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背景

實體器官移植和干細胞移植目前是在全球每日使用的挽救生命的技術(shù)。盡管對于免疫預(yù)防的研究已進行數(shù)十年，預(yù)防這些移植排斥的免疫抑制劑的使用距離最優(yōu)程度尚遠。毒性、機會性感染、細胞因子風暴和增加的癌癥風險在用這些作用劑治療的常需終身免疫抑制的患者中仍是普遍的。在該領(lǐng)域中生物制劑的使用在某種程度上改善了患者的結(jié)果，但這些副作用持續(xù)給患者和醫(yī)生制造了許多困難。

α/βT淋巴細胞通過稱為αβT細胞抗原受體(TCR)-CD3復合物的多聚蛋白合作的方式識別肽-MHC配體。該結(jié)構(gòu)由結(jié)合抗原的可變αβTCR二聚體和參與TCR-CD3表面轉(zhuǎn)運、穩(wěn)定和信號轉(zhuǎn)導的三個不變二聚體(CD3γε、δε和ζζ)組成。ΑβT細胞受體(αβTCR)在大多數(shù)(約95％)的T細胞上表達且在經(jīng)由展示于MHC上的抗原的參與在T細胞活化中起關(guān)鍵作用。已開發(fā)了展示改進的結(jié)合概貌的靶向αβTCR細胞的新的人源化單克隆抗體(WO2013037484)。這些有前景的新抗體(描述于WO2013037484和本文中)包括GL1BM VH31、GL1BM VH28、HEBE1 H66和HEBE1 H71。在本領(lǐng)域?qū)Ω倪M的施用該類型人源化抗αβTCR抗體的方法存在需求，所述抗體能夠?qū)雇N異體反應(yīng)性T淋巴細胞同時保留無病原體活性的T細胞(pathogen inactive T cell)(如γδT細胞、iNK T細胞和CD3-CD56+NK細胞)。

概述

本發(fā)明部分基于驚人地發(fā)現(xiàn)了重復性施用人源化抗αβTCR結(jié)合多肽至受試者導致所述受試者中相對γδT細胞的αβT細胞的顯著減少。重要的是，通過在受試者中相對αβT細胞增加γδT細胞水平，由γδT細胞提供的一種或多種優(yōu)勢性的先天和獲得性免疫特征可在受試者中增強。例如，當在受試者中治療T細胞介導的病癥時，任選地當使用移植的細胞、組織或器官等時，獲得γδT細胞介導的免疫力尤其重要。本發(fā)明還證明了靶向αβTCR的人源化單克隆抗體在體外和體內(nèi)的有效性。還提供了用于使用靶向αβTCR的單克隆抗體的改進的方法。

在一個實施方案中，本文教導了在受試者中相對γδT細胞(例如人γδT細胞)優(yōu)先減少αβT細胞(例如人αβT細胞)的方法，其包括以兩次、三次或多次的劑量施用人源化抗αβTCR結(jié)合多肽至受試者。在另一個實施方案中，所述劑量是順序的劑量。在另一個實施方案中，最優(yōu)先減少的人αβT細胞為CD4+人αβT細胞。在另一個實施方案中，相對γδT細胞的αβT細胞的優(yōu)先減少在外周血細胞、脾和骨髓中的一者或任何組合中發(fā)生。在另一個實施方案中，受試者患有T細胞介導的病癥或處于患上T細胞介導的病癥的風險。在另一個實施方案中，T細胞介導的病癥由于細胞、組織、機體部分或器官移植發(fā)生。在另一個實施方案中，T細胞介導的病癥選自下組：自身免疫性病癥、異種移植相關(guān)病癥、同種異體移植相關(guān)病癥、異種妊娠相關(guān)病癥、先兆子癇和溶血性疾病(Rh disease)。在另一個實施方案中，人源化抗αβTCR結(jié)合多肽是人源化單克隆抗體。在另一個實施方案中，人源化單克隆抗體是GL1BM VH31、GL1BM VH28、HEBE1 H66或HEBE1 H71。

在一個實施方案中，本文教導了在受試者的外周血中相對γδT細胞優(yōu)先減少αβT細胞的方法，其包括以兩次或多次的劑量對所述受試者施用人源化的抗αβTCR結(jié)合多肽。在另一個實施方案中，所述受試者患有T細胞介導的病癥或處于患上T細胞介導的病癥的風險。在另一個實施方案中，所述T細胞介導的病癥由于細胞、組織、機體部分或器官移植發(fā)生。在另一個實施方案中，所述T細胞介導的病癥選自下組：自身免疫性病癥、異種移植相關(guān)病癥、同種異體移植相關(guān)病癥、異種妊娠相關(guān)病癥、先兆子癇和溶血性疾病(Rh disease)。在另一個實施方案中，所述T細胞介導的病癥選自下組：系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和炎性腸病(IBD)(包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩氏病(Crohn’s disease，CD))、多發(fā)性硬化癥(MS)、硬皮病和1型糖尿病(T1D)，以及其它疾病和病癥，如尋常型天皰瘡(pemphigus vulgaris，PV)、銀屑病、特應(yīng)性皮炎、乳糜瀉、慢性阻塞性肺病、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、格雷夫斯病(Graves’disease)(甲狀腺)、干燥綜合征(Sjogren’s syndrome)、格林-巴利綜合癥(Guillain-Barre syndrome)、古德帕斯徹氏綜合征(Goodpasture’s syndrome)、阿狄森氏病(Addison’s disease)、韋格納肉芽腫(Wegener’s granulomatosis)、原發(fā)性膽汁性硬化、硬化性膽管炎、自身免疫性肝炎、風濕性多肌痛、雷諾氏現(xiàn)象(Raynaud’s phenomenon)、顳動脈炎、巨細胞動脈炎、自身免疫性溶血性貧血、惡性貧血、結(jié)節(jié)性多動脈炎、白塞氏病(behcet’s disease)、原發(fā)性膽汁性肝硬化、葡萄膜炎、心肌炎、風濕熱、強直性脊柱炎、血管球性腎炎、結(jié)節(jié)病、皮肌炎、肌無力、多肌炎、斑禿和白癜風。在另一個實施方案中，人源化抗αβTCR結(jié)合多肽是人源化單克隆抗體。在另一個實施方案中，所述人源化單克隆抗體是GL1BM VH31、GL1BM VH28、HEBE1 H66或HEBE1 H71。

在一個實施方案中，本文教導了在受試者的脾中相對γδT細胞優(yōu)先減少αβT細胞的方法，其包括以兩次或多次的劑量對所述受試者施用人源化的抗αβTCR結(jié)合多肽。在另一個實施方案中，所述受試者患有T細胞介導的病癥或處于患上T細胞介導的病癥的風險。在另一個實施方案中，所述T細胞介導的病癥由于細胞、組織、機體部分或器官移植發(fā)生。在另一個實施方案中，所述T細胞介導的病癥選自下組：自身免疫性病癥、異種移植相關(guān)病癥、同種異體移植相關(guān)病癥、異種妊娠相關(guān)病癥、先兆子癇和溶血性疾病(Rh disease)。在另一個實施方案中，所述T細胞介導的病癥選自下組：系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和炎性腸病(IBD)(包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩氏病(Crohn’s disease，CD))、多發(fā)性硬化癥(MS)、硬皮病和1型糖尿病(T1D)，以及其它疾病和病癥，如尋常型天皰瘡(pemphigus vulgaris，PV)、銀屑病、特應(yīng)性皮炎、乳糜瀉、慢性阻塞性肺病、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、格雷夫斯病(Graves’disease)(甲狀腺)、干燥綜合征(Sjogren’s syndrome)、格林-巴利綜合癥(Guillain-Barre syndrome)、古德帕斯徹氏綜合征(Goodpasture’s syndrome)、阿狄森氏病(Addison’s disease)、韋格納肉芽腫(Wegener’s granulomatosis)、原發(fā)性膽汁性硬化、硬化性膽管炎、自身免疫性肝炎、風濕性多肌痛、雷諾氏現(xiàn)象(Raynaud’s phenomenon)、顳動脈炎、巨細胞動脈炎、自身免疫性溶血性貧血、惡性貧血、結(jié)節(jié)性多動脈炎、白塞氏病(behcet’s disease)、原發(fā)性膽汁性肝硬化、葡萄膜炎、心肌炎、風濕熱、強直性脊柱炎、血管球性腎炎、結(jié)節(jié)病、皮肌炎、肌無力、多肌炎、斑禿和白癜風。在另一個實施方案中，人源化抗αβTCR結(jié)合多肽是人源化單克隆抗體。在另一個實施方案中，人源化單克隆抗體是GL1BM VH31、GL1BM VH28、HEBE1 H66或HEBE1 H71。

在一個實施方案中，本文教導了在骨髓中相對γδT細胞優(yōu)先減少αβT細胞的方法，其包括以兩次或多次的劑量對所述受試者施用人源化的抗αβTCR結(jié)合多肽。在另一個實施方案中，所述受試者患有T細胞介導的病癥或處于患上T細胞介導的病癥的風險。在另一個實施方案中，所述T細胞介導的病癥由于細胞、組織、機體部分或器官移植發(fā)生。在另一個實施方案中，所述T細胞介導的病癥選自下組：自身免疫性病癥、異種移植相關(guān)病癥、同種異體移植相關(guān)病癥、異種妊娠相關(guān)病癥、先兆子癇和溶血性疾病(Rh disease)。在另一個實施方案中，所述T細胞介導的病癥選自下組：系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和炎性腸病(IBD)(包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩氏病(Crohn’s disease，CD))、多發(fā)性硬化癥(MS)、硬皮病和1型糖尿病(T1D)，以及其它疾病和病癥，如尋常型天皰瘡(pemphigus vulgaris，PV)、銀屑病、特應(yīng)性皮炎、乳糜瀉、慢性阻塞性肺病、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、格雷夫斯病(Graves’disease)(甲狀腺)、干燥綜合征(Sjogren’s syndrome)、格林-巴利綜合癥(Guillain-Barre syndrome)、古德帕斯徹氏綜合征(Goodpasture’s syndrome)、阿狄森氏病(Addison’s disease)、韋格納肉芽腫(Wegener’s granulomatosis)、原發(fā)性膽汁性硬化、硬化性膽管炎、自身免疫性肝炎、風濕性多肌痛、雷諾氏現(xiàn)象(Raynaud’s phenomenon)、顳動脈炎、巨細胞動脈炎、自身免疫性溶血性貧血、惡性貧血、結(jié)節(jié)性多動脈炎、白塞氏病(behcet’s disease)、原發(fā)性膽汁性肝硬化、葡萄膜炎、心肌炎、風濕熱、強直性脊柱炎、血管球性腎炎、結(jié)節(jié)病、皮肌炎、肌無力、多肌炎、斑禿和白癜風。在另一個實施方案中，人源化抗αβTCR結(jié)合多肽是人源化單克隆抗體。在另一個實施方案中，人源化單克隆抗體是GL1BM VH31、GL1BM VH28、HEBE1 H66或HEBE1 H71。

在另一個實施方案中，本文教導了在受試者中增加CD3+T細胞群內(nèi)γδT細胞比例的方法，其包括以兩次、三次或多次的劑量對所述受試者施用人源化的抗αβTCR結(jié)合多肽。在另一個實施方案中，所述受試者患有T細胞介導的病癥或處于患上T細胞介導的病癥的風險。在另一個實施方案中，所述T細胞介導的病癥由于細胞、組織、機體部分或器官移植發(fā)生。在另一個實施方案中，所述T細胞介導的病癥選自下組：自身免疫性病癥、異種移植相關(guān)病癥、同種異體移植相關(guān)病癥、異種妊娠相關(guān)病癥、先兆子癇和溶血性疾病。在另一個實施方案中，所述T細胞介導的病癥選自下組：系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和炎性腸病(IBD)(包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩氏病(Crohn’s disease，CD))、多發(fā)性硬化癥(MS)、硬皮病和1型糖尿病(T1D)，以及其它疾病和病癥，如尋常型天皰瘡(pemphigus vulgaris，PV)、銀屑病、特應(yīng)性皮炎、乳糜瀉、慢性阻塞性肺病、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、格雷夫斯病(Graves’disease)(甲狀腺)、干燥綜合征(Sjogren’s syndrome)、格林-巴利綜合癥(Guillain-Barre syndrome)、古德帕斯徹氏綜合征(Goodpasture’s syndrome)、阿狄森氏病(Addison’s disease)、韋格納肉芽腫(Wegener’s granulomatosis)、原發(fā)性膽汁性硬化、硬化性膽管炎、自身免疫性肝炎、風濕性多肌痛、雷諾氏現(xiàn)象(Raynaud’s phenomenon)、顳動脈炎、巨細胞動脈炎、自身免疫性溶血性貧血、惡性貧血、結(jié)節(jié)性多動脈炎、白塞氏病(behcet’s disease)、原發(fā)性膽汁性肝硬化、葡萄膜炎、心肌炎、風濕熱、強直性脊柱炎、血管球性腎炎、結(jié)節(jié)病、皮肌炎、肌無力、多肌炎、斑禿和白癜風。在另一個實施方案中，人源化抗αβTCR結(jié)合多肽是人源化單克隆抗體。在另一個實施方案中，人源化單克隆抗體是GL1BM VH31、GL1BM VH28、HEBE1 H66或HEBE1 H71。

在另一個實施方案中，本文教導了在有需要的受試者中在抑制T細胞介導的響應(yīng)的同時保留無病原體活性細胞(pathogen inactive cell)的方法，其包括施用多次劑量的人源化抗αβTCR結(jié)合多肽至所述受試者。在進一步的實施方案中，無病原體活性細胞選自下組：CD3+效應(yīng)細胞、γδT細胞、iNK T細胞和NK細胞。在另一個實施方案中，人源化抗αβTCR結(jié)合多肽是人源化的單克隆抗體。在另一個實施方案中，人源化的單克隆抗體是GL1BM VH31、GL1BM VH28、HEBE1 H66或HEBE1 H71。

在另一個實施方案中，本文教導了在受試者中特異性消除同種異體反應(yīng)性T細胞的方法，其包括以兩次、三次或多次的劑量對所述受試者施用人源化抗αβTCR結(jié)合多肽的步驟。在另一個實施方案中，人源化抗αβTCR結(jié)合多肽是人源化單克隆抗體。在另一個實施方案中，人源化單克隆抗體是GL1BM VH31、GL1BM VH28、HEBE1 H66或HEBE1 H71。

在另一個實施方案中，本文教導了用于在經(jīng)歷T細胞減少的受試者中增強先天免疫力和獲得性免疫力之一或兩者的方法，其包括如下步驟：以兩次、三次或多次的劑量對所述受試者施用人源化的抗αβTCR結(jié)合多肽；和在所述受試者中相對γδT細胞優(yōu)先減少αβT細胞，以在所述受試者中增強先天免疫力和獲得性免疫力之一或兩者。在另一個實施方案中，相對γδT細胞的αβT細胞的優(yōu)先減少在外周血細胞、脾和骨髓的一者或任何組合中發(fā)生。在另一個實施方案中，在經(jīng)歷相對γδT細胞的αβT細胞的優(yōu)先減少的第一受試者中先天免疫力和獲得性免疫力之一或兩者的增強相對經(jīng)歷αβT細胞的非優(yōu)先減少例如經(jīng)歷一般性T細胞減少的第二受試者進行確定。在另一個實施方案中，人源化抗αβTCR結(jié)合多肽是人源化的單克隆抗體。在另一個實施方案中，人源化的單克隆抗體是GL1BM VH31、GL1BM VH28、HEBE1 H66或HEBE1 H71。

在一個實施方案中，本文教導了在有需要的受試者中治療由于細胞、組織、機體部分或器官移植發(fā)生的T細胞介導的病癥的方法，其包括將細胞、組織、機體部分或器官移植入受試者并將治療上可接受的量的兩次、三次或多次劑量的人源化抗αβTCR結(jié)合多肽施用至所述受試者。在另一個實施方案中，人源化抗αβTCR結(jié)合多肽是人源化的單克隆抗體。在另一個實施方案中，所述人源化的單克隆抗體是GL1BM VH31、GL1BM VH28、HEBE1 H66或HEBE1 H71。

在另一個實施方案中，本文教導了在有需要的受試者中治療T細胞介導的病癥的方法，其包括以兩次、三次或多次的劑量施用藥物上可接受的量的人源化抗αβTCR結(jié)合多肽至受試者。在進一步的實施方案中，T細胞介導的病癥選自下組：自身免疫性病癥、異種移植相關(guān)病癥、同種異體移植相關(guān)病癥、異種妊娠相關(guān)病癥、先兆子癇和溶血性疾病。在實施方案中，T細胞介導的病癥選自下組：系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和炎性腸病(IBD)(包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩氏病(Crohn’s disease，CD))、多發(fā)性硬化癥(MS)、硬皮病和1型糖尿病(T1D)，以及其它疾病和病癥，如尋常型天皰瘡(pemphigus vulgaris，PV)、銀屑病、特應(yīng)性皮炎、乳糜瀉、慢性阻塞性肺病、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、格雷夫斯病(Graves’disease)(甲狀腺)、干燥綜合征(Sjogren’s syndrome)、格林-巴利綜合癥(Guillain-Barre syndrome)、古德帕斯徹氏綜合征(Goodpasture’s syndrome)、阿狄森氏病(Addison’s disease)、韋格納肉芽腫(Wegener’s granulomatosis)、原發(fā)性膽汁性硬化、硬化性膽管炎、自身免疫性肝炎、風濕性多肌痛、雷諾氏現(xiàn)象(Raynaud’s phenomenon)、顳動脈炎、巨細胞動脈炎、自身免疫性溶血性貧血、惡性貧血、結(jié)節(jié)性多動脈炎、白塞氏病(behcet’s disease)、原發(fā)性膽汁性肝硬化、葡萄膜炎、心肌炎、風濕熱、強直性脊柱炎、血管球性腎炎、結(jié)節(jié)病、皮肌炎、肌無力、多肌炎、斑禿和白癜風。

在一些實施方案中，可將一次或多次劑量的人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)施用至受試者，例如以在受試者中相對γδT細胞優(yōu)先減少αβT細胞，以增加受試者中CD3+T細胞群內(nèi)的γδT細胞比例，以在抑制受試者中T細胞介導的響應(yīng)的同時保留非無病原體活性細胞，以特異性消除受試者中同種異體反應(yīng)性T細胞，以增強經(jīng)歷T細胞減少的受試者中先天免疫力和獲得性免疫力之一或兩者，以在受試者中治療T細胞介導的病癥，或這些的任何組合。將藥物上可接受的量的人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)以一次或多次的劑量使用任何方式對受試者施用，包括但不限于本文所述的任何和全部方法和組合物。

在一些實施方案中，人源化的單克隆抗體或人源化的單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)可多次施用至受試者。多重劑量的人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)可給予限定的時間段(例如1周、1個月、6個月、1年、5年或10年)，例如持續(xù)與需要治療的疾病、病癥或疾患持續(xù)時間或風險的持續(xù)時間相等的時間段，或持續(xù)受試者終生的時間段。人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)的第二和后續(xù)的劑量可在施用第一劑量后立即(0-10分鐘后，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10分鐘后)施用至受試者、在施用第一劑量后的1小時內(nèi)(例如15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘后)施用至受試者，在施用第一劑量后的1天內(nèi)(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時后)施用至受試者，在施用第一劑量后的1周內(nèi)(例如1、2、3、4、5、6或7天后)施用至受試者，在施用第一劑量后的1個月內(nèi)(例如1、2、3、或4周后)施用至受試者，在施用第一劑量后的6個月內(nèi)(例如1、2、3、4、5或6個月內(nèi))施用至受試者等。第二和隨后的劑量可以規(guī)律的時間間隔給予，包括但不限于每日、每周、每月或每年。劑量在移植后的最初的數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月可施用更加頻繁或劑量間的時間間隔可保持相同。

在一些實施方案中，劑量的數(shù)目范圍可以是但不限于兩次至數(shù)千次劑量。例如，受試者接受的劑量的數(shù)目可以是：施用2-10劑量(即可以是2、3、4、5、6、7、9或10劑量)；施用11-20劑量(即可以是11、12、13、14、15、16、17、18、19或20劑量)；施用21-30劑量(即可以是21、22、23、24、25、26、27、28、29或30劑量)；施用31-40劑量(即可以是31、32、33、34、35、36、37、38、39或40劑量)；施用41-50劑量(即可以是41、42、43、44、45、46、47、48、49或50劑量)；施用51-60劑量(即可以是51、52、53、54、55、56、57、58、59或60劑量)；施用61-70劑量(即可以是61、62、63、64、65、66、67、68、69或70劑量)；施用71-80劑量(即可以是71、72、73、74、75、76、77、78、79或80劑量)；施用81-90劑量(即可以是81、82、83、84、85、86、87、88、89或90劑量)或施用91-100劑量(即可以是91、92、93、94、95、96、97、98、99或100劑量)。受試者接受的劑量的數(shù)目可以是超過100劑量，例如其可以是101-200劑量、201-300劑量、301-400劑量、401-500劑量、501-600劑量、601-700劑量、701-800劑量、801-900劑量、901-1,000劑量、1,100-1,200劑量、1,201-1,300劑量、1,301-1,400劑量、1,401-1,500劑量、1,501-1,600劑量、1,601-1,700劑量、1,701-1,800劑量、1,801-1,900劑量、1,901-2,000劑量、2,100-2,200劑量、2,201-2,300劑量、2,301-2,400劑量、2,401-2,500劑量、2,501-2,600劑量、2,601-2,700劑量、2,701-2,800劑量、2,801-2,900劑量、2,901-3,000劑量、3,100-3,200劑量、3,201-3,300劑量、3,301-3,400劑量、3,401-3,500劑量、3,501-3,600劑量、3,601-3,700劑量、3,701-3,800劑量、3,801-3,900劑量、3,901-4,000劑量、4,100-4,200劑量、4,201-4,300劑量、4,301-4,400劑量、4,401-4,500劑量、4,501-4,600劑量、4,601-4,700劑量、4,701-4,800劑量、4,801-4,900劑量和4,901-5,000劑量。取決于情況的嚴重性和受試者需要治療的時間長度，劑量的數(shù)目還可超過5,000次且可例如為約6,000、約7,000、約8,000、約9,000或約10,000。

在實施方案中，在對于T細胞介導的病癥的治療過程中，或?qū)τ赥細胞介導的病癥或?qū)細胞介導的病癥的風險的出現(xiàn)進行治療后，可能存在一次或多次劑量的人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)的施用。人源化的單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)可僅在T細胞介導的病癥的風險出現(xiàn)前施用，僅在T細胞介導的病癥的風險出現(xiàn)過程中施用，或僅在T細胞介導的病癥的風險出現(xiàn)之后施用。人源化的單克隆抗體或人源化的單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)還可在T細胞介導的病癥的風險出現(xiàn)之前和過程中施用、在T細胞介導的病癥的風險出現(xiàn)過程中和之后施用，在T細胞介導的病癥的風險出現(xiàn)之前和之后施用，或在T細胞介導的病癥的風險出現(xiàn)之前、過程中和之后施用。在這些時間段的每一個中可施用一次或多于一次劑量的人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)。例如，在T細胞介導的病癥的風險出現(xiàn)之前和過程中可存在一次或多于一次劑量的施用，在T細胞介導的病癥的風險出現(xiàn)過程中和之后可存在一次或多于一次劑量的施用，在T細胞介導的病癥的風險出現(xiàn)之前和之后可存在一次或多于一次劑量的施用，或在T細胞介導的病癥的風險出現(xiàn)之前、過程中和之后可存在一次或多于一次劑量的施用。在任何這些時間段中劑量的數(shù)目的范圍可以為但不限于如本文進一步討論的兩次至數(shù)千次劑量。

在一些實施方案中，一次或多次劑量的人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)可在移植至受試者前施用至細胞、組織、機體部分或?qū)嶓w器官。該施用可例如在體內(nèi)(外植或提取前)、離體(外植或提取后)或體外(外植或提取后)發(fā)生。藥物上可接受的量的人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)可使用任何方式施用至細胞、組織、機體部分或?qū)嶓w器官，所述方式包括但不限于上文討論的任何和全部方法和組合物。人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)可以任何方式施用至細胞、組織、機體部分或?qū)嶓w器官，所述方式包括但不限于：細胞培養(yǎng)、灌注、注射、浸泡和輸注。該施用可在任何適當?shù)沫h(huán)境中實施，包括但不限于皿、生物反應(yīng)器和/或培養(yǎng)室。在一些實施方案中，移植前人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)的施用可通過施用至供體生物體發(fā)生。

在一些實施方案中，人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)可在細胞、組織、機體部分或器官移植入受試者后多次施用至有需要的受試者?？蓪⒍啻蝿┝康娜嗽椿瘑慰寺】贵w或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)持續(xù)限定的時間段給予(例如1周、1個月、6個月、1年、5年或10年)，持續(xù)與需要治療的疾病、病癥或疾患的持續(xù)時間或其風險的持續(xù)時間相等的時間段給予，或持續(xù)受試者的終生給予。第一劑量的人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)可與移植同時施用至受試者、移植后立即施用至受試者(0-10分鐘后，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10分鐘后)，移植后1小時內(nèi)施用至受試者(例如15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘后)、移植后1天內(nèi)施用至受試者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時后)，移植后1周內(nèi)施用至受試者(例如1、2、3、4、5、6或7天后之內(nèi))，移植后1個月內(nèi)施用至受試者(例如1、2、3或4周)或移植后6個月內(nèi)施用至受試者(例如1、2、3、4、5或6個月內(nèi))。第二和后續(xù)劑量的人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)可移植后立即施用至受試者(0-10分鐘后，包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10分鐘后)，移植后1小時內(nèi)施用至受試者(例如15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分鐘后)、移植后1天內(nèi)施用至受試者(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小時后)，移植后1周內(nèi)施用至受試者(例如1、2、3、4、5、6或7天后之內(nèi))，移植后1個月內(nèi)施用至受試者(例如1、2、3或4周)或移植后6個月內(nèi)施用至受試者(例如1、2、3、4、5或6個月內(nèi))。第二和隨后的劑量可以規(guī)律的時間間隔給予，包括但不限于每日、每周、每月或每年。劑量在移植后的最初數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月內(nèi)可施用更加頻繁或劑量間的時間間隔可保持相同。

在一些實施方案中，劑量的數(shù)目范圍可以是但不限于兩次至數(shù)千次劑量。例如，受試者接受的劑量的數(shù)目可以是：施用2-10劑量(即可以是2、3、4、5、6、7、9或10劑量)；施用11-20劑量(即可以是11、12、13、14、15、16、17、18、19或20劑量)；施用21-30劑量(即可以是21、22、23、24、25、26、27、28、29或30劑量)；施用31-40劑量(即可以是31、32、33、34、35、36、37、38、39或40劑量)；施用41-50劑量(即可以是41、42、43、44、45、46、47、48、49或50劑量)；施用51-60劑量(即可以是51、52、53、54、55、56、57、58、59或60劑量)；施用61-70劑量(即可以是61、62、63、64、65、66、67、68、69或70劑量)；施用71-80劑量(即可以是71、72、73、74、75、76、77、78、79或80劑量)；施用81-90劑量(即可以是81、82、83、84、85、86、87、88、89或90劑量)或施用91-100劑量(即可以是91、92、93、94、95、96、97、98、99或100劑量)。受試者接受的劑量的數(shù)目可以是超過100劑量，例如其可以是101-200劑量、201-300劑量、301-400劑量、401-500劑量、501-600劑量、601-700劑量、701-800劑量、801-900劑量、901-1,000劑量、1,100-1,200劑量、1,201-1,300劑量、1,301-1,400劑量、1,401-1,500劑量、1,501-1,600劑量、1,601-1,700劑量、1,701-1,800劑量、1,801-1,900劑量、1,901-2,000劑量、2,100-2,200劑量、2,201-2,300劑量、2,301-2,400劑量、2,401-2,500劑量、2,501-2,600劑量、2,601-2,700劑量、2,701-2,800劑量、2,801-2,900劑量、2,901-3,000劑量、3,100-3,200劑量、3,201-3,300劑量、3,301-3,400劑量、3,401-3,500劑量、3,501-3,600劑量、3,601-3,700劑量、3,701-3,800劑量、3,801-3,900劑量、3,901-4,000劑量、4,100-4,200劑量、4,201-4,300劑量、4,301-4,400劑量、4,401-4,500劑量、4,501-4,600劑量、4,601-4,700劑量、4,701-4,800劑量、4,801-4,900劑量和4,901-5,000劑量。取決于情況的嚴重性和受試者需要藥物的時間長度，劑量的數(shù)目還可超過5,000次且可例如為約6,000、約7,000、約8,000、約9,000或約10,000。

在實施方案中，在移植或T細胞介導的病癥的風險出現(xiàn)前，在移植或T細胞介導的病癥的風險出現(xiàn)過程中，或移植或T細胞介導的病癥的風險出現(xiàn)后，可能存在一次或多次劑量的人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)的施用。人源化的單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)可僅在移植或T細胞介導的病癥的風險出現(xiàn)前施用，僅在移植或T細胞介導的病癥的風險出現(xiàn)過程中施用，或僅在移植或T細胞介導的病癥的風險出現(xiàn)之后施用。人源化的單克隆抗體或人源化的單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)還可在移植或T細胞介導的病癥的風險出現(xiàn)之前和過程中施用、在移植或T細胞介導的病癥的風險出現(xiàn)過程中和之后施用，在移植或T細胞介導的病癥的風險出現(xiàn)之前和之后施用，或在移植或T細胞介導的病癥的風險出現(xiàn)之前、過程中和之后施用。在這些時間段的每一個中可存在一次或多于一次劑量的人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)的施用。例如，在移植或T細胞介導的病癥的風險出現(xiàn)之前和過程中可存在一次或多于一次劑量的施用，在移植或T細胞介導的病癥的風險出現(xiàn)過程中和之后可存在一次或多于一次劑量的施用，在移植或T細胞介導的病癥的風險出現(xiàn)之前和之后可存在一次或多于一次劑量的施用，或在移植或T細胞介導的病癥的風險出現(xiàn)之前、過程中和之后可存在一次或多于一次劑量的施用。在任何這些時間段過程中劑量的數(shù)目的范圍可以為但不限于如上文討論的兩次至數(shù)千次劑量。全部所述的劑量和本文所述的治療方案可施用至供體或受體。

在任何上述的方面和實施方案中，人源化抗αβTCR結(jié)合多肽可以是WO2013037484中所述的人源化的單克隆抗體，包括但不限于GL1BM VH31、GL1BM VH28、HEBE1 H66和HEBE1 H71。WO2013037484在本文出于全部的目的以其全文并入。

在具體的實施方案中，人源化抗αβTCR結(jié)合多肽是人源化單克隆抗體，其包含選自含有示于SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重鏈的重鏈可變區(qū)和含有示于SEQ ID NO:14的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。

在具體的實施方案中，人源化抗αβTCR結(jié)合多肽是人源化單克隆抗體，其包含含有示于SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的CDR的重鏈可變區(qū)和示于SEQ ID NO:18的人IGHV1-3*01框架，其中框架位置38、44和48的一處或多處為供體殘基。

在具體的實施方案中，人源化抗αβTCR結(jié)合多肽是人源化單克隆抗體，其包含含有示于SEQ ID NO:14的CDR的輕鏈可變區(qū)和示于SEQ ID NO:19的人IGKV3-11*01框架，其中框架位置46、70和71的一處或多處為供體殘基。

在具體的實施方案中，人源化抗αβTCR結(jié)合多肽是人源化單克隆抗體，其包含含有示于SEQ ID NO:7、12或13的CDR的重鏈可變區(qū)和示于SEQ ID NO:17的人IGH3-23框架，其中框架位置6、18、49和69的一處或多處為供體殘基。

在具體的實施方案中，人源化抗αβTCR結(jié)合多肽是人源化單克隆抗體，其包含選自含有示于SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重鏈的重鏈可變區(qū)，和含有示于SEQ ID NO:14的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)序列。

在具體的實施方案中，提供了用于在本文所述的方法中使用的人源化抗αβTCR結(jié)合多肽。在另一個實施方案中，人源化抗αβTCR結(jié)合多肽是人源化單克隆抗體或其片段。

在另一個實施方案中，人源化單克隆抗體或其片段是GL1BM VH31、GL1BM VH28、HEBE1 H66或HEBE1 H71。在另一個實施方案中，人源化單克隆抗體或其片段包含含有示于SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和含有示于SEQ ID NO:14的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在另一個實施方案中，人源化單克隆抗體或其片段包含含有示于SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的CDR的重鏈可變區(qū)和示于SEQ ID NO:18的人IGHV1-3*01框架，其中選自38、44和48的一處或多處框架位置是供體殘基。在另一個實施方案中，人源化單克隆抗體或其片段包含含有示于SEQ ID NO:14的CDR的輕鏈可變區(qū)和示于SEQ ID NO:19的人IGKV3-11*01框架，其中選自46、70和71的一處或多次框架位置為供體殘基。在另一個實施方案中，人源化單克隆抗體或其片段包含選自示于SEQ ID NO:7、12和13的CDR的重鏈可變區(qū)和示于SEQ ID NO:17的人IGH3-23框架，其中選自6、18、49和69的一處或多處框架位置為供體殘基。在另一個實施方案中，人源化單克隆抗體或其片段包含選自示于SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和含有示于SEQ ID NO:14的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)序列。在另一個實施方案中，抗體片段選自Fab、Fab'、F(ab')2和F(v)片段，或單獨的輕鏈或重鏈可變區(qū)或其任何部分。

在具體的實施方案中，提供了包含兩次或多次劑量的人源化抗αβTCR結(jié)合多肽和任選的使用說明的試劑盒。在另一實施方案中，提供了包含含有兩次或多次劑量的人源化抗αβTCR結(jié)合多肽的多重劑量藥物、任選的藥物上可接受的載劑和任選的說明的試劑盒。在進一步的實施方案中，劑量是順序的劑量。在進一步的實施方案中，說明用于本文所述任何方法中的試劑盒的使用。在進一步的實施方案中，人源化抗αβTCR結(jié)合多肽是人源化的單克隆抗體。在進一步的實施方案中，人源化單克隆抗體是GL1BM VH31、GL1BM VH28、HEBE1 H66或HEBE1 H71。在進一步的實施方案中，人源化單克隆抗體包含含有示于SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和含有示于SEQ ID NO:14的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。在進一步的實施方案中，人源化單克隆抗體包含含有示于SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16的CDR的重鏈可變區(qū)和示于SEQ ID NO:18的人IGHV1-3*01框架，其中選自38、44和48的一處或多處框架位置為供體殘基。在進一步的實施方案中，人源化單克隆抗體包含含有示于SEQ ID NO:14的CDR的輕鏈可變區(qū)和示于SEQ ID NO:19的人IGKV3-11*01框架，其中選自46、70和71的一處或多處框架位置為供體殘基。在進一步的實施方案中，人源化單克隆抗體包含選自示于SEQ ID NO:7、12和13的CDR的重鏈可變區(qū)和示于SEQ ID NO:17的人IGH3-23框架，其中選自6、18、49和69的一處或多處框架位置為供體殘基。在進一步的實施方案中，人源化單克隆抗體包含選自示于SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)和含有示于SEQ ID NO:14的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。

附圖簡述

前文和本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢將由下列說明性實施方案的詳細描述連同附圖更完全地得到理解。

圖1A-1B圖形描述了流式細胞術(shù)研究的結(jié)果，其證明了人源化αβT細胞抗體誘導的未刺激的αβT細胞的細胞凋亡。圖1A圖形描述了作為人αβT細胞的百分比給出的凋亡前的膜聯(lián)蛋白V陽性αβT細胞。圖1B圖形描述了作為全部事件百分比的細胞凋亡的膜聯(lián)蛋白V和7-AAD雙陽性PBMC。

圖2A-2D圖形描述了流式細胞術(shù)研究的結(jié)果，其證明了人源化αβT細胞抗體誘導的活化的αβT細胞的細胞凋亡。圖2A圖形描述了對于全部時間點和方案的代表性的膜聯(lián)蛋白V和7-AAD染色。圖2B圖形描述了不同治療后膜聯(lián)蛋白V-陽性αβT細胞百分比的統(tǒng)計學評估。誤差棒代表三次獨立實驗的SEM，*＝p<0.05，**＝p<0.01。圖2C圖形描述了三次代表性實驗的一次，其證明了在與GZ-αβTCR溫育的過程中PBMC中供體CD3+T細胞中γδT細胞的增加。圖2D圖形描述了αβ-mAb治療之前和之后通過αβT細胞的IFN-γ、TNF-α和IL-4的細胞因子的產(chǎn)生。

圖3A-3B圖形描述了來自GVHD的小鼠模型的結(jié)果。圖3A示意性地描述實驗的時間線和細節(jié)。圖3B圖形描述了GZ-αβTCR的單次劑量(SD)和重復應(yīng)用(RA)后的第0、3和6天對外周血的人CD45+、CD4+、CD8+和γδT細胞的分析。外周血細胞中CD3+αβT細胞中CD4+和CD8+細胞的百分比設(shè)為100％且直方圖顯示與在第0天的初始值相比，人CD4+細胞(右上)的百分比改變和人CD8+細胞(右下)的百分比改變(圖3B)。誤差棒代表SEM；d0和d3：■n＝18，□n＝17；d6SD:■n＝9，□n＝8；d6RA:■n＝9，□n＝9。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，****p<0.0001。

圖4是系列直方圖，其描述了在GZ-αβTCR的單次劑量(SD，左側(cè)柱)或重復應(yīng)用(RA，右側(cè)柱)后第6天在外周血、脾和骨髓(bm)中人CD45+細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞和γδT細胞的百分比。誤差棒代表SEM；d0和d3:■n＝18，□n＝17；d6SD:■n＝9，□n＝8；d6RA：■n＝9，□n＝9。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001，****p<0.0001。

圖5A-5B圖形描述了使用hu-HSC-NSG模型實施的實驗。圖5A示意性地描述實驗的時間線和細節(jié)。圖5B圖形描述了在第6天對外周血、脾和骨髓(bm)的人CD3+、CD4+、CD8+和γδT細胞的分析。誤差棒代表SEM；■n＝4，□n＝4。*p<0.05；****p<0.0001。

發(fā)明詳述

本文提供了用于治療其中根本病理涉及受試者免疫系統(tǒng)有害激活的T細胞介導的病癥(例如移植物抗宿主病等)的改進的方法。本文提供的方法一般性涉及對有需要的受試者施用有效量的對αβT細胞受體(αβ-TCR)特異性的人源化結(jié)合多肽。

I.定義

除非另外表明，本文使用的全部技術(shù)和科學術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解相同的含義。與本文公開的那些相似或等同的任何方法和材料可用于本公開的技術(shù)的方法中。本文引用的全部出版物出于描述和公開可與本發(fā)明連用的報導于出版物中的方法學、試劑和工具的目的在本文以其全文通過提述并入。

除非另外表明，本申請的方法和技術(shù)一般根據(jù)本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法并如貫穿本申請全文引用和討論的多種一般和更具體的參考文獻所述實施。參見例如Gennaro,A.R.編輯(1990)Remington's Pharmaceutical Sciences,18th ed.,Mack Publishing Co.；Hardman,J.G.,Limbird,L.E.,and Gilman,A.G.編輯(2001)The Pharmacological Basis of Therapeutics,10th ed.,McGraw-Hill Co.；Colowick,S.等人，編輯，Methods In Enzymology,Academic Press,Inc.；Weir,D.M.and Blackwell,C.C.編輯，(1986)Handbook of Experimental Immunology,Vols.I-IV,Blackwell Scientific Publications；Maniatis,T.等人，編輯，(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Vols.I-III,Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel,F.M.等人，編輯，(1999)Short Protocols in Molecular Biology,第4版,John Wiley&Sons；Ream等人，編輯，(1998)Molecular Biology Techniques:An Intensive Laboratory Course,Academic Press；Newton,C.R.and Graham,A.，編輯，(1997)PCR(Introduction to Biotechniques Series)，第2版，Springer-Verlag。

如本文使用的術(shù)語“治療”指具有疾病、病癥和/或疾患的患者或受試者的看護。治療可針對但不限于下列一者或任何組合：疾病、病癥和/或疾患的治愈；疾病、病癥和/或疾患的癥狀的改善；和/或目的為預(yù)防或減少疾病、病癥和/或疾患發(fā)生率的預(yù)防性或防范性的行為。

如本文使用的術(shù)語“受試者”指是脊椎動物的生物體，其包括但不限于任何哺乳動物(包括大象、狗、貓、馬，和靈長類動物如人、猿或猴，嚙齒動物如小鼠、大鼠、沙鼠、倉鼠、兔和/或豚鼠等)、鳥和/或魚。

如本文使用的“人源化的單克隆抗體”是由人抗體框架組成的抗體，其中已將來自非人抗體的互補決定區(qū)(CDR)植入其中。還可生成人接受者框架中的改變。用于設(shè)計和產(chǎn)生人源化抗體的步驟為本領(lǐng)域熟知，且已描述于例如Cabilly等人，美國專利號4,816,567；Cabilly等人，歐洲專利申請0 125 023；Boss等人，美國專利號4,816,397；Boss等人，歐洲專利申請0 120 694；Neuberger,M.S.等人，WO 86/01533；Neuberger,M.S.等人，歐洲專利申請0 194276B1；Winter,美國專利號5,225,539；Winter,歐洲專利申請0 239 400；Padlan,E.A.等人，歐洲專利申請0 519 596。關(guān)于抗體、人源化抗體、人工程化抗體和用于其制備的方法的進一步細節(jié)可在Kontermann,R.和Dijbel,S.編輯(2001,2010)Antibody Engineering,第2版，Springer-Verlag,New York,NY中發(fā)現(xiàn)。

除非另外表明，術(shù)語“結(jié)合蛋白”或“結(jié)合多肽”用于指代包含至少一個負責與感興趣的靶抗原(例如人抗原)選擇性結(jié)合的結(jié)合位點的多肽(例如抗體)。示例性的結(jié)合位點包括抗體可變結(jié)構(gòu)域、受體的配體結(jié)合位點或配體的受體結(jié)合位點。一些方面中，本文描述的結(jié)合多肽包含多重(例如兩個、三個、四個或多個)結(jié)合位點。

除非另外表明，術(shù)語“抗體”用于指代完整抗體以及這種抗體的抗原結(jié)合片段。例如，該術(shù)語涵蓋四鏈IgG分子以及抗體片段。

如本文使用的術(shù)語“抗體片段”指完整的全長抗體的部分，例如如下文進一步所述。

抗體可以是任何種類，如IgG、IgA或IgM；和任何亞類，如IgG1或IgG4。免疫球蛋白的不同種類和亞類具有不同的性質(zhì)，其在不同應(yīng)用中可以是優(yōu)勢性的。例如，IgG4抗體具有減少的與Fc受體的結(jié)合。

在本文所述的抗體的上下文中，特異性意為要求保護的抗體能夠選擇性地結(jié)合其限定的關(guān)聯(lián)抗原，即αβTCR/CD3復合物。本文所述的抗體結(jié)合表達在細胞上的αβTCR/CD3復合物。

人αβTCR/CD3復合物是存在于T細胞表面的T細胞受體復合物。參見，Kuhns等人(2006)Immunity 24:133-139。該復合物由鼠類單克隆抗體BMA031(參見歐洲專利申請EP 0 403 156；SEQ ID NO:1和2，在本文通過提述以其整體并入)和本文包括的人源化的抗體靶向。

天然存在的免疫球蛋白具有通用的核心結(jié)構(gòu)，其中兩條相同的輕鏈(約24kD)和兩條相同的重鏈(約55或70kD)形成四聚體。每條鏈的氨基末端部分已知為可變(V)區(qū)且可與每條鏈剩余的更保守的恒定(C)區(qū)區(qū)別。在輕鏈的可變區(qū)(也稱為V_L結(jié)構(gòu)域)內(nèi)是稱為J區(qū)的C-末端部分。在重鏈的可變區(qū)(也稱為V_H結(jié)構(gòu)域)內(nèi)，存在D區(qū)以及J區(qū)。大多在免疫球蛋白中的氨基酸序列變化都限于直接參與抗原結(jié)合的稱為高變區(qū)或互補決定區(qū)(CDR)的V區(qū)中的三個分開的位置。從氨基酸末端起，這些區(qū)分別稱為CDR1、CDR2和CDR3。CDR由更保守的框架區(qū)(FR)保持在位。從氨基酸末端起，這些區(qū)分別稱為FR1、FR2、FR3和FR4。CDR和FR區(qū)的位置和編號系統(tǒng)已由Kabat等(Kabat,E.A.等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,U.S.Government Printing Office(1991)，且其更新可在線獲得)定義。此外，CDR區(qū)邊界已進一步由IMGT命名法定義。

根據(jù)所述實施方案的抗體可變區(qū)可在SEQ ID NO:5-9和12-16中找到，且可通過人源化BMA031獲得，即通過將BMA031的CDR轉(zhuǎn)移至人框架獲得。描述了兩個系列的人源化抗體，HEBE1系列，其包含SEQ ID NO:5-7、12和13，和GL1BM系列，其包含如SEQ ID NO:8、15和16所示的重鏈可變區(qū)。在兩種情況中，使用的輕鏈可變區(qū)均示于SEQ ID NO:14(GL1BM VK43)。在HEBE1的情況中使用的人框架為IGH3-23，且在GL1BM的情況中為IGHV1-3*01和IGKV3-11*01。恒定區(qū)可源自任何人抗體恒定區(qū)?？蓪⒖勺儏^(qū)基因與恒定區(qū)基因以符合讀框的方式克隆入表達載體以表達免疫球蛋白重鏈和輕鏈。這種表達載體可轉(zhuǎn)染入產(chǎn)生抗體的宿主細胞用于抗體合成。

人抗體可變和恒定區(qū)可源自序列數(shù)據(jù)庫。例如，免疫球蛋白序列可在IMGT/LIGM數(shù)據(jù)庫(Giudicelli等人，(2006)Nucleic Acids Res.34(suppl.1):D781-D784)或VBase 30(vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk)獲得。去糖基化抗體可具有大量修飾的功能性；參見Boyd等(1996)Mol.lmmunol.32:1311-1318。如本文使用的“δab”或Δab修飾是如Armour等人，(1999)Eur.J.lmmunol.29:2613-2624中所述的Fc修飾。用于修飾抗體Fc區(qū)糖基化的技術(shù)為本領(lǐng)域已知，且包括化學、酶促和/或突變的方式，例如CH2結(jié)構(gòu)域中N297位置的突變。用于突變產(chǎn)生去糖基化IgG分子的抗體基因的技術(shù)描述于Tao and Morrison(1989)J.lmmunol.143:2595-2601。

如本文使用的術(shù)語“核酸”包含編碼本文所述抗體的DNA分子。編碼本文所述抗體的優(yōu)選的DNA分子為表達載體，其適于表達宿主細胞中的抗體基因。用于抗體基因表達的表達載體和宿主細胞為本領(lǐng)域已知，參見例如Morrow,K.J.Genetic Engineering&Biotechnology News(June 15,2008)28(12),and Backliwal,G.等(2008)Nucleic Acids Res.36(15):e96-e96。

II.抗體

本文涵蓋施用本文所述人源化抗αβTCR抗體的一種或多種抗原結(jié)合片段至有需要的受試者的方法?？贵w片段能夠結(jié)合αβTCR/CD3復合物。其涵蓋Fab、Fab'、F(ab')2和F(v)片段，或單獨的輕鏈或重鏈可變區(qū)或其任何部分。片段包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv等。一些方面中，片段相比完整抗體缺乏完整抗體的Fc部分，從循環(huán)更迅速地清除和/或可具有較少的非特異性組織結(jié)合。一些方面中，片段可從完整抗體使用已知的技術(shù)產(chǎn)生，例如通過使用酶如木瓜蛋白酶(以產(chǎn)生Fab片段)或胰蛋白酶(以產(chǎn)生F(ab')2片段)的蛋白水解切割。

一些方面中，抗體和/或抗體片段涵蓋與αβTCR/CD3復合物結(jié)合的單鏈抗體片段(scFv)。一些方面中，scFv包含與抗體輕鏈可變區(qū)(VL)可操作連接的抗體重鏈可變區(qū)(VH)，其中重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)之一或兩者共同或單獨形成結(jié)合αβTCR的結(jié)合位點。scFv可在氨基末端包含VH區(qū)且在羧基末端包含VL區(qū)?？商鎿Q地，scFv可在氨基末端包含VL區(qū)且在羧基末端包含VH區(qū)。此外，盡管Fv片段的兩個結(jié)構(gòu)域VL和VH由不同的基因編碼，其可使用重組方法通過合成接頭連接，所述合成接頭能夠?qū)⑺鼈冎瞥善渲蠽L和VH區(qū)配對形成單價分子(稱為單鏈Fv(scFv))的單蛋白鏈。scFv可任選地進一步在重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)間包含多肽接頭。

抗體和抗體片段還涵蓋如Ward,E.S.等(1989)Nature 341:544-546中所述的結(jié)構(gòu)域抗體(dAb)片段，其由VH結(jié)構(gòu)域組成。抗體和抗體片段還涵蓋重鏈抗體(HCAb)。已報導HCAb僅使用重鏈可變區(qū)形成抗原結(jié)合區(qū)，在其中功能性抗體僅為重鏈的二聚體(稱為“重鏈抗體”或“HCAb”)。相應(yīng)地，一些方面中，抗體和抗體片段可以是與αβTCR/CD3復合物特異性結(jié)合的HCAb。抗體和抗體片段還涵蓋為SMIP或特異性針對αβTCR/CD3復合物的結(jié)合結(jié)構(gòu)域免疫球蛋白融合蛋白的抗體。這些構(gòu)建體是包含與實施抗體效應(yīng)功能所必需的免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域融合的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的單鏈多肽(參見WO 2005/017148)?？贵w和抗體片段還涵蓋雙抗體。雙抗體指其中VH和VL結(jié)構(gòu)域表達在單多肽鏈上但使用由于太短而不允許相同鏈上的兩個結(jié)構(gòu)域進行配對的接頭的二價抗體。這迫使結(jié)構(gòu)域與另一條鏈的互補結(jié)構(gòu)域配對并由此產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點(參見例如WO 93/11161)。雙抗體可以是雙特異性或單特異性。

一些方面中，抗體或抗體片段不與任何除αβTCR/CD3復合物之外的靶標交叉反應(yīng)?？尚揎椏贵w或抗體片段進而增加其血清半衰期，例如通過添加分子如PEG或其他水溶性多聚物，包括多糖多聚物等以增加抗體或抗體片段的半衰期。

抗體和抗體片段可以是雙特異性的。例如，雙特異性抗體或抗體片段可模仿包含兩個不同的結(jié)合位點(可變區(qū))的單獨的抗體(或抗體片段)。雙特異性抗體可通過多種方法如化學技術(shù)、“polydoma”技術(shù)或重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。雙特異性抗體可具有針對至少兩種不同表位(至少其中之一是αβTCR/CD3復合物)的結(jié)合特異性。其他特異性可選自任何有用的或合意的特異性，包括例如針對人血清白蛋白用于延長體內(nèi)半衰期的特異性。

隨著批準三功能性Catumaxomab在惡性腹水情況中的使用和雙特異性抗體Blinatumomab目前在惡性血液腫瘤中的II期試驗，腫瘤學應(yīng)用的臨床中雙特異性抗體的使用現(xiàn)在逐漸成為事實。這些抗體共同具有與T細胞結(jié)合的結(jié)合臂和與腫瘤靶細胞結(jié)合的第二臂，導致T細胞介導的腫瘤靶標的裂解。此外共同的是，這些分子經(jīng)由位于細胞表面的CD3蛋白招募T細胞。經(jīng)由CD3的另一種招募是利用也表達在細胞表面上的αβT細胞受體(αβTCR)。

在一些示例性的實施方案中，根據(jù)本公開的抗體可通過將針對腫瘤相關(guān)抗原的特異性與針對αβT細胞受體(αβTCR)的特異性組合用于開發(fā)抗腫瘤抗體。

III.抗αβ-TCR抗體

與αβTCR結(jié)合并抑制或預(yù)防T細胞介導的病癥的任何抗體可在本文所述的方法中使用。適于如本文所述使用的示例性的抗體VH、VL和CDR氨基酸序列示于表1。在列于表1的序列中，CDR由下劃線的方式表示。

表1.示例性的抗αβTCR抗體的VH、VL和CDR氨基酸序列

在一些實施方案中，結(jié)合多肽是人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段，其包含選自含有示于SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的氨基酸序列的重鏈的重鏈可變區(qū)和含有示于SEQ ID NO:14的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)。

在其他實施方案中，結(jié)合多肽是人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段，其包含含有示于SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16的CDR的重鏈可變區(qū)和示于SEQ ID NO:18的人IGHV1-3*01框架，其中框架位置38、44和48的一處或多處可以是供體殘基。

在其他實施方案中，結(jié)合多肽是人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段，其包含含有示于SEQ ID NO:14的CDR的輕鏈可變區(qū)和示于SEQ ID NO:19的人IGKV3-11*01框架，其中框架位置46、70和71的一處或多處可以是供體殘基。

在其他實施方案中，結(jié)合多肽是人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段，其包含含有示于SEQ ID NO:7、12或13的CDR的重鏈可變區(qū)和示于SEQ ID NO:17的人IGH3-23框架，其中框架位置6、18、49和69的一處或多處可以是供體殘基。

在其他實施方案中，結(jié)合多肽是人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段，其包含選自含有示于SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的重鏈的重鏈可變區(qū)和含有示于SEQ ID NO:14的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)序列。

IV.修飾的抗αβ-TCR抗體

抗αβTCR抗體可以包含一處或多處修飾。根據(jù)本發(fā)明的修飾的抗αβTCR抗體可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)制備。

i)減少免疫原性

在一些示例性的實施方案中，去免疫可用于減少抗體或其抗原結(jié)合片段的免疫原性。如本文使用的術(shù)語“去免疫”包括改變抗體或其抗原結(jié)合片段以修飾一個或多個T細胞表位(參見例如WO9852976A1、WO0034317A2)。例如，可分析來自初始抗體的VH和VL序列，并從顯示與互補決定區(qū)(CDR)和序列內(nèi)的其他核心殘基相關(guān)的表位位置的每個V區(qū)生成人T細胞表位“圖譜”?？煞治鰜碜訲細胞表位圖譜的單獨的T細胞表位，進而識別改變最終抗體活性風險低的可替換的氨基酸取代?？稍O(shè)計一系列包含氨基酸取代的組合的可替換的VH和VL，且這些序列可隨后并入一系列用于本文所公開的方法中的抗αβTCR抗體或抗αβTCR抗體片段，隨后對其進行功能測試。包含修飾的V和人C區(qū)的完整的重鏈和輕鏈基因隨后可克隆入表達載體，并且可以將后續(xù)的質(zhì)粒引入用于產(chǎn)生完整抗體的細胞系。隨后可在適當?shù)纳蜕镌囼炛斜容^抗體，并可鑒定最佳變體。

ii)效應(yīng)功能和Fc修飾

人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)可包含抗體恒定區(qū)(例如IgG恒定區(qū)如人IgG恒定區(qū)，如人IgG1或IgG4恒定區(qū))，其介導一種或多種效應(yīng)功能。例如，補體C1部分與抗體恒定區(qū)的結(jié)合可激活補體系統(tǒng)。補體的激活在調(diào)理作用和細胞病原體裂解中很重要。補體的激活還刺激炎癥響應(yīng)且還可參與自身免疫超敏反應(yīng)。此外，抗體經(jīng)由Fc區(qū)與多種細胞上的受體結(jié)合，其中抗體Fc區(qū)上的Fc受體結(jié)合位點與細胞上的Fc受體(FcR)結(jié)合。存在多種特異性針對不同種類的抗體的Fc受體，包括IgG(γ受體)、IgE(ε受體)、IgA(α受體)和IgM(μ受體)?？贵w與細胞表面上Fc受體的結(jié)合觸發(fā)多個重要且多樣的生物響應(yīng)，包括抗體包被的顆粒的吞噬和破壞、免疫復合物的清除、通過殺傷細胞對抗體包被的靶細胞進行裂解(稱為抗體依賴性細胞介導的細胞毒性或ADCC)、炎癥調(diào)節(jié)劑的釋放、胎盤轉(zhuǎn)移和控制免疫球蛋白的生產(chǎn)。在一些實施方案中，人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)與Fc受體結(jié)合。在可替換的實施方案中，人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)可包含缺乏一種或多種效應(yīng)功能(例如ADCC活性)的恒定區(qū)和/或不能結(jié)合Fcγ受體。

本文所述的一些實施方案提供人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)，其中一個或多個恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域中的至少一個氨基酸已缺失或以其他方式發(fā)生改變，進而提供與完整的、未改變的具有大約相同免疫原性的抗體相比合意的生化特性，如例如減少或增強的效應(yīng)功能、非共價二聚化的能力、增加的在腫瘤位點定位的能力、減少的血清半衰期和/或增加的血清半衰期。例如，一些用于在本文所述的診斷和治療方法中使用的抗體或其片段是結(jié)構(gòu)域缺失的抗體，其包含與免疫球蛋白重鏈相似的多肽鏈，但其缺乏至少一條或多條重鏈結(jié)構(gòu)域的一部分。例如，在一些抗體中，修飾的抗體的恒定區(qū)的一個整體的結(jié)構(gòu)域?qū)⑷笔В鏑H2結(jié)構(gòu)域的全部或部分將缺失。

在一些其他實施方案中，人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)包含源自不同抗體同種型的恒定區(qū)(例如來自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的兩者或多者的恒定區(qū))。在其他實施方案中，人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)包含嵌合鉸鏈(即含有源自不同抗體同種型鉸鏈結(jié)構(gòu)域的鉸鏈部分，例如來自IgG4分子的上部鉸鏈結(jié)構(gòu)域和IgG1中部鉸鏈結(jié)構(gòu)域)。在一個實施方案中，人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)包含來自人IgG4分子的Fc區(qū)或其部分和分子核心鉸鏈區(qū)中的Ser228Pro突變(EU編號)。

在一些示例性的實施方案中，人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)的Fc部分可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)突變以增加或減少效應(yīng)功能。例如，恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域的缺失或失活(通過點突變或其他方式)可減少循環(huán)的修飾抗體的Fc受體結(jié)合，由此增加腫瘤定位。在其他情況中，與本公開相符的恒定區(qū)的修飾可緩和補體結(jié)合并因此減少偶聯(lián)的細胞毒素的血清半衰期和非特異性締合。恒定區(qū)的其他修飾可用于修飾二硫連接基或寡糖部分，其由于增加的抗原特異性或柔性允許增強的定位。獲得的生理概貌、生物利用度和修飾的其他生化效果如腫瘤定位、生物分布和血清半衰期可使用已知的免疫技術(shù)而不過度進行實驗來輕易測量和量化。

在一些實施方案中，人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)中采用的Fc結(jié)構(gòu)域是Fc變體。如本文使用的術(shù)語“Fc變體”指相對所述Fc結(jié)構(gòu)域所源自的野生型Fc結(jié)構(gòu)域具有至少一個氨基酸取代的Fc結(jié)構(gòu)域。例如，其中Fc結(jié)構(gòu)域源自人IgG1抗體，所述人IgG1Fc結(jié)構(gòu)域的Fc變體相對所述Fc結(jié)構(gòu)域包含至少一個氨基酸取代。

Fc變體的氨基酸取代可位于Fc結(jié)構(gòu)域內(nèi)的任何位置(即任何EU慣例氨基酸位置)。在一個實施方案中，F(xiàn)c變體在位于鉸鏈結(jié)構(gòu)域或其部分中的氨基酸位置處包含取代。在另一個實施方案中，F(xiàn)c變體在位于CH2結(jié)構(gòu)域或其部分中的氨基酸位置處包含取代。在另一個實施方案中，F(xiàn)c變體在位于CH3結(jié)構(gòu)域或其部分中的氨基酸位置處包含取代。在另一個實施方案中，F(xiàn)c變體在位于CH4結(jié)構(gòu)域或其部分中的氨基酸位置處包含取代。

抗體可采用任何本領(lǐng)域認可的已知賦予改進(例如減少或增強)的效應(yīng)功能和/或FcR結(jié)合的Fc變體。所述Fc變體可包括例如公開于國際PCT公開WO88/07089A1、WO96/14339A1、WO98/05787A1、WO98/23289A1、WO99/51642A1、WO99/58572A1、WO00/09560A2、WO00/32767A1、WO00/42072A2、WO02/44215A2、WO02/060919A2、WO03/074569A2、WO04/016750A2、WO04/029207A2、WO04/035752A2、WO04/063351A2、WO04/074455A2、WO04/099249A2、WO05/040217A2、WO05/070963A1、WO05/077981A2、WO05/092925A2、WO05/123780A2、WO06/019447A1、WO06/047350A2和WO06/085967A2或美國專利號5,648,260；5,739,277；5,834,250；5,869,046；6,096,871；6,121,022；6,194,551；6,242,195；6,277,375；6,528,624；6,538,124；6,737,056；6,821,505；6,998,253和7,083,784(其每一篇在本文都通過提述并入)中的任一種氨基酸取代。在一個示例性的實施方案中，人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)可包含在EU位置268處含有氨基酸取代(例如H268D或H268E)的Fc變體。在另一個示例性的實施方案中，人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)可在EU位置239處(例如S239D或S239E)和/或EU位置332處(例如I332D或I332Q)包含氨基酸取代。

在一些實施方案中，人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)可包含含有改變抗體的抗原依賴性效應(yīng)功能(特別是抗體的循環(huán)半衰期)的氨基酸取代的Fc變體。當與缺乏這些取代的抗體相比時，這種抗體展示與FcRn增加或減少的結(jié)合，因此，分別具有增加的或減少的血清半衰期。具有針對FcRn改進的親和力的Fc變體預(yù)期將具有較長的血清半衰期，且在施用的抗體的長半衰期是合意的情況下，這種分子在治療哺乳動物例如治療慢性疾病或病癥的方法中具有有效應(yīng)用。相反，具有減少的FcRn結(jié)合親和力的Fc變體預(yù)期具有較短的半衰期，且在縮短的循環(huán)時間可能是優(yōu)勢性的情況下，這種分子還例如可用于對哺乳動物的施用，例如用于體內(nèi)診斷成像或在當初始抗體在循環(huán)中存在延長的時間段時具有毒性副作用的情況中。具有減少的FcRn結(jié)合親和力的Fc變體還不可能穿過胎盤且因此還可用于妊娠婦女中疾病或病癥的治療。此外，其他其中減少的FcRn結(jié)合親和力可能合意的應(yīng)用包括其中定位腦、腎和/或肝為合意的那些應(yīng)用。在一個示例性的實施方案中，改變的抗體展示減少的從血管穿過腎小球上皮的轉(zhuǎn)運。在另一個實施方案中，改變的抗體展示減少的從腦穿過血腦屏障(BBB)進入血管間隙的轉(zhuǎn)運。在一個實施方案中，具有改變的FcRn結(jié)合的抗體在Fc結(jié)構(gòu)域的“FcRn結(jié)合環(huán)”內(nèi)包含具有一個或多個氨基酸取代的Fc結(jié)構(gòu)域。FcRn結(jié)合環(huán)由氨基酸殘基280-299(根據(jù)EU編號)組成。改變FcRn結(jié)合活性的示例性的氨基酸取代公開于國際PCT公開號WO05/047327，其在本文出于全部目的通過提述以其整體并入。在一些示例性的實施方案中，人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)包含具有一個或多個下列取代的Fc結(jié)構(gòu)域：V284E、H285E、N286D、K290E和S304D(EU編號)。

在其他實施方案中，用于本文所述的診斷和治療方法中的人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)具有恒定區(qū)，例如IgG1或IgG4重鏈恒定區(qū)，其經(jīng)改變以減少或消除糖基化。例如，抗體還可包含含有改變抗體糖基化的氨基酸取代的Fc變體。例如，所述Fc變體可具有減少的糖基化(例如N-或O-連接糖基化)。在示例性的實施方案中，F(xiàn)c變體包含通常在氨基酸位置297(EU編號)處發(fā)現(xiàn)的N-連接聚糖減少的糖基化。在另一個實施方案中，抗體在糖基化基序附近或之內(nèi)具有氨基酸取代，例如包含氨基酸序列NXT或NXS的N-連接的糖基化基序。在具體的實施方案中，抗體包含在氨基酸位置228或299(EU編號)處具有氨基酸取代的Fc變體。在更具體的實施方案中，抗體包含含有S228P和T299A突變(EU編號)的IgG1或IgG4恒定區(qū)。

賦予減少或改變的糖基化的示例性的氨基酸取代公開于國際PCT公開號WO05/018572，其在本文出于全部目的以其整體通過提述并入。在一些實施方案中，修飾抗體或其片段以消除糖基化。這種抗體或其片段可稱為“去糖(agly)”抗體或其片段(例如“去糖”抗體片段)。由于并非意在受到科學理論的限制，可以確信的是去糖抗體或其片段可具有改進的體內(nèi)安全性和穩(wěn)定性概貌。示例性的去糖抗體或去糖抗體片段包含缺少Fc效應(yīng)功能的IgG4抗體的去糖基化Fc區(qū)，由此消除對正常重要器官的潛在Fc介導的毒性。在其他實施方案中，去糖抗體或去糖抗體片段包含改變的聚糖。例如，去糖抗體或去糖抗體片段可在Fc區(qū)的Asn297處的N-聚糖上具有減少數(shù)目的巖藻糖殘基，即去巖藻糖基化。在另一個實施方案中，去糖抗體或去糖抗體片段可在Fc區(qū)的Asn297處的N-聚糖上具有改變數(shù)目的唾液酸殘基。

iii)共價附接

可例如通過分子與抗體的共價附接修飾人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)，由此共價附接不阻止抗體與其關(guān)聯(lián)表位的特異性結(jié)合。例如，但不限于，人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)可通過糖基化、乙?；?、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通過已知的保護/阻斷基團的衍生化、蛋白水解切割、與細胞配體或其他蛋白的連接等修飾。多種化學修飾的任意化學修飾可通過已知的技術(shù)實施，包括但不限于特異性化學切割、乙?；?、甲酰化等。此外，衍生物可包含一個或多個非經(jīng)典的氨基酸。

人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)可進一步與異源多肽在N或C末端重組融合，或化學偶聯(lián)(包括共價和非共價偶聯(lián))至多肽或其他組合物。例如，抗αβTCR抗體可與在檢測試驗中用作標記物的分子和效應(yīng)分子如異源多肽、藥物、放射性核素或毒素重組融合或偶聯(lián)。參見例如PCT公開WO 92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；美國公開號5,314,995；和EP 396,387。

人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)可使用本領(lǐng)域已知的方法與一種或多種異源多肽融合以增加體內(nèi)半衰期或用于在免疫試驗中使用。例如，在一個實施方案中，PEG可與人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)偶聯(lián)以增加其體內(nèi)半衰期。Leong,S.R.,等人，Cytokine 16:106(2001)；Adv.in Drug Deliv.Rev.54:531(2002)；或Weir等人，Biochem.Soc.Transactions 30:512(2002)。

此外，人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)可與一種或多種標記物序列如肽融合以促進人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)的純化或檢測。在一些實施方案中，標記物氨基酸序列是六-組氨酸肽，如pQE載體中提供的標簽(QIAGEN,Inc.,9259Eton Avenue,Chatsworth,Calif.,91311)等，其中許多已可商業(yè)獲得。例如如Gentz等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:821-824(1989)中所述，六-組氨酸提供融合蛋白便利的純化。其他可用于純化的肽標簽包括但不限于對應(yīng)于源自流感血凝素蛋白的表位的“HA”標簽(Wilson等人，Cell37:767-778(1984))和“flag”標簽。

人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)可在非偶聯(lián)形式中使用，或可與多種分子的至少一種偶聯(lián)，例如以改進分子的治療性質(zhì)、促進靶標檢測或用于受試者的成像或療法。當實施純化時，可在純化之前或之后標記或偶聯(lián)人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)。具體地，人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)可與治療劑、前藥、肽、蛋白質(zhì)、酶、病毒、脂質(zhì)、生物響應(yīng)修飾劑、藥劑或PEG偶聯(lián)。

本文進一步涵蓋與診斷或治療劑偶聯(lián)的人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)。人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)可作為臨床測試方法的一部分診斷性使用以例如監(jiān)測免疫細胞病癥(例如CLL)的發(fā)展或進展來例如確定給定治療和/或預(yù)防方案的效力?？赏ㄟ^將人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)與可檢測的物質(zhì)偶聯(lián)來促進檢測?？蓹z測物質(zhì)的實例包括多種酶、輔基、熒光材料、發(fā)光材料、生物發(fā)光材料、放射性材料、使用多種正電子發(fā)射斷層掃描術(shù)的正電子發(fā)射金屬和非放射性順磁金屬離子。根據(jù)本發(fā)明對于可與抗體偶聯(lián)用作診斷劑的金屬離子，參見例如美國專利號4,741,900。適當?shù)拿傅膶嵗ɡ备^氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；適當?shù)妮o基復合物的實例包括鏈霉親和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；適當?shù)臒晒獠牧系膶嵗▊阈瓮?、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪氨基熒光素(dichorotriazinylamine fluorescein)、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光材料的實例包括魯米諾；生物發(fā)光材料的實例包括螢光素酶、螢光素和水母發(fā)光蛋白；且適當?shù)姆派湫圆牧系膶嵗?sup>125I、¹³¹I、¹¹¹In或⁹⁹Tc。

用于在本文公開的診斷和治療方法中使用的人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)可與一種或多種細胞毒素(如放射性同位素、細胞毒性藥物或毒素)治療劑、細胞抑制劑、生物毒素、前藥、肽、蛋白質(zhì)、酶、病毒、脂質(zhì)、生物響應(yīng)修飾劑、藥劑、免疫活性配體(例如淋巴因子或其他抗體，其中獲得的分子與腫瘤細胞和效應(yīng)細胞如T細胞都結(jié)合)或PEG偶聯(lián)。

在另一個實施方案中，在本文公開的診斷和治療方法中使用的人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)可與減少腫瘤細胞生長的分子偶聯(lián)。在其他實施方案中，公開的組合物可包含與藥物或前藥偶聯(lián)的人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)。本文所述的其他實施方案包含偶聯(lián)至特定生物毒素或其他細胞毒性片段如蓖麻毒蛋白、白樹毒素、假單胞菌外毒素或白喉毒素等的抗體或其片段的用途。待使用的偶聯(lián)或非偶聯(lián)抗體的選擇將取決于癌癥的類型和分期、輔助治療(例如化療或外部輻射)的使用和受試者的情況?？梢岳斫獾氖潜绢I(lǐng)域的技術(shù)人員可以很容易地基于本文的教導做出這些選擇。

可以理解的是，在之前的研究中，用同位素標記的抗腫瘤抗體已成功用于摧毀動物模型和一些人的情況中的腫瘤細胞。示例性的放射性同位素包括但不限于：⁹⁰Y、¹²⁵I、¹³¹I、¹²³I、¹¹¹In、¹⁰⁵Rh、¹⁵³Sm、⁶⁷Cu、⁶⁷Ga、¹⁶⁶Ho、¹⁷⁷Lu、¹⁸⁶Re和¹⁸⁸Re。放射性核素通過產(chǎn)生引起核DNA多重鏈斷裂的電離輻射發(fā)揮作用，導致細胞死亡。用于產(chǎn)生治療性偶聯(lián)物的同位素通常產(chǎn)生高能α或β顆粒，其具有短路徑長度。這種放射性核素殺傷與其接近的、與偶聯(lián)物附接或偶聯(lián)物進入的細胞，例如腫瘤細胞。其對未定位的細胞不具有或具有極少的影響。放射性核素實質(zhì)上是非免疫原性的。

V.抗體產(chǎn)生

本文所述示例性的抗體的可變結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列示于SEQ ID NO:5-9和12-16?？贵w的產(chǎn)生可通過任何本領(lǐng)域已知的技術(shù)實施，包括在轉(zhuǎn)基因的生物體中如山羊(參見Pollock等(1999)J.lmmunol.Methods 231:147-157)、雞(參見Morrow,K.J.J.(2000)Genet.Eng.News 20:1-55)、小鼠(參見Pollock等人，supra)或植物(參見Doran,P.M.(2000)Curr.Opinion Biotechnol.11:199-204,Ma.J.K-C.(1998)Nat.Med.4:601-606,Baez,J.等(2000)BioPharm.13:50-54,Stoger,E.等(2000)Plant Mol.Biol.42:583-590)?？贵w還可通過化學合成或通過編碼抗體的基因的表達在宿主細胞中產(chǎn)生。

分離編碼人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)的多核苷酸并將其插入可復制構(gòu)建體或載體如質(zhì)粒用于進一步在宿主細胞中增殖或表達。適于表達根據(jù)所述實施方案的人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)的構(gòu)建體或載體(例如表達載體)在本領(lǐng)域中是可獲得的。可獲得多種載體，包括以單拷貝或多拷貝在宿主細胞中維持的載體或變得整合入宿主細胞染色體的載體。構(gòu)建體或載體可引進適當?shù)乃拗骷毎?，且可產(chǎn)生表達人源化的免疫球蛋白的細胞，并在培養(yǎng)物中保持。單載體或多重載體可用于人源化免疫球蛋白的表達。

編碼人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)的多核苷酸很容易分離并使用常規(guī)方法測序(例如寡核苷酸探針)?？墒褂玫妮d體包括質(zhì)粒、病毒、噬菌體、轉(zhuǎn)座子、微染色體，其中質(zhì)粒是經(jīng)典的實施方案。一般而言，這種載體進一步包括與輕鏈和/或重鏈多核苷酸可操作連接的單序列、復制起點、一個或多個標記物基因、增強元件、啟動子和轉(zhuǎn)錄終止序列進而促進表達。編碼輕鏈和重鏈的多核苷酸可插入不同的載體并同時或順序引進(例如通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、電穿孔或轉(zhuǎn)導)相同的宿主細胞，或者酌情重鏈和輕鏈都可在該引進前插入相同的載體。

在適當?shù)乃拗骷毎锌商峁┯糜诒磉_的啟動子。啟動子可以是組成型或誘導型。例如，啟動子可與編碼人源化免疫球蛋白或免疫球蛋白鏈的核酸可操作連接，進而其指導編碼的多肽的表達。用于原核和真核宿主的多種適當?shù)膯幼邮强梢垣@得的。原核啟動子包括用于大腸桿菌的lac、tac、T3、T7啟動子；3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶例如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶和葡糖激酶。真核啟動子包括誘導型酵母啟動子如醇脫氫酶2、異細胞色素C、酸性磷酸酶、金屬硫蛋白和負責氮代謝或麥芽糖/半乳糖利用的酶；RNA聚合酶II啟動子包括病毒啟動子如多瘤病毒、禽痘病毒和腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽類肉瘤病毒、巨細胞病毒(具體地，即刻早期基因啟動子)、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒、肌動蛋白、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子和早期或晚期猿猴病毒40和非病毒啟動子如EF-1α(Mizushima and Nagata(1990)Nucleic Acids Res.18(17):5322)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將能夠選擇適當?shù)膯幼佑糜诒磉_人源化抗體或其部分。

適當時，例如對于更高等真核生物中的表達，在上文所述的發(fā)現(xiàn)位于啟動子中的那些之外或作為替代可包括其他增強元件。適當?shù)牟溉閯游镌鰪娮有蛄邪▉碜郧虻鞍?、彈性蛋白酶、白蛋白、胎蛋白、金屬硫蛋白和胰島素的增強子元件?？商鎿Q地，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可使用來自真核細胞病毒如SV40、巨細胞病毒早期啟動子增強子、多瘤病毒增強子、桿狀病毒增強子或鼠類IgG2a基因座(參見WO 04/009823)的增強子元件。盡管這種增強子經(jīng)常位于載體上在啟動子上游的位點，其還可位于別處，例如在非翻譯區(qū)或多腺苷酸化信號下游。增強子的選擇和定位可基于與用于表達的宿主細胞的兼容性。

此外，載體(例如表達載體)可包含用于選擇攜載載體的宿主細胞的可選擇標記物，并在可復制載體的情況中包含復制起點。賦予抗生素或藥物抗性的編碼產(chǎn)物的基因是通用的可選擇性標記物且可在原核生物(例如f3-內(nèi)酰胺酶基因(氨芐青霉素抗性)、tet基因(四環(huán)素抗性))和真核細胞(例如新霉素(G418或遺傳霉素)、gpt(霉酚酸)、氨芐青霉素或潮霉素5抗性基因)中使用。二氫葉酸還原酶標記物基因在多種宿主中允許使用氨甲喋呤的選擇。編碼宿主營養(yǎng)缺陷型標記物的基因產(chǎn)物的基因(例如LEU2、URA3、HIS3)經(jīng)常用作酵母中的可選擇標記物。還可以考慮病毒(例如桿狀病毒)或噬菌體載體和能夠整合入宿主細胞基因組的載體如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的使用。

在真核系統(tǒng)中，多腺苷酸化和終止信號與編碼本文所述抗體的多核苷酸可操作連接。這些信號通常置于開放閱讀框的3'。在哺乳動物系統(tǒng)中，多腺苷酸化/終止信號的非限制性實例包括源自生長激素、延伸因子1α和病毒(例如SV40)基因或逆轉(zhuǎn)錄病毒長末端重復的那些。在酵母系統(tǒng)中，多腺苷酸化/終止信號的非限制性實例包括源自磷酸甘油酸激酶(PGK)和醇脫氫酶1(ADH)基因的那些。在原核系統(tǒng)中，通常不需要多腺苷酸化信號，且取而代之通常采用較短的更確定的終止子序列。多腺苷酸化/終止序列的選擇可基于與用于表達的宿主細胞的兼容性。除上文外，其他可采用以增強產(chǎn)量的特征包括染色質(zhì)重塑元件、內(nèi)含子和宿主細胞特異性密碼子修飾。可修飾本文所述的抗體的密碼子使用以容納宿主細胞的密碼子偏好進而增強轉(zhuǎn)錄和/或產(chǎn)物產(chǎn)量(例如Hoekema,A.等(1987)MoL Cell Biol.7(8):2914-24)。密碼子的選擇可基于與用于表達的宿主細胞的兼容性。

本文因此涉及編碼人源化免疫球蛋白或其重鏈或輕鏈的分離的核酸分子。本文還涉及編碼免疫球蛋白抗原結(jié)合部分和其鏈的分離的核酸分子。

可通過例如在適當?shù)乃拗骷毎斜磉_一種或多種編碼抗體的重組核酸產(chǎn)生人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)。宿主細胞可使用任何適當?shù)姆椒óa(chǎn)生。例如，本文所述的表達構(gòu)建體(例如一種或多種載體，如哺乳動物細胞表達載體)可引進適當?shù)乃拗骷毎?，且可在適于表達構(gòu)建體或載體的條件下維持獲得的細胞(例如在培養(yǎng)物中、在動物中、在植物中)。宿主細胞可以是原核細胞，包括細菌細胞如大腸桿菌(例如種系DH5aTM)(Invitrogen,Carlsbad,CA)、PerC6(Crucell,Leiden,NL)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和/或其他適當?shù)募毦?；真核細胞如真菌或酵母細?例如巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、曲霉屬物種(Aspergillus sp.)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、粗糙脈孢菌(Neurospora crassa))或其他低等的真核細胞，和高等真核生物的細胞如來自昆蟲的細胞(例如Drosophila Schnieder S2細胞、Sf9昆蟲細胞)(WO94/126087(O'Connor))、BTI-TN-5B1-4(High Five^TM)昆蟲細胞(Invitrogen)、來自哺乳動物的細胞(例如COS細胞如COS-1(ATCC登錄號CRL-1650)和COS-7(ATCC登錄號CRL-1651)、CHO(例如ATCC登錄號CRL-9096)、CHO DG44(Urlaub,G.and Chasin,L.A.(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77(7):4216-4220)、293(ATCC登錄號CRL-1573)、HeLa(ATCC登錄號CCL-2)、CVI(ATCC登錄號CCL-70)、WOP(Dailey,L.,等(1985)J.Virol.,54:739-749)、3T3、293T(Pear,W.S.,等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,90:8392-8396)、NSO細胞、SP2/0細胞、HuT 78細胞等或來自植物(例如煙草、青萍(浮萍)和海藻)的細胞。參見例如Ausubel,F.M.等人，編輯，Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates and John Wiley&Sons Inc.(1993)。在一些實施方案中，宿主細胞不是多細胞生物體(例如植物或動物)的一部分，例如其為分離的宿主細胞或為細胞培養(yǎng)物的一部分。

宿主細胞可培養(yǎng)在轉(zhuǎn)瓶、搖瓶、滾瓶、波動反應(yīng)器(例如來自wavebiotech.com的System 1000)或中空纖維系統(tǒng)中，但對于大規(guī)模生產(chǎn)優(yōu)選使用攪拌罐反應(yīng)器或袋反應(yīng)器(例如Wave Biotech,Somerset,New Jersey USA)，特別是用于懸浮培養(yǎng)。攪拌罐反應(yīng)器可使用例如噴霧器、擋板或低剪切葉輪以配合用于通風。對于鼓泡柱和氣升式反應(yīng)器，可以直接使用空氣或氧氣氣泡通氣。在宿主細胞培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基時，可用細胞保護劑如Pluronic F-68補充培養(yǎng)基以幫助預(yù)防由于通氣步驟導致的細胞損傷。取決于宿主細胞特性，微載體可用作用于貼壁依賴性細胞系(anchorage dependent cell line)的生長基質(zhì)，或細胞可經(jīng)調(diào)適以進行懸浮培養(yǎng)。宿主細胞特別是脊椎動物宿主細胞的培養(yǎng)可利用多種操作模式如分批、補料分批、重復分批處理(參見Drapeau等(1994)Cytotechnology 15:103-109)、延長的分批方法或灌注培養(yǎng)。盡管重組轉(zhuǎn)化的哺乳動物宿主細胞可在含有胎牛血清(FCS)的包含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，優(yōu)選這些宿主細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)如Keen等(1995)Cytotechnology 17:153-163所公開，或可商業(yè)獲得的培養(yǎng)基如ProCHO-CDM或UltraCHOTM(Cambrex NJ,USA)，必要時可補充能量來源如葡萄糖和合成生長因子如重組胰島素。宿主細胞的無血清培養(yǎng)可能需要使那些細胞適應(yīng)在無血清的條件中生長。一種適應(yīng)方式是在包含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些宿主細胞并反復交換80％的培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基，進而使宿主細胞學會適應(yīng)無血清條件(參見例如Scharfenberg,K.等(1995)Animal Cell Technology:Developments Towards the 21st Century(Beuvery,E.C.等人，編輯),pp.619-623,Kluwer Academic publishers)。

根據(jù)所述實施方案的人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)可分泌入培養(yǎng)基并使用多種技術(shù)從中回收和純化以提供適于預(yù)期用途的純化程度。例如，當與包含治療性抗體的培養(yǎng)基比較時，用于治療人受試者的用途的人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)通常要求如通過還原的SDS-PAGE所確定的至少95％的純度，更通常98％或99％的純度。首先，來自培養(yǎng)基的細胞碎片可使用離心去除，隨后是使用例如微濾、超濾和/或深度過濾的上清澄清步驟。可替換地，人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)可通過微濾、超濾或深度過濾收獲而無需在先的離心?？捎玫倪€有多種其他技術(shù)如透析和凝膠電泳及層析技術(shù)如羥基磷灰石(HA)、親和層析(任選地涉及親和標簽系統(tǒng)如多聚組氨酸)和/或疏水相互作用層析(HIC)(參見US5,429,746)。在一個實施方案中，多個澄清步驟后，人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)使用蛋白A或G親和層析捕獲，隨后為進一步的層析步驟如離子交換和/或HA層析、陰離子或陽離子交換、尺寸排阻層析和硫酸銨沉淀。還可采用多種病毒去除步驟(例如使用如DV-20過濾器的納米過濾)。這些不同的步驟后，提供包含至少10mg/ml或更多例如100mg/ml或更多本文所述抗體的純化制備物且因此形成另一本文所述的實施方案。達到100mg/ml或更高的濃度可通過超濾生成。這種制備物基本上無本文所述抗體的聚集形式。

細菌系統(tǒng)特別適于抗體片段的表達。這些片段位于細胞內(nèi)或周質(zhì)內(nèi)。可提取不可溶的周質(zhì)蛋白并根據(jù)本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的方法重新折疊以形成活性蛋白，參見Sanchez等(1999)J.Biotechnol.72:13-20；Cupit,P.M.等(1999)Lett.Appl.Microbiol.29:273-277。

本文還涉及包含本文所述的核酸例如載體(例如表達載體)的細胞。例如，編碼根據(jù)所述實施方案的人源化免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的核酸(即一種或多種核酸)或包含該核酸的構(gòu)建體(例如一種或多種構(gòu)建體如一種或多種載體)可通過對于所選宿主細胞適當?shù)姆椒?例如轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、電穿孔、感染)引進適當?shù)乃拗骷毎?，其中所述核酸本身或變得與一種或多種表達控制元件(例如在載體中，在構(gòu)建體中通過細胞中的過程生成，整合入宿主細胞基因組)可操作連接。宿主細胞可在適于表達的條件下維持(例如在誘導子存在下，補充適當?shù)柠}、生長因子、抗生素、營養(yǎng)補充劑等的適當培養(yǎng)基中)，由此產(chǎn)生編碼的多肽。酌情可例如從宿主細胞、培養(yǎng)基或乳汁分離編碼的人源化抗體。該過程涵蓋在轉(zhuǎn)基因動物或植物(例如煙草)的宿主細胞(例如乳腺細胞)中的表達(參見例如WO 92/03918)。

VI.抗αβ-TCR抗體的藥物組合物和施用方法

在一些實施方案中，提供了藥物組合物，其包含本文所述的人源化單克隆抗體或人源化單克隆抗體片段(例如抗αβTCR抗體或其片段)，或可通過如本文之前的一些方面限定的試驗方法識別的一種或多種配體。配體可以是如本文討論的免疫球蛋白、肽、核酸或小分子。在下文中將其稱為“化合物”。

本文所述的藥物組合物是含有能夠作為活性成分調(diào)節(jié)T細胞活性的一種或多種化合物的物質(zhì)組合?；衔锸侨魏嗡幬锷峡山邮艿男问?，或例如合適時，是類似物、游離堿形式、互變異構(gòu)體、對映體的外消旋體或其組合。設(shè)想例如，在治療移植物抗宿主病中，當以依賴于特定情況的量施用時，含有本文所述活性成分的藥物組合物的活性成分顯示治療活性。

在另一個實施方案中，在治療任何上述病況中，本文所述的一種或多種化合物可與任何本領(lǐng)域認可的已知適于治療特定適應(yīng)癥的化合物組合使用。相應(yīng)地，本文所述的一種或多種化合物可與一種或多種本領(lǐng)域認可的已知適于治療上述適應(yīng)癥的化合物組合，由此可將便利、單獨的化合物施用至受試者。可調(diào)整劑量方案以提供最佳治療響應(yīng)。

例如，數(shù)個分開的劑量可每日施用，或劑量可按照治療情況的迫切需要所示按比例減少。

活性成分可以便利的方式施用，如通過口服、靜脈內(nèi)(在水溶性的情況下)，肌內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、皮內(nèi)或栓劑途徑或植入(例如，使用緩慢釋放分子)。在移植的情況中，活性成分還可在移植入患者前用于處理待移植的細胞、組織或器官。可完成上述進而預(yù)防癥狀、減少癥狀的可能性或減輕癥狀，例如移植物抗宿主病的癥狀。

取決于施用途徑，可能需要活性成分包被在材料中以保護所述成分免于酶、酸和其他可能滅活所述成分的天然條件的作用。

為通過腸胃外施用以外的方式施用活性成分，其可通過材料包被或與材料一起施用以防止活性成分的失活。例如，活性成分可在佐劑中施用、與酶抑制劑共施用或在脂質(zhì)體中施用。佐劑以其最廣義的方式使用且包括任何免疫刺激化合物如干擾素。本文考慮的佐劑包括間苯二酚、非離子表面活性劑如聚氧乙烯油基醚和正十六聚乙烯醚。酶抑制劑包括胰蛋白酶。

脂質(zhì)體包括水包油包水CGF乳劑以及常規(guī)的脂質(zhì)體。

活性成分還可腸胃外或腹膜內(nèi)施用。

還可在甘油、液體聚乙二醇和其混合物中以及油中制備分散劑。在普通保存和使用條件下，這些制備物包含防腐劑以預(yù)防微生物的生長。

適于可注射用途的藥物形式包括無菌水溶液(在水溶性的情況下)或分散劑和用于無菌可注射溶液或分散劑臨場制備的無菌粉末。在全部的情況中，所述形式必須是無菌的且必須是存在易于注射性的程度的流體。其在制造和保存情況中必須是穩(wěn)定的且必須抵抗微生物如細菌和真菌污染作用保存。載劑可以是溶劑或分散培養(yǎng)基，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液體聚乙二醇等)其適當?shù)幕旌衔锖椭参镉?。適當?shù)牧鲃有钥赏ㄟ^例如使用包被如卵磷脂、在分散劑的情況中通過維持所需粒徑和通過使用表面活性劑來維持。

微生物作用的預(yù)防可通過多種抗細菌和抗真菌劑帶來，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在一些情況中，優(yōu)選包含等滲劑例如糖或氯化鈉。可注射組合物延長的吸收可通過使用延遲吸收的作用劑的組合物例如單硬脂酸鋁和明膠帶來。

無菌可注射溶液通過將活性成分以所需的量并入適當?shù)木哂袛?shù)種其他上文枚舉的成分的溶劑中制備，按需要，隨后通過過濾除菌。一般而言，分散劑通過將無菌的活性成分并入包含基本分散培養(yǎng)基和來自上文枚舉的所需的其他成分的無菌媒劑制備。在用于無菌可注射溶液制備的無菌粉末的情況中，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，其收獲活性成分加上任何其他合意成分的粉末，所述其他何以成分來自之前經(jīng)無菌過濾的它的溶液。

多種其他的材料可作為包被存在或以其他方式修飾劑量單位的物理形式。當然，在制備任何劑量單位形式中使用的任何材料應(yīng)該是藥物上純的且在所采用的量中基本上無毒。此外，活性成分可以并入持續(xù)釋放的制備物和配制物。

如本文使用的“藥物上可接受的載劑和/或稀釋劑”包括任何和全部溶劑、分散介質(zhì)、包被、抗細菌和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。這種用于藥物活性物質(zhì)的培養(yǎng)基和作用劑的使用為本領(lǐng)域已知。只要任何常規(guī)培養(yǎng)基或作用劑與活性成分兼容，即可考慮其在治療組合物中的使用。補充的活性成分還可并入組合物中。

以便于施用和劑量均勻的劑量單位形式配制胃腸外組合物是特別具有優(yōu)勢的。如本文使用的劑量單位形式指物理上分散的單位，其適于作為用于待治療的哺乳動物受試者的單位劑量；每個單位包含經(jīng)計算以產(chǎn)生合意的治療效果的預(yù)先確定量的活性材料連同所需的藥物載劑。本文所述的用于新型劑量單位形式的說明由下述各項規(guī)定或直接依賴于下述各項：(a)活性材料的獨有特性和待實現(xiàn)的特定治療效果，和(b)配制領(lǐng)域中的固有限制，如用于治療其中機體健康受損的具有疾病病況的活受試者中疾病的活性材料。在劑量單位形式中，混合主要活性成分用于與適當?shù)乃幬锷峡山邮艿妮d劑一起以有效的量便利和有效地施用。在包含補充性活性成分的組合物的情況中，劑量通過參照常規(guī)劑量和所述成分的施用方式確定。

劑量可包括但不限于0.01mg/kg-20mg/kg，包括：0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.03mg/kg、0.04mg/kg、0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.07mg/kg、0.08mg/kg、0.09mg/kg、0.10mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1.00mg/kg、1.1mg/kg、1.2mg/kg、1.3mg/kg、1.4mg/kg、1.5mg/kg、1.6mg/kg、1.7mg/kg、1.8mg/kg、1.9mg/kg、2.0mg/kg、2.1mg/kg、2.2mg/kg、2.3mg/kg、2.4mg/kg、2.5mg/kg、2.6mg/kg、2.7mg/kg、2.8mg/kg、2.9mg/kg、3.0mg/kg、3.1mg/kg、3.2mg/kg、3.3mg/kg、3.4mg/kg、3.5mg/kg、3.6mg/kg、3.7mg/kg、3.8mg/kg、3.9mg/kg、4.0mg/kg、4.1mg/kg、4.2mg/kg、4.3mg/kg、4.4mg/kg、4.5mg/kg、4.6mg/kg、4.7mg/kg、4.8mg/kg、4.9mg/kg、5.0mg/kg、5.1mg/kg、5.2mg/kg、5.3mg/kg、5.4mg/kg、5.5mg/kg、5.6mg/kg、5.7mg/kg、5.8mg/kg、5.9mg/kg、6.0mg/kg、6.1mg/kg、6.2mg/kg、6.3mg/kg、6.4mg/kg、6.5mg/kg、6.6mg/kg、6.7mg/kg、6.8mg/kg、6.9mg/kg、7.0mg/kg、7.1mg/kg、7.2mg/kg、7.3mg/kg、7.4mg/kg、7.5mg/kg、7.6mg/kg、7.7mg/kg、7.8mg/kg、7.9mg/kg、8.0mg/kg、8.1mg/kg、8.2mg/kg、8.3mg/kg、8.4mg/kg、8.5mg/kg、8.6mg/kg、8.7mg/kg、8.8mg/kg、8.9mg/kg、9.0mg/kg、9.1mg/kg、9.2mg/kg、9.3mg/kg、9.4mg/kg、9.5mg/kg、9.6mg/kg、9.7mg/kg、9.8mg/kg、9.9mg/kg、10.0mg/kg、10.1mg/kg、10.2mg/kg、10.3mg/kg、10.4mg/kg、10.5mg/kg、10.6mg/kg、10.7mg/kg、10.8mg/kg、10.9mg/kg、11.0mg/kg、11.1mg/kg、11.2mg/kg、11.3mg/kg、11.4mg/kg、11.5mg/kg、11.6mg/kg、11.7mg/kg、11.8mg/kg、11.9mg/kg、12.0mg/kg、12.1mg/kg、12.2mg/kg、12.3mg/kg、12.4mg/kg、12.5mg/kg、12.6mg/kg、12.7mg/kg、12.8mg/kg、12.9mg/kg、13.0mg/kg、13.1mg/kg、13.2mg/kg、13.3mg/kg、13.4mg/kg、13.5mg/kg、13.6mg/kg、13.7mg/kg、13.8mg/kg、13.9mg/kg、14.0mg/kg、14.1mg/kg、14.2mg/kg、14.3mg/kg、14.4mg/kg、14.5mg/kg、14.6mg/kg、14.7mg/kg、14.8mg/kg、14.9mg/kg、15.0mg/kg、15.1mg/kg、15.2mg/kg、15.3mg/kg、15.4mg/kg、15.5mg/kg、15.6mg/kg、15.7mg/kg、15.8mg/kg、15.9mg/kg、16.0mg/kg、16.1mg/kg、16.2mg/kg、16.3mg/kg、16.4mg/kg、16.5mg/kg、16.6mg/kg、16.7mg/kg、16.8mg/kg、16.9mg/kg、17.0mg/kg、17.1mg/kg、17.2mg/kg、17.3mg/kg、17.4mg/kg、17.5mg/kg、17.6mg/kg、17.7mg/kg、17.8mg/kg、17.9mg/kg、18.0mg/kg、18.1mg/kg、18.2mg/kg、18.3mg/kg、18.4mg/kg、18.5mg/kg、18.6mg/kg、18.7mg/kg、18.8mg/kg、18.9mg/kg、19.0mg/kg、19.1mg/kg、19.2mg/kg、19.3mg/kg、19.4mg/kg、19.5mg/kg、19.6mg/kg、19.7mg/kg、19.8mg/kg、19.9mg/kg和20.0mg/kg。

劑量還可包括但不限于：約100ng/kg至約0.01mg/kg，包括：約100ng/kg、約200ng/kg、約300ng/kg、約400ng/kg、約500ng/kg、約600ng/kg、約700ng/kg、約800ng/kg、約900ng/kg、約1μg/kg、約2μg/kg、約3μg/kg、約4μg/kg、約5μg/kg、約6μg/kg、約7μg/kg、約8μg/kg、約9μg/kg、約10μg/kg。

為促進肽化合物包括抗體至細胞的遞送，可修飾肽進而改進其穿過細胞膜的能力。例如US 5,149,782公開了基因融合肽(fusogenic peptide)、離子通道形成肽、膜肽、長鏈脂肪酸和其他膜混合劑增加蛋白穿越細胞膜的轉(zhuǎn)運。這些和其他方法還描述于WO 97/37016和US 5,108,921，其在本文通過提述并入。

在進一步的方面中，提供了本文所述的活性成分用于單獨或與本領(lǐng)域認可的已知適于治療特定適應(yīng)癥的化合物組合治療疾病的用途。因此提供了本文所述活性成分在制造用于治療與異常免疫響應(yīng)相關(guān)的病癥的藥物中的用途。

此外，提供了用于治療與異常免疫響應(yīng)相關(guān)的病況的方法，其包括對受試者施用治療上有效量的使用如上文所述的試驗方法鑒定的配體。

VIII.治療或預(yù)防T細胞介導的病癥的方法

在多個其中免疫抑制為必要和/或發(fā)生自身免疫狀況的情況中，T細胞活性抑制是合意的。相應(yīng)地，在涉及不當或不合意的免疫響應(yīng)如炎癥、自身免疫和/或其他涉及該機制的病況的治療中，指明了對αβTCR/CD3復合物的靶向。在一個實施方案中，這些疾病或病癥是自身免疫和/或炎性疾病。這種自身免疫和/或炎性T細胞介導的疾病的實例包括但不限于：系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和炎性腸病(IBD)(包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩氏病(Crohn’s disease，CD))、多發(fā)性硬化癥(MS)、硬皮病和1型糖尿病(T1D)，以及其它疾病和病癥，如尋常型天皰瘡(pemphigus vulgaris，PV)、銀屑病、特應(yīng)性皮炎、乳糜瀉、慢性阻塞性肺病、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、格雷夫斯病(Graves’disease)(甲狀腺)、干燥綜合征(Sjogren’s syndrome)、格林-巴利綜合癥(Guillain-Barre syndrome)、古德帕斯徹氏綜合征(Goodpasture’s syndrome)、阿狄森氏病(Addison’s disease)、韋格納肉芽腫(Wegener’s granulomatosis)、原發(fā)性膽汁性硬化、硬化性膽管炎、自身免疫性肝炎、風濕性多肌痛、雷諾氏現(xiàn)象(Raynaud’s phenomenon)、顳動脈炎、巨細胞動脈炎、自身免疫性溶血性貧血、惡性貧血、結(jié)節(jié)性多動脈炎、白塞氏病(behcet’s disease)、原發(fā)性膽汁性肝硬化、葡萄膜炎、心肌炎、風濕熱、強直性脊柱炎、血管球性腎炎、結(jié)節(jié)病、皮肌炎、肌無力、多肌炎、斑禿和白癜風。

在一個實施方案中，這些疾病或病癥是SLE、RA或IBD。在一個實施方案中，這些疾病或病癥是MS。

在另一個實施方案中，這些疾病或病癥是異種移植相關(guān)病癥、同種異體移植相關(guān)病癥、異種妊娠相關(guān)病癥、先兆子癇或溶血性疾病。

在另一個實施方案中，這些疾病是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)和炎性腸病(IBD)(包括潰瘍性結(jié)腸炎(UC)和克羅恩氏病(Crohn’s disease，CD))、多發(fā)性硬化癥(MS)、硬皮病和1型糖尿病(T1D)，以及其它疾病和病癥，如尋常型天皰瘡(pemphigus vulgaris，PV)、銀屑病、特應(yīng)性皮炎、乳糜瀉、慢性阻塞性肺病、橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、格雷夫斯病(Graves’disease)(甲狀腺)、干燥綜合征(Sjogren’s syndrome)、格林-巴利綜合癥(Guillain-Barre syndrome)、古德帕斯徹氏綜合征(Goodpasture’s syndrome)、阿狄森氏病(Addison’s disease)、韋格納肉芽腫(Wegener’s granulomatosis)、原發(fā)性膽汁性硬化、硬化性膽管炎、自身免疫性肝炎、風濕性多肌痛、雷諾氏現(xiàn)象(Raynaud’s phenomenon)、顳動脈炎、巨細胞動脈炎、自身免疫性溶血性貧血、惡性貧血、結(jié)節(jié)性多動脈炎、白塞氏病(behcet’s disease)、原發(fā)性膽汁性肝硬化、葡萄膜炎、心肌炎、風濕熱、強直性脊柱炎、血管球性腎炎、結(jié)節(jié)病、皮肌炎、肌無力、多肌炎、斑禿和白癜風。

在特定的實施方案中，根據(jù)所述實施方案的抗體用于通過免疫抑制受試者幫助移植。這種用途緩解了移植物抗宿主病(GVHD)，一種異種移植或同種異體移植(包括但不限于：干細胞、骨髓、組織、機體部分和實體器官的移植)后常見的并發(fā)癥。組織可包括但不限于：角膜、鞏膜、骨、皮膚、血管和心臟瓣膜。機體部分可包括但不限于：面部及其部分、一個或多個臂及其部分、一只或多只手及其部分、一條或多條腿及其部分和頭皮及其部分。實體器官可包括但不限于：心臟、肺、肝、腎、胰腺、胃、小腸、大腸、睪丸和卵巢。對于已有的針對移植物抗宿主病的治療的描述，參見例如Svennilson,Bone Marrow Transplantation(2005)35:S65-S67，和其中引用的參考文獻。有利的是，本文給出的抗體可與其他可獲得的療法組合使用。

對于自身免疫疾病的治療，組合療法可包括本文所述抗體與藥物的共同施用，所述藥物與所述抗體一起包含用于預(yù)防或治療該自身免疫疾病的有效量。當所述自身免疫疾病是1型糖尿病時，組合療法可涵蓋一種或多種促進胰臟β細胞生長或增強β細胞移植的作用劑，如β細胞生長或存活因子或免疫調(diào)節(jié)抗體。當所述自身免疫疾病是類風濕關(guān)節(jié)炎時，所述組合療法可涵蓋甲氨蝶呤、抗TNF-p抗體、TNF-p受體-Ig融合蛋白、抗IL-15或抗IL-21抗體、非甾體類抗炎藥(NSAID)或疾病修飾抗風濕藥(DMARD)的一種或多種。例如，其他作用劑可以是生物作用劑如抗TNF作用劑(類英利昔單抗(infliximab)和阿達木單抗(adalimumab)或利妥昔單抗(rituximab)當所述自身免疫疾病是造血移植排斥反應(yīng)時，可施用造血生長因子(如促紅細胞生成素、G-CSF、GM-CSF、IL-3、IL-11、促血小板生成素等)或抗微生物劑(如抗生素、抗病毒、抗真菌藥物)。當所述自身免疫疾病是銀屑病時，其他作用劑可以是一種或多種tar及其衍生物、光療、糖皮質(zhì)激素、環(huán)孢菌素A、維生素D類似物、氨甲喋呤、p38有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制劑以及生物制劑如抗TNF作用劑和當所述自身免疫疾病是炎性腸病(IBD)如例如克羅恩病(Crohn’s Disease)或潰瘍性結(jié)腸炎時，其他作用劑可以是一種或多種氨基水楊酸鹽、皮質(zhì)類固醇、免疫調(diào)節(jié)劑、抗生素或生物制劑如和

治療組合可按本領(lǐng)域的技術(shù)人員認為必要的或便利的任何方式實施，且就本說明書而言，認為對于順序、量、重復或在組合中將使用的化合物的相對量沒有限制。相應(yīng)地，根據(jù)所述實施方案的抗體可配制為用于在療法中使用的藥物組合物。

下文提供的實施例僅出于闡述目的，且不應(yīng)理解為是對本文所述組合物和方法的限制。

IX.實施例

人外周血單核細胞(hPBMC)從健康成人志愿者和血液捐獻者獲得，依據(jù)Helsinki聲明簽署知情同意書。在肝素中收集hPBMC，分離并通過Ficoll密度梯度離心純化(PAA Laboratories,Germany)。

實施例1:靶向αβTCR的抗體在體外誘導細胞凋亡

對人源化αβT細胞抗體(αβmAb)GZαβTCR在人外周血單核細胞(hPBMC培養(yǎng)物)的T細胞中誘導細胞凋亡的能力進行了測試。

hPBMC從健康成人志愿者和血液捐獻者獲得，依據(jù)Helsinki聲明簽署知情同意書。在肝素中收集hPBMC，分離并通過Ficoll密度梯度離心純化(PAA Laboratories,Germany)。

將2x10⁵個hPBMC與低劑量IL-2(30U/mL)溫育至多48小時。按所示進一步處理(60Gy-照射，與同種型mAbs或GZαβTCR[100ng/mL]進行溫育)。此后，洗滌細胞并用熒光標記的mAb染色且使用FACS Calibur流式細胞儀分析。

與GZαβTCR的溫育隨時間穩(wěn)定增加了全部培養(yǎng)物中膜聯(lián)蛋白V+αβT細胞的比例(圖1A-B)。48小時后，觀察到與對照相比膜聯(lián)蛋白V+αβT細胞比例高達5倍的增加。與此同時，觀察到凋亡的膜聯(lián)蛋白V和7-AAD雙陽性細胞的持續(xù)增加(圖1B)。細胞凋亡的誘導依賴于時間和劑量二者。在不少于100ng/mL的劑量和溫育48小時后觀察到最大效力。體外48小時后膜聯(lián)蛋白V陽性的αβT細胞的最大值為約10％。細胞凋亡的誘導依賴于時間和劑量二者。在劑量≥100ng/mL和溫育48小時后觀察到最大效力。

實施例2:αβT細胞抗體是活化的αβT細胞中細胞凋亡的強誘導劑

hPBMC以1×10^6細胞/ml的濃度在補充了10％熱滅活FCS(Biochrom,Germany)、L-谷氨酰胺(4mM)和青霉素(50U/ml)/鏈霉素(50μg/ml)的RPMI1640培養(yǎng)基中懸浮并在96孔U底微滴定板(Costar,USA)中鋪板。平板在37℃、5％CO2、95％濕度溫育。

為測試αβmAb處理誘導活化的hPBMC中細胞凋亡的效力，以1:1的珠比細胞比率根據(jù)制造商的方案(Invitrogen,Darmstadt,Germany)用抗CD3/CD28珠(Human T-Activator CD3/CD28)刺激2x10⁵PBMC24小時。最初的24小時溫育后，將100ng/mL GZαβTCR添加至培養(yǎng)物且隨后進一步溫育細胞48小時。

細胞凋亡的檢測使用PE-膜聯(lián)蛋白V細胞凋亡檢測試劑盒I(BD Biosciences,Germany)根據(jù)制造商的方案實施。顯示了全部時間點和處理的αβT細胞代表性的膜聯(lián)蛋白V和7-AAD染色(圖2A)。

與GZ-αβTCR抗體溫育48小時后，T細胞的預(yù)活化將膜聯(lián)蛋白V+αβT細胞的百分比增加至50.90％(+/-12.50％)(相比未刺激的對照hPBMC中少于2％)(圖2A，圖2B)。誤差棒代表四次獨立實驗的SEM(*P<0.05；**P<0.01，使用未配對的雙尾t檢驗和GraphPad Prism軟件(Graphpad Software,USA))。

盡管培養(yǎng)物中αβT細胞的比例由于所證明的細胞凋亡而減少，γδT細胞大多未受影響，在與GZ-αβTCR溫育過程中其比例增加(圖2C)。

細胞內(nèi)FACS染色證明αβT細胞中細胞凋亡的誘導與促炎性細胞因子如IFN-γ、IL-4和TNF-α的增加無關(guān)(圖2D)。這些實驗使用FIX&PERM(ADG,Austria)根據(jù)制造商的方案與下列抗體共同實施：FITC標記的IFN-γ(B27)和IL-4(8D4-8)(BioLegend,Germany)和APC標記的TNF-α(MAb 11)(BD Biosciences,Germany)。這些數(shù)據(jù)在FACS Calibur或LSRII流式細胞儀上采集并使用CellQuest software(BD Biosciences,USA)分析。

實施例3:GZ-αβTCR-處理對hu-PBL鼠類模型中外周血中細胞的影響。

NOD-scid IL2rγ^null小鼠(NOD-scid IL2受體γ鏈敲除小鼠；NSG小鼠；NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ小鼠)是在IL-2受體γ鏈基因攜帶靶向的突變的NOD-scid小鼠，且在用于研究人胰島同種異體反應(yīng)性的模型(huPBL模型)中使用。這些小鼠之前已證明允許高水平的huCD45+細胞植入，伴隨較低的供體間和供體內(nèi)可變性(King等人，Clin Exp Immunol 2009(157))。注射hPBMC細胞三周后，外周血中看到的huCD45+細胞幾乎都是(>98％)CD3+且保留其功能。此外，在該時間段γδT細胞的植入低于huCD45+細胞的1％。此外，注射hPBMC三周后，直至第30天脾中huCD45+細胞的百分比才達到平臺，這為研究體內(nèi)αβmAb治療效果提供了7天的時間框。

從Jackson Laboratory(Maine,USA)獲得6-20周齡的NSG小鼠且在單氣流籠中于特定的無病原體條件下飼養(yǎng)。全部實驗NSG小鼠靜脈內(nèi)接受2x10⁷hPBMC(通過尾靜脈)，并在三周后通過FACS染色評估了小鼠外周血中huCD45+細胞的植入。隨后將小鼠匹配為兩組并在第0天用GZ-αβTCR(20μg/小鼠)，或在第0和3天用GZ-αβTCR(20μg/小鼠)，或以PBS(100μL)作為對照進行i.v.注射(圖3A)。

在對照注射、GZ-αβTCR的單劑量(SD)或重復應(yīng)用(RA)后的第0、3和6天，對外周血實施了人CD45+、CD4+、CD8+和γδT細胞分析(圖3B)。GZ-αβTCR的單次注射在第3天顯著減少了血液中人造血細胞的百分比(圖3B,p<0.001)，但該效果在第6天已不明顯且治療小鼠(n＝9)中的植入與對照小鼠(n＝8；圖3B)中的植入無差異。然而，在第6天當與對照(PBS注射；n＝9)小鼠相比時，在第0天和第3天GZ-αβTCR的重復注射(圖3A)導致具有顯著較低水平的植入huCD45+細胞的小鼠(n＝9)(圖3B,p<0.001)。

相似地，單次注射后大多為CD4+αβT細胞的短期減少(圖3B)在第6天不再明顯，而在第6天與PBS處理的對照小鼠相比，GZ-αβTCR的重復應(yīng)用導致CD4+αβT細胞明顯、持續(xù)且顯著(p<0.05)的下降(圖3B)。相應(yīng)地，其減少了CD8+αβT細胞的相對比例(圖3B)。

將外周血細胞的CD3+αβT細胞中CD4+和CD8+細胞的百分比設(shè)置為100％，且直方圖顯示與在第0天的初始值相比，人CD4+細胞(右上)的百分比改變和人CD8+細胞的(右下)的百分比改變(圖3B)。

實施例4：GZαβTCR-處理對hu-PBL鼠類模型中外周血、脾和骨髓細胞的影響。

使用單次劑量的GZ-αβTCR治療6天后，外周血中植入的huCD45+和CD3+T細胞水平未改變(實施例3)。同樣，脾和骨髓中huCD45+細胞的植入與PBS處理的對照相比無偏差(圖4)。此外，在任何測試的器官中未看到CD4+/CD8+T細胞比率的差異。

然而，在處理后的第6天與對照小鼠相比，重復處理(兩劑量)不僅在外周血(p<0.001)也在脾中(p<0.0001)減少了huCD45+細胞。重復處理未減少這些小鼠骨髓中的huCD45+細胞水平(圖4)。

此外，在第6天，這種使用GZ-αβTCR的重復處理優(yōu)先減少外周血(p<0.01)和脾(p<0.01)中的CD4+T細胞(圖4)。

有趣的是，當huCD45+細胞的整體植入水平未受影響時，在骨髓中也觀察到相同的效果(p<0.05)。因此，CD4+αβT細胞的減少導致外周血(p<0.01)、脾(p<0.01)和骨髓(p<0.05,圖4)中CD8+αβT細胞比例的相對增加。

在huCD45+細胞中CD3+T細胞和αβT細胞的比例整體下降的同時，單次GZ-αβTCR注射后三天在外周血中觀察到γδT細胞比例的增加(圖3B,p<0.01)。單次注射后，相比PBS處理的小鼠，GZ-αβTCR治療的小鼠中γδT細胞的比例在第3天(圖3B,p<0.01)和第6天(圖3B,p<0.01)都有所升高。αβmAb的多次應(yīng)用后，從第3天到第6天在外周血中看到了γδT細胞比例進一步的顯著增加(圖3B,p<0.05)。

γδT細胞/CD3+T細胞比例的顯著增加還在GZ-αβTCR治療后第6天的脾和骨髓中觀察到。因此，單次應(yīng)用和多次應(yīng)用在第6天導致脾(p<0.01和p<0.05)和骨髓(p<0.01和p<0.05)中顯著更高的γδT細胞比例。

實施例5：重復的αβmAb應(yīng)用導致hu-HSC模型中的T細胞調(diào)節(jié)。

人CD34+干細胞源自G-CSF動員的外周血干細胞盈余，所述G-CSF動員的外周血干細胞盈余來自通過CD34+選擇已減少了T細胞的親代供體(CliniMACS,Miltenyi,Germany)。依照Helsinki聲明，關(guān)于科學用途的知情同意書已從全部捐贈者/供體獲得。

NSG小鼠(參見上文)使用¹³⁷Cs輻射器以亞致死劑量輻射(250cGy)(Gammacell 1000Elite；MDS Nordion,Fleurus,Belgium)。四小時后，小鼠接受1x10⁶人捐贈者衍生的CD34+造血干細胞。重組小鼠接受每只小鼠每周20μg由Merck(Germany)慷慨提供的Fc-IL-7融合蛋白的靜脈內(nèi)注射。這些CD34+植入小鼠顯示健康人免疫系統(tǒng)的全部造血譜系。

在第6天，與對照不同的是，重復的GZ-αβTCR治療(3劑量，參見圖5A中的實驗示意圖)顯著減少了外周血、脾和骨髓(各自p<0.05)中的CD3+T細胞。此外，CD3+T細胞中的γδT細胞比例在αβmAb治療后顯著增加(血液p<0.05，脾p<0.0001，骨髓p<0.05,圖5B)。

GZ-αβTCR治療后CD4+T細胞的優(yōu)先減少在該模型的脾中顯著(p<0.05)，而在骨髓中的下降則不顯著(圖5B)。