本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵酶制劑
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種腺苷酸脫氨酶的液態(tài)發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
：高I+G(5′-肌苷酸鈉和5′-鳥核酸鈉)酵母抽提物是在原酵母抽提物的基礎(chǔ)上，強(qiáng)化了產(chǎn)品中呈味核苷酸物質(zhì)含量的酵母抽提物，作為天然、營(yíng)養(yǎng)的高端調(diào)味品可替代味精，具有增鮮、提味和降鹽等作用，符合現(xiàn)代人的飲食消費(fèi)習(xí)慣和營(yíng)養(yǎng)需求趨勢(shì)。酵母抽提物中I+G的含量直接影響著產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)和生產(chǎn)成本。在國(guó)內(nèi)的研究中，酵母抽提物中I+G含量在10％左右，而國(guó)外有I+G含量達(dá)到20％的酵母抽提物的專利報(bào)道。我單位通過(guò)增加對(duì)高蛋白高核酸酵母的熱提取時(shí)間和pH的改進(jìn)，在抽提物溶液中酵母RNA由原來(lái)的13％提高到25％以上，再通過(guò)酶解工藝改進(jìn)可以直接生產(chǎn)出18％以上的I+G產(chǎn)品，再對(duì)該產(chǎn)品進(jìn)行超濾，產(chǎn)品各項(xiàng)性能得到明顯改善，產(chǎn)品各項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到歐美高端產(chǎn)品質(zhì)量水平，屬國(guó)內(nèi)首創(chuàng)。高I+G酵母抽提物的生產(chǎn)過(guò)程中，首先使用5′-核苷酸的磷酸二酯酶對(duì)單鏈DNA和RNA進(jìn)行水解，生成腺苷酸(AMP)和鳥苷酸(GMP)，再由5′-腺苷酸脫氨酶進(jìn)行作用，將腺苷酸轉(zhuǎn)化為肌苷酸(IMP)。在高I+G酵母抽提物制備過(guò)程中，5′-腺苷酸脫氨酶起著至關(guān)重要的作用，5′-腺苷酸脫氨酶的酶活力及作用性能直接影響肌苷酸生成及高I+G酵母抽提物的質(zhì)量。因此，獲得高催化活力、高性能的5′-腺苷酸脫氨酶是解決高I+G酵母抽提物生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)之一，具有重要的研究意義和市場(chǎng)價(jià)值。5′-腺苷酸脫氨酶最早由鼠骨骼肌和人紅血細(xì)胞制備，現(xiàn)代化工業(yè)生產(chǎn)中使用的酶大都使用酵母、青霉、曲霉及毛霉等微生物發(fā)酵法制備，其中使用最多的菌種是米曲霉和蜂蜜曲霉，近年日本也有用基因工程鏈霉菌進(jìn)行生產(chǎn)的專 利報(bào)道。脫氨酶生產(chǎn)早期通常使用的是固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)，該方法的缺點(diǎn)是固體原料中的色素、蛋白質(zhì)、糖及無(wú)機(jī)鹽等被混雜到酶液中而使酶的提取純化和使用帶來(lái)困難，而且固體酶的酶活往往很低。隨后人們開始采用液體發(fā)酵法生產(chǎn)脫氨酶，該方法可以有效地克服固態(tài)發(fā)酵的某些缺點(diǎn)，但是酶的活性及穩(wěn)定性仍未解決。5′-腺苷酸脫氨酶的工業(yè)化生產(chǎn)，目前，國(guó)際上只有日本天野酶株式會(huì)社擁有成熟的技術(shù)和產(chǎn)品，國(guó)內(nèi)的廣西科學(xué)院也有產(chǎn)品在試銷，但產(chǎn)品的穩(wěn)定性和應(yīng)用效果還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。目前，國(guó)內(nèi)有關(guān)5′-腺苷酸脫氨酶的研究報(bào)道不多，并且主要仍集中在菌種選育和發(fā)酵條件優(yōu)化方面。劉昌軍等通過(guò)菌種篩選和發(fā)酵工藝優(yōu)化，利用米曲霉固態(tài)發(fā)酵方式獲得5′-腺苷酸脫氨酶的表達(dá)量為1543.48u/g鮮曲；普為民等從多株青霉及曲霉中篩選到一株腺苷酸脫氨酶蜂蜜曲霉產(chǎn)生菌，經(jīng)紫外線及復(fù)合誘變處理及發(fā)酵工藝優(yōu)化后，使原始菌種脫氨酶表達(dá)量提高了16倍，最終得到脫氨酶的表達(dá)量達(dá)到1300u/g；段作營(yíng)等通過(guò)固態(tài)發(fā)酵方式獲得米曲霉脫氨酶的表達(dá)量約1560u/g，并使用鹽析沉淀方法對(duì)該酶進(jìn)行了純化并對(duì)酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究。高I+G酵母抽提物是在原酵母抽提物的基礎(chǔ)上，強(qiáng)化了產(chǎn)品呈味核苷酸物質(zhì)的酵母抽提物。該產(chǎn)品具有調(diào)味、營(yíng)養(yǎng)和輔助醫(yī)療的作用，產(chǎn)品質(zhì)量品質(zhì)更高，可以滿足人們對(duì)調(diào)味原料發(fā)展的需要。5′-腺苷酸脫氨酶可以專一地將腺苷酸(AMP)轉(zhuǎn)變?yōu)榧≤账?IMP)，在高I+G酵母抽提物的工業(yè)化生產(chǎn)中起著重要的作用；通過(guò)曲霉發(fā)酵是獲取腺苷酸脫氨酶的主要途徑，由于大多數(shù)菌種產(chǎn)酶活力低下，專一性不強(qiáng)，造成市場(chǎng)上腺苷酸脫氨酶供應(yīng)緊缺，提高菌種腺苷酸脫氨酶的產(chǎn)酶活力是解決高I+G酵母抽提物生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)之一，具有重要的研究意義和市場(chǎng)價(jià)值。目前市場(chǎng)上以日本天野酶制劑公司的腺苷酸脫氨酶為主要生產(chǎn)商，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)腺苷酸脫氨酶的廠家較少，該產(chǎn)品市場(chǎng)開發(fā)潛力大。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是現(xiàn)有的采用曲霉發(fā)酵法生產(chǎn)腺苷酸脫氨酶的存在發(fā)酵酶活低，生產(chǎn)成本高的缺陷。具體來(lái)說(shuō)，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種腺苷酸脫氨酶的液態(tài)發(fā)酵方法，其包括如下步驟：(1)菌種活化：將曲霉孢子接入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，洗脫得到孢子懸液；(2)種子制備：將孢子懸液按照1％～2.5％重量比的接種量接入種子搖瓶培養(yǎng)基中，得到種子菌液；(3)種子罐培養(yǎng)：按照0.1％～0.5％重量比的接種量，將種子菌液接入裝有種子培養(yǎng)基的種子罐中培養(yǎng)，得到種子培養(yǎng)液，其中轉(zhuǎn)速為50～150rpm，通風(fēng)比為1：0.3～1：1.2；(4)發(fā)酵罐生產(chǎn)：按照2％～10％重量比的接種量，將種子培養(yǎng)液接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)，其中轉(zhuǎn)速為100～200rpm，通風(fēng)比為1：0.3～1：1.2，發(fā)酵結(jié)束得到發(fā)酵液。優(yōu)選的，步驟(1)中所述培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。優(yōu)選的，步驟(1)中所述菌種置于28～29℃培養(yǎng)2～4天。優(yōu)選的，步驟(2)中所述的孢子懸液置于28～29℃培養(yǎng)20～24小時(shí)。優(yōu)選的，步驟(3)中所述的種子罐培養(yǎng)是在29～31℃溫度下，培養(yǎng)24～28小時(shí)。優(yōu)選的，步驟(4)中所述的發(fā)酵罐生產(chǎn)是在29～30℃溫度下，培養(yǎng)110～130小時(shí)。優(yōu)選的，對(duì)所述的發(fā)酵液采用板框過(guò)濾得到粗酶過(guò)濾液。優(yōu)選的，對(duì)所述的粗酶過(guò)濾液進(jìn)行濃縮，濃縮倍數(shù)控制在10～20倍，得到濃縮液。優(yōu)選的，對(duì)所述的濃縮液進(jìn)行凍干或者噴粉處理，得到固體脫氨酶。優(yōu)選的，所述的種子培養(yǎng)基，以100mL水計(jì)，包括：黃豆汁8～12g，蔗糖1～3g，K2HPO40.25～0.75g和酵母粉0.05～0.25g，pH值為5.0～7.2。優(yōu)選的，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基，以100mL水計(jì)，包括：葡萄糖1～5g，蛋白胨1～4g，三水檸檬酸二鈉0.2～0.6g，MgSO4·7H2O0.02～0.06g，微量元素母液2～6g和吐溫-800.08～0.24g，pH值為5.0～7.0。優(yōu)選的，所述的微量元素母液，，以100mL水計(jì)，包括：硫酸鋅0.5～3g和氯化鈣1～4g。其中，步驟(1)中所述菌株為蜂蜜曲霉(Aspergillusmelleus)，商購(gòu)自 中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，也就是說(shuō)商購(gòu)自在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的菌株，菌株保藏編號(hào)為CCTCCAF200042。其保藏地址為武漢市珞珈山武漢大學(xué)，該菌株來(lái)源于美國(guó)模式菌種保藏中心(ATCC)，收藏時(shí)間為2007-12-40。該菌株的共享方式分為公益性共享，合作研究共享，資源交換性共享；其獲取途徑包括郵件，現(xiàn)場(chǎng)獲取，網(wǎng)上訂購(gòu)。其中，通風(fēng)比用每分鐘內(nèi)通過(guò)單位體積培養(yǎng)液的空氣體積比來(lái)表示。(V/V.min)。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明通過(guò)該生產(chǎn)方法，解決了目前脫氨酶發(fā)酵酶活低，生產(chǎn)成本高的問(wèn)題，從而提高了產(chǎn)量，實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。腺苷酸脫氨酶目前工業(yè)用量最大的為高I+G酵母抽提物行業(yè)，由于行業(yè)所限，使得與大宗酶(如糖化酶和淀粉酶等)相比，國(guó)內(nèi)科研院所對(duì)腺苷酸脫氨酶的研究相對(duì)較少，僅有少量研究報(bào)道，致使腺苷酸脫氨酶的發(fā)展極為緩慢，尚無(wú)成熟的自主商業(yè)產(chǎn)品。目前國(guó)內(nèi)高I+G酵母抽提物生產(chǎn)中使用的腺苷酸脫氨酶幾乎全部為日本進(jìn)口產(chǎn)品，這使得我國(guó)高I+G酵母抽提物生產(chǎn)中所使用的關(guān)鍵酶制劑為人所控，也使得我國(guó)高I+G酵母抽提物行業(yè)的發(fā)展為人所制。因此，從特種酶制劑和快速發(fā)展的高I+G酵母抽提物兩種行業(yè)的久遠(yuǎn)發(fā)展來(lái)看，自主開發(fā)腺苷酸脫氨酶生產(chǎn)技術(shù)，均具有重要的現(xiàn)實(shí)和戰(zhàn)略意義。具體實(shí)施方式本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)中采用曲霉發(fā)酵法生產(chǎn)脫氨酶的方法存在生產(chǎn)成本高、脫氨酶的酶活力低，因而產(chǎn)量低的缺陷，通過(guò)發(fā)酵法制備得到脫氨酶成品，可用于5’-腺苷酸水解脫氨生成次黃嘌呤核酸-5’-磷酸。具體而言，本發(fā)明提供了一種腺苷酸脫氨酶的液態(tài)發(fā)酵方法，其包括如下步驟：(1)菌種活化：將曲霉孢子接入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，洗脫得到孢子懸液；(2)種子制備：將孢子懸液按照1％～2.5％重量比的接種量接入種子搖瓶培養(yǎng)基中，得到種子菌液；(3)種子罐培養(yǎng)：按照0.1％～0.5％重量比的接種量，將種子菌液接入裝 有種子培養(yǎng)基的種子罐中培養(yǎng)，得到種子培養(yǎng)液，其中轉(zhuǎn)速為50～150rpm，通風(fēng)比為1：0.3～1：1.2；(4)發(fā)酵罐生產(chǎn)：按照2％～10％重量比的接種量，將種子培養(yǎng)液接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)，其中轉(zhuǎn)速為100～200rpm，通風(fēng)比為1：0.3～1：1.2，發(fā)酵結(jié)束得到發(fā)酵液。下面通過(guò)具體實(shí)施例來(lái)闡述本發(fā)明的實(shí)施過(guò)程和技術(shù)效果，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，這不應(yīng)被理解為對(duì)本發(fā)明權(quán)利要求范圍的限制。其中，實(shí)施例及對(duì)比例中所用到的菌株為蜂蜜曲霉(Aspergillusmelleus)，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，菌株保藏編號(hào)為CCTCCAF200042。值得注意的是，本發(fā)明中接種量均指的是重量比。其中，實(shí)施例中所用PDA培養(yǎng)基的配方為：每1000ml水，含土豆(去皮)200g，葡萄糖20g和瓊脂20g，pH自然。其中，本發(fā)明所用到的各種培養(yǎng)基以及各種容器均經(jīng)過(guò)高壓蒸汽滅菌處理。實(shí)施例中所用的具體試劑和設(shè)備均是商購(gòu)的。其中試劑的具體來(lái)源列于下面的表1中：表1實(shí)施例和對(duì)比例中用到的各試劑及廠商試劑/設(shè)備純度生產(chǎn)廠商蔗糖工業(yè)級(jí)北京康普匯維科技有限公司酵母粉工業(yè)級(jí)無(wú)棣縣德大農(nóng)業(yè)有限公司磷酸氫二鉀工業(yè)級(jí)吳江市南風(fēng)精細(xì)化工有限公司葡萄糖食品級(jí)濟(jì)南圣豐工貿(mào)有限公司蛋白胨工業(yè)級(jí)衡水中裕膠業(yè)有限公司三水檸檬酸二鈉食品級(jí)河南新義精細(xì)化工有限公司七水硫酸鎂工業(yè)級(jí)萊州市守喜鎂業(yè)有限公司硫酸鋅工業(yè)級(jí)鄒平縣潤(rùn)梓化工有限公司氯化鈣工業(yè)級(jí)廊坊納博化學(xué)技術(shù)有限公司吐溫-80工業(yè)級(jí)濟(jì)南騰博化工有限公司黃豆汁的做法：取100g黃豆，用榨汁機(jī)榨成黃豆汁，定容至1L。其中，黃豆購(gòu)自荊州市常青農(nóng)業(yè)科技有限公司。設(shè)備生產(chǎn)廠商如下：凍干設(shè)備，上海東富龍科技股份有限公司；噴粉設(shè)備，常州市益民干燥設(shè)備有限公司；超濾濃縮設(shè)備，西安濱潤(rùn)環(huán)?？萍加邢薰尽Ｏ佘账崦摪泵该富顪y(cè)定方法如下：1)移取3mL腺苷酸脫氨酶底物(3.475×10-2g/L)在37℃溫度下保溫5min，加入稀釋后的AMP脫氨酶溶液0.1mL，立刻計(jì)時(shí)反應(yīng)，反應(yīng)15min后加入3mL10％的高氯酸溶液終止反應(yīng)。2)對(duì)照樣品處理方法同上，反應(yīng)底物保溫后用冰水預(yù)冷，加入3mL10％的高氯酸溶液終止反應(yīng)，再加入0.1mL的樣品。反應(yīng)結(jié)束后，在265nm處，用石英比色皿，以水為參比測(cè)量吸光度。酶活定義：在上述條件下每分鐘吸光值改變0.001，定義為酶的活力單位。液體酶活(U/mL)＝(△A265×10×K)/(0.001×T)式中：△A265為空白對(duì)照與反應(yīng)液吸光度的差值；K為酶液稀釋倍數(shù)；T為酶的反應(yīng)時(shí)間(min)。實(shí)施例11.菌種活化：取蜂蜜曲霉孢子懸液甘油管一支，用10ul接種環(huán)挑取一環(huán)，在無(wú)菌環(huán)境中接入200gPDA培養(yǎng)基中，至于28℃環(huán)境中培養(yǎng)4天，并用50ml無(wú)菌水洗脫，得到孢子懸液。2.種子制備：將孢子懸液按照1％接種量接入3L種子搖瓶培養(yǎng)基中，置于28℃培養(yǎng)24小時(shí)，得到種子菌液。其中，種子搖瓶培養(yǎng)基的配方同步驟3中種子培養(yǎng)基的配方。3.種子罐培養(yǎng)：按照0.1％的接種量，將種子菌液接入到裝有300L種子培養(yǎng)基的種子罐(儲(chǔ)存量為0.5噸)中培養(yǎng)，得到種子培養(yǎng)液，培養(yǎng)溫度29℃，轉(zhuǎn)速50rpm，通風(fēng)比1：0.3，培養(yǎng)周期28小時(shí)。其中種子培養(yǎng)基以重量 ％計(jì)，由下述組分制成：黃豆汁8％，蔗糖1％，K2HPO40.25％，酵母粉0.25％，其余組分為水，滅菌前pH值調(diào)到5.0。4.發(fā)酵罐生產(chǎn)：按照2％的接種量，將種子培養(yǎng)液接入裝有15噸發(fā)酵培養(yǎng)基的的發(fā)酵罐(儲(chǔ)存量為25噸)中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度29℃，轉(zhuǎn)速100rpm，通風(fēng)比1:0.3，培養(yǎng)周期130小時(shí)后結(jié)束，放罐測(cè)定酶活水平。其中發(fā)酵培養(yǎng)基以重量％計(jì)，由下述組分制成：葡萄糖1％，蛋白胨4％，三水檸檬酸二鈉0.2％，MgSO4·7H2O0.02％，微量元素母液2％，吐溫-800.08％，其余組分為水，滅菌前調(diào)pH5.0。以重量％計(jì)，微量元素母液由下述組分制成：硫酸鋅0.5％，氯化鈣4％，其余組分為水。5.板框處理：采用板框過(guò)濾除去菌體得到粗酶過(guò)濾液。6.超濾濃縮：將粗酶過(guò)濾液通過(guò)超濾濃縮設(shè)備進(jìn)行濃縮，濃縮倍數(shù)控制在20倍，得到濃縮液。7.凍干處理：對(duì)濃縮液進(jìn)行凍干處理，得到固體脫氨酶。實(shí)驗(yàn)測(cè)得腺苷酸脫氨酶的酶活水平為2036U/mL。實(shí)施例21.菌種活化：取蜂蜜曲霉孢子懸液甘油管一支，用10ul接種環(huán)挑取一環(huán)，在無(wú)菌環(huán)境中接入200gPDA培養(yǎng)基中，至于29℃環(huán)境中培養(yǎng)2天，并用50ml無(wú)菌水洗脫，得到孢子懸液。2.種子制備：將孢子懸液按照2.5％接種量接入共計(jì)7.5L種子搖瓶培養(yǎng)基中，置于29℃培養(yǎng)20小時(shí)，得到種子菌液。其中，種子搖瓶培養(yǎng)基的配方同步驟3中種子培養(yǎng)基的配方。3.種子罐培養(yǎng)：按照0.5％的接種量，將種子菌液接入到裝有1.5噸種子培養(yǎng)基的種子罐(儲(chǔ)存量為2噸)中培養(yǎng)，得到種子培養(yǎng)液，培養(yǎng)溫度31℃，轉(zhuǎn)速150rpm，通風(fēng)比1：1.2，培養(yǎng)周期24小時(shí)。其中種子培養(yǎng)基以重量％計(jì)，由下述組分制成：黃豆汁12％，蔗糖3％，K2HPO40.75％，酵母粉0.05％，其余組分為水，滅菌前pH值調(diào)到7.2。4.發(fā)酵罐生產(chǎn)：按照10％的接種量，將種子培養(yǎng)液接入裝有15噸發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐(儲(chǔ)存量為25噸)中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度30℃，轉(zhuǎn)速200rpm， 通風(fēng)比1:1.2，培養(yǎng)周期110小時(shí)后結(jié)束，放罐測(cè)定酶活水平。其中發(fā)酵培養(yǎng)基以重量％計(jì)，由下述組分制成：葡萄糖5％，蛋白胨1％，三水檸檬酸二鈉0.6％，MgSO4·7H2O0.06％，微量元素母液6％，吐溫-800.24％，其余組分為水，滅菌前調(diào)pH7.0。以重量％計(jì)，微量元素母液由下述制成制成：硫酸鋅3％，氯化鈣1％，其余組分為水。5.板框處理：采用板框過(guò)濾除去菌體得到粗酶過(guò)濾液。6.超濾濃縮：將粗酶過(guò)濾液通過(guò)超濾濃縮設(shè)備進(jìn)行濃縮，濃縮倍數(shù)控制在15倍，得到濃縮液。7.噴粉處理：對(duì)濃縮液通過(guò)噴粉處理，得到固體脫氨酶。實(shí)驗(yàn)測(cè)得腺苷酸脫氨酶的酶活水平為2313U/mL。實(shí)施例31.菌種活化：取蜂蜜曲霉孢子懸液甘油管一支，用10ul接種環(huán)挑取一環(huán)，在無(wú)菌環(huán)境中接入200gPDA培養(yǎng)基中，至于28℃環(huán)境中培養(yǎng)3天，并用50ml無(wú)菌水洗脫，得到孢子懸液。2.種子制備：將孢子懸液按照2％接種量接入共計(jì)2.7L的種子搖瓶培養(yǎng)基中，置于28℃培養(yǎng)22小時(shí)，得到種子菌液。其中，種子搖瓶培養(yǎng)基的配方同步驟3中種子培養(yǎng)基的配方。3.種子罐培養(yǎng)：按照0.3％的接種量，將種子菌液接入到裝有900L種子培養(yǎng)基的種子罐(儲(chǔ)存量為1噸)中培養(yǎng)，得到種子培養(yǎng)液培養(yǎng)溫度30℃，轉(zhuǎn)速100rpm，通風(fēng)比1：0.7，培養(yǎng)周期26小時(shí)。其中種子培養(yǎng)基以重量％計(jì)，由下述組分制成：黃豆汁10％，蔗糖2％，K2HPO40.5％，酵母粉0.2％，其余組分為水，滅菌前調(diào)pH值為6.0。4.發(fā)酵罐生產(chǎn)：按照6％的接種量，將種子培養(yǎng)液接入裝有15噸發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐(儲(chǔ)存量為25噸)中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度29℃，轉(zhuǎn)速150rpm，通風(fēng)比1:0.7，培養(yǎng)周期115小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后放罐測(cè)定酶活水平。其中發(fā)酵培養(yǎng)基以重量％計(jì)，由下述組分制成：葡萄糖3％，蛋白胨2％，三水檸檬酸二鈉0.3％，MgSO4·7H2O0.05％，微量元素母液5％，吐溫-800.12％，其余組分為水，滅菌前調(diào)pH6.0。以重量％計(jì)，微量元素母液由下述組分制成：硫 酸鋅2％，氯化鈣2％，其余組分為水。5.板框處理：采用板框過(guò)濾除去菌體得到粗酶過(guò)濾液。6.超濾濃縮：將粗酶過(guò)濾液通過(guò)超濾濃縮設(shè)備進(jìn)行濃縮，濃縮倍數(shù)控制在10倍，得到濃縮液。7.凍干處理：對(duì)濃縮液通過(guò)凍干處理，得到固體脫氨酶。實(shí)驗(yàn)測(cè)得腺苷酸脫氨酶的酶活水平為2631U/mL。實(shí)施例41.菌種活化：取蜂蜜曲霉孢子懸液甘油管一支，用10ul接種環(huán)挑取一環(huán)，在無(wú)菌環(huán)境中接入200gPDA培養(yǎng)基中，至于29℃環(huán)境中培養(yǎng)3天，并用50ml無(wú)菌水洗脫，得到孢子懸液。2.種子制備：將孢子懸液按照2％接種量接入3.6L種子搖瓶培養(yǎng)基中，置于29℃培養(yǎng)24小時(shí)。其中，種子搖瓶培養(yǎng)基的配方同步驟3中種子培養(yǎng)基的配方。3.種子罐培養(yǎng)：按照0.3％的接種量，將種子菌液接入到裝有1.2噸種子培養(yǎng)基的的種子罐(儲(chǔ)存量為2噸)中培養(yǎng)，得到種子培養(yǎng)液，培養(yǎng)溫度30℃，轉(zhuǎn)速100rpm，通風(fēng)比1：1，培養(yǎng)周期28小時(shí)。其中種子培養(yǎng)基以重量％計(jì)，由下述組分制成：黃豆汁10％，蔗糖2％，K2HPO40.5％，酵母粉0.15％，其余組分為水，滅菌前調(diào)pH值為6.5。4.發(fā)酵罐生產(chǎn)：按照8％的接種量，將種子培養(yǎng)液接入裝有15噸發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐(儲(chǔ)存量為25噸)中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度29℃，轉(zhuǎn)速150rpm，通風(fēng)比1:1，培養(yǎng)周期120小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后放罐測(cè)定酶活水平。其中發(fā)酵培養(yǎng)基以重量％計(jì)，由下述組分制成：葡萄糖3％，蛋白胨2.52％，三水檸檬酸二鈉0.4％，MgSO4·7H2O0.04％，微量元素母液4％，吐溫-800.16％，其余組分為水，滅菌前調(diào)pH6.0。以重量％計(jì)，微量元素母液由下述組分制成：硫酸鋅1％，氯化鈣2％，其余組分為水。5.板框處理：采用板框過(guò)濾除去菌體得到粗酶過(guò)濾液。6.超濾濃縮：將粗酶過(guò)濾液通過(guò)超濾濃縮設(shè)備進(jìn)行濃縮，濃縮倍數(shù)控制在15倍，得到濃縮液。7.凍干處理：對(duì)濃縮液通過(guò)凍干處理，得到固體脫氨酶。實(shí)驗(yàn)測(cè)得腺苷酸脫氨酶的酶活水平為3021U/mL。對(duì)比例11.菌種活化：取蜂蜜曲霉孢子懸液甘油管一支，用10ul接種環(huán)挑取一環(huán)，在無(wú)菌環(huán)境中接入200gPDA培養(yǎng)基中，至于29℃環(huán)境中培養(yǎng)3天，并用50ml無(wú)菌水洗脫，得到孢子懸液。2.種子制備：將孢子懸液按照0.5％接種量接入3.6L種子搖瓶培養(yǎng)基中，置于29℃培養(yǎng)30小時(shí)，得到種子菌液。其中種子搖瓶培養(yǎng)基的配方和實(shí)施例4相同。3.種子罐培養(yǎng)：按照0.3％的接種量，將種子菌液接入到裝有1.2噸種子培養(yǎng)基的種子罐(儲(chǔ)存量為2噸)中培養(yǎng)，得到種子培養(yǎng)液，培養(yǎng)溫度30℃，轉(zhuǎn)速100rpm，通風(fēng)比1：1，培養(yǎng)周期28小時(shí)。其中種子培養(yǎng)基的配方和實(shí)施例4相同。4.發(fā)酵罐生產(chǎn)：按照8％的接種量，將種子培養(yǎng)液接入裝有15噸發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐(儲(chǔ)存量為25噸)中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度29℃，轉(zhuǎn)速150rpm，通風(fēng)比1:1，培養(yǎng)周期120小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后放罐測(cè)定酶活水平。其中發(fā)酵培養(yǎng)基的配方和實(shí)施例4相同。其他步驟同實(shí)施例4中步驟5-7。實(shí)驗(yàn)測(cè)得腺苷酸脫氨酶的酶活水平為1821U/mL。對(duì)比例21.菌種活化：取蜂蜜曲霉孢子懸液甘油管一支，用10ul接種環(huán)挑取一環(huán)，在無(wú)菌環(huán)境中接入到200gPDA培養(yǎng)基中，至于29℃環(huán)境中培養(yǎng)3天，并用50ml無(wú)菌水洗脫，得到孢子懸液。2.種子制備：將該孢子懸液按照3％接種量接入3.6L種子搖瓶培養(yǎng)基中，置于29℃培養(yǎng)15小時(shí)，得到種子菌液。其中種子搖瓶培養(yǎng)基的配方和實(shí)施例4相同。3.種子罐培養(yǎng)：按照0.3％的接種量，將種子菌液接入到裝有1.2噸種子 培養(yǎng)基的種子罐(儲(chǔ)存量為2噸)中培養(yǎng)得到種子培養(yǎng)液，其中培養(yǎng)溫度30℃，轉(zhuǎn)速100rpm，通風(fēng)比1：1，培養(yǎng)周期28小時(shí)。其中種子培養(yǎng)基的配方和實(shí)施例4相同。4.發(fā)酵罐生產(chǎn)：按照8％的接種量，將種子培養(yǎng)液接入裝有15噸的發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐(儲(chǔ)存量為25噸)中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度29℃，轉(zhuǎn)速150rpm，通風(fēng)比1:1，培養(yǎng)周期120小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后放罐測(cè)定酶活水平。其中發(fā)酵培養(yǎng)基的配方和實(shí)施例4相同。其他步驟同實(shí)施例4中步驟5-7。實(shí)驗(yàn)測(cè)得腺苷酸脫氨酶的酶活水平為1628U/mL。對(duì)比例31.菌種活化：取蜂蜜曲霉孢子懸液甘油管一支，用10ul接種環(huán)挑取一環(huán)，在無(wú)菌環(huán)境中接入200gPDA培養(yǎng)基中，至于29℃環(huán)境中培養(yǎng)3天，并用50ml無(wú)菌水洗脫，得到孢子懸液。2.種子制備：將孢子懸液按照2％接種量接入3.6L種子搖瓶培養(yǎng)基中，置于29℃培養(yǎng)24小時(shí)，得到種子菌液。其中種子搖瓶培養(yǎng)基的配方和實(shí)施例4相同。3.種子罐培養(yǎng)：按照0.05％的接種量，將種子菌液接入到裝有1.2噸種子培養(yǎng)基的種子罐(儲(chǔ)存量為2噸)中培養(yǎng)，得到種子培養(yǎng)液，培養(yǎng)溫度30℃，轉(zhuǎn)速25rpm，通風(fēng)比1：0.2，培養(yǎng)周期35小時(shí)。其中種子培養(yǎng)基的配方和實(shí)施例4相同。4.發(fā)酵罐生產(chǎn)：按照1％的接種量，將種子培養(yǎng)液接入裝有15噸發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐(儲(chǔ)存量為25噸)中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度29℃，轉(zhuǎn)速50rpm，通風(fēng)比1:0.2，培養(yǎng)周期140小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后放罐測(cè)定酶活水平。其中發(fā)酵培養(yǎng)基的配方和實(shí)施例4相同。其他步驟同實(shí)施例4中步驟5-7。實(shí)驗(yàn)測(cè)得腺苷酸脫氨酶的酶活水平為1702U/mL。對(duì)比例41.菌種活化：取蜂蜜曲霉孢子懸液甘油管一支，用10ul接種環(huán)挑取一環(huán)，在無(wú)菌環(huán)境中接入到200gPDA培養(yǎng)基中，至于29℃環(huán)境中培養(yǎng)3天，并用50ml無(wú)菌水洗脫，得到孢子懸液。2.種子制備：將孢子懸液按照2％接種量接入3.6L種子搖瓶培養(yǎng)基中，置于29℃培養(yǎng)24小時(shí)，得到種子菌液。其中種子搖瓶培養(yǎng)基的配方和實(shí)施例4相同。3.種子罐培養(yǎng)：按照0.7％的接種量，將種子菌液接入到裝有1.2噸種子培養(yǎng)基的種子罐(儲(chǔ)存量為2噸)中培養(yǎng)，得到種子培養(yǎng)液，其中培養(yǎng)溫度30℃，轉(zhuǎn)速200rpm，通風(fēng)比1：1.5，培養(yǎng)周期18小時(shí)。其中種子培養(yǎng)基的配方和實(shí)施例4相同。4.發(fā)酵罐生產(chǎn)：按照12％的接種量，將種子培養(yǎng)液接入裝有15噸發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐(儲(chǔ)存量為25噸)中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度29℃，轉(zhuǎn)速250rpm，通風(fēng)比1:1.5，培養(yǎng)周期100小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后放罐測(cè)定酶活水平。其中發(fā)酵培養(yǎng)基的配方和實(shí)施例4相同。其他步驟同實(shí)施例4中步驟5-7。實(shí)驗(yàn)測(cè)得腺苷酸脫氨酶的酶活水平為1803U/mL。對(duì)比例51.菌種活化：取蜂蜜曲霉孢子懸液甘油管一支，用10ul接種環(huán)挑取一環(huán)，在無(wú)菌環(huán)境中接入200gPDA培養(yǎng)基中，至于25℃環(huán)境中培養(yǎng)4天，并用50ml無(wú)菌水洗脫，得到孢子懸液。2.種子制備：將孢子懸液按照2％接種量接入到3.6L種子搖瓶培養(yǎng)基中，置于25℃培養(yǎng)30小時(shí)，得到種子菌液。其中種子搖瓶培養(yǎng)基的配方和實(shí)施例4相同。3.種子罐培養(yǎng)：按照0.3％的接種量，將種子菌液接入到裝有1.2噸種子培養(yǎng)基的種子罐(儲(chǔ)存量為2噸)中培養(yǎng)，得到種子培養(yǎng)液，其中培養(yǎng)溫度25℃，轉(zhuǎn)速100rpm，通風(fēng)比1：1，培養(yǎng)周期35小時(shí)。其中種子培養(yǎng)基的配方和實(shí)施例4相同。4.發(fā)酵罐生產(chǎn)：按照8％的接種量，將種子培養(yǎng)液接入裝有15噸發(fā)酵培 養(yǎng)基的發(fā)酵罐(儲(chǔ)存量為25噸)中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃，轉(zhuǎn)速150rpm，通風(fēng)比1:1，培養(yǎng)周期150小時(shí)，發(fā)酵結(jié)束后放罐測(cè)定酶活水平。其中發(fā)酵培養(yǎng)基的配方和實(shí)施例4相同。其他步驟同實(shí)施例4中步驟5-7。實(shí)驗(yàn)測(cè)得腺苷酸脫氨酶的酶活水平為923U/mL。各實(shí)施例與各對(duì)比例的酶活測(cè)定結(jié)果表明，該蜂蜜曲霉菌株通過(guò)本發(fā)明的生產(chǎn)方法，所產(chǎn)的腺苷酸脫氨酶的酶活水平較高，酶活力達(dá)到2000-3100U/mL，具有大規(guī)模工業(yè)化的應(yīng)用價(jià)值。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3