本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵酶制劑
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種腺苷酸脫氨酶的固態(tài)發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
：高I+G(5′-肌苷酸鈉和5′-鳥(niǎo)核酸鈉)酵母抽提物是在原酵母抽提物的基礎(chǔ)上，強(qiáng)化了產(chǎn)品中呈味核苷酸物質(zhì)含量的酵母抽提物，作為天然、營(yíng)養(yǎng)的高端調(diào)味品可替代味精，具有增鮮、提味和降鹽等作用，符合現(xiàn)代人的飲食消費(fèi)習(xí)慣和營(yíng)養(yǎng)需求趨勢(shì)。酵母抽提物中I+G的含量直接影響著產(chǎn)品的風(fēng)味品質(zhì)和生產(chǎn)成本。在國(guó)內(nèi)的研究中，酵母抽提物中I+G含量在10％左右，而國(guó)外有I+G含量達(dá)到20％的酵母抽提物的專利報(bào)道。我單位通過(guò)增加對(duì)高蛋白高核酸酵母的熱提取時(shí)間和pH的改進(jìn)，在抽提物溶液中酵母RNA由原來(lái)的13％提高到25％以上，再通過(guò)酶解工藝改進(jìn)可以直接生產(chǎn)出18％以上的I+G產(chǎn)品，再對(duì)該產(chǎn)品進(jìn)行超濾，產(chǎn)品各項(xiàng)性能得到明顯改善，產(chǎn)品各項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到歐美高端產(chǎn)品質(zhì)量水平，屬國(guó)內(nèi)首創(chuàng)。高I+G酵母抽提物的生產(chǎn)過(guò)程中，首先使用5′-核苷酸的磷酸二酯酶對(duì)單鏈DNA和RNA進(jìn)行水解，生成腺苷酸(AMP)和鳥(niǎo)苷酸(GMP)，再由5′-腺苷酸脫氨酶進(jìn)行作用，將腺苷酸轉(zhuǎn)化為肌苷酸(IMP)。在高I+G酵母抽提物制備過(guò)程中，5′-腺苷酸脫氨酶起著至關(guān)重要的作用，5′-腺苷酸脫氨酶的酶活力及作用性能直接影響肌苷酸生成及高I+G酵母抽提物的質(zhì)量。因此，獲得高催化活力、高性能的5′-腺苷酸脫氨酶是解決高I+G酵母抽提物生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)之一，具有重要的研究意義和市場(chǎng)價(jià)值。5′-腺苷酸脫氨酶最早由鼠骨骼肌和人紅血細(xì)胞制備，現(xiàn)代化工業(yè)生產(chǎn)中使用的酶大都使用酵母、青霉、曲霉及毛霉等微生物發(fā)酵法制備，其中使用最多的菌種是米曲霉和蜂蜜曲霉，近年日本也有用基因工程鏈霉菌進(jìn)行生產(chǎn)的專 利報(bào)道。采用液態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)脫氨酶，酶的活性不高，穩(wěn)定性差。因此脫氨酶早期采用的是固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)，但是采用該方法得到的固體酶的酶活往往偏低。目前，國(guó)際上只有日本天野酶株式會(huì)社擁有成熟的技術(shù)和產(chǎn)品，國(guó)內(nèi)的廣西科學(xué)院也有產(chǎn)品在試銷，但產(chǎn)品的穩(wěn)定性和應(yīng)用效果還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。目前，國(guó)內(nèi)有關(guān)5′-腺苷酸脫氨酶的研究報(bào)道不多，并且主要仍集中在菌種選育和發(fā)酵條件優(yōu)化方面。劉昌軍等通過(guò)菌種篩選和發(fā)酵工藝優(yōu)化，利用米曲霉固態(tài)發(fā)酵方式獲得5′-腺苷酸脫氨酶的表達(dá)量為1543.48u/g鮮曲；普為民等從多株青霉及曲霉中篩選到一株腺苷酸脫氨酶蜂蜜曲霉產(chǎn)生菌，經(jīng)紫外線及復(fù)合誘變處理及發(fā)酵工藝優(yōu)化后，使原始菌種脫氨酶表達(dá)量提高了16倍，最終得到脫氨酶的表達(dá)量達(dá)到1300u/g；段作營(yíng)等通過(guò)固態(tài)發(fā)酵方式獲得米曲霉脫氨酶的表達(dá)量約1560u/g，并使用鹽析沉淀方法對(duì)該酶進(jìn)行了純化并對(duì)酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究。高I+G酵母抽提物是在原酵母抽提物的基礎(chǔ)上，強(qiáng)化了產(chǎn)品呈味核苷酸物質(zhì)的酵母抽提物。該產(chǎn)品具有調(diào)味、營(yíng)養(yǎng)和輔助醫(yī)療的作用，產(chǎn)品質(zhì)量品質(zhì)更高，可以滿足人們對(duì)調(diào)味原料發(fā)展的需要。5′-腺苷酸脫氨酶可以專一地將腺苷酸(AMP)轉(zhuǎn)變?yōu)榧≤账?IMP)，在高I+G酵母抽提物的工業(yè)化生產(chǎn)中起著重要的作用；通過(guò)曲霉發(fā)酵是獲取腺苷酸脫氨酶的主要途徑，由于大多數(shù)菌種產(chǎn)酶活力低下，專一性不強(qiáng)，造成市場(chǎng)上腺苷酸脫氨酶供應(yīng)緊缺，提高菌種腺苷酸脫氨酶的產(chǎn)酶活力是解決高I+G酵母抽提物生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)之一，具有重要的研究意義和市場(chǎng)價(jià)值。目前市場(chǎng)上以日本天野酶制劑公司的腺苷酸脫氨酶為主要生產(chǎn)商，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)腺苷酸脫氨酶的廠家較少，該產(chǎn)品市場(chǎng)開(kāi)發(fā)潛力大。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是現(xiàn)有的大多數(shù)菌種發(fā)酵產(chǎn)腺苷酸脫氨酶存在的活力低下，專一性不強(qiáng)，生產(chǎn)成本高的缺陷。具體來(lái)說(shuō)，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案：本發(fā)明提供了一種腺苷酸脫氨酶的固態(tài)發(fā)酵方法，包括如下步驟：(1)菌種活化：取曲霉孢子懸液接入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，洗脫得到孢子懸液；(2)種子制備：將孢子懸液按照1％～2.5％重量比的接種量接入種子搖瓶 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到種子菌液；(3)種子罐培養(yǎng)：按照0.1％～0.5％重量比的接種量，將種子菌液接入裝有種子培養(yǎng)基的種子罐中培養(yǎng)，得到種子培養(yǎng)液，其中轉(zhuǎn)速為50～150rpm，通風(fēng)比1：0.3～1：1.2；以及(4)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)：將種子培養(yǎng)液接入到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。優(yōu)選的，步驟(1)中所述培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。優(yōu)選的，步驟(1)中所述菌種置于28～29℃環(huán)境中培養(yǎng)2～4天。優(yōu)選的，步驟(2)中所述的孢子懸液置于28～29℃培養(yǎng)20～24小時(shí)。優(yōu)選的，步驟(3)中所述的種子罐培養(yǎng)是在29～31℃溫度下，培養(yǎng)24～28小時(shí)。優(yōu)選的，步驟(4)中所述的固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)溫度為26～30℃，發(fā)酵時(shí)間為50～70小時(shí)。優(yōu)選的，對(duì)步驟(4)中固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)盤(pán)間品溫進(jìn)行控制，包括如下步驟：最高溫超過(guò)35℃，最低溫低于25℃時(shí)，進(jìn)行上下倒盤(pán)，品溫高的盤(pán)移至散熱快的風(fēng)口或移至底層，品溫低的移至上層或遠(yuǎn)離風(fēng)口。優(yōu)選的，將步驟(4)得到的含有腺苷酸脫氨酶的發(fā)酵料進(jìn)行浸提處理，得到發(fā)酵液。優(yōu)選的，將發(fā)酵料加入到相當(dāng)于發(fā)酵料20～30倍體積的浸提液中，攪拌1～2h，待固體發(fā)酵料充分打散后，再浸泡5～6h。優(yōu)選的，調(diào)節(jié)自來(lái)水pH至5.2～7，加入0.02～0.1％(w/v)EDTA2Na和0.1～0.5％(w/v)焦亞硫酸鈉得到所述的浸提液。優(yōu)選的，對(duì)得到的發(fā)酵液采用板框過(guò)濾得到粗酶過(guò)濾液。優(yōu)選的，對(duì)所述的粗酶過(guò)濾液進(jìn)行超濾濃縮，濃縮倍數(shù)為10～20倍，得到濃縮液。優(yōu)選的，對(duì)所述的濃縮液通過(guò)凍干得到固體脫氨酶。優(yōu)選的，步驟(3)中所述的種子培養(yǎng)基，每1000mL水包括如下組分：蔗糖10～50g，黃豆粉1～7g，酵母粉1～3g和磷酸氫二鉀0.5～1.5g，pH值為6～7.5。優(yōu)選的，步驟(4)中所述的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，按重量份計(jì)，包括如下組分：麩皮100份、水90～150份、蔗糖1～4份、蛋白胨1～4份、硫酸銨0.1～0.8 份、硫酸鎂0.1～0.8份、檸檬酸鈉0.1～0.8份、吐溫-800.1～0.8份，pH值為6～7.5。其中，步驟(1)中所述菌株為米曲霉(Aspergillusoryzae)，商購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，也就是說(shuō)商購(gòu)自保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCCAF200035的菌株。其保藏地址為武漢市珞珈山武漢大學(xué)，該菌株來(lái)源于武漢大學(xué)生科院教研室，收藏時(shí)間為2007-12-33。該菌株的共享方式分為公益性共享，合作研究共享，資源交換性共享；其獲取途徑包括郵件，現(xiàn)場(chǎng)獲取，網(wǎng)上訂購(gòu)。其中，通風(fēng)比用每分鐘內(nèi)通過(guò)單位體積培養(yǎng)液的空氣體積比來(lái)表示。(V/V.min)。本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明通過(guò)該生產(chǎn)方法，解決了目前脫氨酶發(fā)酵酶活低，生產(chǎn)成本高的問(wèn)題，從而提高了產(chǎn)量，實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。腺苷酸脫氨酶目前工業(yè)用量最大的為高I+G酵母抽提物行業(yè)，由于行業(yè)所限，使得與大宗酶(如糖化酶和淀粉酶等)相比，國(guó)內(nèi)科研院所對(duì)腺苷酸脫氨酶的研究相對(duì)較少，僅有少量研究報(bào)道，致使腺苷酸脫氨酶的發(fā)展極為緩慢，尚無(wú)成熟的自主商業(yè)產(chǎn)品。目前國(guó)內(nèi)高I+G酵母抽提物生產(chǎn)中使用的腺苷酸脫氨酶幾乎全部為日本進(jìn)口產(chǎn)品，這使得我國(guó)高I+G酵母抽提物生產(chǎn)中所使用的關(guān)鍵酶制劑為人所控，也使得我國(guó)高I+G酵母抽提物行業(yè)的發(fā)展為人所制。因此，從特種酶制劑和快速發(fā)展的高I+G酵母抽提物兩種行業(yè)的久遠(yuǎn)發(fā)展來(lái)看，自主開(kāi)發(fā)腺苷酸脫氨酶生產(chǎn)技術(shù)，均具有重要的現(xiàn)實(shí)和戰(zhàn)略意義。具體實(shí)施方式本發(fā)明為了克服現(xiàn)有技術(shù)中采用曲霉發(fā)酵法生產(chǎn)脫氨酶的方法存在生產(chǎn)成本高、脫氨酶的酶活力低，因而產(chǎn)量低的缺陷，通過(guò)發(fā)酵法制備得到脫氨酶成品，可用于5′-腺苷酸水解脫氨生成次黃嘌呤核酸-5′-磷酸。具體的，本發(fā)明提供了一種腺苷酸脫氨酶的固態(tài)發(fā)酵方法，包括如下步驟：(1)菌種活化：取曲霉孢子懸液接入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，洗脫得到孢子懸液；(2)種子制備：將孢子懸液按照1％～2.5％重量比的接種量接入種子搖瓶 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到種子菌液；(3)種子罐培養(yǎng)：按照0.1％～0.5％重量比的接種量，將種子菌液接入裝有種子培養(yǎng)基的種子罐中培養(yǎng)，得到種子培養(yǎng)液，其中轉(zhuǎn)速為50～150rpm，通風(fēng)比1：0.3～1：1.2；以及(4)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)：將種子培養(yǎng)液接入到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。下面通過(guò)具體實(shí)施例來(lái)闡述本發(fā)明的實(shí)施過(guò)程和技術(shù)效果，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是，這不應(yīng)被理解為對(duì)本發(fā)明權(quán)利要求范圍的限制，同時(shí)需要注意的是，本發(fā)明中提到的接種量均為重量比。其中，實(shí)施例和對(duì)比例中所用到的菌株為米曲霉(Aspergillusoryzae)，商購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，菌株保藏編號(hào)為CCTCCAF200035。其中，實(shí)施例中所用PDA培養(yǎng)基的配方為：每1000ml水中，含土豆(去皮)200g，葡萄糖20g和瓊脂20g，pH自然。其中，本發(fā)明所用到的各種培養(yǎng)基以及各種容器均經(jīng)過(guò)高壓蒸汽滅菌處理。實(shí)施例中所用的具體試劑和設(shè)備均是商購(gòu)的。其中試劑的具體來(lái)源列于下面的表1中：表1實(shí)施例及對(duì)比例中用到的各試劑及廠商試劑/設(shè)備純度生產(chǎn)廠商蔗糖工業(yè)級(jí)蘇州華航化工科技有限公司黃豆粉工業(yè)級(jí)興化市聯(lián)富食品有限公司酵母粉工業(yè)級(jí)安琪酵母股份有限公司磷酸氫二鉀工業(yè)級(jí)蘇州華航化工科技有限公司麩皮工業(yè)級(jí)徐州市北斗星面業(yè)有限公司蛋白胨工業(yè)級(jí)衡水中裕膠業(yè)有限公司硫酸銨工業(yè)級(jí)蘇州華航化工科技有限公司硫酸鎂工業(yè)級(jí)鄒平縣潤(rùn)梓化工有限公司檸檬酸鈉工業(yè)級(jí)蘇州華航化工科技有限公司吐溫-80工業(yè)級(jí)濟(jì)南騰博化工有限公司設(shè)備生產(chǎn)廠商如下：凍干設(shè)備，上海東富龍科技股份有限公司；噴粉設(shè)備，常州市益民干燥設(shè)備有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋，重慶市科發(fā)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；超濾濃縮設(shè)備，西安濱潤(rùn)環(huán)?？萍加邢薰?；混料機(jī)，東莞市配角機(jī)械設(shè)備有限公司。腺苷酸脫氨酶酶活測(cè)定方法如下：1)移取3mL腺苷酸脫氨酶底物(3.475×10-2g/L)在37℃溫度下保溫5min，加入稀釋后的AMP脫氨酶溶液0.1mL，立刻計(jì)時(shí)反應(yīng)，反應(yīng)15min后加入3mL10％的高氯酸溶液終止反應(yīng)。2)對(duì)照樣品處理方法同上，反應(yīng)底物保溫后用冰水預(yù)冷，加入3mL10％的高氯酸溶液終止反應(yīng)，再加入0.1mL的樣品。反應(yīng)結(jié)束后，在265nm處，用石英比色皿，以水為參比測(cè)量吸光度。酶活定義：在上述條件下每分鐘吸光值改變0.001，定義為酶的活力單位。液體酶活(U/mL)＝(△A265×10×K)/(0.001×T)式中：△A265為空白對(duì)照與反應(yīng)液吸光度的差值；K為酶液稀釋倍數(shù)；T為酶的反應(yīng)時(shí)間(min)。實(shí)施例11.菌種活化：取米曲霉孢子懸液甘油管一支，用10ul接種環(huán)挑取一環(huán)，在無(wú)菌環(huán)境下接入到100gPDA培養(yǎng)基中，置于28℃環(huán)境中培養(yǎng)4天，并用50ml無(wú)菌水洗脫，得到孢子懸液。2.種子制備：將孢子懸液按照1％接種量接入3L種子搖瓶培養(yǎng)基中，置于28℃培養(yǎng)24小時(shí)得到種子菌液，其中種子搖瓶培養(yǎng)基的配方同步驟3中種子培養(yǎng)基的配方。3.種子罐培養(yǎng)：按照0.1％的接種量，將種子菌液接入到裝有300L種子培養(yǎng)基的種子罐(儲(chǔ)存量為0.5噸)中培養(yǎng)，得到種子培養(yǎng)液，其中培養(yǎng)溫度29℃，轉(zhuǎn)速50rpm，通風(fēng)比1：0.3，培養(yǎng)周期28小時(shí)。其中種子培養(yǎng)基中各組分濃度如下：蔗糖10g/L，黃豆粉7g/L，酵母粉1g/L，磷酸氫二鉀0.5g/L， pH6，其余組分為水。4.固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)：由接種管線將種子培養(yǎng)液接入到1.5噸固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻，在26℃條件下培養(yǎng)70小時(shí)結(jié)束。其中固體發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分的重量配比如下：麩皮100份、水90份、蔗糖1份、蛋白胨1份、硫酸銨0.1份、硫酸鎂0.1份、檸檬酸鈉0.1份、吐溫-800.1份，pH值為6。將固體發(fā)酵培養(yǎng)基按照配方配制完成后，在混料機(jī)中進(jìn)行拌料，拌料完成后在121℃條件下進(jìn)行高壓蒸汽滅菌50min。發(fā)酵期間控制品溫：當(dāng)盤(pán)間品溫出現(xiàn)溫差，最高溫超過(guò)35℃，最低溫低于25℃時(shí)，及時(shí)進(jìn)行上下倒盤(pán)，品溫高的盤(pán)移至散熱快的風(fēng)口，品溫低的遠(yuǎn)離風(fēng)口。5.浸提：用檸檬酸調(diào)節(jié)自來(lái)水pH至5.2，加入0.02％(w/v)EDTA2Na和0.1％(w/v)焦亞硫酸鈉并溶解充分得到浸提液。將發(fā)酵料投入到含有20倍浸提液的浸提罐中，攪拌1h，待固體發(fā)酵料充分打散，再浸泡5h。取含有腺苷酸脫氨酶的浸提液適量，測(cè)定酶活力。6.板框處理：采用板框過(guò)濾除去菌體和固體發(fā)酵渣。7.超濾濃縮：將粗酶過(guò)濾液通過(guò)超濾濃縮設(shè)備進(jìn)行濃縮，濃縮倍數(shù)控制在20倍。8.凍干處理：利用凍干設(shè)備冷凍干燥處理得到固體脫氨酶。實(shí)驗(yàn)測(cè)得浸提液中腺苷酸脫氨酶的酶活水平為1582U/mL。實(shí)施例21.菌種活化：取米曲霉孢子懸液甘油管一支，用10ul接種環(huán)挑取一環(huán)，在無(wú)菌環(huán)境下接入到100gPDA培養(yǎng)基中，置于29℃環(huán)境中培養(yǎng)2天，并用50ml無(wú)菌水洗脫，得到孢子懸液。2.種子制備：該孢子懸液按照2.5％接種量接入到7.5L種子搖瓶培養(yǎng)基中，置于29℃培養(yǎng)20小時(shí)得到種子菌液，其中種子搖瓶培養(yǎng)基的配方同步驟3中種子培養(yǎng)基的配方。3.種子罐培養(yǎng)：按照0.5％的接種量，將種子菌液接入到裝有300L種子培養(yǎng)基的種子罐(儲(chǔ)存量為0.5噸)中培養(yǎng)得到種子培養(yǎng)液，培養(yǎng)溫度31℃，轉(zhuǎn)速150rpm，通風(fēng)比1：1.2，培養(yǎng)周期24小時(shí)。其中種子培養(yǎng)基各組分濃度 如下：蔗糖50g/L，黃豆粉1g/L，酵母粉3g/L，磷酸氫二鉀1.5g/L，pH7.5，其余組分為水。4.固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)：由接種管線將種子培養(yǎng)液接入到1.5噸固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻，在30℃條件下，發(fā)酵50小時(shí)結(jié)束。其中固體發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分的重量配比如下：麩皮100份、水150份、蔗糖4份、蛋白胨4份、硫酸銨0.8份、硫酸鎂0.8份、檸檬酸鈉0.8份、吐溫-800.8份，pH值為7.5。將固體發(fā)酵培養(yǎng)基按照配方配制完成后，在混料機(jī)中進(jìn)行拌料，拌料完成后在121℃條件下進(jìn)行高壓蒸汽滅菌50min。發(fā)酵期間控制品溫：當(dāng)盤(pán)間品溫出現(xiàn)溫差，最高溫超過(guò)35℃，最低溫低于25℃時(shí)，及時(shí)進(jìn)行上下倒盤(pán)，品溫高的盤(pán)移至散熱快的底層，品溫低的移至上層。5.浸提：用檸檬酸調(diào)節(jié)自來(lái)水pH至7，加入0.1％(w/v)EDTA2Na和0.5％(w/v)焦亞硫酸鈉并溶解充分得到浸提液。將發(fā)酵料投入到含有30倍浸提液的浸提罐中，攪拌2h，待固體發(fā)酵料充分打散，再浸泡6h。取含有腺苷酸脫氨酶的浸提液適量，測(cè)定酶活力。6.板框處理：采用板框過(guò)濾除去菌體和固體發(fā)酵渣。7.超濾濃縮：將粗酶過(guò)濾液通過(guò)超濾濃縮設(shè)備進(jìn)行濃縮，濃縮倍數(shù)控制在10倍。8.噴粉處理：利用噴粉設(shè)備處理得到固體脫氨酶。實(shí)驗(yàn)測(cè)得浸提液中腺苷酸脫氨酶的酶活水平為1620U/mL。實(shí)施例31.菌種活化：取米曲霉孢子懸液甘油管一支，用10ul接種環(huán)挑取一環(huán)，在無(wú)菌環(huán)境下接入100gPDA培養(yǎng)基中，置于28℃環(huán)境中培養(yǎng)3天，并用50ml的無(wú)菌水洗脫，得到孢子懸液。2.種子制備：將孢子懸液按照2％接種量接入到6L種子搖瓶培養(yǎng)基中，置于28℃培養(yǎng)22小時(shí)得到種子菌液，其中種子搖瓶培養(yǎng)基的配方同步驟3中種子培養(yǎng)基的配方。3.種子罐培養(yǎng)：按照0.3％的接種量，將種子菌液接入到裝有300L種子培養(yǎng)基的種子罐(儲(chǔ)存量為0.5噸)中培養(yǎng)得到種子培養(yǎng)液，培養(yǎng)溫度30℃， 轉(zhuǎn)速100rpm，通風(fēng)比1：1，培養(yǎng)周期26小時(shí)。其中種子培養(yǎng)基中各組分的濃度如下：蔗糖30g/L，黃豆粉4g/L，酵母粉2g/L，磷酸氫二鉀1g/L，pH7，其余組分為水。4.固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)：由接種管線將種子培養(yǎng)液接入到1.5噸固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻，在28℃條件下，發(fā)酵培養(yǎng)60小時(shí)結(jié)束。其中固體發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分的重量配比如下：麩皮100份、水120份、蔗糖2.5份、蛋白胨2.5份、硫酸銨0.5份、硫酸鎂0.5份、檸檬酸鈉0.5份、吐溫-800.5份，pH值為7。將固體發(fā)酵培養(yǎng)基按照配方配制完成后，在混料機(jī)中進(jìn)行拌料，拌料完成后在121℃條件下進(jìn)行高壓蒸汽滅菌50min。發(fā)酵期間控制品溫：當(dāng)盤(pán)間品溫出現(xiàn)溫差，最高溫超過(guò)35℃，最低溫低于25℃時(shí)，及時(shí)進(jìn)行上下倒盤(pán)，品溫高的盤(pán)移至散熱快的風(fēng)口，品溫低的遠(yuǎn)離風(fēng)口。5.浸提：用檸檬酸調(diào)節(jié)自來(lái)水pH至6，加入0.05％(w/v)EDTA2Na和0.3％(w/v)焦亞硫酸鈉并溶解充分得到浸提液。將發(fā)酵料投入到含有25倍浸提液的浸提罐中，攪拌1.5h，待固體發(fā)酵料充分打散，再浸泡5.5h。取含有腺苷酸脫氨酶的浸提液適量，測(cè)定酶活力。6.板框處理：采用板框過(guò)濾除去菌體和固體發(fā)酵渣。7.超濾濃縮：將粗酶過(guò)濾液通過(guò)超濾濃縮設(shè)備進(jìn)行濃縮，濃縮倍數(shù)控制在15倍。8.凍干處理：利用凍干設(shè)備進(jìn)行冷凍干燥處理得到固體脫氨酶。實(shí)驗(yàn)測(cè)得浸提液中腺苷酸脫氨酶的酶活水平為2021U/mL。對(duì)比例11.菌種活化：取米曲霉孢子懸液甘油管一支，用10ul接種環(huán)挑取一環(huán)，在無(wú)菌環(huán)境下接入100gPDA培養(yǎng)基中，置于28℃環(huán)境中培養(yǎng)3天，并用50ml無(wú)菌水洗脫，得到孢子懸液。2.種子制備：將孢子懸液按照0.5％接種量接入到1.5L種子搖瓶培養(yǎng)基中，置于28℃培養(yǎng)30小時(shí)得到種子菌液，其中種子搖瓶培養(yǎng)基的配方同實(shí)施例3。3.種子罐培養(yǎng)：按照0.3％的接種量，將種子菌液接入到裝有300L種子培養(yǎng)基的種子罐(儲(chǔ)存量為0.5噸)中培養(yǎng)得到種子培養(yǎng)液，培養(yǎng)溫度30℃， 轉(zhuǎn)速100rpm，通風(fēng)比1：1，培養(yǎng)周期26小時(shí)。其中種子培養(yǎng)基的配方同實(shí)施例3。4.固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)：由接種管線將種子培養(yǎng)液接入1.5噸固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻，在28℃條件下，發(fā)酵60小時(shí)結(jié)束。其中固體發(fā)酵培養(yǎng)基的配方和配制以及品溫控制的操作和實(shí)施例3相同。其他步驟和實(shí)施例3中的步驟5-8相同。實(shí)驗(yàn)測(cè)得浸提液中腺苷酸脫氨酶的酶活水平為1300U/mL。對(duì)比例21.菌種活化：取米曲霉孢子懸液甘油管一支，用10ul接種環(huán)挑取一環(huán)，在無(wú)菌環(huán)境下接入到100gPDA培養(yǎng)基中，置于28℃環(huán)境中培養(yǎng)3天，并用50ml無(wú)菌水洗脫，得到孢子懸液。2.種子制備：將孢子懸液按照3％接種量接入9L種子搖瓶培養(yǎng)基中，置于28℃培養(yǎng)15小時(shí)得到種子菌液，其中種子搖瓶培養(yǎng)基的配方同實(shí)施例3。3.種子罐培養(yǎng)：按照0.3％的接種量，將種子菌液接入到裝有300L種子培養(yǎng)基的種子罐(儲(chǔ)存量為0.5噸)中培養(yǎng)得到種子培養(yǎng)液，培養(yǎng)溫度30℃，轉(zhuǎn)速100rpm，通風(fēng)比1：1，培養(yǎng)周期26小時(shí)。其中種子培養(yǎng)基的配方同實(shí)施例3。4.固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)：由接種管線將種子培養(yǎng)液接入1.5噸固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻，在28℃條件下，發(fā)酵60小時(shí)結(jié)束。其中固體發(fā)酵培養(yǎng)基的配方和配制以及品溫控制的操作和實(shí)施例3相同。其他步驟和實(shí)施例3中的步驟5-8相同。實(shí)驗(yàn)測(cè)得浸提液中腺苷酸脫氨酶的酶活水平為1329U/mL。對(duì)比例31.菌種活化：取米曲霉孢子懸液甘油管一支，用10ul接種環(huán)挑取一環(huán)，在無(wú)菌環(huán)境下接入到100gPDA培養(yǎng)基中，置于28℃環(huán)境中培養(yǎng)3天，并用50ml無(wú)菌水洗脫，得到孢子懸液。2.種子制備：將孢子懸液按照2％接種量接入到6L種子搖瓶培養(yǎng)基中， 置于28℃培養(yǎng)22小時(shí)得到種子菌液，其中種子搖瓶培養(yǎng)基的配方同實(shí)施例3。3.種子罐培養(yǎng)：按照0.05％的接種量，將種子菌液接入到裝有300L種子培養(yǎng)基的種子罐(儲(chǔ)存量為0.5噸)中培養(yǎng)得到種子培養(yǎng)液，培養(yǎng)溫度30℃，轉(zhuǎn)速25rpm，通風(fēng)比1：0.2，培養(yǎng)周期35小時(shí)。其中種子培養(yǎng)基的配方同實(shí)施例3。4.固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)：由接種管線將種子培養(yǎng)液接入到1.5噸固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻，在28℃條件下，發(fā)酵80小時(shí)結(jié)束。其中固體發(fā)酵培養(yǎng)基的配方和配制以及品溫控制的操作和實(shí)施例3相同。其他步驟和實(shí)施例3中的步驟5-8相同。實(shí)驗(yàn)測(cè)得浸提液中腺苷酸脫氨酶(鮮曲)的酶活水平為1382U/mL。對(duì)比例41.菌種活化：取米曲霉孢子懸液甘油管一支，用10ul接種環(huán)挑取一環(huán)，在無(wú)菌環(huán)境下接入到100gPDA培養(yǎng)基中，置于28℃環(huán)境中培養(yǎng)3天，并用50ml無(wú)菌水洗脫，得到孢子懸液。2.種子制備：將孢子懸液按照2％接種量接入到6L種子搖瓶培養(yǎng)基中，置于28℃培養(yǎng)22小時(shí)得到種子菌液，其中種子搖瓶培養(yǎng)基的配方同實(shí)施例3。3.種子罐培養(yǎng)：按照0.7％的接種量，將種子菌液接入到裝有300L種子培養(yǎng)基的種子罐(儲(chǔ)存量為0.5噸)中培養(yǎng)得到種子培養(yǎng)液，培養(yǎng)溫度30℃，轉(zhuǎn)速200rpm，通風(fēng)比1：1.5，培養(yǎng)周期18小時(shí)。其中種子培養(yǎng)基的配方同實(shí)施例3。4.固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)：由接種管線將種子培養(yǎng)液接入1.5噸固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻，在28℃條件下，發(fā)酵40小時(shí)結(jié)束。其中固體發(fā)酵培養(yǎng)基的配方和配制以及品溫控制的操作和實(shí)施例3相同。其他步驟和實(shí)施例3中的步驟5-8相同。實(shí)驗(yàn)測(cè)得浸提液中腺苷酸脫氨酶的酶活水平為1473U/mL。對(duì)比例51.菌種活化：取米曲霉孢子懸液甘油管一支，用10ul接種環(huán)挑取一環(huán)， 在無(wú)菌環(huán)境下接入到100gPDA培養(yǎng)基中，置于25℃環(huán)境中培養(yǎng)4天，并用50ml無(wú)菌水洗脫，得到孢子懸液。2.種子制備：將孢子懸液按照2％接種量接入6L種子搖瓶培養(yǎng)基中，置于25℃溫度下培養(yǎng)30小時(shí)得到種子菌液，其中種子搖瓶培養(yǎng)基的配方同實(shí)施例3。3.種子罐培養(yǎng)：按照0.3％的接種量，將種子菌液接入到裝有300L種子培養(yǎng)基的種子罐(儲(chǔ)存量為0.5噸)中培養(yǎng)，得到種子培養(yǎng)液，培養(yǎng)溫度25℃，轉(zhuǎn)速100rpm，通風(fēng)比1：1，培養(yǎng)周期35小時(shí)。其中種子培養(yǎng)基的配方同實(shí)施例3。4.固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)：由接種管線將種子培養(yǎng)液接入1.5噸固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻，在25℃條件下，發(fā)酵80小時(shí)結(jié)束。其中固體發(fā)酵培養(yǎng)基的配方和配制以及品溫控制的操作和實(shí)施例3相同。其他步驟和實(shí)施例3中的步驟5-8相同。實(shí)驗(yàn)測(cè)得浸提液中腺苷酸脫氨酶的酶活水平為1223U/mL。各實(shí)施例與各對(duì)比例的酶活測(cè)定結(jié)果表明，該米曲霉菌株通過(guò)該生產(chǎn)方法，所產(chǎn)的腺苷酸脫氨酶的酶活水平較高，酶活力達(dá)到1500～2100U/mL，具有大規(guī)模工業(yè)化的應(yīng)用價(jià)值。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3