燈盞細辛破壁飲片的指紋圖譜共有模式構(gòu)建及其質(zhì)量檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及中藥飲片的質(zhì)量檢測方法，尤其是燈盞細辛破壁飲片的指紋圖譜共有 模式構(gòu)建及其質(zhì)量檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 本品為菊科植物短葶飛蓬 Erigeronbreviscapus (Vant. )Hand. -Mazz.的干燥 全草。燈盞細辛的主要活性成分為黃酮類和咖啡酰類，主要包括野黃芩素、芹菜素、芹菜 素-0-7--D-葡萄糖醛酸、野黃芩苷、1，5-二咖啡酰奎寧酸和3, 4-二咖啡?？鼘幩岬取?2010版藥典以野黃芩苷為對照品，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇0. 1%磷酸 溶液（40 :60)為流動相；檢測波長335nm，理論板數(shù)按野黃芩苷峰計算應不低于5000的色 譜條件，照《高效液相色譜法檢驗標準操作程序》測定對其進行質(zhì)量控制。
[0003] 中藥破壁飲片是利用現(xiàn)代超微粉碎技術(shù)將傳統(tǒng)飲片進行破細胞壁粉碎成粒度分 布D90小于45 y m的微細顆粒，再制成30~100目的顆粒。相對于傳統(tǒng)飲片具有色澤一致， 質(zhì)量均一，穩(wěn)定性好的特點，為創(chuàng)新型中藥飲片。由于中藥破壁飲片不具傳統(tǒng)中藥飲片的 形態(tài)特征，破壁后會帶來有效成分或指標成分等化學成分的溶出度變化，使傳統(tǒng)飲片的鑒 另IJ、質(zhì)量檢測方法不能完全適用。因此，必須針對中藥破壁飲片建立專屬性強，全面反映中 藥破壁飲片質(zhì)量狀況的檢測方法。而建立一項新的質(zhì)量檢測方法并非易事，例如檢測條件、 對照品的選擇和供試品的制備方法等均需要研宄考量并進行驗證。雖然現(xiàn)有技術(shù)中有涉及 中藥指紋圖譜的檢測方法，但并無針對形態(tài)特殊的中藥破壁飲片的方法，且存在專屬性、穩(wěn) 定性、重現(xiàn)性和精密度差缺陷，不能完全反應飲片的質(zhì)量情況的缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種燈盞細辛破壁飲片的指紋圖譜共有模式構(gòu)建方法及其質(zhì)量檢 測方法。
[0005] 其中，所述的指紋圖譜共有模式構(gòu)建方法包括以下步驟：
[0006] (1)供試品溶液的制備：取燈盞細辛破壁飲片約0? 250g，加入70%甲醇50ml，浸 潤30min,水浴加熱回流提取2h，用0. 22um微孔濾膜過濾，濾液備用；
[0007] (2)對照品配制：取燈盞乙素對照品適量，加70%甲醇配制成0. lmg/ml的對照品 溶液；
[0008] (3)色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱； 以甲醇為流動相A，以0. 3%甲酸溶液為流動相B ;梯度洗脫：0min-20min-50min，流動相A 變化：35% -45% -75% ;柱溫為35°C ;檢測波長為335nm ;流速：0. 6mL/min ;注入量：供試 品溶液10U 1，對照品5ul ;
[0009] (4)按上述供試品溶液及對照品的制備方法及色譜條件對10批以上的燈盞細辛 破壁飲片樣品進行HPLC分析，得到相應指紋圖譜；以燈盞乙素峰為參照峰，計算各指紋圖 譜中主要色譜峰的相對保留時間及相對峰面積；輸入指紋圖譜分析軟件，對各批次樣品指 紋圖譜進行相似度比較，以平均譜圖為共有模式，計算相似度，建立燈盞細辛破壁飲片指紋 圖譜共有模式標準圖譜，包括13個特征峰。
[0010] 所述的質(zhì)量檢測方法包括以下步驟：
[0011] (1)按上述的構(gòu)建方法中步驟（1)和步驟（2)分別制備待測樣品供試品溶液和對 照品溶液，按步驟（3)的色譜條件，精密吸取待測樣品供試品溶液10 y 1，對照品5ul，注入 HPLC色譜儀，測定，記錄色譜，即得。
[0012] (2)合格指標的建立及指定圖譜、判斷方法：供試品色譜中，應呈現(xiàn)13個與燈盞細 辛破壁飲片HPLC指紋圖譜共有模式標準圖譜相對應的特征峰；按中藥色譜指紋圖譜相似 度評價系統(tǒng)計算，供試品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度不得低于〇. 90,以燈盞乙素峰 為對照峰，其余12個共有特征峰相對保留時間分別為：0. 363、0. 450、0. 512、0. 838、0. 942、 1. 113、1. 163、1. 267、1. 543、1. 658、1. 757、1. 983,各峰相對保留時間 RSD 彡 ±5%，為合格。
[0013] 本發(fā)明是首次針對燈盞細辛破壁飲片質(zhì)量控制所構(gòu)建的HPLC指紋圖譜共有模式 標準圖譜及質(zhì)量檢測方法。該方法克服了現(xiàn)有技術(shù)不能完全適用燈盞細辛破壁飲片質(zhì)量控 制的缺陷。該圖譜較全面涵蓋了燈盞細辛破壁飲片主要活性成分的圖譜信息，專屬性明顯 優(yōu)于現(xiàn)有的同類指紋圖譜方法。經(jīng)試驗驗證該方法的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和精密度均達到法定 要求，且操作簡單，檢測快速準確；并能有效控制燈盞細辛藥材、破壁粉體、破壁飲片整體質(zhì) 量及鑒別偽品。
【附圖說明】
[0014] 圖1是對照品峰的指認中燈盞細辛破壁飲片與燈盞乙素對照品的比較圖譜。
[0015] 圖2是燈盞細辛破壁飲片指紋圖譜專屬性考察比較圖譜。
[0016] 圖3是燈盞細辛破壁飲片的指紋圖譜共有模式建立中樣品指紋圖譜。
[0017] 圖4是燈盞細辛破壁飲片的指紋圖譜共有模式圖譜。
【具體實施方式】
[0018] 一、燈盞細辛破壁飲片指紋圖譜共有模式標準圖譜的建立。
[0019] 1儀器與試樣
[0020] 1. 1儀器：安捷倫1200RRLC快速液相色譜儀（配有G1315C型號DAD檢測器、 G4218A的ELSD蒸發(fā)光檢測器、G1312B二元泵、G1329B自動進樣器、G1322A脫氣機、G1316B 柱溫箱，Agilent Chemstation色譜工作站
[0021] 1. 2試藥：試劑，甲醇（瑞典進口 Oceanpak色譜溶劑），乙腈（安徽時聯(lián)特種溶劑 有限公司，色譜純），雙蒸水（實驗室自制）、磷酸（天津市福晨化學試劑）、冰醋酸（天津市 福晨化學試劑廠）、甲酸（天津市福晨化學試劑）、甲醇（分析純，天津市大茂化學試劑有限 公司）、乙酸乙酯、乙醇等（均為分析純）。燈盞乙素對照品（110842-201106)購于中國食 品藥品檢定研究院。
[0022] 供試品：燈盞細辛破壁飲片、燈盞細辛破壁粉體、燈盞細辛原藥材（均由中山中智 藥業(yè)集團提供）。
[0023] 2?實驗方法
[0024] 2. 1樣品制備方法研宄
[0025] 2. 1. 1燈盞細辛破壁飲片提取溶劑的考察
[0026] 根據(jù)文獻資料記載，燈盞細辛藥材指紋圖譜研宄主要是采用甲醇和乙醇作為提取 溶劑，于是本研宄只比較甲醇和乙醇提取效率。
[0027] 樣品制備：精確稱取4份燈盞細辛破壁飲片（20121104)樣品各約0. 250g，樣品1 和2號加入甲醇50ml，樣品3和4號加入乙醇50m，稱定重量，浸潤30min,超聲提取60min, 取出，冷卻至室溫，用相應的溶劑補足減失的重量，搖勻，粗濾，0. 22um微孔濾膜過濾，備用。
[0028] 色譜條件：資生堂Capcell PAK C18(4.6X250mm，5um)色譜柱，柱溫30°C，流速 0.61111/111；[11，檢測波長33511111，流動相為甲醇-0.4%磷酸溶液，0-60111；[11，甲醇濃度變化為 25% -65 %梯度洗脫。
[0029] 結(jié)果見表1及記錄的圖譜，由表可得知兩溶劑色譜峰出峰情況相近，但是主要色 譜峰甲醇提取物均高于乙醇提取物，說明甲醇對燈盞細辛破壁飲片提取效率高于乙醇提取 效率。于是接下選擇甲醇作為提取溶劑進行提取方式的考察。
[0030] 表1燈盞細辛破壁飲片考察提取溶劑
【主權(quán)項】
1. 燈盞細辛破壁飲片的HPLC指紋圖譜共有模式標準圖譜的構(gòu)建方法，其特征在于，包 括以下步驟： (1) 供試品溶液的制備：取燈盞細辛破壁飲片約0.250g，加入70 %甲醇50ml，浸潤 30min，水浴加熱回流提取2h，用0. 22um微孔濾膜過濾，濾液備用； (2) 對照品配制：取燈盞乙素對照品適量，加70 %甲醇配制成0. lmg/ml的對照品溶 液； (3) 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的色譜柱；以甲 醇為流動相A，以0. 3%甲酸溶液為流動相B ;梯度洗脫：0min-20min-50min，流動相A變化： 35% -45% -75% ;柱溫為35°C ;檢測波長為335nm ;流速：0. 6mL/min ;注入量：供試品溶液 IOy 1，對照品5ul ; (4) 按上述供試品溶液及對照品的制備方法及色譜條件對10批以上的燈盞細辛破壁 飲片樣品進行HPLC分析，得到相應指紋圖譜；以燈盞乙素峰為參照峰，計算各指紋圖譜中 主要色譜峰的相對保留時間及相對峰面積；輸入指紋圖譜分析軟件，對各批次樣品指紋圖 譜進行相似度比較，以平均譜圖為共有模式，計算相似度，建立燈盞細辛破壁飲片指紋圖譜 共有模式標準圖譜，包括13個特征峰。
2. -種菊花破壁飲片的質(zhì)量檢測方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 按權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法中步驟（1)和步驟（2)分別制備待測樣品供試品 溶液和對照品溶液，按步驟（3)的色譜條件，精密吸取待測樣品供試品溶液IOy 1，對照品 5ul，注入HPLC色譜儀，測定，記錄色譜，即得。 (2) 合格指標的建立及指定圖譜、判斷方法：供試品色譜中，應呈現(xiàn)13個與燈盞細辛 破壁飲片HPLC指紋圖譜共有模式標準圖譜相對應的特征峰；按中藥色譜指紋圖譜相似度 評價系統(tǒng)計算，供試品指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似度不得低于〇. 90,以燈盞乙素峰為 對照峰，其余12個共有特征峰相對保留時間分別為：0. 363、0. 450、0. 512、0. 838、0. 942、 L 113、L 163、L 267、L 543、L 658、L 757、L 983,各峰相對保留時間 RSD 彡 ±5%，為合格。
【專利摘要】本發(fā)明涉及燈盞細辛破壁飲片的指紋圖譜共有模式構(gòu)建及其質(zhì)量檢測方法。該方法以燈盞乙素為對照，在柱溫35℃，檢測波長335nm，以甲醇為流動相A，0.3％甲酸溶液為流動相B；洗脫梯度0min-20min-50min，流動相A變化：35％-45％-75％的色譜條件下對10批以上的樣品進行HPLC分析，建立共有模式標準圖譜和判斷指標。將同一色譜條件下的待測樣品圖譜與之比較，檢測待測樣品的質(zhì)量。本發(fā)明是首次針對燈盞細辛破壁飲片建立的HPLC指紋圖譜及質(zhì)量檢測方法。該圖譜較全面涵蓋了燈盞細辛破壁飲片主要活性成分的圖譜信息，專屬性強，檢測快速準確；并能有效控制藥材、破壁粉體、破壁飲片的整體質(zhì)量。
【IPC分類】G01N30-02
【公開號】CN104849362
【申請?zhí)枴緾N201510116245
【發(fā)明人】彭麗華, 王慧玲, 徐吉銀, 成金樂
【申請人】中山市中智藥業(yè)集團有限公司
【公開日】2015年8月19日
【申請日】2015年3月17日