段,即可確定待測樣品中包含抗性基因組重組核酸片段。

此外,本申請還提供了檢測重組核酸片段的試劑盒,其包括如前述的引物。

進(jìn)一步地,本申請還提供了篩選含有重組核酸片段的水稻植株或種子的方法,其包括檢測待測水稻植株的基因組中是否含有如前所述的重組核酸片段的步驟。在一實(shí)施方案中,采用如前所述的引物來檢 測待測水稻植株的基因組中是否含有如前所述的重組核酸片段。在另一實(shí)施方案中,采用如前所述的檢測重組核酸片段的方法來檢測待測水稻植株的基因組中是否含有如前所述的重組核酸片段。在又一實(shí)施方案中,采用如前所述的試劑盒來檢測待測水稻植株的基因組中是否含有如前所述的重組核酸片段。

在又一方面,本申請?zhí)峁┝送ㄟ^所述方法篩選得到的含有本申請公開的重組核酸片段的水稻植株或其種子。

本申請?zhí)峁┑幕谌蚪M選擇育種技術(shù)選育含有抗褐飛虱基因組重組核酸片段的水稻植株的方法,具有快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定三大特點(diǎn)。僅通過五世代轉(zhuǎn)育,即可僅將目標(biāo)基因組片段導(dǎo)入受體材料,并同時實(shí)現(xiàn)背景的回復(fù)。本申請改良的受體材料為廣泛使用的三系恢復(fù)系‘岳恢9113’。利用上述方法,可以在保留‘岳恢9113’原有特征的前提下,導(dǎo)入褐飛虱抗性基因組片段。進(jìn)一步的,通過配組實(shí)現(xiàn)雜交種褐飛虱抗性的大幅度提高。本申請?zhí)峁┑闹亟M核酸片段與褐飛虱抗性緊密相關(guān),可作為抗性資源應(yīng)用于其他品種的培育。

附圖說明

圖1為本申請實(shí)施例1中CR020352水稻RICE60K全基因組育種芯片檢測結(jié)果;其中,橫坐標(biāo)數(shù)字所指示方框依次表示水稻12條染色體,縱坐標(biāo)數(shù)字為水稻基因組上的物理位置[以兆堿基(Mb)為單位],灰色線條代表受體親本‘岳恢9113’基因型,黑色線條代表供體親本‘華3418B’基因型,白色線條代表兩親本基因型一致即無多態(tài)性區(qū)段。圖中第4號染色體黑色圓點(diǎn)處線條顯示區(qū)段即為導(dǎo)入的抗褐飛虱基因組重組核酸片段RecCR020352。

圖2為本申請實(shí)施例2中RecCR020352上游同源重組片段測序比對結(jié)果;圖中所示星號代表比對結(jié)果中相同堿基,圖中CR020352為獲得的新品系,T005為受體親本‘岳恢9113’,R002為供體親本‘華3418B’。

圖3為本申請實(shí)施例2中RecCR020352下游同源重組片段測序比對結(jié)果。

圖4為本申請實(shí)施例2中RecCR020352兩側(cè)同源重組片段的結(jié)構(gòu)圖;其中,(A)為上游同源重組片段結(jié)構(gòu)圖;(B)為下游同源重組片段結(jié)構(gòu)圖,上方堿基為供體‘華3418B’的SNP或InDel標(biāo)記,下方堿基為受體‘岳恢9113’的SNP或InDel標(biāo)記。灰色區(qū)段為來源于‘岳恢9113’基因組區(qū)段,黑色區(qū)段為來源于‘華3418B’基因組區(qū)段,白色區(qū)段為同源重組區(qū)段,橫坐標(biāo)為片段長度,以堿基對數(shù)目(bp)為單位。

圖5為本申請實(shí)施例3中CR020352褐飛虱抗性室內(nèi)鑒定結(jié)果;圖中所示葉片依次為:(A)高感褐飛虱品種‘臺中在來1號’;(B)原品種‘岳恢9113’;(C)改良新品系CR020352;(D)供體親本‘華3418B’。

具體實(shí)施方式

提供以下定義和方法用以更好地界定本申請以及在本申請實(shí)踐中指導(dǎo)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員。除非另作說明,術(shù)語按照相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員的常規(guī)用法理解。

如本文所用,“核苷酸序列”包括涉及單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物,并且除非另有限制,核苷酸序列以5’至3’方向從左向右書寫,包括具有天然核苷酸基本性質(zhì)的已知類似物(例如,肽核酸),所述類似物以與天然存在的核苷酸類似的方式與單鏈核酸雜交。

在一些實(shí)施方案中,可以對本申請的核苷酸序列進(jìn)行改變,以進(jìn)行保守氨基酸替換。在某些實(shí)施方案中,可以依照單子葉密碼子偏好性對本申請的核苷酸序列進(jìn)行不改變氨基酸序列的替換,例如可以用單子葉植物偏好的密碼子替換編碼同一氨基酸序列的密碼子,而不改變該核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。

具體地,本申請涉及對SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2進(jìn)一步優(yōu)化所得的核苷酸序列。該方法的更多細(xì)節(jié)描述于Murray等(1989)Nucleic Acids Res.17:477-498。優(yōu)化核苷酸序列可用于提高抗褐飛虱基因組重組核酸片段在水稻中的表達(dá)。

在一些實(shí)施方案中,本申請還涉及SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2 所示序列的變體。一般來講,特定核苷酸序列的變體將與該特定核苷酸序列具有至少約70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.5%或99.9%或更高的序列同一性,或以上的互補(bǔ)序列。這樣的變體序列包括一個或多個核酸殘基的添加、缺失或替換,從而可以導(dǎo)致相應(yīng)的氨基酸殘基的添加、移除或替換。通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的序列比對程序包括雜交技術(shù)確定序列同一性。實(shí)施方案的核苷酸序列變體與本申請的序列的差異可以少至1-15個核苷酸、少至1-10個(例如6-10個),少至5個,少至4、3、2或甚至1個核苷酸。

本申請還涉及包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列中特定位點(diǎn)的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列,例如,包含SEQ ID NO:1所示序列的720-2175位核苷酸的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列,或者包含SEQ ID NO:2所示序列的636-888位核苷酸的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列。根據(jù)包含上述特定位點(diǎn)的片段,能夠特異性地鑒定出相應(yīng)的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列。進(jìn)一步地,通過鑒定出含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列的重組核酸片段,即可確定待測樣品中包含抗性基因組重組核酸片段。

如本文所用,“水稻”是任何水稻植株并包括可以與水稻育種的所有植物品種。如本文所用,“植株”或“植物”,包括整株植物、植物細(xì)胞、植物器官、植物原生質(zhì)體、植物可以從中再生的植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、植物叢和植物或植物部分中完整的植物細(xì)胞,所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果實(shí)、莖桿、根、根尖、花藥等。

在本申請的方法可以適用于任何需要選育的水稻品種。也就是說,可以將任何缺少某種有利性狀的優(yōu)良品種(即綜合性狀較好,預(yù)計有發(fā)展前途的品種)用作輪回親本。用另一具有該受體所缺少的有利性狀的品種作為供體親本。在本申請的實(shí)施方案中,采用水稻‘岳恢9113’作為輪回親本,采用具有良好的褐飛虱抗性的水稻‘華3418B’作為供體。

在本申請所提供的重組植株的選育方法中,利用分子標(biāo)記對重組 植株進(jìn)行前景選擇。前景選擇的可靠性主要取決于標(biāo)記與目標(biāo)基因組片段間連鎖的緊密程度,為提高選擇的準(zhǔn)確率,一般同時用兩側(cè)相鄰的兩個標(biāo)記對目標(biāo)基因組片段進(jìn)行跟蹤選擇。

在本申請的實(shí)施方案中,采用的前景選擇標(biāo)記包括正向選擇標(biāo)記和負(fù)向選擇標(biāo)記,其中,正向選擇標(biāo)記是在距目標(biāo)基因組片段(含抗褐飛虱基因)上、下游50kb(在水稻中其遺傳距離為0.2cM)范圍內(nèi)篩選的多型性分子標(biāo)記。負(fù)向選擇標(biāo)記是在距目標(biāo)基因組片段上、下游500kb(在水稻中其遺傳距離為2cM)范圍內(nèi)篩選的多型性分子標(biāo)記。在具體實(shí)施方案中,經(jīng)優(yōu)化篩選使用的正向選擇標(biāo)記是與目標(biāo)基因組片段緊密連鎖的標(biāo)記BphC04ID06,負(fù)向選擇標(biāo)記是距目標(biāo)片段上游約220kb的分子標(biāo)記RM6659,以及距目標(biāo)片段下游約360kb的分子標(biāo)記BphC04S08。

在本申請的實(shí)施方案中,利用上述前景選擇標(biāo)記進(jìn)行同源重組的檢測時,一側(cè)或單側(cè)同源重組的判斷標(biāo)準(zhǔn)是BphC04ID06檢出與‘華3418B’相同帶型,且RM6659或BphC04S08檢出與‘岳恢9113’相同帶型;兩側(cè)或雙側(cè)同源重組的判斷標(biāo)準(zhǔn)是BphC04ID06檢出與‘華3418B’相同帶型,且RM6659和BphC04S08檢出與‘岳恢9113’相同帶型。

在本申請中,可以使用任何一種可利用的芯片進(jìn)行本申請所提供的育種方法中的背景選擇。在優(yōu)選的實(shí)施方案中,可以采用本申請人在中國專利申請CN102747138A中公開的水稻全基因組育種芯片RICE6K,或者在PCT國際申請WO/2014/121419中公開的水稻全基因組育種芯片RICE60K。這兩份申請文件中的全部內(nèi)容整體并入本文作為參考。

以下實(shí)施例僅用于說明而非限制本申請范圍的目的。若未特別指明,實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件,如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001),或按照制造廠商說明書建議的條件。

本申請中所使用的水稻植株材料信息均可參見中國水稻品種及其系譜數(shù)據(jù)庫(http://www.ricedata.cn/variety/index.htm)。

本申請中所提到的水稻基因組物理位置均參照水稻日本晴基因組MSU/TIGR注釋第6.1版(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。

本申請所提到的公開SSR分子標(biāo)記可參見網(wǎng)站http://www.gramene.org/。

實(shí)施例1選育導(dǎo)入抗褐飛虱基因組片段的重組植株

本實(shí)施例中使用的材料為水稻‘岳恢9113’及水稻‘華3418B’。

水稻‘華3418B’具有良好的褐飛虱抗性,推測可能是第4號染色體的Bph3(Liu等,Nature Biotechnology.2015,33:301-305)、QBph4(Hu等,Molecular Breeding.2015,35:3)和Bph15(Yang等,Theoretical and Applied Genetics.2004,110:182-191)所在的基因簇區(qū)域?qū)υ摬牧系暮诛w虱抗性起了關(guān)鍵作用。

在重組植株的選育過程中,利用分子標(biāo)記對重組植株進(jìn)行前景選擇,對所采用的前景選擇分子標(biāo)記進(jìn)行了篩選。所使用的分子標(biāo)記部分來源于網(wǎng)站http://www.gramene.org/,部分自行設(shè)計。設(shè)計方法為,參照水稻日本晴基因組MSU/TIGR注釋第6.1版,下載前述區(qū)段DNA序列。使用SSRLocator軟件對上述序列中的SSR位點(diǎn)進(jìn)行掃描。利用Primer Premier 3.0軟件對尋找出的SSR位點(diǎn)設(shè)計引物,共設(shè)計引物106對。通過PCR的方法,篩選上述引物對在‘華3418B’及‘岳恢9113’中的多態(tài)性,最終挑選出在兩份材料中具有多態(tài)性、擴(kuò)增效率高的前景選擇分子標(biāo)記,分別是正向選擇標(biāo)記BphC04ID06和負(fù)向選擇標(biāo)記RM6659、BphC04S08。

用于PCR擴(kuò)增上述分子標(biāo)記的具體引物信息見表1。

表1前景選擇分子標(biāo)記引物信息

將‘華3418B’中前述基因簇所在的基因組片段導(dǎo)入到‘岳恢9113’中,具體過程如下:

以‘岳恢9113’為輪回親本,‘華3418B’為供體親本進(jìn)行雜交,將所得的雜交種與輪回親本‘岳恢9113’進(jìn)行回交,獲得BC1F1種子,育苗后利用正向選擇標(biāo)記BphC04ID06和負(fù)向選擇標(biāo)記RM6659、BphC04S08進(jìn)行重組單株選擇,篩選出13個在目標(biāo)基因組片段一側(cè)同源重組的單株,即BphC04ID06檢出與‘華3418B’相同帶型,且RM6659或BphC04S08檢出與‘岳恢9113’相同帶型,并利用水稻全基因組育種芯片RICE6K(CN102747138A)對其進(jìn)行背景選擇(Yu等,Plant Biotechnology Journal.2014,12:28-37)。

在篩選出的13個單側(cè)同源重組單株中比較芯片結(jié)果,選擇背景回復(fù)最好的重組單株(此世代背景回復(fù)值超過75%),使其與輪回親本‘岳恢9113’再次進(jìn)行回交,獲得BC2F1種子,育苗后利用正向選擇標(biāo)記BphC04ID06對其進(jìn)行檢測,選擇含有目標(biāo)基因組片段的重組單株,即BphC04ID06檢出與‘華3418B’相同帶型,利用水稻全基因組育種芯片RICE6K對其進(jìn)行背景選擇。

選擇背景回復(fù)較好的單株(此世代背景回復(fù)值超過87.5%),使其與輪回親本‘岳恢9113’又一次進(jìn)行回交,獲得BC3F1種子,育苗后利用正向選擇標(biāo)記BphC04ID06和負(fù)向標(biāo)記RM6659、BphC04S08對收獲的種子進(jìn)行目標(biāo)基因組片段另一側(cè)同源重組片段的篩選,獲得9個在目標(biāo)片段兩側(cè)重組的單株,即BphC04ID06檢出與‘華3418B’相同帶型,且RM6659和BphC04S08檢出與‘岳恢9113’相同帶型。

利用水稻全基因組育種芯片RICE60K(WO/2014/121419)對上述9個雙側(cè)交換單株進(jìn)行背景和目標(biāo)片段選擇(Chen等,Molecular Plant.2014,7:541-553),篩選到導(dǎo)入目標(biāo)片段較小,且背景回復(fù)好的目標(biāo)單株一個(此世代背景回復(fù)值超過93.75%)。

將選中的單株自交一次,獲得BC3F2,育苗后利用正向選擇標(biāo)記BphC04ID06對其進(jìn)行檢測,選擇含有目標(biāo)基因組片段的單株,即BphC04ID06檢出與‘華3418B’相同帶型,利用水稻全基因組育種芯片RICE60K對其進(jìn)行背景選擇。

最終獲得目標(biāo)片段純合,且背景回復(fù)(背景回復(fù)值超過99%)的株系一個,命名為CR020352。芯片檢測結(jié)果見圖1。

實(shí)施例2導(dǎo)入褐飛虱抗性基因組片段后同源重組片段的確定

為了確定導(dǎo)入的抗褐飛虱基因組片段大小,對‘岳恢9113’導(dǎo)入抗褐飛虱基因組片段的純合單株進(jìn)行了目標(biāo)基因組片段兩側(cè)同源重組片段的測序。將CR020352所含的抗褐飛虱基因組重組核酸片段命名為RecCR020352。

通過水稻全基因組育種芯片RICE60K檢測結(jié)果初步確定,RecCR020352位于兩個SNP標(biāo)記R0406683327TC和F0406988115GA之間。

同時,使用Miseq測序技術(shù)對‘岳恢9113’、‘華3418B’和CR020352三個樣本進(jìn)行全基因組測序。使用TruSeq Nano DNA LT Kit(illumina)試劑盒進(jìn)行文庫建立,使用Library Quantification Kit–Universal(KAPA Biosystems)試劑盒進(jìn)行定量,使用MiSeq V2Reagent Kit(illumina)試劑盒進(jìn)行測序反應(yīng)。使用Miseq臺式測序儀(illumina)進(jìn)行檢測。具體步驟及方法參見各試劑盒及測序儀使用說明書。

根據(jù)前述SNP芯片及Miseq測序結(jié)果,將CR020352抗褐飛虱基因組重組片段上游同源重組片段定位在第4染色體的6684714bp到6687759bp區(qū)間,下游同源重組片段定位于6986399bp到6987430bp區(qū)間。

在此基礎(chǔ)上,參照水稻日本晴基因組MSU/TIGR注釋第6.1版,下載對應(yīng)區(qū)段DNA序列。使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計擴(kuò)增及測序引物,設(shè)計要求為引物長22nt左右、GC含量40-60%且沒有錯配。

以受體親本‘岳恢9113’和供體親本‘華3418B’為對照,對CR020352的上游和下游同源重組片段分別設(shè)計擴(kuò)增引物,使用高保真酶KOD FX Neo(TOYOBO)進(jìn)行擴(kuò)增,使用兩步法或三步法尋找最佳擴(kuò)增條件,確保擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳檢測中顯示為單一明亮條帶。其中確定的上游同源重組片段擴(kuò)增引物反應(yīng)條件為:94℃2min;98℃10sec,63℃30sec,68℃150sec,37個循環(huán);20℃1min。下 游同源重組片段擴(kuò)增引物反應(yīng)條件為:94℃2min;98℃10sec,60℃30sec,68℃90sec,37個循環(huán);20℃1min。由此,最終篩選出兩對擴(kuò)增引物分別用于上游和下游同源重組片段的擴(kuò)增。

另外,以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板,利用Sanger測序法進(jìn)行測序,根據(jù)實(shí)際測序效果,最終篩選出6條和3條測序引物分別用于上游和下游同源重組片段的測序。

具體的擴(kuò)增引物及測序引物序列見表2,測序結(jié)果見圖2和圖3。

RecCR020352上游同源重組片段測序長度為2859bp(SEQ ID NO:1)。1-720bp為受體‘岳恢9113’的基因組區(qū)段,與供體‘華3418B’比較,存在3個SNP。721-2174bp這一1454bp區(qū)段為同源重組區(qū)段。2175-2859bp為供體‘華3418B’基因組片段,與‘岳恢9113’比較,存在4個SNP。

RecCR020352下游同源重組片段測序長度為1050bp(SEQ ID NO:2)。1-636bp為供體‘華3418B’的基因組區(qū)段,與‘岳恢9113’比較,存在3個SNP,2個Indel。637-887bp這一251bp區(qū)段為同源重組區(qū)段。888-1050bp為受體‘岳恢9113’的基因組區(qū)段,與供體‘華3418B’比較,存在7個SNP,1個Indel。

圖4為RecCR020352兩側(cè)同源重組片段的結(jié)構(gòu)圖。其中,(A)為上游同源重組片段結(jié)構(gòu)圖;(B)為下游同源重組片段結(jié)構(gòu)圖。上方堿基為供體‘華3418B’的SNP或InDel標(biāo)記,下方堿基為受體‘岳恢9113’的SNP或InDel標(biāo)記?;疑珔^(qū)段為來源于‘岳恢9113’基因組區(qū)段,黑色區(qū)段為來源于‘華3418B’基因組區(qū)段,白色區(qū)段為同源重組區(qū)段。橫坐標(biāo)為片段長度,以堿基對數(shù)目(bp)為單位。

表2抗褐飛虱基因組重組核酸片段擴(kuò)增及測序引物信息

實(shí)施例3‘岳恢9113’導(dǎo)入抗褐飛虱基因組片段后的抗性鑒定

為了鑒定選育出的含重組核酸片段植株的褐飛虱抗性,對本申請選育的新品系CR020352、受體親本‘岳恢9113’、供體親本‘華3418B’(作為陽性對照),以及高感褐飛虱品種‘臺中在來1號’(作為陰性對照)進(jìn)行褐飛虱室內(nèi)抗性鑒定,鑒定方法如下。

將各份材料在室內(nèi)浸種、催芽,隨后播種在劃好格子線的塑料面盆中,每份材料分3行共播種45株,待兩葉一心期時,每行保留10株共30株健康長勢一致的植株用于接蟲。蟲源來自從田間采集到的褐飛虱,并在室內(nèi)飼養(yǎng)繁殖。取2-3齡若蟲到待鑒定的植株上,每株有5-10頭若蟲即可。待‘臺中在來1號’死苗95%時開始記錄各鑒定苗的抗性等級,取30株苗的抗性等級的平均值,作為該材料的抗性等級,根據(jù)抗性等級評價其抗性水平。其中,抗性等級共分10級:0或1級,葉片未受害或第一片葉葉尖發(fā)黃;2級,第一片葉1/2發(fā)黃或者葉尖皺縮;3級,第一片葉發(fā)黃或是枯萎;4級,第二片葉部分發(fā)黃或心葉葉尖發(fā)黃;5級,第二片葉發(fā)黃、皺縮或是枯萎、心葉青卷;6級,心葉卷曲,心葉葉尖枯萎;7級,心葉卷曲枯萎,植株未死亡;8級,心葉枯萎,稍微倒伏;9級,整株倒伏。根據(jù)上述抗性等級,0-0.9級判定為高抗,1.0-2.9級為抗,3.0-5.9級為中抗,6.0-6.9級為中感,7.0-7.9級為感,8.0-9.0級為高感。

褐飛虱室內(nèi)抗性鑒定結(jié)果見圖5,其中‘臺中在來1號’為高感,原品種‘岳恢9113’為感,改良新品系CR020352為抗,供體親本‘華3418B’為高抗。

雖然,上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本申請作了詳盡的描述,但在本申請基礎(chǔ)上,可以對之作一些修改或改進(jìn),這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此,在不偏離本申請精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn),均屬于本申請要求保護(hù)的范圍。

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