本發(fā)明屬生物制藥領(lǐng)域,特別是涉及一種咖啡酰奎寧酸衍生物,該衍生物具有對(duì)神經(jīng)元修復(fù)和保護(hù)的作用。
背景技術(shù):
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神經(jīng)退行性疾病是一種大腦和脊髓的細(xì)胞神經(jīng)元喪失的疾病狀態(tài)。大腦和脊髓由神經(jīng)元組成,神經(jīng)元有不同的功能,如控制運(yùn)動(dòng),處理感覺(jué)信息,并作出決策。大腦和脊髓的細(xì)胞一般是不會(huì)再生的,所以過(guò)度的損害可能是毀滅性的,不可逆轉(zhuǎn)的。神經(jīng)退行性疾病是由神經(jīng)元或其髓鞘的喪失所致,隨著時(shí)間的推移而惡化,導(dǎo)致功能障礙。初步治療取決于具體疾病的診斷。目前,僅有少數(shù)幾個(gè)藥物可用于一些神經(jīng)退行性疾病。因此,尋找安全有效的治療藥物迫在眉睫。
牛蒡,為菊科牛蒡?qū)俣晟荼局参?,又名“惡?shí)”、白肌人參或蒡翁菜等。作為抗衰老、降血糖的特種保健蔬菜和經(jīng)濟(jì)作物,牛蒡在中國(guó)有廣泛種植。牛蒡根在《藥性論》、《本草拾遺》等典籍中多有記載,有抗氧化防衰老的作用,但沒(méi)有形成中草藥類(lèi)的商品,多作為牛蒡子的副產(chǎn)品而廢棄不用。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),牛蒡根對(duì)人體具有多種藥理作用,包括保肝,抗炎和抗氧化等,這些功效與其含有大量的咖啡酰奎寧酸化合物有關(guān)。但牛蒡根中具有何種結(jié)構(gòu)的咖啡酰奎寧酸衍生物對(duì)神經(jīng)元所起到的作用卻未見(jiàn)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
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發(fā)明目的:本發(fā)明的目的在于提供一種咖啡酰奎寧酸衍生物,這些衍生物均為新的化合物。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種咖啡??鼘幩嵫苌锏闹苽浞椒?。
本發(fā)明的再一目的在于提供一種咖啡酰奎寧酸衍生物制備用于神經(jīng)元修復(fù)和保護(hù)藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明的再一目的在于提供一種含有上述咖啡酰奎寧酸衍生物的藥物組合物,和一種以上藥學(xué)可接受的載體。
技術(shù)方案:
為實(shí)現(xiàn)上述目的,本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
一種咖啡??鼘幩嵫苌?,具體包括具有下式結(jié)構(gòu)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽:
所述的藥學(xué)上可接受的鹽可以是酸加成鹽、堿加成鹽或兩性離子存在。
例如:乙酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、苯甲酸鹽等。
本發(fā)明含有上述咖啡??鼘幩嵫苌锏乃幬锝M合物,和一種以上藥學(xué)可接受的載體。
所述載體包括各種藥用輔料、包材等。根據(jù)制劑需要進(jìn)行選擇。例如輔料包括填充劑、崩解劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑等,可以適用于口服、吸入、非腸胃給藥或表面給藥;劑型包括但不限于注射劑、溶液劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑等。
一種如上所述咖啡??鼘幩嵫苌?,可制備用于神經(jīng)元修復(fù)和保護(hù)藥物的應(yīng)用。所述咖啡??鼘幩嵫苌锏膽?yīng)用,可以是神經(jīng)退行性疾病、創(chuàng)傷性腦損傷、中風(fēng)疾病藥物。
一種如上所述咖啡??鼘幩嵫苌锏闹苽浞椒?,其特征在于:取牛蒡根藥材,8-20倍量的質(zhì)量百分比為55%乙醇水溶液浸泡,加熱回流提取3次,第一次2h,后兩次1h;合并提取液,減壓回收溶劑得到濃縮浸膏;將浸膏分散于適量水中,用乙酸乙酯萃??;減壓回收溶劑得到乙酸乙酯萃取物,運(yùn)用色譜分離手段,對(duì)乙酸乙酯層萃取物進(jìn)行提取分離,得到所述的咖啡酰奎寧酸衍生物;結(jié)合理化性質(zhì)和現(xiàn)代波譜學(xué)手段,鑒定結(jié)構(gòu)式如下:
優(yōu)點(diǎn)及效果:本發(fā)明的二咖啡酰奎寧酸衍生物具有顯著的神經(jīng)元修復(fù)和保護(hù)活性,可開(kāi)發(fā)用于神經(jīng)退行性疾病、創(chuàng)傷性腦損傷、中風(fēng)疾病等疾病的治療,為此類(lèi)疾病的治療提供潛在的機(jī)會(huì)。
附圖說(shuō)明:
1、附圖1為本發(fā)明兩個(gè)新化合物的結(jié)構(gòu)圖;
2、附圖2為MTT[3-(4,5)-雙甲基-2-噻唑-(2,5)-苯基溴化四氮唑藍(lán)]法測(cè)定的咖啡??鼘幩嵫苌飳?duì)過(guò)氧化氫介導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的修復(fù)結(jié)果示意圖;注:縱坐標(biāo)為細(xì)胞存活率,橫坐標(biāo):con組代表空白組,其他組均加入400μM的過(guò)氧化氫,其中7.5,15,30和15,30,60分別代表不同濃度的給藥組。下同。
3、附圖3為L(zhǎng)DH(乳酸脫氫酶)法測(cè)定的咖啡??鼘幩嵫苌? 對(duì)過(guò)氧化氫介導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的修復(fù)結(jié)果示意圖。
具體實(shí)施方式:
下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述,但發(fā)面的實(shí)施例方式不限于此。
下面通過(guò)以下實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例1:咖啡酰奎寧酸衍生物A和B的制備。
牛蒡根藥材10.0kg,8-20倍量的質(zhì)量百分比55%乙醇水溶液浸泡過(guò)夜,加熱回流提取3次,第一次2h,后兩次1h。合并提取液,減壓回收溶劑得到濃縮浸膏。將浸膏分散于適量水中,依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取。減壓回收溶劑得到石油醚萃取物(15.6g),二氯甲烷萃取物(43.1g),乙酸乙酯萃取物(256.8g)和正丁醇萃取物(843.2g)。經(jīng)檢測(cè),乙酸乙酯層活性最佳。將乙酸乙酯萃取物(256.8g)過(guò)硅膠柱,用二氯甲烷-甲醇洗脫(100:1-1:100),得到15個(gè)流份。將流份Fr.12(10g)用ODS柱色譜分離,洗脫溶劑甲醇水(10:90-100:0),得到18個(gè)流份。流份Fr.12-10用ODS柱色譜分離,洗脫溶劑甲醇水(10:90-100:0),得到10個(gè)流份。流份Fr.12-10-4(800mg)用制備液相制備,色譜條件(JASCO制備型高效液相色譜儀,YMC-Pack Pro ODS-A C18,Ф250×10mm,10μm,水:乙腈:三氟乙酸=77.5:22.5:1),得到A(18mg,rt=65min)和B(80mg,rt=48min)。
化合物A的HR-MS數(shù)據(jù)和NMR數(shù)據(jù):HR-TOF-MS m/z(rel.int.):645.1453[M-H+]-(calcd.645.1456for C30H29O16);1H-NMR(600MHz,CD3OD):δ:7.60,7.55(each 1H,d,J=15.8Hz,H-7″,7″′),7.07,7.05(each 1H,d,J=1.9Hz,H-2″,2″′),6.98,6.96(each 1H,dd,J=1.9,8.1Hz,H-6″,6″′),6.79,6.77(each 1H,d,J=8.1Hz,H-5″,5″′),6.32,6.23(each 1H,d,J=15.8Hz,H-8″,8″′),5.58(1H,m,H-5),5.10(1H,dd,J=3.2,8.5Hz,H-4),4.54(1H,m,H-3′),4.44(1H,m,H-3),3.70(OCH3),2.78(1H,d,J =5.2,16.0Hz,H-2′a),2.60(1H,d,J=5.2,16.0Hz,H-2′b),2.60(1H,m,H-6a),2.50(1H,m,H-2a),2.50(1H,m,H-2b),2.16(1H,m,H-6b).13C-NMR(150MHz,CD3OD):δ:174.9(C-1′),171.2(C-7),169.9(C-4′),168.1(C-9″),168.0(C-9″′),149.7(C-4″),149.1(C-4″′),147.7(C-7″),147.7(C-7″′),146.8(C-3″),146.8(C-3″′),127.8(C-1″),127.7(C-1″′),123.1(C-6″),123.1(C-6″′),116.5(C-5″),116.5(C-5″′),115.3(C-2″),115.2(C-2″′),115.1(C-8″),114.7(C-8″′),80.5(C-1),75.5(C-4),68.4(C-2′),68.3(C-5),67.2(C-3),52.8(OCH3),40.2(C-3′),37.4(C-6),35.7(C-2).
化合物B的HR-MS數(shù)據(jù)和NMR數(shù)據(jù):HR-TOF-MS m/z(rel.int.):669.1439[M+Na]+(calcd.669.1432for C30H30O16Na);1H-NMR(600MHz,CD3OD):δ:7.62,7.61(each 1H,d,J=15.8Hz,H-7″,7″′),7.10,7.07(each 1H,d,J=1.9Hz,H-2″,2″′),7.00,6.96(each1H,dd,J=1.9,8.3Hz,H-6″,6″),6.81,6.79(each 1H,d,J=8.2Hz,H-5″,5″′),6.35,6.30(each 1H,d,J=15.8Hz,H-8″,8″′),5.47(1H,m,H-3),5.43(1H,m,H-5),4.47(1H,m,H-2')3.95(each 1H,dd,J=3.7,9.4Hz,H-4),3.56(OCH3),2.77(1H,m,H-2a)2.71(2H,m,H-3'),2.62(1H,m,H-6a),2.45(1H,m,H-2b),2.00(1H,m,H-6b).13C-NMR(150MHz,CD3OD):δ:175.0(C-1′),174.0(C-7),171.3(C-4′),168.6(C-9″′),167.7(C-9″),149.8(C-4″),149.6(C-4″′),148.1(C-7″),147.4(C-7″′),146.8(C-3″),146.7(C-3″′),127.7(C-1″),127.6(C-1″′),123.3(C-6″),123.0(C-6″′),115.3(C-8″),115.3(C-2″),115.2(C-8″′),115.2(C-2″′),115.0(C-5″),114.9(C-5″′),80.5(C-1),73.2(C-3),71.6(C-4),71.0(C-5),68.2(C-2′),52.8(OCH3),40.3(C-3′),37.9(C-6),32.7(C-2).
實(shí)施例2:咖啡??鼘幩嵫苌矬w外神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)和保護(hù)活性研究。
本發(fā)明采用MTT和LDH活性測(cè)試法測(cè)定咖啡酰奎寧酸衍生物對(duì)過(guò)氧化氫介導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞損傷的保護(hù)作用,結(jié)果表明咖啡酰奎寧酸衍生物具有顯著的修復(fù)神經(jīng)細(xì)胞的作用,因此可以用于研究開(kāi)發(fā)治療神經(jīng)退行性疾病、中風(fēng)及創(chuàng)傷性腦損傷藥物。
(1)儀器與試劑:DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司,胎牛血清為Hyclone產(chǎn)品;CKX31型倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司);恒溫CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司);5810R型臺(tái)式高速低溫離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司);全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Biotek集團(tuán));過(guò)氧化氫(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);LDH試劑盒(南京建成)
(2)細(xì)胞培養(yǎng):將復(fù)蘇后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(5%CO2,相對(duì)濕度90%),隔天更換培養(yǎng)液。待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶壁的80-90%左右時(shí),進(jìn)行傳代或下步試驗(yàn),控制細(xì)胞密度在1×105cells/mL左右。
(3)MTT法測(cè)定生物活性:取指數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞,接種于96孔培養(yǎng)板中,細(xì)胞數(shù)密度為1×105個(gè)/mL,每孔加入100μL,置37℃,5%CO2孵箱中培養(yǎng)12h,細(xì)胞貼壁后每孔加入100ul400umol/L過(guò)氧化氫損傷8h,損傷結(jié)束后棄去培養(yǎng)液,分別加入不同濃度(20ug/ml,40ug/ml,80ug/ml)的新化合物培養(yǎng)液200ul,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔,置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24h。24h后每孔加入MTT(5mg/mL)20μl,繼續(xù)在孵箱中孵育4h。棄去上清,每孔加入150μlDMSO,在490nm處測(cè)定吸光值(OD值)。按照下式計(jì)算活細(xì)胞的比例:
活細(xì)胞所占比例(Cell Viability)=(加藥組OD值)/(對(duì)照組OD)值×100%
結(jié)果如下:如圖2所示,與損傷組相比較,加藥組的細(xì)胞生存率明顯高于損傷組,化合物A在7.5,15和30μM濃度下的細(xì)胞存活率為52%,64%和78%;化合物B在15,30和60μM濃度下的細(xì)胞存活率為58%,69%和82%。
(4)LDH法測(cè)定活性:取指數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞,接種于 96孔培養(yǎng)板中,細(xì)胞數(shù)密度為1×105個(gè)/mL,每孔加入100μL,置37℃,5%CO2孵箱中培養(yǎng)12h,細(xì)胞貼壁后每孔加入100ul 400umol/L過(guò)氧化氫損傷6h,損傷結(jié)束后棄去培養(yǎng)液,分別加入不同濃度(20ug/ml,40ug/ml,80ug/ml)的新化合物的培養(yǎng)液200ul,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔,置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24h。24h后取上清液,按照LDH試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后,在酶標(biāo)儀450nm處測(cè)定OD值。
LDH釋放量的結(jié)果表示為相當(dāng)于空白組的百分?jǐn)?shù)。
結(jié)果顯示:如圖3所示,與損傷組相比較,加藥組的LDH釋放量明顯低于損傷組,化合物A在7.5,15和30μM濃度下的LDH釋放量為230%,130%和110%;化合物B在15,30和60μM濃度下的LDH釋放量為294%,231%和139%。
上述結(jié)果表明:咖啡酰奎寧酸衍生物均具有較好的神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)活性,且在一定劑量范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的劑量依賴性關(guān)系。
實(shí)施例3:藥物組合物的制備
化合物A 6.5g
糊精 80g
按常規(guī)方法,將上述物質(zhì)混合均勻后,分1000等份分別裝入普通明膠膠囊,得到1000顆膠囊。
實(shí)施例4:藥物組合物的制備
化合物B 6.5g
糊精 80g
按常規(guī)方法,將上述物質(zhì)混合均勻后,分1000等份分別裝入普通明膠膠囊,得到1000顆膠囊。
上述實(shí)施例3、4所述載體為糊精,載體也可以包括各種藥用輔料、包材等。根據(jù)制劑需要進(jìn)行選擇,例如輔料包括填充劑、崩解劑、粘合劑、潤(rùn)滑劑等,可以適用于口服、吸入、非腸胃給藥或表面給藥;劑型包括但不限于注射劑、溶液劑、片劑、膠囊劑、顆粒劑等。
上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式,但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制,其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所做的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化均應(yīng)為等效的置換方式,都包含在本發(fā)明的框架包含范圍之內(nèi)。