本發(fā)明涉及一種層析方法。更接近地，本發(fā)明涉及一種在用于純化目標分子優(yōu)選單克隆抗體mAbs的層析方法中除去大的污染物（例如病毒）的方法，通過使用具有薄的外層和用吸收所述mAbs或其部分的配體官能化的核的專門設計的層析珠。

發(fā)明背景

免疫球蛋白代表在世界范圍內制造或開發(fā)中的最流行的生物藥物產(chǎn)品。對該特別治療市場的高商業(yè)要求和由此產(chǎn)生的價值導致重點被放在藥物公司上以在控制相關成本的同時使其相應的mAb制造方法的生產(chǎn)率最大化。

在大多數(shù)情況下，親和層析用作在純化這些免疫球蛋白分子例如單克隆或多克隆抗體中的關鍵步驟之一。特別感興趣種類的親和試劑為能夠特異結合到免疫球蛋白分子的不變部分的蛋白質，這種相互作用獨立于抗體的抗原-結合特異性。這種試劑可以廣泛用于從不同樣品（例如但不限于血清或血漿制劑或細胞培養(yǎng)物衍生的原料）親和層析回收免疫球蛋白。這種蛋白質的例子為包含能夠結合到來自不同物類的IgG免疫球蛋白的Fc和Fab部分的域的葡萄球菌蛋白質A。

由于其高親和性和選擇性，發(fā)現(xiàn)基于葡萄球菌蛋白質A (SpA)的試劑在生物技術領域中（例如在用于捕獲和純化抗體以及用于檢測的親和層析中）廣泛使用。當前，基于SpA的親和介質可能為最廣泛使用的親和介質，其用于從不同樣品（包括來自細胞培養(yǎng)物的工業(yè)原料）分離單克隆抗體及其片段。因此，包含蛋白質A-配體的各種基質為市售可得的，例如為天然蛋白質A形式（例如蛋白質A SEPHAROSE?，GE Healthcare，Uppsala，Swenden）且還由重組蛋白質A（例如rProtein A SEPHAROSE?，GE Healthcare）構成。更特別地，在商業(yè)重組蛋白質A產(chǎn)品中實施的基因操作的目的在于促進其附接到載體。

病毒除去為在mAbs的下游純化中的必要純化步驟。病毒除去通過使mAb進料流過具有限定截流的專用病毒除去過濾器常規(guī)地實施，因此mAb經(jīng)過過濾器而病毒的主要部分無法通過。

不管在免疫球蛋白生產(chǎn)期間的病毒除去的現(xiàn)有技術，仍然需要改進的產(chǎn)品和方法。

發(fā)明概述

第一方面，本發(fā)明涉及用于從較大污染物例如病毒純化含免疫球蛋白蛋白質或其部分的方法，其包括：a）使含免疫球蛋白樣品與包含具有限定的孔尺寸的薄蓋(lid)和提供有親和配體的限定的孔尺寸的內核的層析珠接觸；b）將所述含免疫球蛋白蛋白質吸收到所述配體；c）清洗所述珠以除去任何污染物；和d）洗脫所述珠以釋放捕獲的含免疫球蛋白蛋白質或其部分。

所述層析珠的平均直徑尺寸為10-500μm，例如10-50μm，50-100μm或250-450μm。所述層析珠可以例如用于精加工、捕獲且在細胞培養(yǎng)物之后的中游使用。

根據(jù)例如高離析度或快速傳質所需的具體應用，或當進料粘度高時，選擇所述層析珠的尺寸。所述層析介質的平均尺寸例如計算為體積加權的中值直徑。

所述蓋的厚度為1-8μm，優(yōu)選3-5μm。所述蓋厚度可以根據(jù)全部珠尺寸有利地變化。例如，在一些實施方案中，具有較薄蓋以便保持高的結合容量是合乎需要的。在其他實施方案中，當病毒對數(shù)降低比結合容量更重要時，設計具有較厚蓋的層析介質為有利的。

當mAb或Fab為目標時，所述蓋優(yōu)選為無活性的，即不提供有任何相互作用的配體。所述蓋厚度可以通過共焦顯微鏡，通過切片機切片或常規(guī)顯微鏡測量。

所述蓋和核的孔尺寸對應于0.1-1的K_D，優(yōu)選0.3-0.7，其用Mw 110 kDa的葡聚糖作為探針分子測量。本發(fā)明適用于大于20000D的目標分子，例如約150000D的Mab。所述孔尺寸對容量而且對選擇性具有重要性。在溶脹材料例如瓊脂糖和其他多糖凝膠中，所述孔尺寸最好通過反向排阻層析方法評估，其中測定探針分子（例如Mw 110 kDa的葡聚糖）可通過的體積分數(shù)K_d。在例如L Hagel等人:J Chromatogr A 743，33-42(1996)中描述了這種方法。

所述蓋和核的孔尺寸可以為相同的或不同的。對于Mabs和Fabs的純化，優(yōu)選為相同的。

在優(yōu)選的實施方案中，所述蓋和核的孔隙率為0.30-0.95，優(yōu)選約0.60-0.85。所述蓋和核的孔隙率可以為相同的或不同的。

在所述蓋和核中的孔隙率或孔密度差可以通過產(chǎn)生層析介質的條件的變化獲得，例如使用不同的量和百分數(shù)的珠材料、交聯(lián)劑、鹽和收縮劑。所述層析介質的孔隙率也可以通過在珠顆粒的不同層中選擇性加入將物理和化學降低孔隙率的不同的帶電或不帶電的化學實體來改性。

根據(jù)本發(fā)明，所述蓋和核由瓊脂糖制成，但還可以由其他天然或合成聚合物制成。

優(yōu)選地，所述親和配體為蛋白性親和配體，所述配體最優(yōu)選為蛋白質A或由蛋白質A衍生的親和配體。所述配體可以為單體、二聚物或任何多聚物。對于Mabs，配體優(yōu)選為五聚物(Z4)。

在另一個實施方案中，所述親和配體為蛋白質L或由蛋白質L衍生的親和配體。在這種情況下，所述免疫球蛋白為具有除了天然存在的抗體以外的其他結構的單克隆抗體，例如單特異性抗體（抗原結合片段，F(xiàn)(ab')2片段，F(xiàn)ab'片段，單鏈可變片段，雙-scFv，單域抗體）。

在又一個實施方案中，所述親和配體為蛋白質G或由蛋白質G衍生的親和配體。

所述層析珠可以在柱中提供且所述污染物在流過中獲得。或者，所述層析珠以間歇模式提供。所述層析珠可以為磁性的。在又一個備選方案中，所述層析珠以流化床模式提供。

根據(jù)本發(fā)明的方法尤其適用于從Mab進料中除去污染病毒。在抗體的下游加工中，要求調查和確保將可能存在于進料中的病毒除去。獲得官方贊成例如來自FDA的贊成為一個關鍵問題。病毒除去的有效步驟顯著簡化該方法的驗證。本發(fā)明的方法可以優(yōu)選用于獲得不含污染病毒的治療藥物/蛋白質（尤其是Mabs）的驗證過程。

如實施例章節(jié)將所示，本發(fā)明的方法提供與現(xiàn)有技術方法相比顯著改進的病毒降低。

應當理解術語“含免疫球蛋白蛋白質”包括抗體和融合蛋白質或包含抗體部分或Fc鏈以及抗體片段例如FAbs的綴合物和變異抗體，只要它們基本上保持抗體的結合性質。所述含免疫球蛋白蛋白質可以為單特異性的或雙特異性的（三官能團抗體，化學連接的F(ab')2，雙特異性的T-細胞銜接劑）。所述抗體可以為單克隆抗體或多克隆抗體。所述抗體優(yōu)選為來自哺乳動物物類例如人類的IgG、IgA和/或IgM。

所述術語層析介質、層析珠、凝膠或樹脂涵蓋相同概念且可互換使用。

附圖簡述

圖1顯示了如下描述的試驗1的層析圖，其中將1mg純mAb和1.2x10⁷pfu病毒注射到原型LS-02213C上。

圖2顯示了試驗2的層析圖，其中將1.5mg與噬菌體混合的半純化mAb注射到原型LS-02213C上。

圖3顯示了層析圖，其中將1.5mg與噬菌體混合的半純化mAb注射到商業(yè)層析樹脂MabSelect Sure LX上。

發(fā)明詳述

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，病毒在mAb捕獲步驟中通過使用具有限定的孔尺寸的薄的無活性的蓋和在珠的核內部的吸附性配體的層析珠除去。這將使病毒不可能穿透所述蓋，且最后進料中的病毒將隨流過級分出來，而mAb將擴散通過蓋層且吸收到珠的核內部的配體。在柱清洗之后，mAb隨后用乙酸常規(guī)洗脫。

將與附圖和實驗部分更緊密地聯(lián)系來描述本發(fā)明。

在本發(fā)明中，合成兩種層析珠原型：

具有無活性外層和在珠內部的蛋白質A（Z4）配體的蛋白質A核珠，稱為原型LS-02213A、B和C。

具有無活性外層和在珠內部的蛋白質L配體的蛋白質L核珠，稱為原型LS-002480。

噬菌體Φx174（大腸桿菌噬菌體ATCC? 13706-1?）用作試驗病毒。由于其小直徑25nm，通過排阻從mAb除去這種病毒具有挑戰(zhàn)性。這種病毒顆粒具有二十面體結構。

噬菌體Φx174感染且在大腸桿菌（E.coli）中增殖。Φx174的檢測可以通過用E.coli作為宿主的噬斑瓊脂覆蓋試驗進行。這種試驗極其靈敏，因為其可以檢測單個病毒顆粒。

在本發(fā)明中，Φx174在ATCC? 13706?大腸桿菌菌株C（也從ATCC購買）中增殖。將所述噬菌體純化且用噬菌體侵入mAb樣品。將這個樣品加載到包含具有無活性層和在珠內部的親和配體的核珠的層析柱上。在樣品施加之后清洗該柱且最后將mAb洗脫。在層析期間，收集級分以測定在選擇級分中的病毒滴定量。測定流過級分、第一清洗級分和mAb洗脫級分中的病毒滴定量。計算mAb洗脫級分的病毒對數(shù)降低。

實驗部分

實施例1：產(chǎn)生蓋/核珠

部分溴化和蓋失活的烯丙基化高流動瓊脂糖（HFA）根據(jù)US 6 602 990，30μmol烯丙基/mL凝膠，Kd：0.675，d50v：87.6，Dw：70.3制備。

使HFA珠在外層中失活以形成三種不同的蓋厚度尺寸2、4和6μm。

部分溴化

計算加入的溴的量以使蓋大于目標蓋厚度0.5μm。因為經(jīng)驗顯示由于溴損失，蓋常常變得比目標厚度更薄。

蓋)：60mL來自LS-001647A的烯丙基化HFA 35Z 用5xGV蒸餾水清洗，且隨后轉移排到1L圓底燒瓶中。加入450mL蒸餾水且應用機械螺旋槳攪拌。在磁力攪拌下在100mL E-燒瓶中制備15μL溴在100mL蒸餾水中的溶液。隨后在劇烈攪拌（200rpm）下在~60秒期間加入溴溶液。將燒瓶留在室溫下15分鐘。凝膠隨后用12xGV蒸餾水清洗。

蓋)：160mL來自LS-001647A的烯丙基化HFA 35Z用5xGV蒸餾水清洗，且隨后轉移排到2L圓底燒瓶中。加入1200mL蒸餾水且應用機械螺旋槳攪拌。在磁力攪拌下在100mL E-燒瓶中制備68μL溴在100mL蒸餾水中的溶液。隨后在劇烈攪拌（300rpm）下在~60秒期間加入溴溶液。將燒瓶留在室溫下15分鐘。凝膠隨后用12xGV蒸餾水清洗。

蓋)：60mL來自LS-001647A的烯丙基化HFA 35Z用5xGV蒸餾水清洗，且隨后轉移排到1L圓底燒瓶中。加入450mL蒸餾水且應用機械螺旋槳攪拌。在磁力攪拌下在100mL E-燒瓶中制備35μL溴在100mL蒸餾水中的溶液。隨后在劇烈攪拌（300rpm）下在~60秒期間加入溴溶液。將燒瓶留在室溫下15分鐘。凝膠隨后用12xGV蒸餾水清洗。

使活化蓋失活

A(2μm蓋)：將來自上文A的部分活化凝膠轉移排到500mL圓底燒瓶中。加入53.7mL蒸餾水和6.34mL的50% NaOH（1M），且應用機械螺旋槳攪拌。將燒瓶浸入到50℃水浴中14.5h。凝膠隨后用10xGV蒸餾水清洗。

蓋)：將來自上文B的部分活化凝膠轉移排到500mL圓底燒瓶中。加入143.1mL蒸餾水和16.9mL的50% NaOH（1M），且應用機械螺旋槳攪拌。將燒瓶浸入到50℃水浴中14.5h。凝膠隨后用10xGV蒸餾水清洗。

蓋)：將來自上文C的部分活化凝膠轉移排到500mL圓底燒瓶中。加入53.7mL蒸餾水和6.34mL的50%NaOH（1M），且應用機械螺旋槳攪拌。將燒瓶浸入到50℃水浴中15h。凝膠隨后用10xGV蒸餾水清洗。

滴定

用足夠的水清洗凝膠。用Teflon立方塊測量1.0mL凝膠且轉移到具有9ml蒸餾水的抽濾瓶中。將溴在水中的飽和溶液加入直到黃顏色由于Br₂過量而持續(xù)存在。該樣品留在磁力攪拌下5min。將該樣品在磁力攪拌下放在真空（吸水）下以除去過量的溴。該樣品隨后通過用10mL蒸餾水沖洗燒瓶轉移到滴定燒杯中。加入2-3滴濃HNO₃且開始用0.1M AgNO₃滴定以間接測量烯丙基含量。結果以μmol/mL凝膠給出。

將烯丙基化凝膠LS-001647A再次滴定（#2），與此同時確定剩余的烯丙基含量。這次測定較低的烯丙基含量，25.1而不是29.8μmol 烯丙基/mL凝膠?；谠紲y定的LS-001647A的烯丙基含量即29.8μmol烯丙基/mL凝膠計算部分活化的溴的全部加入量。通過使用剩余烯丙基含量和初始烯丙基含量25.1μmol/mL凝膠評估實際的蓋厚度。蓋厚度無法完全為目標厚度，但仍然獲得三種不同的水平，這是令人滿意的。蓋厚度可以使用共焦顯微鏡檢測。

實施例2：構建蛋白質A核珠

在這個實施例中，將蛋白質A固定到具有不同蓋失活的烯丙基化HFA的核中。

使用蛋白質Z的四聚物Z(N3A，N6D，N23T)₄–Cys(以下稱為Z4)作為蛋白質A的配體。

凝膠的活化

相同步驟用于LS-001840A、B和C。

將55mL(g)干凝膠放在具有55ml蒸餾水和2.2g NaOAc的E-燒瓶中。旋轉燒瓶隨后加入溴的飽和水溶液直到黃顏色持續(xù)存在。隨后加入甲酸鈉以猝滅過量的溴。

還原蛋白質

向55mL Z4（51.7mg/mL，基于AAA）中，加入570mg NaHCO₃(應當為465mg)、58mg Na₂CO₃、481mg NaCl和20mg EDTA。震蕩E-燒瓶且加入212mg DTE，且隨后將燒瓶放到震蕩臺上。還原在填充超環(huán)(super loop)之前進行90分鐘。

脫鹽

使用連接到?KTA系統(tǒng)的Sephadex G-25柱(~400mL)以使四聚物脫鹽。在開始運行之前，柱用0.15M NaCl/1mM EDTA平衡直到導電性和pH穩(wěn)定。52mL還原溶液產(chǎn)生90.18g脫鹽四聚物。收集級分9-17（~90mL）。

通過UV測定蛋白質濃度

將該脫鹽溶液稀釋20倍且具有在276nm的0.286吸光度。這等于26.4mg/mL的蛋白質濃度（87%產(chǎn)率）。

耦合(Coupling)

該活化的凝膠用3xGV 0.1M磷酸鹽/1mM EDTA pH8.6清洗。

A：將51mL凝膠(LS-001840A)+14mg Z4/mL凝膠(27.1mL)+10.5mL脫鹽緩沖液(應當為8.615mL)+1.45M Na₂SO₄(17.86g)在250mL燒瓶中混合。

B：將51mL凝膠(LS-001840B)+15mg Z4/mL凝膠(29.0mL)+6.68mL脫鹽緩沖液+1.45M Na₂SO₄(17.86g)在250mL燒瓶中混合。

C：將51mL凝膠(LS-001840C)+16mg Z4/mL凝膠(31.0mL)+4.74mL脫鹽緩沖液+1.45M Na₂SO₄(17.86g)在250mL燒瓶中混合。

應用機械螺旋槳攪拌且將燒瓶浸入到33℃水浴中3h。

失活

凝膠用3xGV蒸餾水清洗。將凝膠+1GV 0.1M磷酸鹽/1mM EDTA/7.5%硫代甘油pH8.5混合且將燒瓶留在室溫下17h。凝膠隨后交替用1xGV 0.5M HAc和2xGV 0.1M TRIS/0.15M NaCl pH8.5且隨后用10xGV mL蒸餾水清洗三次。

干燥方法

通過單次測量測定原型的干重。使用Teflon立方塊測量1mL凝膠且轉移到預干燥和預稱重的玻璃過濾器。將凝膠抽干且用丙酮清洗兩次。干燥在真空下在50℃的烤箱中實施過夜，且通過減去預稱重的玻璃過濾器的質量確定凝膠的干重。

氨基酸分析

將1mL各種凝膠干燥并分析。

干重：81.9mg/mL　　　 　配體密度：3.8mg/mL

LS-002213B干重：83.5mg/mL　　　　配體密度：5.0mg/mL

LS-002213C干重：82.4mg/mL　　　　配體密度：5.0mg/mL

實施例3：構建蛋白質L核珠

將蛋白質L固定到具有3.5μm蓋失活的烯丙基化HFA的核中。

參考文獻：Structure of Peptostreptococcal Protein L and Identification of a Repeated Immunoglobulin Light Chain-binding Domain, The Journal of Biological Chemsitry, 第 267卷, 第18期, 6月25日發(fā)行, 第12820-12825頁,1992, William Kastern, Ulf Sjobring和Lars Bj?rck。

凝膠的活化

將來自LS-001840B的55mL(g)的干凝膠放在55ml的蒸餾水和2.2g的NaOAc的E-燒瓶中。將所述燒瓶旋轉隨后加入溴的飽和的水溶液直到黃顏色持續(xù)存在。隨后加入甲酸鈉以除去過量的溴。

耦合

活化的凝膠用3xGV 0.2M磷酸鹽/1mM EDTA pH 11.5清洗。

將52mL凝膠(LS-001840B)+15mg PrL /mL凝膠(15.2mL)+21.2 mL耦合緩沖液+1.30M Na₂SO₄(16.32g)在250mL燒瓶中混合。

應用機械螺旋槳攪拌且將燒瓶浸入到30℃水浴中17.5h。

失活

凝膠用3xGV蒸餾水清洗，且隨后用4xGV 0.1磷酸鹽/1mM EDTA pH 8.5清洗。將凝膠+1GV 0.1M磷酸鹽/1mM EDTA/7.5%硫代甘油pH 8.5混合且將燒瓶在攪拌下浸入45℃的水浴中2h。凝膠隨后交替用3xGV 0.1M HAc和3xGV 0.1M TRIS/0.15M NaCl pH 8.5且隨后用10xGV mL蒸餾水清洗三次。

干燥方法

通過單次測量測定原型的干重。使用Teflon立方塊測量1mL凝膠且轉移到預干燥和預稱重的玻璃過濾器中。將凝膠抽干且用丙酮清洗兩次。干燥在真空下在50℃的烤箱中實施過夜，且通過減去預稱重的玻璃過濾器的質量確定凝膠的干重。

氨基酸分析，AAA

將1mL凝膠干燥并分析。

LS-002480 干重：　　　　91.4mg/mL凝膠

配體密度：　　11.9mg PrL/mL凝膠

多點附接：　　10.6賴氨酸/附接凝膠的PrL

當計算配體密度和多點附接程度時，使用氨基酸丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸的AAA數(shù)據(jù)。

實驗4：噬菌體和細菌的增殖

營養(yǎng)素瓊脂

將23g營養(yǎng)素瓊脂和5.0g NaCl稱重到1000mL玻璃燒杯中。玻璃燒杯填充有1000milli-Q水，且將溶液混合。溶液在121℃下高壓殺菌15分鐘。在高壓殺菌之后，將溶液儲存在45℃水浴中。

營養(yǎng)素肉湯

將16g營養(yǎng)素肉湯和5.0g NaCl稱重到1000mL玻璃燒杯中。玻璃燒杯填充有1000milli-Q水，且將溶液混合。溶液在121℃下高壓殺菌15分鐘。在高壓殺菌之后，將溶液儲存在45℃水浴中。

頂層瓊脂(top agar)

將7.7g營養(yǎng)素瓊脂和5.0g NaCl稱重到1000mL玻璃燒杯中。玻璃燒杯填充有1000milli-Q水，且將溶液混合。溶液在121℃下高壓殺菌15分鐘。在高壓殺菌之后，將溶液儲存在45℃水浴中。

制備瓊脂板

10cm板通過將10mL的45℃營養(yǎng)素瓊脂加到各個板中制備。將該板儲存在5℃下。

將1mL營養(yǎng)素肉湯加到來自ATCC的包含大腸桿菌菌株C的冷凍干燥小瓶中。還加入50μL甘油且將小瓶混合充分。將小瓶儲存在-70℃下。

為了增殖細菌，將血清學環(huán)放在冷凍的細菌中且一些細菌在環(huán)中捕獲。將包含細菌的環(huán)拉到瓊脂板上。將瓊脂板放在37℃培養(yǎng)箱中過夜。第二天在瓊脂板中看到細菌生長，且細菌從血清學環(huán)刮下并放在包含3mL營養(yǎng)素肉湯的管中。所述管在環(huán)境震蕩器中孵化18h且在18小時之后產(chǎn)生細菌生長的混濁發(fā)展。

將1mL營養(yǎng)素肉湯移液到包含大腸桿菌噬菌體ATCC? 13706-01? (Φx174)的冷凍干燥小瓶中。將10cm瓊脂板在37℃下預熱1小時。將2滴3mL細菌培養(yǎng)液與2.5mL頂層瓊脂混合。將該等分部分傾注到預熱板上，且使板凝固。將0.5mL再水合的噬菌體溶液血清學移液到瓊脂板中的頂層瓊脂的表面上。將瓊脂板孵化過夜且看到大腸桿菌細胞溶解。將軟瓊脂表面刮到無菌的10mL離心管中。懸浮液在4000rpm下離心10分鐘，且上清液通過0.2μm的無菌過濾器無菌過濾到無菌的1.5mL收集管中。管中的增殖和過濾的噬菌體溶液儲存在5℃下。

為了測定增殖噬菌體溶液的病毒滴定量，使用噬斑覆蓋試驗。

細菌如上增殖，但當細胞在肉湯管中生長時，生長在3小時之后停止。8個瓊脂板在37℃下預熱。通過移液10μL噬菌體儲液且與990μL營養(yǎng)素肉湯混合在無菌的1.5mL管中連續(xù)稀釋噬菌體。這是10²稀釋。

通過每次稀釋取100μL且與900μL營養(yǎng)素肉湯混合將噬菌體進一步連續(xù)稀釋到高達10⁹。

將每次稀釋的100μL噬菌體與300μL細菌在10mL無菌離心管中混合，孵化15分鐘且隨后將3mL的溫熱（45℃）的頂層瓊脂加到每個管中。將與細菌和噬菌體混合的頂層瓊脂傾注到瓊脂板上。將頂層瓊脂在室溫下凝固且放入37℃培養(yǎng)箱中3小時。在3小時之后可看到可見的3-5mm噬斑且在某一稀釋下這些噬斑在菌落計數(shù)器中可計數(shù)。在10⁷稀釋下發(fā)現(xiàn)17個噬斑，意味著儲液中的病毒濃度為17x10⁷/0.1ml=17x10⁸=1.7x10⁹pfu(噬斑形成單位)/mL。

實施例5：通過層析從mAb樣品中除去病毒

層析系統(tǒng)　　?KTA avant 25 sn 1536118，GE Healthcare

柱　　　　　Tricorn5/100，GE Healthcare

樹脂　　　　LS-02213C核珠4.5-5μm OH-蓋

配體： 5.0mg Z4/mL凝膠

基底基質： HFA

參考樹脂　　MabSelect SuRe LX，GE Healthcare

樣品：

mAb，純的3.0mg/mL，用Mabselect SuRe、Capto S純化，以除去酸和堿變體且Capto粘附以除去HCP和DNA

mAb 5，半純化的15.0mg/mL，僅用MabSelect SuRe純化

試驗1

將15μL噬菌體儲液（1.7x10⁹pfu/mL）、1.0mL的3.0mg/mL在PBS中的純mAb和0.48mL PBS溶液在1.5mL管中混合。使用0.2μm無菌過濾器無菌過濾該溶液。這為初始材料。注意到無菌過濾可能降低噬菌體的量。試驗1在本發(fā)明的原型上實施。

試驗2和3

將50μL噬菌體儲液（1.7x10⁹pfu/mL）、1.0mL15mg/mL PrA純化的Mab（不純的）和3.95mL PBS溶液在10mL離心管中混合。通過0.45μm過濾器過濾溶液。這為初始材料。注意到0.45μm過濾可能降低噬菌體的量。試驗2在本發(fā)明的原型上實施。試驗3為在商業(yè)樹脂上實施的對比實施例。

層析

兩個tricorn柱用8mL/min流速的在10mM NaCl中的原型LS-002213C裝填。床高度調節(jié)到5.2cm且將頂部適配器調節(jié)到低于標記~1mm。在柱中獲得1.0mL樹脂。對MaBSelect SuRe LX樹脂實施相同的裝填步驟。

使用10mL容量瓶在1.0mL/min下檢查體系流動。在0.25mL/min（4min停留時間）下平衡該柱5cv。

使用500μL毛細管環(huán)將具有噬菌體的500μL Mab混合物注射到各個柱。開始具有0.5mL級分的級分收集。

在注射之后，柱用5cv PBS在0.25mL/min下接著用5cv 0.1M NaOAc pH 6.0在0.25mL/min下清洗。mAb用5cv 0.1M HAc在0.25mL/min下洗脫，且級分收集器使用watch commandos（峰起點>50mAU、峰端點<100mAU）僅使洗脫峰峰分級。柱用2cv 0.1M NaOH在0.25mL/min下CIP:ed（包括在1cv之后保持20min時間），接著用PBS 5cv在0.25mL/min下平衡。

將級分b10和b11中的mAb洗脫峰合并（如果需要）。

病毒計數(shù)

細菌如上增殖，但規(guī)模為9mL。在3小時后停止生長。在37℃下預熱90個瓊脂板。通過移液100μL級分且與900μL營養(yǎng)素肉湯混合在無菌1.5mL管中連續(xù)稀釋所選擇的各種級分和初始樣品。樣品通過取100μL各種稀釋液且與900μL營養(yǎng)素肉湯混合進一步連續(xù)稀釋到高達10⁷。

將100μL各種稀釋樣品與300μL細菌在10mL無菌離心管中混合，孵化15分鐘且隨后將3mL溫熱（45℃）頂層瓊脂加到各個管中。將與細菌和噬菌體混合的頂層瓊脂傾注到瓊脂板上。頂層瓊脂在室溫下凝固且放入37℃培養(yǎng)箱中3小時。在3小時之后可看到可見的3-5mm噬斑且在某一稀釋下這些噬斑在菌落計數(shù)器中可計數(shù)。

結果

圖1顯示來自試驗1的層析圖，其中與噬菌體混合的1mg純mAb注射到原型LS-02213C。用于噬斑覆蓋試驗的選擇級分：初始樣品、A1、A2、A3、A4和mAb洗脫峰B10和B11（合并體積=0.56mL）。

在表1中可以看到計數(shù)噬斑（pfu）的方案。黑體數(shù)字為用于計算的數(shù)字。

表1. 在不同稀釋下來自層析圖的選擇級分的pfu計數(shù)方案，試驗1。

質量平衡計算，試驗1：

初始樣品：2.4x10⁶pfu/0.1x0.5=1.2x10⁷pfu加載的

A1：1.1x10⁶/0.1x0.5= 5.5x10⁶pfu

A2：5.0x10⁵/0.1x0.5=2.5x10⁶pfu

A3：2.9x10⁵/0.1x0.5=1.45x10⁶pfu

A4：8x10⁴/0.1x0.5=0.4x10⁶pfu

全部A1-A4=9.85x10⁶pfu，產(chǎn)率=0.985/1.20*100=82%

洗脫級分：1.8x10²/0.1x0.56mL=1.0x10³pfu

降低：log₁₀(1.2x10⁷/1.0x10³)=4.1

Mab產(chǎn)率：加載的Mab 1.0mg，在池中洗脫的mAb=0.83mg產(chǎn)率=83%(使用1.4的消光系數(shù)(ext.coeff.)在280nm下通過UV測量)

圖2顯示試驗2的層析圖，其中將1.5mg半純化的mAb和2.8x10⁷pfu加載到原型LS-02213C上。

可以在表2中看到試驗2的計數(shù)噬斑（pfu）的方案。黑體數(shù)字為用于計算的數(shù)字。

表2. 在不同稀釋下來自層析圖的選擇級分的pfu計數(shù)方案，試驗2。

質量平衡計算，試驗2：

初始樣品：5.6x10⁶pfu/0.1x0.5=2.8x10⁷pfu加載的

A1：1.1x10⁵/0.1x0.5=0.55x10⁶pfu

A2：5.0x10⁵/0.1x0.5=2.5x10⁶pfu

A3：3.2x10⁵/0.1x0.5=1.6x10⁶pfu

A4：2.5x10⁵/0.1x0.5=1.25x10⁶pfu

A5：1.6x10⁵/0.1x0.5=0.8x10⁶pfu

全部A1-A5=0.67x10⁷pfu，產(chǎn)率=0.67/2.8*100=24%

洗脫級分：5.3x10³/0.1x0.58mL=3.1x10⁴pfu

降低：log₁₀(2.8x10⁷/3.1x10⁴)=3.0

Mab產(chǎn)率：加載的Mab 1.5mg，在池中洗脫的mAb=1.34mg產(chǎn)率=89%(使用1.4的消光系數(shù)(ext.coeff.)在280nm下通過UV測量)

圖3顯示層析圖，其中將與噬菌體混合的1.5mg半純化的mAb注射到MabSelect Sure LX上。用于噬斑覆蓋試驗的選擇級分：初始樣品、A1、A2、A3、A4、A5和mAb洗脫峰。

在圖4的層析圖中，將1.5mg半純化的mAb和1.4x10⁷pfu加載到MaBSelect SuRe上。

表3. 在不同稀釋下來自層析圖的選擇級分的pfu計數(shù)方案，試驗3。

質量平衡計算，試驗3：

初始樣品：2.8x10⁶pfu/0.1x0.5=1.4x10⁷pfu加載的

A1：0.3x10⁵/0.1x0.5=0.15x10⁶pfu

A2：2.2x10⁵/0.1x0.5=1.1x10⁶pfu

A3：2.4x10⁵/0.1x0.5=1.2x10⁶pfu

A4：1.0x10⁵/0.1x0.5=0.5x10⁶pfu

A5：0.35x10⁵/0.1x0.5=0.17x10⁶pfu

全部A1-A5=3.1x10⁶pfu，產(chǎn)率=0.31/1.4*100=22%

洗脫級分：2.4x10⁴/0.1x0.66mL=1.6x10⁵pfu

降低：log₁₀(1.4x10⁷/1.6x10⁵)=1.9

Mab產(chǎn)率：加載的Mab 1.5mg，在池中洗脫的mAb=1.36mg產(chǎn)率=91%(使用1.4的消光系數(shù)(ext.coeff.)在280nm下通過UV測量)

結果

對于原型LS-02213C，純mAb的病毒降低比使用半純化的mAb的試驗更好（1 log）。與其中使用半純化的mab的試驗（僅24%）相比，其中使用純mAb的試驗中的病毒回收率也更好（82%）。

在其中使用相同的初始材料的試驗2和3中，明確顯示使用半純化的mAb進料，原型LS-02213C具有比MabSelect SuRe更好的病毒降低性能。原型LS-02213C顯示比MabSelect SuRe更好的病毒降低(1 log)。

結果顯示：使用純mAb，原型LS-02213C能夠降低噬菌體的量，4.1的對數(shù)降低和83%的mAb產(chǎn)率。

使用半純化的mAb，LS-02213C的病毒對數(shù)降低為3.0，而MabSelect Sure LX的病毒對數(shù)降低為1.9。

應當注意到對數(shù)降低取決于停留/吸收時間（流速）和在洗脫蛋白質之前的清洗體積。在上述實施例中，使用標準柱停留時間4min和10柱體積的標準清洗（在洗脫之前）。