本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因載體及制備方法，更具體地說(shuō)，涉及一種具有pH敏感性的改性殼聚糖轉(zhuǎn)基因載體及其制備方法。

背景技術(shù)：

基因治療，是指通過(guò)一定的外源方式將人類的正?；蚧蛘呔哂幸欢ㄖ委熥饔玫幕蚱螌?dǎo)入人類的正常細(xì)胞，借以糾正所產(chǎn)生疾病的基因缺陷或者發(fā)揮治療作用的一種新興技術(shù)。所以開發(fā)及選擇合適的基因載體，能夠高效地將基因片段遞送到病灶位置，并且使基因能夠高效表達(dá)，成為基因治療技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在近幾十年的發(fā)展中，主要出現(xiàn)了兩種類型的基因載體：病毒載體和非病毒載體。病毒載體由于其獨(dú)特的細(xì)胞感染機(jī)制及自我復(fù)制的能力，能夠取得很高的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率，得到很好的治療效果。然而由于病毒載體的攜帶能力低、導(dǎo)向性差、潛在致癌性和免疫原性等缺點(diǎn)，限制了其在臨床治療中的應(yīng)用。非病毒載體具有低毒性、低致癌性、低免疫原性、攜帶目的基因能力高和易制備等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)取得了巨大的研究進(jìn)展。非病毒載體主要包括裸DNA，脂質(zhì)體，陽(yáng)離子高聚物等。其中陽(yáng)離子高聚物由于來(lái)源廣泛，制備簡(jiǎn)單且多樣化，近年來(lái)廣受研究者青睞，已發(fā)展成為非病毒基因載體中最大的一類。但是陽(yáng)離子高聚物作為基因載體應(yīng)用時(shí)，仍呈現(xiàn)出了一些問(wèn)題，例如生物相容性差、有毒性、生物降解性低以及轉(zhuǎn)染效率低等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種生物相容性好、毒性小、轉(zhuǎn)染效率高的陽(yáng)離子高聚物作為非病毒型轉(zhuǎn)基因載體進(jìn)行使用。

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種制備上述陽(yáng)離子高聚物的方法。

本發(fā)明的目的還在于提供一種上述陽(yáng)離子高聚物的應(yīng)用，作為轉(zhuǎn)基因載體的應(yīng)用。

本發(fā)明的上述目的通過(guò)下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

改性殼聚糖轉(zhuǎn)基因載體，作為陽(yáng)離子高聚物，當(dāng)作轉(zhuǎn)基因載體進(jìn)行使用。

改性殼聚糖轉(zhuǎn)基因載體，將胍基丁胺和二甲基馬來(lái)酸酐分別接枝在殼聚糖大分子主鏈上形成同時(shí)帶有正負(fù)電荷的生物大分子，分子結(jié)構(gòu)如下式所示：

以殼聚糖分子為主鏈，在殼聚糖的氨基上接枝二甲基馬來(lái)酸酐，在殼聚糖的羥甲基上接枝胍基丁胺。

上述改性殼聚糖的數(shù)均分子量為12—20萬(wàn)。

上述改性殼聚糖中，二甲基馬來(lái)酸酐的取代度為90—95％，胍基丁胺的取代度為9％—14％。

一種制備改性殼聚糖轉(zhuǎn)基因載體的方法，首先將二甲基馬來(lái)酸酐接枝在殼聚糖的氨基上，生成二甲基馬來(lái)酸酐修飾的殼聚糖；其次用對(duì)甲苯磺酰氯對(duì)二甲基馬來(lái)酸酐修飾的殼聚糖的羥甲基位置進(jìn)行改性，生成二甲基馬來(lái)酸酐修飾的對(duì)甲苯磺酰基殼聚糖；最后將二甲基馬來(lái)酸酐修飾的對(duì)甲苯磺?；鶜ぞ厶桥c胍基丁胺反應(yīng)，生成二甲基馬來(lái)酸酐與胍基丁胺共同修飾的殼聚糖，具體制備步驟如下：

步驟1，將二甲基馬來(lái)酸酐接枝在殼聚糖的氨基上，得到二甲基馬來(lái)酸酐修飾的殼聚糖；

將二甲基馬來(lái)酸酐溶于N,N-二甲基甲酰胺與水的混合溶劑中，向其中加入殼聚糖，混合均勻后，在惰性氣氛中，反應(yīng)溫度100—150℃，反應(yīng)時(shí)間3—5小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物冷卻至室溫，用乙醇沉淀并洗滌三次，最后經(jīng)真空干燥即可得到二甲基馬來(lái)酸酐修飾的殼聚糖；

在步驟1中，為保證二甲基馬來(lái)酸酐對(duì)殼聚糖氨基的取代度足夠高，殼聚糖糖環(huán)結(jié) 構(gòu)單元與二甲基馬來(lái)酸酐的摩爾比為1：(1—4)，優(yōu)選1：(2—3)；N,N-二甲基甲酰胺與水的混合溶劑中，水和N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1：(20—25)，優(yōu)選1：(22—24)；為確保反應(yīng)順利進(jìn)行，反應(yīng)需在無(wú)氧條件下進(jìn)行，通過(guò)通入惰性氣體(如氮?dú)?、氦氣、氬?來(lái)實(shí)現(xiàn)。

在步驟1中，在反應(yīng)過(guò)程中進(jìn)行持續(xù)攪拌，以實(shí)現(xiàn)體系的均勻混合，例如150—300轉(zhuǎn)/min。

步驟2，對(duì)甲苯磺酰氯對(duì)二甲基馬來(lái)酸酐修飾的殼聚糖的羥甲基位置進(jìn)行改性，得到二甲基馬來(lái)酸酐修飾的對(duì)甲苯磺?；鶜ぞ厶?；

將步驟1制備的二甲基馬來(lái)酸酐修飾的殼聚糖溶于1M的氫氧化鈉水溶液中，放置到冰水浴中攪拌均勻，然后將對(duì)甲苯磺酰氯溶于乙腈，滴加到二甲基馬來(lái)酸酐修飾殼聚糖的氫氧化鈉水溶液中，冰水浴攪拌反應(yīng)至少2小時(shí)后轉(zhuǎn)到室溫20—25攝氏度繼續(xù)反應(yīng)至少3小時(shí)。

在步驟2中，殼聚糖糖環(huán)結(jié)構(gòu)單元與對(duì)甲苯磺酰氯的摩爾比為1：(6—20)，優(yōu)選1：(8—15)；在反應(yīng)過(guò)程中進(jìn)行持續(xù)攪拌，以實(shí)現(xiàn)體系的均勻混合，例如150—300轉(zhuǎn)/min；滴加速度為1—5ml/min；反應(yīng)一開始進(jìn)行2—4小時(shí)的冰水浴反應(yīng)，而后升溫至20—25攝氏度繼續(xù)反應(yīng)4—5小時(shí)。反應(yīng)完畢后，為了避免產(chǎn)物的變性用乙醇沉淀并洗滌三次，然后用磷酸鹽緩沖液(pH＝7.4)洗滌直至中性，最后經(jīng)真空干燥即可得到二甲基馬來(lái)酸酐修飾的對(duì)甲苯磺?；鶜ぞ厶恰?/p>

步驟3，將二甲基馬來(lái)酸酐修飾的對(duì)甲苯磺?；鶜ぞ厶桥c胍基丁胺反應(yīng)，生成二甲基馬來(lái)酸酐與胍基丁胺共同修飾的殼聚糖；

將步驟2制備的二甲基馬來(lái)酸酐修飾的對(duì)甲苯磺?；鶜ぞ厶桥c胍基丁胺溶于混合溶劑中，攪拌均勻后在惰性氣氛中，80—90℃攪拌反應(yīng)至少24小時(shí)；所述混合溶劑由0.2M氫氧化鈉水溶液和三乙醇胺組成的混合溶劑，0.2M氫氧化鈉水溶液和三乙醇胺的體積比為(1—2)：1，優(yōu)選(1.5—2)：1。

在步驟3中，殼聚糖糖環(huán)結(jié)構(gòu)單元與胍基丁胺的摩爾比為1：(6—20)，優(yōu)選1：(8—15)；在步驟3中，在反應(yīng)過(guò)程中進(jìn)行持續(xù)攪拌，以實(shí)現(xiàn)體系的均勻混合，例如150—300轉(zhuǎn)/min。

在步驟3中，為了避免產(chǎn)物的變性，將最終的反應(yīng)液置于截留分子量為3500的透析袋中用磷酸鹽緩沖液(pH＝7.4)透析5天，凍干即得二甲基馬來(lái)酸酐與胍基丁胺共同修 飾的殼聚糖。

在步驟3中，為確保反應(yīng)順利進(jìn)行，反應(yīng)需在無(wú)氧條件下進(jìn)行，通過(guò)通入惰性氣體(如氮?dú)?、氦氣、氬?來(lái)實(shí)現(xiàn)。

在步驟3中，優(yōu)選在80—90℃攪拌反應(yīng)24—48小時(shí)。

在本發(fā)明的技術(shù)方案中，殼聚糖糖環(huán)結(jié)構(gòu)單元是指如上述分子式中，殼聚糖主鏈上的六元糖的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，即由五個(gè)碳和一個(gè)氧組成的糖環(huán)。

利用500MHz高分辨超導(dǎo)核磁共振儀Varian UNITY plus-500對(duì)原料、中間產(chǎn)物和最終樣品進(jìn)行檢測(cè)，得到氫譜，結(jié)果如附圖1、3、4所示。由附圖4可以看出，化學(xué)位移1.70處的峰值對(duì)應(yīng)化學(xué)基團(tuán)-C(CH₃)＝C(CH₃)-中的氫原子，而由附圖3所示殼聚糖在此化學(xué)位移處并沒(méi)有出現(xiàn)峰，說(shuō)明二甲基馬來(lái)酸酐修飾成功。從附圖1可以看出，化學(xué)位移1.72處的峰值對(duì)應(yīng)化學(xué)基團(tuán)-C(CH₃)＝C(CH₃)-中的氫原子，說(shuō)明二甲基馬來(lái)酸酐修飾成功?；瘜W(xué)位移3.04、2.83、1.42三處的峰值分別對(duì)應(yīng)胍基丁胺中處于三種化學(xué)環(huán)境的氫原子，說(shuō)明胍基丁胺修飾成功，更進(jìn)一步說(shuō)明二甲基馬來(lái)酸酐與胍基丁胺共同修飾的殼聚糖制備成功。

本發(fā)明所制備的二甲基馬來(lái)酸酐與胍基丁胺共同修飾的殼聚糖能夠在pH＝7.4的條件下有效壓縮DNA形成表面帶負(fù)電荷的納米復(fù)合物，而在pH＝6.5的條件下，電荷反轉(zhuǎn)發(fā)生，納米復(fù)合物的表面電荷由負(fù)轉(zhuǎn)變?yōu)檎?。將二甲基馬來(lái)酸酐與胍基丁胺共同修飾的殼聚糖與DNA形成的復(fù)合物分別置于pH＝7.4和pH＝6.5的緩沖液中，用馬爾文公司的Zetasizer Nano ZS90儀器測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的電位，結(jié)果如附圖2所示。從附圖2中可以看出，在pH＝7.4的條件下，二甲基馬來(lái)酸酐與胍基丁胺共同修飾的殼聚糖與DNA形成的復(fù)合物表面電位隨著時(shí)間的變化基本保持不變，始終維持在-12mv左右。而在pH＝6.5的條件下，所形成復(fù)合物的表面電位在半小時(shí)內(nèi)迅速由負(fù)轉(zhuǎn)變?yōu)檎罱K維持在12mv左右。可以看出，二甲基馬來(lái)酸酐與胍基丁胺共同修飾的殼聚糖與DNA形成的復(fù)合物具有pH敏感性，隨著pH值的降低，電荷反轉(zhuǎn)現(xiàn)象發(fā)生。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于制備方法簡(jiǎn)單，反應(yīng)條件溫和，選取生物大分子殼聚糖為主鏈，具有生物相容性好，細(xì)胞毒性小，易降解等優(yōu)點(diǎn)。所制備的載體能夠有效地壓縮DNA形成納米復(fù)合物，通過(guò)調(diào)節(jié)pH值達(dá)到大幅度提高轉(zhuǎn)染效率的目的。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明的改性殼聚糖CS-DM-Agm10的核磁共振氫譜。

圖2是本發(fā)明的改性殼聚糖CS-DM-Agm10與DNA形成復(fù)合物的電位隨時(shí)間變化圖，1為CS-DM-Agm10與DNA形成的復(fù)合物在pH＝7.4的條件下電位隨時(shí)間的變化曲線，2為CS-DM-Agm10與DNA形成的復(fù)合物在pH＝6.5的條件下電位隨時(shí)間的變化曲線。

圖3是本發(fā)明使用的殼聚糖的核磁共振氫譜。

圖4是本發(fā)明中使用二甲基馬來(lái)酸酐修飾殼聚糖的核磁共振氫譜。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。

實(shí)施例1：

將二甲基馬來(lái)酸酐(5.86g，46.5mmol，sigma)溶于N,N-二甲基甲酰胺(48mL)與水(2mL)的混合溶液中，向其中加入殼聚糖(2.5g，15.5mmol糖環(huán)結(jié)構(gòu)單元，sigma)，混合均勻后，在氮?dú)夥諊校?30℃攪拌反應(yīng)5小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物冷卻至室溫，用乙醇沉淀并洗滌三次，最后經(jīng)真空干燥即可得到二甲基馬來(lái)酸酐修飾的殼聚糖，命名為CS-DMA，¹H-NMR分析產(chǎn)物結(jié)構(gòu)：二甲基馬來(lái)酸酐的取代度約為95％。

將上述得到的二甲基馬來(lái)酸酐修飾的殼聚糖(1.2g，5mmol的糖環(huán)結(jié)構(gòu)單元)溶于1M的氫氧化鈉溶液(100mL)中，放置到冰水浴中攪拌均勻。然后將對(duì)甲苯磺酰氯(7.62g，40mmol，sigma)溶于乙腈(40mL)中，逐滴加入到二甲基馬來(lái)酸酐修飾殼聚糖的氫氧化鈉溶液中，冰水浴攪拌反應(yīng)2小時(shí)后轉(zhuǎn)到室溫繼續(xù)反應(yīng)3小時(shí)。反應(yīng)完畢后，用乙醇沉淀并洗滌三次，然后用磷酸鹽緩沖液(pH＝7.4)洗滌直至中性，最后經(jīng)真空干燥即可得到二甲基馬來(lái)酸酐修飾的對(duì)甲苯磺酰基殼聚糖，命名為CS-DMA-Ts8。

將上述得到的所有二甲基馬來(lái)酸酐修飾的對(duì)甲苯磺?；鶜ぞ厶桥c胍基丁胺(5.7g，25mmol，sigma)溶于0.2M的氫氧化鈉(60mL)與三乙醇胺(40mL)的混合溶液中，攪拌均勻后，在氮?dú)夥諊校?5℃攪拌反應(yīng)48小時(shí)，將最終的反應(yīng)液置于截留分子量為3500的透析袋中用磷酸鹽緩沖液(pH＝7.4)透析5天，凍干即得二甲基馬來(lái)酸酐與胍基丁胺共同修飾的殼聚糖，命名為CS-DM-Agm8，¹H-NMR分析產(chǎn)物結(jié)構(gòu)：胍基丁胺的取代度約為9％。

將得到的最終產(chǎn)物2mg溶于1mL超純水中，用0.22μm濾器濾菌。將上述溶液與等體積的pGL3質(zhì)粒溶液混合配制成CS-DM-Agm8/DNA復(fù)合物，復(fù)合質(zhì)量比為12/1，靜置 30分鐘后，將復(fù)合物溶液加入到已培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期的人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)的含血清培基中(pH＝7.4或6.5)，轉(zhuǎn)染4小時(shí)后，換液，繼續(xù)培養(yǎng)44小時(shí)。裂解細(xì)胞，測(cè)定其中的熒光素酶活性為:7.94×10⁴RLU/mg protein(pH＝7.4)，2.22×10⁷RLU/mg protein(pH＝6.5)。

實(shí)施例2：

將二甲基馬來(lái)酸酐(5.86g，46.5mmol，sigma)溶于N,N-二甲基甲酰胺(48mL)與水(2mL)的混合溶液中，向其中加入殼聚糖(2.5g，15.5mmol糖環(huán)結(jié)構(gòu)單元，sigma)，混合均勻后，在氮?dú)夥諊校?30℃攪拌反應(yīng)5小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物冷卻至室溫，用乙醇沉淀并洗滌三次，最后經(jīng)真空干燥即可得到二甲基馬來(lái)酸酐修飾的殼聚糖，命名為CS-DMA，¹H-NMR分析產(chǎn)物結(jié)構(gòu)：二甲基馬來(lái)酸酐的取代度約為95％。

將上述得到的二甲基馬來(lái)酸酐修飾的殼聚糖(1.2g，5mmol的糖環(huán)結(jié)構(gòu)單元)溶于1M的氫氧化鈉溶液(100mL)中，放置到冰水浴中攪拌均勻。然后將對(duì)甲苯磺酰氯(9.53g，50mmol，sigma)溶于乙腈(40mL)中，逐滴加入到二甲基馬來(lái)酸酐修飾殼聚糖的氫氧化鈉溶液中，冰水浴攪拌反應(yīng)2小時(shí)后轉(zhuǎn)到室溫繼續(xù)反應(yīng)3小時(shí)。反應(yīng)完畢后，用乙醇沉淀并洗滌三次，然后用磷酸鹽緩沖液(pH＝7.4)洗滌直至中性，最后經(jīng)真空干燥即可得到二甲基馬來(lái)酸酐修飾的對(duì)甲苯磺酰基殼聚糖，命名為CS-DMA-Ts10。

將上述得到的所有二甲基馬來(lái)酸酐修飾的對(duì)甲苯磺?；鶜ぞ厶桥c胍基丁胺(5.7g，25mmol，sigma)溶于0.2M的氫氧化鈉(60mL)與三乙醇胺(40mL)的混合溶液中，攪拌均勻后，在氮?dú)夥諊校?5℃攪拌反應(yīng)48小時(shí)，將最終的反應(yīng)液置于截留分子量為3500的透析袋中用磷酸鹽緩沖液(pH＝7.4)透析5天，凍干即得二甲基馬來(lái)酸酐與胍基丁胺共同修飾的殼聚糖，命名為CS-DM-Agm10，¹H-NMR分析產(chǎn)物結(jié)構(gòu)：胍基丁胺的取代度約為13％。

將得到的最終產(chǎn)物2mg溶于1mL超純水中，用0.22μm濾器濾菌。將上述溶液與等體積的pGL3質(zhì)粒溶液混合配制成CS-DM-Agm10/DNA復(fù)合物，復(fù)合質(zhì)量比為10/1，靜置30分鐘后，將復(fù)合物溶液加入到已培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期的人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)的含血清培基中(pH＝7.4或6.5)，轉(zhuǎn)染4小時(shí)后，換液，繼續(xù)培養(yǎng)44小時(shí)。裂解細(xì)胞，測(cè)定其中的熒光素酶活性為:1.38×10⁵RLU/mg protein(pH＝7.4)，4.04×10⁷RLU/mg protein(pH＝6.5)。

實(shí)施例3：

將二甲基馬來(lái)酸酐(5.86g，46.5mmol，sigma)溶于N,N-二甲基甲酰胺(48mL)與水(2mL)的混合溶液中，向其中加入殼聚糖(2.5g，15.5mmol糖環(huán)結(jié)構(gòu)單元，sigma)，混合均勻后，在氮?dú)夥諊校?30℃攪拌反應(yīng)5小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物冷卻至室溫，用乙醇沉淀并洗滌三次，最后經(jīng)真空干燥即可得到二甲基馬來(lái)酸酐修飾的殼聚糖，命名為CS-DMA，¹H-NMR分析產(chǎn)物結(jié)構(gòu)：二甲基馬來(lái)酸酐的取代度約為95％。

將上述得到的二甲基馬來(lái)酸酐修飾的殼聚糖(1.2g，5mmol的糖環(huán)結(jié)構(gòu)單元)溶于1M的氫氧化鈉溶液(100mL)中，放置到冰水浴中攪拌均勻。然后將對(duì)甲苯磺酰氯(14.29g，75mmol，sigma)溶于乙腈(40mL)中，逐滴加入到二甲基馬來(lái)酸酐修飾殼聚糖的氫氧化鈉溶液中，冰水浴攪拌反應(yīng)2小時(shí)后轉(zhuǎn)到室溫繼續(xù)反應(yīng)3小時(shí)。反應(yīng)完畢后，用乙醇沉淀并洗滌三次，然后用磷酸鹽緩沖液(pH＝7.4)洗滌直至中性，最后經(jīng)真空干燥即可得到二甲基馬來(lái)酸酐修飾的對(duì)甲苯磺?；鶜ぞ厶?，命名為CS-DMA-Ts15。

將上述得到的所有二甲基馬來(lái)酸酐修飾的對(duì)甲苯磺酰基殼聚糖與胍基丁胺(5.7g，25mmol，sigma)溶于0.2M的氫氧化鈉(60mL)與三乙醇胺(40mL)的混合溶液中，攪拌均勻后，在氮?dú)夥諊校?5℃攪拌反應(yīng)48小時(shí)，將最終的反應(yīng)液置于截留分子量為3500的透析袋中用磷酸鹽緩沖液(pH＝7.4)透析5天，凍干即得二甲基馬來(lái)酸酐與胍基丁胺共同修飾的殼聚糖，命名為CS-DM-Agm15，¹H-NMR分析產(chǎn)物結(jié)構(gòu)：胍基丁胺的取代度約為14％。

將得到的最終產(chǎn)物2mg溶于1mL超純水中，用0.22μm濾器濾菌。將上述溶液與等體積的pGL3質(zhì)粒溶液混合配制成CS-DM-Agm15/DNA復(fù)合物，復(fù)合質(zhì)量比為10/1，靜置30分鐘后，將復(fù)合物溶液加入到已培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期的人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)的含血清培基中(pH＝7.4或6.5)，轉(zhuǎn)染4小時(shí)后，換液，繼續(xù)培養(yǎng)44小時(shí)。裂解細(xì)胞，測(cè)定其中的熒光素酶活性為:8.30×10⁴RLU/mg protein(pH＝7.4)，2.29×10⁷RLU/mg protein(pH＝6.5)。

根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及實(shí)施例記載的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)，在工藝條件下進(jìn)行調(diào)整均可能制備本發(fā)明的改性殼聚糖，并表現(xiàn)出與實(shí)施例基本相同的性質(zhì)。

以上對(duì)本發(fā)明做了示例性的描述，應(yīng)該說(shuō)明的是，在不脫離本發(fā)明的核心的情況下， 任何簡(jiǎn)單的變形、修改或者其他本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠不花費(fèi)創(chuàng)造性勞動(dòng)的等同替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。