本申請(qǐng)要求2014年3月20日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)No.61/955,975和2014年11月25日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)No.62/084,270的權(quán)益，其內(nèi)容通過提述明確并入本文。

背景

Adnectin是一類來源于人纖連蛋白III型第十結(jié)構(gòu)域(¹⁰Fn3)的具有高親和力和特異性靶結(jié)合特性的治療蛋白。然而，盡管野生型¹⁰Fn3是極其穩(wěn)定和易溶的，在野生型序列的基礎(chǔ)上含有大約4-31個(gè)突變的¹⁰Fn3的靶結(jié)合變體在穩(wěn)定性和溶解度方面變化很大。換言之，任何基于野生型¹⁰Fn3序列的突變，即使是靶結(jié)合所必需的，也存在著降低蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的風(fēng)險(xiǎn)。因此，希望鑒定出可以對(duì)野生型¹⁰Fn3序列實(shí)施的使其穩(wěn)定的修飾，最好與介導(dǎo)Adnectin與其治療靶標(biāo)結(jié)合的殘基的身份無關(guān)。

概述

本文中提供了穩(wěn)定化的基于纖連蛋白的支架(FBS)蛋白，例如Fn3，如¹⁰Fn3分子(例如，人¹⁰Fn3分子)，所述分子的C端連接于由氨基酸序列PmXn組成的部分，其中P是脯氨酸，X是任何氨基酸，m是至少為1的整數(shù)，并且n是0或至少為1的整數(shù)，并且其中PmXn部分增強(qiáng)FBS蛋白的至少一種特征，例如，熱穩(wěn)定性。

附圖簡述

圖1：人¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域(PDB ID:1FNA)的晶體結(jié)構(gòu)、以及在該結(jié)構(gòu)中可見的多肽的蛋白質(zhì)序列的表示。在該結(jié)構(gòu)中限定的最后兩個(gè)殘基，在該感興趣序列中的“EI”，顯示為緊接在C端β鏈G的下游的黑色球體。

發(fā)明詳述

定義

“氨基酸殘基”是在肽鍵形成中已經(jīng)失去一個(gè)水分子(來自含氮側(cè)的H+和來自羧基側(cè)的OH-)之后的剩余氨基酸部分。

如本文中使用的，“¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域”或“¹⁰Fn3部分”或“¹⁰Fn3分子”是指野生型¹⁰Fn3及其生物活性變體，例如與靶標(biāo)(如靶蛋白)特異性地結(jié)合的生物活性變體。野生型人¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域可包含SEQ ID NO:1-8所示的氨基酸序列之一。野生型人¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域的生物活性變體包括這樣的¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域，相對(duì)于包含SEQ ID NO:1-8中的任一者的¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域，其包含至少、包含至多、或包含大約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40或45個(gè)氨基酸改變(即，取代、添加或缺失)。相對(duì)于包含SEQ ID NO:1-8中任一者的¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域，野生型¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域的生物活性變體還可包含、或包含至多1-3、1-5、1-10、1-15、1-10、1-25、1-30、1-35、1-40或1-45個(gè)氨基酸改變。在某些實(shí)施方案中，相對(duì)于包含SEQ ID NO:1-8中任一者的¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域，野生型人¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域的生物活性變體不包含多于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40或45個(gè)氨基酸改變(即，取代、添加或缺失)。氨基酸改變可以在環(huán)區(qū)、鏈、或N端、或C端區(qū)中。允許環(huán)區(qū)中氨基酸改變的簡并¹⁰Fn3氨基酸序列的例子在本文中提供為SEQ ID NO:9-16。

“多肽”是指具有兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸的任何序列，而不論長度、翻譯后修飾、或功能。多肽可包括如在美國專利號(hào)6,559,126中描述的那些天然氨基酸和非天然氨基酸，通過提述將該專利并入本文。也可以多種標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)方法中的任何方法修飾多肽(例如，可用保護(hù)基修飾氨基酸；可將羧基端氨基酸變成末端酰胺基團(tuán)；可用基團(tuán)修飾氨基端殘基，例如，以增強(qiáng)親油性；或者，可以化學(xué)方式將多肽糖基化或以別的方式修飾，以增加穩(wěn)定性或體內(nèi)半衰期)。多肽修飾可包括另一種結(jié)構(gòu)如環(huán)狀化合物或其他分子與多肽的附接，并且還可包括含有處于改變構(gòu)型的一個(gè)或多個(gè)氨基酸(即，R或S；或者，L或D)的多肽。

如本文中使用的¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域(或部分或分子)的“區(qū)域”是指環(huán)(AB、BC、CD、DE、EF和FG)、β鏈(A、B、C、D、E、F和G)、N端(相應(yīng)于SEQ ID NO:1的氨基酸殘基1-7)、或C端(相應(yīng)于SEQ ID NO:1的氨基酸殘基93-94)。

¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域(或部分)的“北極環(huán)”是指¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域的BC、DE和FG環(huán)中任一者。

¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域(或部分)的“南極環(huán)”是指¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域的AB、CD和EF環(huán)中任一者。

“支架區(qū)”是指人¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域的任何非環(huán)區(qū)。支架區(qū)包括A、B、C、D、E、F和Gβ鏈以及N端區(qū)(相應(yīng)于SEQ ID NO:1的殘基1-7的氨基酸)和C端區(qū)(相應(yīng)于SEQ ID NO:1的殘基93-94的氨基酸)。

本文中的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定義為在序列比對(duì)和引入空位(如果需要的話，達(dá)到最大序列同一性百分比，并且不將任何保守取代看作序列同一性的一部分)之后，候選序列中與選定序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比。用于確定氨基酸序列同一性百分比之目的的比對(duì)可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種方法來實(shí)現(xiàn)，例如，利用可公開獲得的計(jì)算機(jī)軟件，如BLAST^SM、BLAST^SM-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign軟件。本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定測(cè)量比對(duì)的適當(dāng)參數(shù)，包括在所比較的序列的全長上實(shí)現(xiàn)最大比對(duì)所需要的任何算法。

為本文的目的，如下計(jì)算給定氨基酸序列A相對(duì)于(與、或針對(duì))給定氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(或者可表述為給定氨基酸序列A相對(duì)于(與、或針對(duì))給定氨基酸序列B具有或包含一定的氨基酸序列同一性％)：100乘以分?jǐn)?shù)X/Y，其中X為在A與B的序列比對(duì)程序(如BLAST^SM、BLAST^SM-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign)比對(duì)中通過該程序評(píng)定為相同匹配的氨基酸殘基的數(shù)目，且其中Y為B中的氨基酸殘基的總數(shù)。應(yīng)當(dāng)理解的是，在氨基酸序列A的長度不等于氨基酸序列B的長度的情況下，A相對(duì)于B的氨基酸序列同一性％不會(huì)等于B相對(duì)于A的氨基酸序列同一性％。

如本文中使用的，多肽中的氨基酸殘基被視為“貢獻(xiàn)于結(jié)合”靶標(biāo)，如果(1)殘基的側(cè)鏈或主鏈的任何非氫原子被發(fā)現(xiàn)與結(jié)合靶標(biāo)的任何原子相距五埃之內(nèi)(基于實(shí)驗(yàn)確定的該復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu))；和/或(2)該殘基突變?yōu)橐吧?sup>10Fn3(例如SEQ ID NO:1)中等價(jià)殘基、突變?yōu)楸彼?、或突變?yōu)榫哂信c討論中的殘基大小相似或更小的側(cè)鏈的殘基，導(dǎo)致測(cè)量的針對(duì)靶標(biāo)的平衡解離常數(shù)增加(例如，k_on增加)。

多肽的血清或血漿“半衰期”可通常定義為該多肽的血清濃度在體內(nèi)降低50％(例如，由于通過天然機(jī)制對(duì)該多肽的降解和/或該多肽的清除或鰲合)所花費(fèi)的時(shí)間。可以任何本身已知的方式，例如通過藥代動(dòng)力學(xué)分析，來測(cè)定半衰期。適合的技術(shù)對(duì)于本領(lǐng)域人員來說是清楚的，例如，可通常涉及下列步驟：向靈長動(dòng)物給予適宜劑量的多肽；以規(guī)律間隔從所述靈長動(dòng)物采集血液樣品或其他樣品；確定所述血液樣品中的多肽濃度水平；并且根據(jù)由此獲得的數(shù)據(jù)(的繪圖)計(jì)算直到該多肽的水平或濃度相比于給藥時(shí)的初始水平降低50％的時(shí)間。確定半衰期的方法例如可見于Kenneth等人，Chemical Stability of Pharmaceuticals:A Handbook for Pharmacists(1986)；Peters等人，Pharmacokinete Analysis:A Practical Approach(1996)；和Gibaldi,M.等人，Pharmacokinetics,Second Rev.Edition,Marcel Dekker(1982)。

可以使用諸如t1/2-α、t1/2-β和曲線下面積(AUC)之類的參數(shù)來表示血清半衰期?！鞍胨テ诘脑黾印笔侵高@些參數(shù)中任一者、這些參數(shù)的任何兩者、或所有這三個(gè)參數(shù)的增加。在某些實(shí)施方案中，半衰期的增加是指t1/2-β的增加，同時(shí)有或者沒有t1/2-α和/或AUC或這兩者的增加。

藥物產(chǎn)品(例如，包含F(xiàn)BS部分和HSA部分的蛋白質(zhì))的“貨架期”是該產(chǎn)品在發(fā)生分解之前的儲(chǔ)存時(shí)長。例如，貨架期可以定義為該產(chǎn)品分解0.1％、0.5％、1％、5％、或10％的時(shí)間。

概覽

本文中提供了與靶標(biāo)特異性地結(jié)合的包含基于纖連蛋白的支架(FBS)結(jié)構(gòu)域(例如Fn3)的蛋白質(zhì)，如¹⁰Fn3分子，其中FBS結(jié)構(gòu)域在其C端與由PmXn組成的區(qū)域連接，其中P是脯氨酸，X是任何氨基酸，并且其中n是0或至少為1的整數(shù)，m是至少為1的整數(shù)。本申請(qǐng)至少部分地基于這樣的發(fā)現(xiàn)：相對(duì)于未經(jīng)修飾的¹⁰Fn3分子，在¹⁰Fn3分子的C端添加脯氨酸和任選地一個(gè)或多個(gè)氨基酸可增強(qiáng)¹⁰Fn3分子的至少一種特征，例如其熱穩(wěn)定性或溶解度。

本文中描述的¹⁰Fn3分子可被設(shè)計(jì)為與任何感興趣的靶標(biāo)結(jié)合。在示例性實(shí)施方案中，靶標(biāo)是抗原、多肽或感興趣的治療蛋白靶標(biāo)。示例性的治療上期望的靶標(biāo)包括，例如，腫瘤壞死因子α(TNF-α)、VEGFR2、PCSK9、IL-23、EGFR和IGF1R。

基于纖連蛋白的支架

如本文中使用的，“基于纖連蛋白的支架”或“FBS”蛋白或部分是指基于纖連蛋白III型(“Fn3”)重復(fù)的蛋白質(zhì)或部分。Fn3是一種小型(約10kDa)結(jié)構(gòu)域，具有免疫球蛋白(Ig)折疊(即，Ig樣β夾心結(jié)構(gòu)，由七個(gè)β鏈和六個(gè)環(huán)構(gòu)成)結(jié)構(gòu)。纖連蛋白具有18個(gè)Fn3重復(fù)，雖然各重復(fù)之間的序列同源性較低，但它們?cè)谌?jí)結(jié)構(gòu)上有高度的相似性。Fn3結(jié)構(gòu)域還出現(xiàn)在除了纖連蛋白之外的多種蛋白質(zhì)，例如粘附分子、細(xì)胞表面分子(例如，細(xì)胞因子受體)、和碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域中。綜述可參見Bork等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89(19):8990-8994(1992)；Bork等人，J.Mol.Biol.,242(4):309-320(1994)；Campbell等人，Structure,2(5):333-337(1994)；Harpez等人，J.Mol.Biol.,238(4):528-539(1994))?！癋BS”蛋白或部分這一術(shù)語意圖包括來自這些其他蛋白質(zhì)(即，非纖連蛋白分子)的基于Fn3結(jié)構(gòu)域的支架。

Fn3結(jié)構(gòu)域是小型的、單體的、可溶的、且穩(wěn)定的。它缺乏二硫鍵，因此在還原條件下是穩(wěn)定的。按照從N端到C端的順序，F(xiàn)n3結(jié)構(gòu)域包含：β或β樣鏈A；環(huán)AB；β或β樣鏈B；環(huán)BC；β或β樣鏈C；環(huán)CD；β或β樣鏈D；環(huán)DE；β或β樣鏈E；環(huán)EF；β或β樣鏈F；環(huán)FG；和β或β樣鏈G。上述七個(gè)反平行β鏈排列成兩個(gè)β片層，這兩個(gè)β片層形成穩(wěn)定的核心，同時(shí)產(chǎn)生兩個(gè)由連接β或β樣鏈的環(huán)構(gòu)成的“面”。環(huán)AB、CD、和EF位于一個(gè)面上(“南極”)，且環(huán)BC、DE、和FG位于相對(duì)的面上(“北極”)。

Fn3分子中的環(huán)在結(jié)構(gòu)上類似于抗體的互補(bǔ)決定區(qū)(CDRs)，并且當(dāng)其被改變時(shí)，可能參與Fn3分子和靶標(biāo)(例如靶蛋白)的結(jié)合。Fn3分子的其他區(qū)域，如β或β樣鏈以及N端或C端區(qū)，當(dāng)被改變時(shí)，也可能參與和靶標(biāo)的結(jié)合。任何或所有環(huán)AB、BC、CD、DE、EF和FG均可參與靶標(biāo)結(jié)合。任何β或β樣鏈都可能參與和靶標(biāo)的結(jié)合。Fn3結(jié)構(gòu)域還可通過一個(gè)或多個(gè)環(huán)以及一個(gè)或多個(gè)β或β樣鏈而結(jié)合至靶標(biāo)。結(jié)合可能還需要N端或C端區(qū)。在蛋白質(zhì)中使用的FBS結(jié)構(gòu)域可包含所有環(huán)、所有β或β樣鏈、或僅僅它們的一部分，其中某些環(huán)和/或β或β樣鏈和/或N端區(qū)或C端區(qū)被修飾(或改變)，條件是FBS結(jié)構(gòu)域優(yōu)選地與靶標(biāo)特異性結(jié)合。例如，F(xiàn)BS結(jié)構(gòu)域可包含1、2、3、4、5或6個(gè)環(huán)，1、2、3、4、5、6、7、或8個(gè)β鏈，以及任選地包含N端區(qū)和/或C端區(qū)，其中一個(gè)或多個(gè)環(huán)、一個(gè)或多個(gè)β鏈、N端區(qū)和/或C端區(qū)相對(duì)于野生型FBS結(jié)構(gòu)域被修飾。

在示例性實(shí)施方案中，本文中描述的配體(或靶標(biāo))結(jié)合FBS部分基于纖連蛋白III型第十結(jié)構(gòu)域，即，F(xiàn)n3的第十模塊(¹⁰Fn3)。野生型人¹⁰Fn3部分的氨基酸序列如下：

(AB、CD和EF環(huán)加下劃線；BC、FG、和DE環(huán)用粗體著重標(biāo)記；β鏈位于各個(gè)環(huán)區(qū)之間或其鄰近；N端區(qū)以斜體表示)。SEQ ID NO:1的最后兩個(gè)氨基酸殘基為C端區(qū)的一部分。

野生型人¹⁰Fn3分子還包括那些缺乏N端區(qū)或其部分的分子。例如，野生型¹⁰Fn3分子可包含SEQ ID NO:1，其中缺失了氨基酸殘基1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6或1-7(分別為SEQ ID NO:2-8)。表1顯示了這些野生型人¹⁰Fn3部分的氨基酸序列：

表1：具有不同N端區(qū)的野生型人¹⁰Fn3分子的氨基酸序列

在一些實(shí)施方案中，AB環(huán)對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的殘基14-17，BC環(huán)對(duì)應(yīng)于殘基23-31，CD環(huán)對(duì)應(yīng)于殘基37-47，DE環(huán)對(duì)應(yīng)于殘基51-56，EF環(huán)對(duì)應(yīng)于殘基63-67，并且FG環(huán)對(duì)應(yīng)于殘基75-87。BC、DE和FG環(huán)沿著該分子的一個(gè)面，即“北極”對(duì)齊，而AB、CD和EF環(huán)沿著該分子的相對(duì)面，即“南極”對(duì)齊。在SEQ ID NO:1中，β鏈A對(duì)應(yīng)于殘基8-13，β鏈B對(duì)應(yīng)于殘基殘基18-22，β鏈C對(duì)應(yīng)于32-36，β鏈D對(duì)應(yīng)于殘基48-50，β鏈E對(duì)應(yīng)于殘基57-62，β鏈F環(huán)對(duì)應(yīng)于殘基68-74，并且β鏈G環(huán)對(duì)應(yīng)于殘基88-92。β鏈通過相應(yīng)的環(huán)彼此連接，例如，在β鏈A、環(huán)AB、β鏈B等等的形成中，鏈A和B經(jīng)由環(huán)AB連接。

基于人¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域的FBS蛋白的實(shí)例為adnectin(Adnexus，Bristol-Myers Squibb的全資附屬公司)。Adnectin是這樣的¹⁰Fn3分子，其中¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域的CDR樣環(huán)區(qū)、β鏈、N端區(qū)和/或C端區(qū)已經(jīng)被修飾，從而演化出能夠與感興趣的化合物結(jié)合的蛋白質(zhì)。例如，美國專利號(hào)7,115,396描述了¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域蛋白，其中針對(duì)BC、DE、和FG環(huán)的改變導(dǎo)致高親和力TNFα結(jié)合物。美國專利號(hào)7,858,739描述了Fn3結(jié)構(gòu)域蛋白，其中針對(duì)BC、DE、和FG環(huán)的改變導(dǎo)致高親和力VEGFR2結(jié)合物。

在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)BS部分包含¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域，所述¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域由以下簡并序列概括性地限定：

VSDVPRDLEVVAA(X)_uLLISW(X)_vYRITY(X)_wFTV(X)_xATISGL(X)_yYTITVYA(X)_zISINYRT(SEQ ID NO:9)，

或由選自SEQ ID NO:10-16的序列限定，所述序列除了分別缺乏1、2、3、4、5、6或7個(gè)N端氨基酸之外，與SEQ ID NO:9相同。表2顯示了這些簡并的人¹⁰Fn3分子的氨基酸序列。

表2：具有不同N端區(qū)的簡并野生型人¹⁰Fn3分子的氨基酸序列

在SEQ ID NO:25-32和50中，AB環(huán)以(X)_u表示，BC環(huán)以(X)_v表示，CD環(huán)以(X)_w表示，DE環(huán)以(X)_x表示，EF環(huán)以(X)_y表示，F(xiàn)G環(huán)以X_z表示。X表示任何氨基酸，在X下面的下標(biāo)表示氨基酸的數(shù)目的整數(shù)。具體地說，u、v、w、x、y和z各自可獨(dú)立地為2-20、2-15、2-10、2-8、5-20、5-15、5-10、5-8、6-20、6-15、6-10、6-8、2-7、5-7、或6-7個(gè)氨基酸。β鏈序列(在SEQ ID NO:9中加下劃線)在所有7個(gè)支架區(qū)上可以具有相對(duì)于SEQ ID NO:9-16中所示的相應(yīng)氨基酸的0到10、0到8、0到6、0到5、0到4、0到3、0到2、或0到1個(gè)取代、缺失或添加。在一些實(shí)施方案中，β鏈序列在所有7個(gè)支架區(qū)上可以具有相對(duì)于SEQ ID NO:9-16中所示的相應(yīng)氨基酸的0到10、0到8、0到6、0到5、0到4、0到3、0到2、或0到1個(gè)取代(例如保守性取代)。

在某些實(shí)施方案中，疏水性核心氨基酸殘基(在以上SEQ ID NO:9中的粗體字的殘基)是固定的，且任何取代、保守性取代、缺失或添加均發(fā)生在除了所述疏水性核心氨基酸殘基之外的殘基處。因此，在一些實(shí)施方案中，本文中提供的多肽的疏水性核心殘基相對(duì)于野生型人¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域(例如，SEQ ID NO:1)未經(jīng)修飾。

在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)BS部分包含¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域，其中該¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域包含環(huán)AB、環(huán)BC、環(huán)CD、環(huán)DE、環(huán)EF、和環(huán)FG，并且選自環(huán)AB、BC、CD、DE、EF和FG中的至少一個(gè)環(huán)具有相對(duì)于野生型人¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域的相應(yīng)環(huán)序列改變的氨基酸序列。在一些實(shí)施方案中，單個(gè)環(huán)被改變。在一些實(shí)施方案中，至多2個(gè)環(huán)被改變。在一些實(shí)施方案中，至多3個(gè)環(huán)被改變。在一些實(shí)施方案中，BC、DE和/或FG環(huán)被改變。在某些實(shí)施方案中，AB、CD、和EF環(huán)被改變。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)G環(huán)是唯一被改變的環(huán)。在某些實(shí)施方案中，CD環(huán)是唯一被改變的環(huán)。在其他實(shí)施方案中，CD和FG環(huán)均被改變，并且任選地，其他環(huán)都不被改變。在某些實(shí)施方案中，CD和EF環(huán)均被改變，并且任選地，其他環(huán)都不被改變。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)特定的支架改變與一個(gè)或多個(gè)環(huán)改變相組合?！案淖儭币庵赶鄬?duì)于模板序列(即，相應(yīng)的野生型人纖連蛋白結(jié)構(gòu)域)的一個(gè)或多個(gè)氨基酸序列改變，并且包括氨基酸添加、缺失、和取代。本文中進(jìn)一步公開了包含改變的環(huán)和/或支架區(qū)(例如，β鏈、N端區(qū)和C端區(qū))的特定組合的示例性¹⁰Fn3分子。

應(yīng)當(dāng)理解，為了實(shí)現(xiàn)對(duì)于期望靶標(biāo)具有強(qiáng)親和力的¹⁰Fn3結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并不是環(huán)區(qū)中的每個(gè)殘基都需要修飾。另外，還可在環(huán)區(qū)中形成插入和缺失，同時(shí)仍然產(chǎn)生高親和力¹⁰Fn3結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

在一些實(shí)施方案中，選自AB、BC、CD、DE、EF和FG的一個(gè)或多個(gè)環(huán)相對(duì)于野生型人¹⁰Fn3中的相應(yīng)環(huán)可以在長度上延長或縮短。在任何給定的多肽中，一個(gè)或多個(gè)環(huán)可以在長度上延長，一個(gè)或多個(gè)環(huán)可以在長度上縮短，或者這兩者的組合。在一些實(shí)施方案中，給定環(huán)的長度可以延長2-25、2-20、2-15、2-10、2-5、5-25、5-20、5-15、5-10、10-25、10-20、或10-15個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中，給定環(huán)的長度可以縮短1-15、1-11、1-10、1-5、1-3、1-2、2-10、或2-5個(gè)氨基酸。具體地說，¹⁰Fn3的FG環(huán)的長度為13個(gè)殘基，而在抗體重鏈中的相應(yīng)環(huán)的長度在4-28個(gè)殘基的范圍。因此，對(duì)于靶結(jié)合依賴于FG的多肽，為了優(yōu)化其抗原結(jié)合，可以改變¹⁰Fn3的FG環(huán)的長度以及序列，以在靶結(jié)合中獲得盡可能大的靈活性和親和力。

在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)BS部分包含¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域，其中非環(huán)區(qū)包含與SEQ ID NO:1的非環(huán)區(qū)具有至少80％、85％、90％、95％、98％、或100％同一性的氨基酸序列，其中選自AB、BC、CD、DE、EF和FG的至少一個(gè)環(huán)被改變。例如，在某些實(shí)施方案中，AB環(huán)可具有至多4個(gè)氨基酸取代，至多10個(gè)氨基酸插入，至多3個(gè)氨基酸缺失，或上述組合；BC可具有至多10個(gè)氨基酸取代，至多4個(gè)氨基酸缺失，至多10個(gè)氨基酸插入，或上述組合；CD環(huán)可具有至多6個(gè)氨基酸取代，至多10個(gè)氨基酸插入，至多4個(gè)氨基酸缺失，或上述組合；DE環(huán)可具有至多6個(gè)氨基酸取代，至多4個(gè)氨基酸缺失，至多13個(gè)氨基酸插入，或上述組合；EF環(huán)可具有至多5個(gè)氨基酸取代，至多10個(gè)氨基酸插入，至多3個(gè)氨基酸缺失，或上述組合；和/或FG環(huán)可具有至多12個(gè)氨基酸取代，至多11個(gè)氨基酸缺失，至多25個(gè)氨基酸插入，或上述組合。

在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)BS部分包含與人¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域具有至少40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、或90％同一性的¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域，所述人¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域具有選自包括SEQ ID NO:1-16的序列組的氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，本文中提供的FBS部分與選自包括SEQ ID NO:1-16的氨基酸序列組的氨基酸序列具有至少50％的同一性。在其他實(shí)施方案中，該FBS部分與選自包括SEQ ID NO:1-16的氨基酸序列組的氨基酸序列具有至少65％的同一性。在某些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)環(huán)相對(duì)于野生型序列的相應(yīng)環(huán)的序列將不被修飾、并且/或者一個(gè)或多個(gè)β鏈相對(duì)于野生型序列的相應(yīng)β鏈的序列將不被修飾、并且/或者N端區(qū)或C端區(qū)將不被修飾。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)BS部分中的¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域的各個(gè)β或β樣鏈可包含、其基本組成為、或其組成為與具有SEQ ID NO:1的相應(yīng)β或β樣鏈的序列具有至少80％、85％、90％、95％或100％的氨基酸序列。優(yōu)選地，β鏈區(qū)中的變化將不會(huì)破壞多肽在生理?xiàng)l件下的穩(wěn)定性。

在一些實(shí)施方案中，通過一個(gè)或多個(gè)保守取代可以修飾⁰Fn3結(jié)構(gòu)域的非環(huán)區(qū)。通過保守取代可以改變¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域中多達(dá)5％、10％、20％或甚至30％或更多的氨基酸，而基本上不改變¹⁰Fn3的配體親和力。在某些實(shí)施方案中，非環(huán)區(qū)，例如β鏈，可包含0-15、0-10、0-8、0-6、0-5、0-4、0-3、1-15、1-10、1-8、1-6、1-5、1-4、1-3、2-15、2-10、2-8、2-6、2-5、2-4、5-15、或5-10個(gè)保守氨基酸取代。在示例性實(shí)施方案中，支架修飾可將¹⁰Fn3結(jié)合物對(duì)配體的結(jié)合親和力降低100倍、50倍、25倍、10倍、5倍、或2倍。這樣的變化可能改變¹⁰Fn3的體內(nèi)免疫原性，并且在免疫原性降低的情況下，這樣的變化可能是合意的。如本文中使用的，“保守取代”是在物理上或功能上與相應(yīng)參考?xì)埢愃频臍埢＜?，保守取代與其參考?xì)埢哂邢嗨频拇笮?、性狀、電荷、化學(xué)特性，包括形成共價(jià)鍵或氫鍵等等的能力。示例性的保守取代包括滿足在Dayhoff等人，Atlas of Protein Sequence and Structure,5:345-352(1978and Supp.)中針對(duì)可接受點(diǎn)突變所定義的標(biāo)準(zhǔn)的那些取代。保守取代的實(shí)例包括在下組范圍內(nèi)的取代：(a)纈氨酸、甘氨酸；(b)甘氨酸、丙氨酸；(c)纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；(d)天冬氨酸、谷氨酸；(e)天冬酰胺、谷氨酰胺；(f)絲氨酸、蘇氨酸；(g)賴氨酸、精氨酸、甲硫氨酸；和(h)苯丙氨酸、酪氨酸。

本文中還提供了具有環(huán)和支架修飾組合的¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域。偶聯(lián)物可包含¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域，所述結(jié)構(gòu)域包含(i)在環(huán)AB、BC、CD、DE、EF、或FG中的至少一者的氨基酸序列中的修飾，和(ii)在至少一個(gè)支架區(qū)的氨基酸序列中的修飾(即，在β鏈、N端區(qū)、和/或C端區(qū)的至少一者中的修飾)，其中修飾的環(huán)和修飾的支架區(qū)兩者貢獻(xiàn)于對(duì)同一個(gè)靶標(biāo)的結(jié)合。在示例性實(shí)施方案中，支架區(qū)修飾位于環(huán)區(qū)中的修飾的附近，例如，如果AB環(huán)被修飾，則支架突變可能傾向于位于在¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域的線性序列上鄰近于AB環(huán)的β鏈A和/或β鏈B中。在其他實(shí)施方案中，在¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域的線性序列上彼此鄰近的環(huán)區(qū)和支架區(qū)中可能同時(shí)出現(xiàn)一簇修飾。例如，對(duì)于既具有環(huán)修飾有具有支架修飾的Fn3結(jié)合物而言，氨基酸修飾簇可能出現(xiàn)于下列在¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域的線性序列上彼此鄰近的下列環(huán)區(qū)和支架區(qū)組合：β鏈/環(huán)/β鏈、環(huán)/β鏈/環(huán)、環(huán)/β鏈/環(huán)/β鏈、端區(qū)/β鏈/環(huán)、或環(huán)/β鏈/端區(qū)，等等。例如，就具有新穎的環(huán)修飾和支架修飾組合的Fn3結(jié)構(gòu)域而言，其可具有這樣的修飾簇：在一段20個(gè)連續(xù)氨基酸的序列上，相對(duì)于野生型至少有15個(gè)氨基酸被修飾。在其他實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型Fn3結(jié)構(gòu)域序列的相應(yīng)氨基酸序列段，在一段連續(xù)的20個(gè)殘基中的至少17個(gè)、20個(gè)殘基中的至少18個(gè)、25個(gè)殘基中的至少17個(gè)、25個(gè)殘基中的至少20個(gè)、或30個(gè)殘基中的至少25個(gè)被修飾。在某些實(shí)施方案中，給定的Fn3結(jié)構(gòu)域可具有被未修飾的(即，野生型)序列段分隔開的兩個(gè)或三個(gè)修飾簇。對(duì)于任何給定的經(jīng)修飾區(qū)域(即，環(huán)、β鏈或端區(qū))而言，可以是該區(qū)域的全部、或者是該區(qū)域僅僅一個(gè)部分相對(duì)于野生型序列修飾。當(dāng)β鏈區(qū)被修飾時(shí)，疏水性核心殘基優(yōu)選地保持未被修飾(即，野生型)，而β鏈中的一個(gè)或多個(gè)非核心殘基被修飾。

在一些實(shí)施方案中，¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域包含沿著分子的“西側(cè)”的結(jié)合面(“西側(cè)結(jié)合物”或“WS結(jié)合物”)。與在SEQ ID NO:1中示出的相應(yīng)CD和FG環(huán)序列相比，WS結(jié)合物可包含修飾的CD環(huán)和修飾的FG環(huán)。CD環(huán)和FG環(huán)兩者貢獻(xiàn)于與同一個(gè)靶標(biāo)結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，WS結(jié)合物可在Fn3結(jié)構(gòu)域內(nèi)的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域包含另外的修飾。例如，WS結(jié)合物可包含在鄰近CD和/或FG環(huán)的一個(gè)或多個(gè)β鏈區(qū)中的支架修飾。具體地說，WS結(jié)合物在β鏈C、β鏈D、β鏈F、和/或β鏈G的一者或多者中可以包含序列修飾。示例性的支架修飾包括在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的氨基酸位置33、35、49、69、71、73、89和/或91的一個(gè)或多個(gè)支架區(qū)位置處的修飾。WS結(jié)合物還可以在BC環(huán)中，尤其是在BC環(huán)的C端部分中包含修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，BC環(huán)中的最后兩個(gè)殘基(即，對(duì)應(yīng)于野生型¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域中的氨基酸30和31)相對(duì)于野生型序列被修飾。上述另外的環(huán)修飾和支架修飾的全部或部分可以與修飾的CD和FG環(huán)一道貢獻(xiàn)于與靶標(biāo)的結(jié)合。優(yōu)選地，疏水性核心殘基相對(duì)于野生型序列未被修飾。

示例性WS結(jié)合物包括在位置30、31、33、35、37、38、46、47、49、50、67、69、71、73、75、76、84、85、86、87、89或91處具有野生型或突變氨基酸的那些結(jié)合物。

在一些實(shí)施方案中，¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域包含在CD環(huán)、DE環(huán)以及在一些情況下在EF環(huán)中的修飾，其中這些環(huán)修飾均貢獻(xiàn)于靶接合。這些多肽被稱為“前結(jié)合物”(“front binder”)。前結(jié)合物可另外包含在一個(gè)或多個(gè)支架區(qū)、尤其是在修飾環(huán)區(qū)之側(cè)翼或鄰近的支架區(qū)中的修飾。例如，前結(jié)合物可在β鏈C、β鏈D、和/或β鏈E中一者或多者中包含相對(duì)于野生型Fn3結(jié)構(gòu)域、例如人¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1)的相應(yīng)β鏈的序列的支架修飾。優(yōu)選地，疏水性核心殘基相對(duì)于野生型序列未被修飾?？纱嬖谟谇敖Y(jié)合物中的示例性支架修飾包括在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的氨基酸位置36、49、58和/或50中的一個(gè)或多個(gè)位置處的修飾。這樣的支架修飾可以與修飾的環(huán)一道貢獻(xiàn)于對(duì)靶標(biāo)的結(jié)合。在某些實(shí)施方案中，前結(jié)合物可包含跨Fn3(例如¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域)的若干環(huán)區(qū)和鏈區(qū)的修飾簇。具體地說，前結(jié)合物在對(duì)應(yīng)于野生型Fn3(例如人¹⁰Fn3)結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1)的殘基36到66的氨基酸之間的31個(gè)殘基中可包含至少15、20、24、25、或27個(gè)殘基的修飾。環(huán)和/或鏈修飾可包括氨基酸取代、缺失和/或插入，或其組合。在示例性實(shí)施方案中，CD環(huán)相對(duì)于Fn3例如野生型人¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1)的CD環(huán)在長度上延長或在長度上縮短。

在一些實(shí)施方案中，¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域包含在EF和FG環(huán)中的修飾，其中這些環(huán)修飾貢獻(xiàn)于與同一個(gè)靶標(biāo)的結(jié)合。這些多肽在本文中稱為“后結(jié)合物”(“back binder”)。后結(jié)合物可在其他環(huán)和/或支架區(qū)中包含另外的修飾。例如，后結(jié)合物在AB環(huán)的至少一個(gè)部分，優(yōu)選地在AB環(huán)的N端部分中可含有修飾。在示例性實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型序列，AB環(huán)中的前兩個(gè)氨基酸(即，對(duì)應(yīng)于野生型¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域中的氨基酸殘基14和15)被修飾。在某些實(shí)施方案中，后結(jié)合物還可含有一個(gè)或多個(gè)支架修飾，尤其是在鄰近修飾的環(huán)區(qū)的一個(gè)或多個(gè)支架區(qū)中的修飾。例如，后結(jié)合物可在β鏈A、β鏈G、N端區(qū)、和/或C端區(qū)的一者或多者中含有一個(gè)或多個(gè)修飾。優(yōu)選地，疏水性核心殘基相對(duì)于野生型序列未被修飾。示例性支架修飾包括在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的氨基酸位置1-7、9-13、89、91、93和/或94的一個(gè)或多個(gè)位置處的修飾。一個(gè)或多個(gè)所述的另外的環(huán)修飾和/或支架修飾可以連同所述修飾的EF和FG環(huán)一起貢獻(xiàn)于對(duì)靶標(biāo)的結(jié)合。適合的環(huán)和/或支架區(qū)修飾包括氨基酸取代、缺失和/或插入，或其組合。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)G環(huán)的氨基酸序列相對(duì)于野生型人¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1)的FG環(huán)在長度上延長或在長度上縮短。

在某些實(shí)施方案中，后結(jié)合物可包含跨越¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域中連續(xù)幾個(gè)區(qū)域的修飾氨基酸殘基簇。例如，F(xiàn)n3(例如¹⁰Fn3)結(jié)構(gòu)域的前15個(gè)氨基酸殘基中的至少14個(gè)殘基可相對(duì)于野生型Fn3(例如人¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域)(SEQ ID NO:1)中的相應(yīng)殘基被修飾，和/或?qū)?yīng)于野生型Fn3(例如人¹⁰Fn3)結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或23)的殘基80到97(或94)之間的氨基酸的18個(gè)殘基中的至少15個(gè)殘基可相對(duì)于野生型序列中的相應(yīng)殘基被修飾。當(dāng)提及在¹⁰Fn3分子中比94位更靠C端的氨基酸時(shí)，其語境是這樣的¹⁰Fn3分子：該分子在Fn3結(jié)構(gòu)域的第10個(gè)重復(fù)和第11個(gè)重復(fù)之間包含一個(gè)柔性接頭(即，EIDKPSQ)，由此形成101個(gè)氨基酸長的蛋白質(zhì)(因此，SEQ ID NO:23表示SEQ ID NO:1的C端連接EIDKPSQ)。

VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTEIDKPSQ(SEQ ID NO:23)

在某些實(shí)施方案中，相對(duì)于野生型序列的相應(yīng)區(qū)域的序列，¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域在β鏈A、環(huán)AB、β鏈B、環(huán)CD、β鏈E、環(huán)EF、和β鏈F的氨基酸序列中包含修飾。這些多肽在本文中被稱為“南極結(jié)合物”(“south pole binder”)或“SP結(jié)合物”。這些修飾的環(huán)和鏈貢獻(xiàn)于對(duì)同一個(gè)靶標(biāo)的結(jié)合。CD環(huán)的氨基酸序列相對(duì)于野生型Fn3(例如人¹⁰Fn3)結(jié)構(gòu)域(SEQ ID NO:1或23)的CD環(huán)可以在長度上延長或在長度上縮短。相對(duì)于野生型序列對(duì)應(yīng)區(qū)的序列，這些南極結(jié)合物在β鏈G和/或C端區(qū)中可包含另外的修飾。在示例性實(shí)施方案中，南極結(jié)合物可在對(duì)應(yīng)于野生型序列的位置11、12、19、60、61、69、91、93和95-97的氨基酸處包含一個(gè)或多個(gè)修飾。

在一些實(shí)施方案中，與SEQ ID NO:1或23中示出的相應(yīng)BC、DE和FG環(huán)相比，¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域包含修飾的BC、DE和FG環(huán)，以及在β鏈C、β鏈D、β鏈F和β鏈G鏈殘基的一者或多者中的另外的修飾。這些β鏈和環(huán)區(qū)修飾一起貢獻(xiàn)于對(duì)靶標(biāo)的結(jié)合。這些蛋白質(zhì)在本文中被稱為“西北結(jié)合物”(“Northwest binder”)或“NW結(jié)合物”。在示例性實(shí)施方案中，NW結(jié)合物包含一個(gè)或多個(gè)對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1或23的支架區(qū)位置R33、T49、Y73和S89的氨基酸位置中任一者或其組合的支架修飾。環(huán)和/或支架區(qū)中的適合修飾包括氨基酸取代、缺失和/或插入，或其組合。在某些實(shí)施方案中，BC、DE和FG環(huán)的一者或多者相對(duì)于野生型序列在長度上延長或在長度上縮短，或其組合。在一個(gè)實(shí)施方案中，BC、DE和FG環(huán)各自相對(duì)于野生型序列(例如，SEQ ID NO:1或23)在長度上延長或在長度上縮短，或其組合。在一些實(shí)施方案中，BC環(huán)僅有一個(gè)部分，尤其是C端部分，相對(duì)于野生型序列被修飾。例如，BC環(huán)可以僅在對(duì)應(yīng)于野生型BC環(huán)的氨基酸27-31的氨基酸殘基處被修飾，而BC環(huán)的剩余部分(即，對(duì)應(yīng)于野生型環(huán)的殘基23-26)不被修飾。

在一些實(shí)施方案中，¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域包含修飾的BC、DE和FG環(huán)，并且在N端區(qū)、β鏈A、β鏈B和/或β鏈E中任一者或其組合中包含一個(gè)或多個(gè)另外的修飾。這些蛋白質(zhì)在本文中被稱為“東北結(jié)合物”(“Northeast binder”)或“NE結(jié)合物”。在示例性實(shí)施方案中，NE結(jié)合物在對(duì)應(yīng)于野生型序列(SEQ ID NO:1或23)的支架區(qū)位置1-7、E9、L19、S21和/或T58的氨基酸中任一者或其組合處被修飾。修飾的環(huán)和支架區(qū)的組合貢獻(xiàn)于對(duì)靶標(biāo)的結(jié)合。

在一些實(shí)施方案中，¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域在AB、CD、DE和EF環(huán)的一者或多者中包含修飾，并且在β鏈B、β鏈D和/或β鏈E的一者或多者中包含另外的修飾。這些蛋白質(zhì)在本文中被稱為“南前結(jié)合物”(“South Front binder”)。修飾的環(huán)和鏈殘基的組合貢獻(xiàn)于與靶標(biāo)的結(jié)合。在示例性實(shí)施方案中，南前結(jié)合物可在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1或23的支架區(qū)位置L19、T49、T58、S60、和/或G61的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置處和/或在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1或23的環(huán)區(qū)位置T14-S17、P51、T56、G40-E47、和/或K63-G65的一個(gè)或多個(gè)氨基酸位置處被修飾。在示例性實(shí)施方案中，南前結(jié)合物在AB環(huán)中、在對(duì)應(yīng)于野生型序列的殘基18和20的氨基酸之間、和/或在CD環(huán)中，可以在長度上延長或在長度上縮短。

在一些實(shí)施方案中，與SEQ ID NO:1或23的相應(yīng)鏈比較，¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域包含修飾的β鏈A和β鏈G。這些蛋白質(zhì)在本文中被稱為“AG結(jié)合物”或“AG鏈”。在某些實(shí)施方案中，AG鏈結(jié)合物在Fn3(例如¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域)的N端和C端部分包含修飾簇，而Fn3的中間部分保持未修飾。例如，在AG鏈結(jié)合物的¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域的前19個(gè)氨基酸(即，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1或23的氨基酸位置1-19)中可包含16/19個(gè)氨基酸的修飾，且在¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域的最后18個(gè)氨基酸(即，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:9的氨基酸位置84-101)中可包含13-17/18個(gè)氨基酸的修飾、或在¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域的最后22個(gè)氨基酸(即，對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:9的氨基酸位置80-101)中可包含14-18/22個(gè)氨基酸的修飾。在示例性實(shí)施方案中，AG結(jié)合物在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:9的位置1-7、9、11-17、19、84-89和91-97的一個(gè)或多個(gè)位置處可包含修飾。優(yōu)選地，AG結(jié)合物中的這些修飾區(qū)貢獻(xiàn)于與同一個(gè)靶標(biāo)結(jié)合。

在一些實(shí)施方案中，¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域包含修飾的CD和EF環(huán)、并且在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1或23的位置69或91-97的殘基中任一者或其組合中包含另外的修飾。這些蛋白質(zhì)在本文中被稱為“西南結(jié)合物”(“Southwest binder”)或“SW結(jié)合物”。修飾的環(huán)和支架區(qū)貢獻(xiàn)于與靶標(biāo)的結(jié)合。

在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)包含具有降低的免疫原性的¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域，其中BC環(huán)的一部分保留為野生型。優(yōu)選地，這樣的多肽相對(duì)于在BC環(huán)的更大部分中具有修飾的等同多肽具有較低的免疫原性。在示例性實(shí)施方案中，BC環(huán)的N端部分保留為野生型。例如，BC環(huán)的前1、2、3、4、5、或5個(gè)殘基可保留為野生型，而BC環(huán)的剩余C端殘基可被修飾。在BC環(huán)的N端區(qū)的至少一部分為野生型的Fn3設(shè)計(jì)中，建議相對(duì)于野生型序列保持β鏈B和/或β鏈C的全部或部分不被修飾，尤其是鄰近BC環(huán)的β鏈B和/或β鏈C部分(即，β鏈B的C端部分和/或β鏈C的N端部分)。在示例性實(shí)施方案中，F(xiàn)n3結(jié)構(gòu)域在BC環(huán)的N端部分中具有野生型序列，且具有降低的免疫原性，該Fn3結(jié)構(gòu)域在N端區(qū)、β鏈A、AB環(huán)、和β鏈B中可以沒有任何修飾。在BC環(huán)的一部分為野生型的Fn3設(shè)計(jì)中，BC環(huán)的修飾部分連同¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域的其他區(qū)中的修飾可貢獻(xiàn)于靶結(jié)合。

在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)包含具有降低的免疫原性的¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域，其中在β鏈B/BC環(huán)/β鏈C區(qū)中的強(qiáng)HLA錨(“BC錨”)已經(jīng)被去除或破壞(例如，相對(duì)于野生型序列被修飾從而降低與一個(gè)多個(gè)HLA受體的結(jié)合親和力)。例如，通過在對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:1的位置L19、S21、R33和/或T35的一個(gè)或多個(gè)位置修飾Fn3(例如¹⁰Fn3)結(jié)構(gòu)域，可去除或破壞BC錨。當(dāng)BC錨已經(jīng)去除或破壞時(shí)，有可能修飾BC環(huán)的序列，而不顯著增加BC區(qū)的免疫原性。因此，許多這樣的Fn3設(shè)計(jì)除了在β鏈B和/或β鏈C中的修飾之外，還具有BC環(huán)中的修飾。BC環(huán)可貢獻(xiàn)于靶結(jié)合，任選地與Fn3結(jié)構(gòu)域的其他區(qū)中的修飾聯(lián)合貢獻(xiàn)于靶結(jié)合。在β鏈B和/或β鏈C中的修飾可以貢獻(xiàn)于也可以不貢獻(xiàn)于靶接合。

在示例性實(shí)施方案中，F(xiàn)BS，例如¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域，以小于500nM、100nM、50nM、10nM、5nM、1nM、500pM、100pM或更小的K_d與期望靶標(biāo)結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，F(xiàn)BS，例如¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域，以1pM和1μM之間、100pM和500nM之間、1nM和500nM之間、或1nM和100nM之間的K_d與期望靶標(biāo)結(jié)合。在示例性實(shí)施方案中，¹⁰Fn3部分特異性地結(jié)合不被野生型¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域，尤其是野生型人¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域，例如具有SEQ ID NO:1-8的野生型人¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域結(jié)合的靶標(biāo)。

在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)BS部分包含與選自SEQ ID NO:1-16的序列組的氨基酸序列具有至少40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列，并且FBS特異性地與靶標(biāo)結(jié)合，例如以小于500nM、100nM、50nM、10nM、5nM、1nM、500pM、100pM或更小的K_d特異性地與靶標(biāo)結(jié)合。FBS部分可以在一個(gè)或多個(gè)環(huán)、以及一個(gè)或多個(gè)支架區(qū)中包含氨基酸改變(或變化)。

在一些實(shí)施方案中，可以將整聯(lián)蛋白結(jié)合基序“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”(RGD)(SEQ ID NO:1的氨基酸78-80)中的一個(gè)或多個(gè)殘基加以取代，從而破壞整聯(lián)蛋白結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，本文中提供的所述多肽的FG環(huán)不含RGD整聯(lián)蛋白結(jié)合位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中，該RGD序列被替換為極性氨基酸-中性氨基酸-酸性氨基酸序列(以N端到C端的方向)。在某些實(shí)施方案中，該RGD序列被替換為SGE或RGE。

在一些實(shí)施方案中，相對(duì)于¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域(例如包含SEQ ID NO:1的¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域)的相應(yīng)區(qū)域的氨基酸序列，F(xiàn)BS部分的N端和/或C端區(qū)的氨基酸序列可以通過缺失、取代或插入而被修飾。

在某些實(shí)施方案中，相對(duì)于具有SEQ ID NO:1的野生型人¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域中的相應(yīng)氨基酸的序列，本文提供的多肽中SEQ ID NO:1的前1、2、3、4、5、6、7、8或9個(gè)殘基的氨基酸序列可以被修飾或缺失。在示例性實(shí)施方案中，與SEQ ID NO:1-16中任一者的氨基酸1-7、8或9對(duì)應(yīng)的氨基酸被替換為長度為1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3,1-2、或1個(gè)氨基酸的替代N端區(qū)。示例性替代N端區(qū)包括(用單字母氨基酸代碼表示)：M、MG、G、MGVSDVPRDL(SEQ ID NO:24)和GVSDVPRDL(SEQ ID NO:25)、或SEQ ID NO:24或25中任一者的N端截短。其他適合的替代N端區(qū)包括，例如，X_nSDVPRDL(SEQ ID NO:26)、X_nDVPRDL(SEQ ID NO:27)、X_nVPRDL(SEQ ID NO:28)、X_nPRDL(SEQ ID NO:29)、X_nRDL(SEQ ID NO:30)、X_nDL(SEQ ID NO:31)、或X_nL，其中n＝0、1或2個(gè)氨基酸，其中當(dāng)n＝1時(shí)，X是Met或Gly，并且當(dāng)n＝2時(shí)，X是Met-Gly。當(dāng)Met-Gly序列被添加至¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域的N端時(shí)，M常被切割掉，在N端留下G。在其他實(shí)施方案中，替代的N端區(qū)包含氨基酸序列MASTSG(SEQ ID NO:32)。

如本文中進(jìn)一步描述，在一些實(shí)施方案中，SEQ ID NO:1的前七個(gè)或八個(gè)殘基(即，殘基1-7或1-8)缺失，從而產(chǎn)生具有例如SEQ ID NO:8的氨基酸序列的¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域。具有SEQ ID NO:1-16中任一者的氨基酸序列的¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域的N端或C端還可添加另外的序列。例如,在一些實(shí)施方案中，N端延伸由選自下組的氨基酸序列組成：M、MG、和G。例如，SEQ ID NO:1-16中任一者之前可以是M、MG、或G。

在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)BS部分基于纖連蛋白例如人纖連蛋白的III型結(jié)構(gòu)域的第10重復(fù)之外的Fn3重復(fù)。例如，F(xiàn)BS部分可類似于任何其他纖連蛋白III型重復(fù)，例如，第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7、第8、第9、第11、第12、第13、第14、第15、第16、第17、和第18Fn3重復(fù)。在其他實(shí)施方案中，F(xiàn)BS部分可以來自纖連蛋白之外的分子。示例性FBS部分可以來源于肌腱蛋白，肌腱蛋白是一種由15個(gè)Fn3結(jié)構(gòu)域組成的蛋白質(zhì)，這些結(jié)構(gòu)域彼此具有如纖連蛋白中所見的相似的序列相似性。這些重復(fù)描述于例如Jacobs等人，Protein Engineering,Design&Selection,25:107(2012)?；诶w連蛋白分子中的重復(fù)以及肌腱蛋白分子中的重復(fù)的同源性，已經(jīng)產(chǎn)生基于這些同源性的人工分子。包含基于纖連蛋白分子中的結(jié)構(gòu)域的同源性的共有氨基酸序列的蛋白質(zhì)被稱為Fibcon和FibconB(WO2010/093627和Jacobs等人，(2012)，上文)，基于肌腱蛋白分子中的結(jié)構(gòu)域的同源性的蛋白質(zhì)被稱為Tencon。示例性Fibcon氨基酸序列包含下列氨基酸序列：

MPAPTDLRFTNETPSSLLISWTPPRVQITGYIIRYGPVGSDGRVKEFTVPPSVSSATITGLKPGTEYTISVIALKDNQESEPLRGRVTTGG(FibconB；SEQ ID NO:33)，

其中環(huán)AB由氨基酸13-16組成(TPSS；SEQ ID NO:34)，環(huán)BC由氨基酸22-28組成(TPPRVQI；SEQ ID NO:35)，環(huán)CD由氨基酸38-43組成(VGSDGR；SEQ ID NO:36)，環(huán)DE由氨基酸51-54組成(PSVS；SEQ ID NO:37)，環(huán)EF由氨基酸60-64組成(GLKPG；SEQ ID NO:38)，環(huán)FG由氨基酸75-81組成(KDNQESEP；SEQ ID NO:39)。另一種Fibcon氨基酸序列包含下列氨基酸序列：

LDAPTDLQVTNVTDTSITVSWTPPSATITGYRITYTPSNGPGEPKELTVPPSSTSVTITGITPGVEYVVSVYALKDNQESPPLVGTCTT(SEQ ID NO:40；Jacobs等人，上文)。

源于肌腱蛋白的Fn3蛋白包括Tencons(WO 2010/051274、WO 2010/051310和WO 2011/137319，將它們通過提述明確并入本文)。示例性Tencon蛋白具有下列氨基酸序列：

LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT(SEQ ID NO:41；Jacobs等人，上文，和WO 2011/137319)，

其中環(huán)AB由氨基酸13-16組成(TEDS；SEQ ID NO:42)，環(huán)BC由氨基酸22-28組成(TAPDAAF；SEQ ID NO:43)，環(huán)CD由氨基酸38-43組成(SEKVGE；SEQ ID NO:44)，環(huán)DE由氨基酸51-54組成(GSER；SEQ ID NO:45)，環(huán)EF由氨基酸60-64組成(GLKPG；SEQ ID NO:46)，環(huán)FG由氨基酸75-81組成(KGGHRSN；SEQ ID NO:47)。

Fibcon、FibconB或Tencon部分，或其靶結(jié)合變體，無論是單獨(dú)的還是綴合有異源部分的，可以如本文中描述進(jìn)行融合。來自其他蛋白質(zhì)，例如細(xì)胞表面激素和細(xì)胞因子受體、伴侶蛋白、和碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域，的Fn3結(jié)構(gòu)域可以如本文中描述進(jìn)行偶聯(lián)。

FBS蛋白或部分在例如WO 2010/093627、WO 2011/130324、WO 2009/083804、WO 2009/133208、WO 02/04523、WO 2012/016245、WO 2009/023184、WO 2010/051310、WO 2011/020033、WO 2011/051333、WO 2011/051466、WO 2011/092233、WO 2011/100700、WO 2011/130324、WO 2011/130328、WO 2011/137319、WO 2010/051274、WO 2009/086116、WO09/058379、WO 2013/067029WO 2012/016245、WO 2014/120891和WO 2014/043344中有描述(所有這些專利均通過提述明確并入本文)：任何在這些出版物中描述的FBS蛋白或部分均可如本文描述加以使用。

在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)包含至少2個(gè)FBS部分，例如，所述蛋白質(zhì)包含多價(jià)FBS部分。例如，多價(jià)FBS可包含共價(jià)締合的2、3或更多個(gè)FBS部分，例如¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域。在示例性實(shí)施方案中，F(xiàn)BS部分是包含兩個(gè)¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域的雙特異性或二聚體蛋白。

在多價(jià)蛋白中的各個(gè)FBS部分，例如，各個(gè)¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域，可以通過多肽接頭加以連接。示例性的多肽接頭包括具有1-20、1-15、1-10、1-8、1-5、1-4、1-3、或1-2個(gè)氨基酸的多肽。適合的用于連接¹⁰Fn3結(jié)構(gòu)域的接頭是這樣的接頭，其允許各別的結(jié)構(gòu)域彼此獨(dú)立地折疊，形成容許與靶分子高親和力結(jié)合的三維結(jié)構(gòu)。適合的接頭的具體實(shí)例包括基于甘氨酸-絲氨酸的接頭、基于甘氨酸-脯氨酸的接頭、基于脯氨酸-丙氨酸的接頭、以及本文中描述的任何其他接頭。在一些實(shí)施方案中，所述接頭為基于甘氨酸-脯氨酸的接頭。這些接頭包含甘氨酸和脯氨酸殘基，并且長度可以在3和30、10和30、以及3和20個(gè)氨基酸之間。這樣的接頭的實(shí)例包括GPG、GPGPGPG(SEQ ID NO:48)和GPGPGPGPGPG(SEQ ID NO:49)。在一些實(shí)施方案中，所述接頭為基于脯氨酸-丙氨酸的接頭。這些接頭包含脯氨酸和丙氨酸殘基，并且長度可以在3和30、10和30、3和20以及6和18個(gè)氨基酸之間。這樣的接頭的實(shí)例包括PAPAPA(SEQ ID NO:50)、PAPAPAPAPAPA(SEQ ID NO:51)和PAPAPAPAPAPAPAPAPA(SEQ ID NO:52)。在一些實(shí)施方案中，所述接頭是基于甘氨酸-絲氨酸的接頭。這些接頭包含甘氨酸和絲氨酸殘基并且長度可以在8和50、10和30、以及10和20個(gè)氨基酸之間。這樣的接頭的實(shí)例包括GSGSGSGSGS((GS)₅；SEQ ID NO:53)、GSGSGSGSGSGS((GS)₆；SEQ ID NO:54)、GSGSGSGSGSGSGSGSGSGS((GS)₁₀；SEQ ID NO:55)、GGGGSGGGGSGGGGS((G₄S)₄；SEQ ID NO:56)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS((G₄S)₅；SEQ ID NO:57)、和GGGGSGGGGSGGGSG(SEQ ID NO:58)。在示例性實(shí)施方案中，接頭不含任何Asp-Lys(DK)對(duì)。

PmXn部分，例如，穩(wěn)定化部分

在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)BS，例如¹⁰Fn3部分，在其C端與由PmXn組成的部分連接，其中P是脯氨酸，X是任何氨基酸，m是至少為1的整數(shù)，并且n是0或至少為1的整數(shù)，并且P在X的N端。PmXn部分可以直接連接于¹⁰Fn3部分的C端氨基酸，例如它的第94個(gè)氨基酸(基于SEQ ID NO:1的氨基酸編號(hào))。PmXn部分可經(jīng)由肽鍵與¹⁰Fn3部分的第94個(gè)氨基酸連接。PmXn部分可與這樣的¹⁰Fn3部分連接，所述¹⁰Fn3部分具有與SEQ ID NO:1同源的氨基酸序列，或者包含表1或2中所示的氨基酸序列、基本上由表1或2中所示的氨基酸序列組成、或由為表1或2中所示的氨基酸序列組成。在SEQ ID NO:1末端的單個(gè)脯氨酸殘基稱為“95Pro”或“Pro95”或“P95”或“95P”。

與PmXn部分連接的示例性¹⁰Fn3部分包括下列序列：

LEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTPmXn(SEQ ID NO:59)

VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTPmXn(SEQ ID NO:60)

在PmXn中，m可以是1、2、3或更多。例如，m可以是1-3或者m可以是1-2?！皀”可以是0、1、2、3或更多，例如，n可以是1-3或1-2。

如本文中進(jìn)一步描述的，通過修飾一個(gè)或多個(gè)環(huán)和/或一個(gè)或多個(gè)β鏈的氨基酸序列，可以修飾這些¹⁰Fn3部分使之與靶標(biāo)結(jié)合(并且形成FBS部分)。與PmXn連接的FBS部分在本文中被稱為“修飾的FBS部分”。因此，本文中提供了包含與SEQ ID NO:59或60至少約50％、60％、70％、80％、90％、或95％相同的氨基酸序列的FBS部分的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)包含PmXn，并且，其中FBS與靶標(biāo)特異性地結(jié)合(除了通過RGD結(jié)構(gòu)域之外)。

在PmXn中，n可以是0，在這種情況下，該蛋白質(zhì)的C端氨基酸是Pm，例如P。在某些實(shí)施方案中，n不是0，并且可以是例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多。例如，n可以是0-10、0-5、0-3、1-10、1-5、1-3或1-2。然而，該脯氨酸可以與10個(gè)以上的氨基酸連接。例如，在串聯(lián)FBS部分或與另一種多肽融合的FBS部分中，F(xiàn)BS部分的C端氨基酸可與一個(gè)或多個(gè)脯氨酸連接，并且最后的脯氨酸與第二個(gè)FBS部分或與異源部分連接。因此，在某些實(shí)施方案中，n可以是范圍為0-100、0-200、0-300、0-400、0-500或更大的整數(shù)。

在某些實(shí)施方案中，PmXn包含半胱氨酸。例如，脯氨酸之后的第一個(gè)氨基酸可以是半胱氨酸，并且該半胱氨酸可以是該分子中最后的氨基酸或者該半胱氨酸可以在一個(gè)或多個(gè)氨基酸之后。半胱氨酸的存在容許異源部分(如化學(xué)部分，例如PEG)與FBS部分偶聯(lián)。包含半胱氨酸的示例性PmXn部分包括：PmCXn，其中C是半胱氨酸。另一個(gè)實(shí)例是PmXn₁CXn₂，其中n₁和n₂獨(dú)立地是0或至少為1的整數(shù)。例如，n₁可以是1并且n₂可以是1、2、3、4或5。

示例性PmXn部分包括在表3中列出的那些。

表3：示例性PmXn部分

任何PmXn部分，例如，在表3中所示的那些，可以被組氨酸尾所跟隨，例如，6xHis標(biāo)簽，或其他標(biāo)簽。這并不排除組氨酸尾可能被包括在PmXn中。

PmXn部分添加到FBS部分上可增強(qiáng)FBS部分的一種或多種特征。例如，如實(shí)施例中所示，相對(duì)于未與PmXn部分連接的部分，它增強(qiáng)¹⁰Fn3部分的熱穩(wěn)定性。熱穩(wěn)定性的提高預(yù)期可改善其他期望的特性，如溶解度、正確折疊和表達(dá)水平。例如，如實(shí)施例中所示，相對(duì)于未與PmXn部分連接的FBS，F(xiàn)BS C端PmXn部分的存在提高了FBS的溶解度。

因此，在某些實(shí)施方案中，相對(duì)于未與PmXn部分連接的FBS部分，F(xiàn)BS例如¹⁰Fn3部分的Tm至少被提高1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15℃。例如，相對(duì)于未與PmXn部分連接的FBS部分，Tm可增加1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、或1-5℃。例如，可如下所述通過熱掃描熒光(TSF)測(cè)量Tm。將蛋白質(zhì)樣品，例如HTPP樣品歸一化為0.2mg/ml(在PBS中)。將1μl的橙色染料用PBS 1:40稀釋，添加至25μl的各樣品，用透明的96孔微孔板密封膠密封所述板。使用BioRad RT-PCR機(jī)使溫度從25℃以每分鐘2度的速率逐漸上升到95℃掃描樣品。使用BioRad CFX manager 2.0軟件分析數(shù)據(jù)。還可如下所述通過差示掃描量熱法(DSC)測(cè)量Tm。在70p.s.i壓力下在VP-毛細(xì)管差示掃描量熱儀(GE Microcal)中通過使溫度以每分鐘1度的速率從15℃逐漸上升到110℃來掃描0.5mg/ml溶液。使用Origin軟件(OriginLab Corp)，利用最佳擬合分析相對(duì)于適當(dāng)緩沖液對(duì)照運(yùn)行的數(shù)據(jù)。

在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)BS部分的溶解度由于其與PmXn部分連接而提高。這樣的分子可以至少10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml或100mg/ml的濃度存在。

PKE部分

FBS部分可與PKE部分連接以延長FBS部分的半衰期。示例性PKE部分包括人血清白蛋白；與人血清白蛋白結(jié)合的蛋白質(zhì)(例如，與HSA或ABD結(jié)合的FBS)；Fc；或其任何部分或變體；和PEG。這些部分可連接在PmXn部分和/或FBS的N端或C端。

半胱氨酸偶聯(lián)的標(biāo)記物和治療劑

在某些實(shí)施方案中，與PmXn部分連接的FBS部分(并且稱為“修飾的FBS部分”)，其中至少一個(gè)或多個(gè)氨基酸“X”為半胱氨酸，通過一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸與異源部分連接，所述異源部分如標(biāo)記物部分、生物活性部分(例如，治療劑)或結(jié)合部分。

本文中描述的FBS部分可通過C端半胱氨酸與治療劑偶聯(lián)而形成免疫偶聯(lián)物，如FBS-藥物偶聯(lián)物(FBS-DC；還有“adnectin-藥物偶聯(lián)物”)。

在FBS-DC中，F(xiàn)BS與藥物偶聯(lián)，其中FBS用作將FBS-DC導(dǎo)向到表達(dá)其抗原的靶細(xì)胞(如癌細(xì)胞)上的靶向劑。優(yōu)選地，抗原是腫瘤相關(guān)抗原，即，由癌細(xì)胞獨(dú)特地表達(dá)或過表達(dá)的抗原。一旦在那里，藥物就在靶細(xì)胞內(nèi)部或在其附近被釋放，以發(fā)揮治療劑的作用。關(guān)于對(duì)與抗體一起使用的藥物偶聯(lián)物(例如在癌癥治療中)的作用機(jī)制和用途的綜述，參見Schrama等人，Nature Rev.Drug Disc.,5:147(2006)。

適合用于藥物偶聯(lián)物中的治療劑包括抗代謝藥、烷化劑、DNA小溝結(jié)合物、DNA嵌合劑、DNA交聯(lián)劑、組蛋白去乙酰化酶抑制劑、核輸出抑制劑、蛋白酶體抑制劑、拓?fù)洚悩?gòu)酶I或II抑制劑、熱休克蛋白抑制劑、酪氨酸激酶抑制劑、抗生素、和抗有絲分裂劑。在FBS-DC中，F(xiàn)BS和治療劑優(yōu)選地經(jīng)由可裂解的接頭偶聯(lián)，所述接頭例如肽基、二硫鍵、或腙接頭。更優(yōu)選地，接頭為肽基接頭，如Val-Cit、Ala-Val、Val-Ala-Val、Lys-Lys、Pro-Val-Gly-Val-Val(SEQ ID NO:89)、Ala-Asn-Val、Val-Leu-Lys、Ala-Ala-Asn、Cit-Cit、Val-Lys、Lys、Cit、Ser、或Glu?？梢愿鶕?jù)在美國專利Nos.7,087,600；6,989,452；和7,129,261；PCT公開文本W(wǎng)O 02/096910；WO 07/038658；WO 07/051081；WO 07/059404；WO 08/083312；和WO 08/103693；美國專利公開文本2006/0024317；2006/0004081；和2006/0247295中描述的類似方法來制備FBS-DC；這些公開內(nèi)容通過提述并入本文。接頭自身可以連接(例如共價(jià)連接、例如利用馬來酰亞胺化學(xué))于PmXn部分的半胱氨酸(例如，共價(jià)連接)，其中至少一個(gè)X是半胱氨酸。例如，接頭可與FBS-PmXn共價(jià)連接，其中至少一個(gè)X是半胱氨酸。例如，接頭可與FBS-PmCn連接，其中P是脯氨酸，C是半胱氨酸，m和n是至少為1的整數(shù)，例如1-3。與半胱氨酸的連接可以利用馬來酰亞胺化學(xué)以本領(lǐng)域已知的方式進(jìn)行(例如，Imperiali,B.等人，Protein Engineering:Nucleic Acids and Molecular Biology,Vol.22,pp.65-96,Gross,H.J.,ed.(2009))。為了將接頭與FBS上的半胱氨酸附接，該接頭例如可以包含馬來酰亞胺基部分，該部分然后與半胱氨酸反應(yīng)而形成共價(jià)鍵。在某些實(shí)施方案中，優(yōu)化半胱氨酸周圍的氨基酸以促進(jìn)化學(xué)反應(yīng)。例如，相對(duì)于以一段帶正電荷的氨基酸圍繞半胱氨酸，通過使帶負(fù)電荷的氨基酸圍繞半胱氨酸可以使反應(yīng)更快(EP 1074563)。

關(guān)于癌癥治療，該藥物優(yōu)選地是引起靶向的癌細(xì)胞死亡的細(xì)胞毒性藥物?？梢栽贔BS-DC中使用的細(xì)胞毒性藥物包括下列類型的化合物及其類似物和衍生物：

(a)烯二炔類，如卡奇霉素(參見，例如，Lee等人，J.Am.Chem.Soc.,109:3464,3466(1987))和uncialamycin(參見，例如，Davies等人，WO 2007/038868A2(2007)和Chowdari等人，美國專利號(hào)8,709,431B2(2012))；

(b)微管溶素類(參見，例如，Domling等人，美國專利號(hào)7,778,814B2(2010)；Cheng等人，美國專利號(hào)8,394,922B2(2013)；和Cong等人，美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2014/0227295A1；

(c)CC-1065和倍癌霉素(參見，例如，Boger,美國專利號(hào)6,5458,530B1(2003)；Sufi等人，美國專利號(hào)8,461,117B2(2013)；和Zhang等人，美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2012/0301490A1(2012))；

(d)埃坡霉素類(參見，例如，Vite等人，美國專利申請(qǐng)公開號(hào)2007/0275904A1(2007)和美國專利號(hào)RE42,930E(2011))；

(e)奧利斯達(dá)汀(auristatins)類(參見，例如，Senter等人，美國專利號(hào)6,844,869B2(2005)和Doronina等人，美國專利號(hào)7,498,298B2(2009))；

(f)吡咯并苯并二氮雜卓(PBD)二聚體類(參見，例如，Howard等人，美國公開文本Nos.2013/0059800A1(2013)和2013/0028919A1(2013)；和WO 2013/041606A1(2013))；以及

(g)美登木素生物堿類，如DM1和DM4(參見，例如，Chari等人，美國專利號(hào)5,208,020(1993)和Amphlett等人，美國專利號(hào)7,374,762B2(2008))。

在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)BS-PmXn，其中至少一個(gè)X是半胱氨酸，與標(biāo)記物或可檢測(cè)部分連接，用于例如體外或體內(nèi)檢測(cè)或成像。

可檢測(cè)標(biāo)記物可以是當(dāng)前在體外診斷學(xué)領(lǐng)域中使用的任何不同類型，包括顆粒標(biāo)記物，包括金屬溶膠，如膠體金；同位素，如I¹²⁵或Tc⁹⁹，例如與N₂S₂、N₃S或N₄類型的肽螯合劑一起提供；發(fā)色團(tuán)，包括熒光標(biāo)志物、生物素、發(fā)光標(biāo)志物、磷光標(biāo)志物等，還有將給定底物轉(zhuǎn)化為可檢測(cè)標(biāo)志物的酶標(biāo)記物，以及通過后續(xù)擴(kuò)增例如聚合酶鏈反應(yīng)顯示的多核苷酸標(biāo)簽。然后可通過親和素或鏈霉親和素結(jié)合檢測(cè)生物素化抗體。適合的酶標(biāo)記物包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等等。例如，標(biāo)記物可以是酶(堿性磷酸酶)，其可通過測(cè)定在轉(zhuǎn)化1,2二氧雜環(huán)丁烷底物，如金剛烷基甲氧基磷氧酰苯基二氧雜環(huán)丁烷(AMPPD)、3-(4-(甲氧基螺{1,2-二氧雜環(huán)丁烷-3,2′-(5′-氯)三環(huán){3.3.1.1 3,7}癸烷}-4-基)苯基磷酸二鈉(CSPD)，還有CDP和或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他發(fā)光底物，例如適合的鑭系元素鋱(III)和銪(III)的螯合物之后化學(xué)發(fā)光的存在或形成而加以檢測(cè)。

可以使用的可檢測(cè)部分包括放射性物質(zhì)，如：放射性重金屬，如鐵螯合物，釓或錳的放射性螯合物，氧、氮、鐵、碳或鎵的正電子發(fā)射體，¹⁸F、⁶⁰Cu、⁶¹Cu、⁶²Cu、⁶⁴Cu、¹²⁴I、⁸⁶Y、⁸⁹Zr、⁶⁶Ga、⁶⁷Ga、⁶⁸Ga、⁴⁴Sc、⁴⁷Sc、¹¹C、¹¹¹In、^114mIn、¹¹⁴In、¹²⁵I、¹²⁴I、¹³¹I、¹²³I、¹³¹I、¹²³I、³²Cl、³³Cl、³⁴Cl、⁷⁴Br、⁷⁵Br、⁷⁶Br、⁷⁷Br、⁷⁸Br、⁸⁹Zr、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、⁸⁶Y、⁹⁰Y、¹⁷⁷Lu、⁹⁹Tc、²¹²Bi、²¹³Bi、²¹²Pb、²²⁵Ac、或¹⁵³Sm。

檢測(cè)手段由選定的標(biāo)記物所決定。在標(biāo)記物是微粒且以適當(dāng)水平累積的情況下，利用肉眼或使用儀器，如分光光度計(jì)、發(fā)光計(jì)、熒光計(jì)等等可獲得標(biāo)記物或其反應(yīng)產(chǎn)物的外觀，這一切都遵循標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐。

可根據(jù)本領(lǐng)域中已知的方法將可檢測(cè)部分與半胱氨酸連接。當(dāng)可檢測(cè)部分是放射活性劑，例如本文中進(jìn)一步描述的那些放射活性劑時(shí)，通過可與半胱氨酸反應(yīng)的螯合劑將可檢測(cè)部分與FBS連接，所述螯合劑例如含有馬來酰亞胺的螯合劑，如馬來酰亞胺-NODAGA或馬來酰亞胺-DBCO。馬來酰亞胺-NODAGA或馬來酰亞胺-DBCO可與FBS的C端上的半胱氨酸反應(yīng)(例如，通過PmXn部分，其中至少一個(gè)X是半胱氨酸)，以分別產(chǎn)生FBS-NODAGA或FBS-DBCO?？梢允褂孟铝序蟿┲腥我徽?，條件是它包含或可被修飾為包含與半胱氨酸反應(yīng)的反應(yīng)部分：DFO、DOTA及其衍生物(CB-DO2A、3p-C-DEPA、TCMC、Oxo-DO3A)、TE2A、CB-TE2A、CB-TE1A1P、CB-TE2P、MM-TE2A、DM-TE2A、diamsar及衍生物、NODASA、NODAGA、NOTA、NETA、TACN-TM、DTPA、1B4M-DTPA、CHX-A″-DTPA、TRAP(PRP9)、NOPO、AAZTA及衍生物(DATA)、H₂dedpa、H₄octapa、H₂azapa、H₅decapa、H₆phospa、HBED、SHBED、BPCA、CP256、PCTA、HEHA、PEPA、EDTA、TETA、和基于TRITA的螯合劑、以及其接近的類似物和衍生物。

在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)BS用PET示蹤劑加以標(biāo)記并用作體內(nèi)成像劑。例如，F(xiàn)BS可用PET示蹤劑⁶⁴Cu加以標(biāo)記。利用諸如馬來酰亞胺-NODAGA的螯合劑，⁶⁴Cu可與具有C端半胱氨酸的FBS連接。

示例性分子

在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)包含(i)包含與SEQ ID NO:1-16中任一者至少約50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、或99％相同的氨基酸序列的FBS部分；和(ii)PmXn，其中P是脯氨酸，X是任何氨基酸，m是至少為1的整數(shù)，并且n是0或至少為1的整數(shù)，其中蛋白質(zhì)特異性地與靶標(biāo)結(jié)合(例如，以小于500nM、100nM、50nM、10nM、5nM、1nM、500pM、100pM或更小的K_d，通過例如表面等離子體共振(SPR)，如Biacore測(cè)定)，并且，其中相對(duì)于由未修飾的FBS部分組成的蛋白質(zhì)，PmXn部分改善了FBS部分的至少一種特性。

在某些實(shí)施方案中，由PmXn部分賦予的增強(qiáng)特性是增強(qiáng)的蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，例如解鏈溫度(Tm)增加至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、1-15℃、2-15℃、3-15℃、5-15℃、5-15℃、1-10℃、2-10℃、3-10℃、4-10℃或5-10℃。Tm可以通過例如熱掃描熒光(TSF)或差示掃描量熱法(DSC)確定?！霸黾拥腡m”是指統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的Tm增加。

在某些實(shí)施方案中，包含F(xiàn)BS部分和PmXn部分的蛋白質(zhì)以至少10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml或100mg/ml的濃度存在于組合物，例如藥物組合物中。

在某些實(shí)施方案中，包含F(xiàn)BS部分和PmXn部分的蛋白質(zhì)主要以單體存在于組合物，例如藥物組合物中，例如，組合物中的該蛋白質(zhì)的至少80％、85％、90％、95％、98％、或99％呈單體形式。例如，通過在Agilent 1100或1200HPLC系統(tǒng)上使用Superdex柱(GE Healthcare)進(jìn)行大小排阻色譜，可以確定蛋白質(zhì)溶液的單體性程度，其中在A₂₁₄nm和A₂₈₀nm進(jìn)行UV檢測(cè)，并進(jìn)行熒光檢測(cè)(激發(fā)＝280nM，發(fā)射＝350nm)?？刹捎镁哂羞m當(dāng)流速的100mM硫酸鈉、100mM磷酸鈉、150mM氯化鈉的緩沖液(例如，pH 6.8)的SEC柱。使用凝膠過濾標(biāo)準(zhǔn)品(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)進(jìn)行分子量校準(zhǔn)。

在某些實(shí)施方案中，包含F(xiàn)BS部分和PmXn部分的蛋白質(zhì)具有與未修飾的FBS部分至少一樣強(qiáng)的生物活性。上述生物活性可以是與靶標(biāo)的結(jié)合親和力，或者在某種測(cè)定中的生物活性，例如破壞腫瘤細(xì)胞的能力。在某些實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)的生物活性在未修飾的FBS部分的活性的5％、10％、25％、50％、100％、2倍或更多倍之內(nèi)。

包含F(xiàn)BS和PmXn部分的蛋白質(zhì)還可包括以上特征的組合。例如，蛋白質(zhì)可以在高達(dá)50mg/ml的濃度是可溶的，可以至少90％單體形式存在，并且/或者具有與未修飾的FBS至少一樣強(qiáng)力的生物活性。

當(dāng)提及增強(qiáng)的特性時(shí)，該增強(qiáng)是統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的增強(qiáng)。

核酸-蛋白質(zhì)技術(shù)

一種迅速制造和測(cè)試具有特異性結(jié)合性質(zhì)的FBS結(jié)構(gòu)域的方式是Adnexus(Bristol-Myers Squibb的一家公司)的核酸-蛋白質(zhì)技術(shù)。這種體外表達(dá)和標(biāo)簽化技術(shù)(稱作Profusion)利用核酸-蛋白質(zhì)融合(RNA-和DNA-蛋白質(zhì)融合)，可用于鑒定對(duì)于與蛋白質(zhì)結(jié)合而言重要的新多肽和氨基酸基序。核酸-蛋白質(zhì)技術(shù)是將蛋白質(zhì)與其編碼遺傳信息共價(jià)偶聯(lián)的技術(shù)。關(guān)于RNA-蛋白質(zhì)技術(shù)和基于纖連蛋白的支架蛋白文庫篩選方法的詳細(xì)描述參見Szostak等人，美國專利Nos.6,258,558；6,261,804；6,214,553；6,281,344；6,207,446；6,518,018；PCT公開文本Nos.WO 00/34784；WO 01/64942；WO 02/032925；和Roberts等人，Proc Natl.Acad.Sci.,94:12297-12302(1997)，通過提述將其并入本文。

載體及多核苷酸實(shí)施方案

本文中公開的包含F(xiàn)BS部分和PmXn部分的各種蛋白質(zhì)的編碼核酸可以通過化學(xué)、酶促或重組方式合成?？梢赃x擇密碼子用法以提高細(xì)胞中的表達(dá)。這樣的密碼子用法將取決于所選擇的細(xì)胞類型。已經(jīng)開發(fā)了專門針對(duì)大腸桿菌和其他細(xì)菌、以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞的密碼子用法模式。參見，例如，Mayfield等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100(2):438-442(Jan.21,2003)；Sinclair等人，Protein Expr.Purif.,26(1):96-105(Oct.2002)；Connell,N.D.,Curr.Opin.Biotechnol.,12(5):446-449(Oct.2001)；Makrides等人，Microbiol.Rev.,60(3):512-538(Sep.1996)；和Sharp等人，Yeast,7(7):657-678(Oct.1991)。

核酸操作的通用技術(shù)描述于例如Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第二版，Vols.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)，或Ausubel,F.等人，Current Protocols in Molecular Biology,Green Publishing and Wiley-Interscience,New York(1987)及定期的更新中，將這些文獻(xiàn)通過提述并入本文。編碼多肽的DNA與適合的來源于哺乳動(dòng)物、病毒、或昆蟲基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)節(jié)元件可操作連接。這樣的調(diào)節(jié)元件包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、任選的控制轉(zhuǎn)錄的操作序列、編碼適合的mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)的序列、和控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止的序列。另外，組入在宿主中復(fù)制的能力(通常由復(fù)制起點(diǎn)賦予)、以及易化轉(zhuǎn)化體識(shí)別的選擇基因。

本文中描述的蛋白質(zhì)不僅可以直接地重組產(chǎn)生，還可以以帶有異源多肽的多肽的形式產(chǎn)生，所述異源多肽優(yōu)選是信號(hào)序列或其他在成熟蛋白或多肽的N端具有特異性切割位點(diǎn)的多肽。選用的異源信號(hào)序列優(yōu)選是可被宿主細(xì)胞識(shí)別和加工(即，被信號(hào)肽酶切割)的信號(hào)序列。對(duì)于不識(shí)別和加工天然信號(hào)序列的原核宿主細(xì)胞，將信號(hào)序列替換為例如選自下組的原核信號(hào)序列：堿性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或熱穩(wěn)定腸毒素II前導(dǎo)序列。為了酵母分泌，可將天然信號(hào)序列取代為例如酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)序列、α因子前導(dǎo)序列(包括酵母屬和克魯維酵母屬α-因子前導(dǎo)序列)、或酸性磷酸酶前導(dǎo)序列、白色念珠菌葡糖淀粉酶前導(dǎo)序列、或PCT公開文本W(wǎng)O 90/13646中描述的信號(hào)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)中，可使用哺乳動(dòng)物信號(hào)序列以及病毒分泌性前導(dǎo)序列，例如單純皰疹gD信號(hào)。這樣的前體區(qū)域的DNA可以閱讀框的方式連接于編碼蛋白質(zhì)的DNA。

表達(dá)載體和克隆載體都包含使所述載體能夠在一個(gè)或多個(gè)選定的宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列。通常，在克隆載體中，這個(gè)序列是使所述載體能夠獨(dú)立于宿主染色體DNA而復(fù)制的序列，并且包括復(fù)制起點(diǎn)或自主復(fù)制序列。對(duì)于多種細(xì)菌、酵母、和病毒而言這樣的序列是熟知的。來自質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點(diǎn)適合于大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌，2μ質(zhì)粒起點(diǎn)適合于酵母，而各種病毒起點(diǎn)(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的克隆載體。通常，復(fù)制起點(diǎn)組分對(duì)于哺乳動(dòng)物表達(dá)載體是不需要的(通常使用SV40起點(diǎn)僅僅是因?yàn)樗性缙趩?dòng)子)。

表達(dá)載體和克隆載體可包含選擇基因，也稱為選擇標(biāo)志物。典型的選擇基因編碼這樣的蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)(a)賦予對(duì)抗生素或其他毒素例如氨芐青霉素、新霉素、甲氨蝶呤、或四環(huán)素的抗性，(b)補(bǔ)足營養(yǎng)缺陷型缺陷，或(c)提供從復(fù)合培養(yǎng)基中不可得的關(guān)鍵養(yǎng)分，例如，編碼用于桿菌的D-丙氨酸消旋酶的基因。

適合于在酵母中使用的選擇基因是trp1基因，其存在于酵母質(zhì)粒YRp7中(Stinchcomb等人，Nature,282:39(1979))。trp1基因針對(duì)缺乏在色氨酸中生長的能力的酵母突變株提供選擇標(biāo)志物，例如，No.44076或PEP4-1.Jones,Genetics,85:12(1977)。此外，酵母宿主細(xì)胞基因組中trp1缺損的存在提供了一個(gè)有效的通過在缺乏色氨酸的情況下的生長來檢測(cè)轉(zhuǎn)化的環(huán)境。類似地，Leu2缺陷型酵母株(20,622或38,626)通過已知的攜帶Leu2基因的質(zhì)粒而得到補(bǔ)全。

表達(dá)載體和克隆載體常常含有可被宿主生物識(shí)別、并且與編碼蛋白質(zhì)的核酸可操作連接的啟動(dòng)子。適合于與原核宿主一起使用的啟動(dòng)子包括phoA啟動(dòng)子、β-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)、堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)、和雜合啟動(dòng)子例如tac啟動(dòng)子。然而，其他已知的細(xì)菌啟動(dòng)子也是適合的。用于細(xì)菌系統(tǒng)中的啟動(dòng)子還將包含Shine-Dalgarno(S.D.)序列，其與編碼蛋白質(zhì)的DNA可操作連接。

真核生物的啟動(dòng)子序列是已知的。幾乎所有的真核基因都具有富AT區(qū)，它位于轉(zhuǎn)錄起始的位點(diǎn)上游大約25到30個(gè)堿基處。另一個(gè)序列在許多基因的轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游70到80個(gè)堿基處出現(xiàn)的是CNCAAT(SEQ ID NO:109)區(qū)，其中N可以是任何核苷酸。在大多數(shù)真核基因的3′端有AATAAA(SEQ ID NO:110)序列，它可能是向編碼序列的3′端添加多聚A尾的信號(hào)。所有這些序列都適宜地插入真核表達(dá)載體中。

適合于與酵母宿主一起使用的啟動(dòng)序列的實(shí)例包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶，如烯醇化酶、3-磷酸甘油醛脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖異構(gòu)酶、磷酸葡糖異構(gòu)酶和葡糖激酶的啟動(dòng)子。

其他酵母啟動(dòng)子，它們是擁有可通過生長條件控制轉(zhuǎn)錄這一額外優(yōu)勢(shì)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，是下列酶的啟動(dòng)子區(qū)：醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素C、酸性磷酸酶、與氮代謝相關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、3-磷酸甘油醛脫氫酶，以及負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶。適合在酵母表達(dá)中使用的載體和啟動(dòng)子在歐洲專利公開文本73,657以及PCT公開文本W(wǎng)O 2011/124718和WO 2012/059486中有進(jìn)一步描述。將酵母增強(qiáng)子與酵母啟動(dòng)子一起使用也是有利的。

在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中，來自載體的轉(zhuǎn)錄可以受到例如獲自病毒(如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳頭瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒，以及最優(yōu)選地，猴病毒40(SV40))的基因組中的啟動(dòng)子、獲自異源哺乳動(dòng)物的啟動(dòng)子(例如啟動(dòng)子或免疫球蛋白啟動(dòng)子)、獲熱休克啟動(dòng)子的控制，只要這樣的啟動(dòng)子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容即可。

SV40病毒的早期啟動(dòng)子和晚期啟動(dòng)子可方便地作為SV40限制性片段獲得，該片段還包含SV40病毒復(fù)制起點(diǎn)。人巨細(xì)胞病毒的立即早期啟動(dòng)子可方便作為HindIII E限制性片段獲得。美國專利號(hào)4,419,446中公開了利用牛乳頭瘤病毒作為載體在哺乳動(dòng)物宿主中表達(dá)DNA的系統(tǒng)。在美國專利號(hào)4,601,978中描述了對(duì)這個(gè)系統(tǒng)的修改。關(guān)于人β干擾素cDNA在來自單純皰疹病毒的胸苷激酶啟動(dòng)子控制下在小鼠細(xì)胞中的表達(dá)，還參見Reyes等人，Nature,297:598-601(1982)?；蛘?，可使用勞斯肉瘤病毒長末端重復(fù)序列作為啟動(dòng)子。

經(jīng)常通過向載體中插入增強(qiáng)子序列來增加高等真核生物對(duì)編碼蛋白質(zhì)的DNA的轉(zhuǎn)錄。目前已知許多來自哺乳動(dòng)物基因(珠蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、α甲胎蛋白、和胰島素)的增強(qiáng)子序列。然而，通常將使用來自真核細(xì)胞病毒的增強(qiáng)子。實(shí)例包括位于復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)(late side)(bp 100-270)的SV40增強(qiáng)子、巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子增強(qiáng)子、位于復(fù)制起點(diǎn)晚期側(cè)(late side)的多瘤病毒增強(qiáng)子、以及腺病毒增強(qiáng)子。關(guān)于真核生物啟動(dòng)子活化的增強(qiáng)元件，還參見Yaniv,Nature,297:17-18(1982)。增強(qiáng)子可拼接到載體中多肽編碼序列5′或3′位置，但優(yōu)選位于啟動(dòng)子的5′的某個(gè)位點(diǎn)。

在真核宿主細(xì)胞(例如，酵母、真菌、昆蟲、植物、動(dòng)物、人類、或來自其他多細(xì)胞生物的有核細(xì)胞)中使用的表達(dá)載體還將含有對(duì)于終止轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定化mRNA必需的序列。這樣的序列通常可從真核生物或病毒DNA的5′(有時(shí)還有3′)非翻譯區(qū)或cDNA得到。這些區(qū)域含有轉(zhuǎn)錄為編碼多肽的mRNA的非翻譯部分中的多腺苷酸化片段的核苷酸區(qū)段。一種有用的轉(zhuǎn)錄終止組分是牛生長激素多腺苷酸化區(qū)。參見WO 94/11026及其中所公開的表達(dá)載體。

重組DNA也可包括任何類型的可用于純化蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)標(biāo)簽序列。蛋白質(zhì)標(biāo)簽的實(shí)例包括，但不限于，組氨酸標(biāo)簽、標(biāo)簽、myc標(biāo)簽、HA標(biāo)簽、或GST標(biāo)簽。用于細(xì)菌、真菌、酵母及哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主的適當(dāng)克隆與表達(dá)載體可見于：Cloning Vectors:A Laboratory Manual,Elsevier,New York(1985)，該文獻(xiàn)的相關(guān)公開內(nèi)容通過提述并入本文。

可使用適合于宿主細(xì)胞的方法將表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是容易想到的。將核酸導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的各種方法是本領(lǐng)域中已知的，包括，但不限于，電穿孔；使用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其他物質(zhì)轉(zhuǎn)染；微粒轟擊；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染；及感染(其中載體為感染介質(zhì))。

適合的宿主細(xì)胞包括原核生物、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、或細(xì)菌細(xì)胞。適合的細(xì)菌包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物，例如，大腸桿菌或芽孢桿菌屬物種。酵母，優(yōu)選地來自酵母屬物種的酵母如釀酒酵母，也可用于產(chǎn)生多肽。還可使用各種哺乳動(dòng)物或昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)來表達(dá)重組蛋白質(zhì)。用于在昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)的桿狀病毒系統(tǒng)由Luckow等人(Bio/Technology,6:47(1988))綜述。適合的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系的實(shí)例包括內(nèi)皮細(xì)胞、COS-7猴腎細(xì)胞、CV-1、L細(xì)胞、C127、3T3、中華倉鼠卵巢(CHO)、人胚腎細(xì)胞、HeLa、293、293T、和BHK細(xì)胞系。通過培養(yǎng)適合的宿主/載體系統(tǒng)來表達(dá)重組蛋白而制備純化的蛋白質(zhì)。然后從培養(yǎng)基或細(xì)胞提取物中純化FBS蛋白。

蛋白質(zhì)產(chǎn)生

用本文中描述的用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，并在常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞，所述營養(yǎng)培養(yǎng)基經(jīng)過改良以適應(yīng)誘導(dǎo)啟動(dòng)子、選擇轉(zhuǎn)化體、或擴(kuò)增編碼期望序列的基因。

可在各種培養(yǎng)基中培養(yǎng)用于產(chǎn)生蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞?？缮藤彽呐囵B(yǎng)基，如Ham's F10(Sigma)、最小必需培養(yǎng)基((MEM)、(Sigma))、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco's Modified Eagle's Medium((DMEM)、(Sigma))適合于培養(yǎng)宿主細(xì)胞。另外，在Ham等人，Meth.Enzymol.,58:44(1979),Barnes等人，Anal.Biochem.,102:255(1980),美國專利4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；PCT公開文本W(wǎng)O 90/03430；WO 87/00195；或美國專利號(hào)RE30,985中描述的培養(yǎng)基中任一者可用作宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基。在需要時(shí)，可對(duì)任何這些培養(yǎng)基補(bǔ)充激素和/或其他生長因子(如胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白或表皮生長因子)、鹽(如氯化鈉、鈣、鎂、和磷酸鹽)、緩沖液(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如慶大霉素藥物)、微量元素(定義為無機(jī)化合物，通常以在微摩爾范圍內(nèi)的終濃度存在)、以及葡萄糖或等效能源。還可包括適當(dāng)濃度的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其他必要的補(bǔ)充劑。培養(yǎng)條件，諸如溫度、pH值等，是先前用于經(jīng)選擇用于表達(dá)的宿主細(xì)胞的那些條件，且對(duì)于普通技術(shù)人員而言是容易想到的。

還可使用無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)產(chǎn)生本文中公開的蛋白質(zhì)。為了這樣的目的，必須修飾編碼蛋白質(zhì)的核酸，以允許體外轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生mRNA并允許mRNA在所用的特定無細(xì)胞系統(tǒng)(真核無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)例如哺乳動(dòng)物或酵母無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，原核無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)例如細(xì)菌無細(xì)胞翻譯系統(tǒng))中進(jìn)行無細(xì)胞翻譯。

也可通過化學(xué)合成產(chǎn)生蛋白質(zhì)(例如，通過在Solid Phase Peptide Synthesis，第二版，The Pierce Chemical Co.,Rockford,IL(1984))中描述的方法)。蛋白質(zhì)的修飾也可通過化學(xué)合成產(chǎn)生。

本文中公開的蛋白質(zhì)可通過蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域中通常已知的用于蛋白質(zhì)的分離/純化方法來純化。非限制性實(shí)例包括萃取、重結(jié)晶、鹽析(例如，使用硫酸銨或硫酸鈉)、離心、透析、超濾、吸附色譜法、離子交換色譜法、疏水色譜法、正相色譜法、反相色譜法、凝膠過濾、凝膠滲透色譜法、親和色譜法、電泳、逆流分布法或這些方法的任何組合。純化后，可通過本領(lǐng)域已知的多種方法中的任何方法，包括但不限于，過濾和透析，將蛋白質(zhì)交換到不同的緩沖液中和/或濃縮。

經(jīng)純化的蛋白質(zhì)優(yōu)選為至少85％純，更優(yōu)選為至少95％純，且最優(yōu)選為至少98％或99％純。不論純度的精確數(shù)值，蛋白質(zhì)的純度足以用作醫(yī)藥產(chǎn)品。

示例性用途

修飾的FBS蛋白可以應(yīng)用于未通過添加PmXn部分被修飾的FBS蛋白能夠應(yīng)用的任何目的。

在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝税捎糜谥委煵“Y的修飾FBS部分的蛋白質(zhì)?？梢灾委煹募膊』虿“Y將由FBS部分的結(jié)合特異性來定義。如本文中描述的，修飾的FBS部分可被設(shè)計(jì)為與任何感興趣的靶標(biāo)結(jié)合。示例性的靶標(biāo)包括，例如，TNF-α、VEGFR2、PCSK9、IL-23、EGFR和IGF1R。只是作為例子，與TNF-α結(jié)合的修飾的FBS部分可用于治療自身免疫病癥，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、銀屑病、和哮喘。本文中描述的修飾的FBS蛋白還可用于治療癌癥。

在某些實(shí)施方案中，用于治療患有諸如癌癥之類的疾病的受試者的方法包括向受試者給予修飾的FBS-藥物偶聯(lián)物。

本文中提供了用于向受試者給予蛋白質(zhì)的方法。在一些實(shí)施方案中，受試者是人。在一些實(shí)施方案中，所述蛋白質(zhì)對(duì)于哺乳動(dòng)物尤其是人類是藥學(xué)上可接受的?！八帉W(xué)上可接受的”組合物是指給予動(dòng)物而無顯著不良醫(yī)療后果的組合物。藥學(xué)上可接受的組合物的實(shí)例包括包含缺乏整聯(lián)蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(RGD)的FBS部分的組合物、以及基本上不含內(nèi)毒素或熱原或具有極低內(nèi)毒素或熱原水平的組合物。

本文中描述的修飾的FBS蛋白的其他用途包括它們?cè)隗w外或體內(nèi)檢測(cè)測(cè)定法中的用途。例如，它們可用于檢測(cè)樣品中的靶分子。方法可包括使該樣品與本文中描述的修飾的FBS接觸，其中所述接觸在允許FBS-靶標(biāo)復(fù)合物形成的條件下進(jìn)行；和檢測(cè)所述復(fù)合物，由此檢測(cè)所述樣品中的所述靶標(biāo)?？墒褂萌魏伪绢I(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，例如放射線照相術(shù)、免疫測(cè)定法、熒光檢測(cè)、質(zhì)譜法、或表面等離子體共振。樣品可來自人或其他哺乳動(dòng)物。對(duì)診斷目的而言，適當(dāng)?shù)淖饔脛┦前ㄓ糜谌沓上竦姆派湫酝凰氐目蓹z測(cè)標(biāo)記物，以及用于樣品測(cè)試的放射性同位素、酶、熒光標(biāo)記物和其他適合的抗體標(biāo)簽。

在某些實(shí)施方案中，本文中描述的修飾的FBS可用于多種診斷和成像應(yīng)用中。在某些實(shí)施方案中，用體內(nèi)可檢測(cè)的部分標(biāo)記修飾的FBS，并且如此標(biāo)記的FBS可用作體內(nèi)成像劑，例如用于全身成像的體內(nèi)成像劑。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，用于檢測(cè)受試者體內(nèi)含有給定抗原的腫瘤的方法包括：向受試者給予與可檢測(cè)標(biāo)記物連接的修飾的FBS，并且在適當(dāng)?shù)臅r(shí)間后檢測(cè)受試者體內(nèi)的標(biāo)記物。

FBS成像劑可以用來診斷與給定抗原水平增加相關(guān)的病癥或疾病，例如癌癥，其中腫瘤選擇性地過表達(dá)所述抗原。以類似的方式，與給定抗原特異性地結(jié)合的修飾的FBS可以用來監(jiān)測(cè)正在由于與該抗原相關(guān)的狀況而接受治療的受試者體內(nèi)該抗原的水平。修飾的FBS可以修飾后也可以不修飾而使用，并且可以通過共價(jià)或非共價(jià)附接可檢測(cè)部分加以標(biāo)記。

制劑和施用

本申請(qǐng)進(jìn)一步提供了包含本文中描述的蛋白質(zhì)的藥學(xué)上可接受的組合物，其中所述組合物基本上不含內(nèi)毒素和/或熱原。

通過將所描述的具有期望純度的蛋白質(zhì)與任選的生理學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合而制備用于儲(chǔ)存的包含蛋白質(zhì)的治療制劑(Osol,A.編輯，Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版(1980))，其呈水溶液、凍干或其他干燥制劑的形式。采用劑量和濃度的可接受的載體、賦形劑、或穩(wěn)定劑對(duì)于接受者是無毒的，并且包括諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽、和其他有機(jī)酸的緩沖劑；包括抗壞血酸和甲硫氨酸在內(nèi)的抗氧化劑；防腐劑(如十八烷基二甲基芐基氯化銨；氯化六甲雙銨；苯扎氯銨、芐索氯銨；苯酚、丁醇或芐醇；烷基對(duì)羥基苯甲酸酯，如對(duì)羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、明膠、或免疫球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸、或賴氨酸；單糖類、二糖類、和其他碳水化合物類，包括葡萄糖、甘露糖、或葡聚糖；螯合劑，如EDTA；糖類，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽反離子，如鈉；金屬復(fù)合物(例如，Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子型表面活性劑，如吐溫、或聚乙二醇(PEG)。

在被治療的特殊適應(yīng)癥需要時(shí)，本文中的制劑還可含有一種以上的活性化合物，優(yōu)選地，所述活性化合物具有彼此無不良影響的互補(bǔ)活性。這樣的分子以對(duì)預(yù)期目的有效的量適當(dāng)?shù)亟M合存在。

還可例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合而將蛋白質(zhì)包埋在制備的微膠囊中，例如分別在膠體藥物遞送系統(tǒng)(例如，脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳液、納米顆粒和納米膠囊)或在粗乳液中的羥甲基纖維素或明膠微膠囊和聚甲基丙烯酸甲酯微膠囊。這樣的技術(shù)公開于Osol,A.編輯，Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版(1980)中。

用于體內(nèi)給藥的制劑必須是無菌的。這通過無菌過濾膜容易實(shí)現(xiàn)。

可以制備緩釋制劑。緩釋制劑的適合實(shí)例包括含有本文中描述的蛋白質(zhì)的固體疏水聚合物的半透性基質(zhì)，所述基質(zhì)呈成形物品的形式，例如薄膜、或微膠囊。緩釋基質(zhì)的實(shí)例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)、或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美國專利號(hào)3,773,919)、L-谷氨酸和y乙基-L-谷氨酸鹽的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRON(由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林組成的注射微球)、和聚-D-(-)-3-羥丁酸。雖然諸如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸的聚合物能夠使分子釋放持續(xù)100天，但某些水凝膠釋放蛋白質(zhì)持續(xù)較短的時(shí)期。當(dāng)封裝的蛋白質(zhì)在體內(nèi)長時(shí)間保留時(shí)，它們可能由于暴露于37℃的濕氣而變性或凝集，導(dǎo)致生物活性的喪失和可能的免疫原性變化?？梢愿鶕?jù)所涉及的機(jī)制針對(duì)穩(wěn)定化設(shè)計(jì)合理的策略。例如，如果發(fā)現(xiàn)凝集機(jī)制為通過巰基二硫鍵轉(zhuǎn)換的分子間S--S鍵形成，可通過修飾巰基殘基、凍干酸性溶液、控制含濕量、使用適當(dāng)?shù)奶砑觿?、和開發(fā)特定的聚合物基質(zhì)組成而實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定化。

雖然技術(shù)人員將理解，每種蛋白質(zhì)的劑量將取決于蛋白質(zhì)的個(gè)性(identity)，優(yōu)選的劑量范圍可以為從約10mg/平方米到約2000mg/平方米，更優(yōu)選從約50mg/平方米到約1000mg/平方米。

為了治療應(yīng)用，以藥學(xué)上可接受的劑型向受試者給予蛋白質(zhì)。所述蛋白質(zhì)可以推注的方式或通過在一定時(shí)段中以連續(xù)方式靜脈內(nèi)給予，通過肌內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、鞘內(nèi)、口服、局部、或吸入途徑給予。還可以通過瘤內(nèi)、腫瘤周圍、病灶內(nèi)、或病灶周圍途徑給予蛋白質(zhì)，以發(fā)揮局部以及全身性療效。適合的藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、和賦形劑是熟知的，并且在臨床情況允許的情況下可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員確定。適合的載體、稀釋劑和/或賦形劑包括：(1)杜爾貝科(Dulbecco)磷酸鹽緩沖鹽水，pH約7.4，含有1mg/ml到25mg/ml的人血清白蛋白，(2)0.9％鹽水(0.9％w/v NaCl)、和(3)5％(w/v)右旋糖。本發(fā)明的方法可以在體外、體內(nèi)、或離體實(shí)施。

蛋白質(zhì)、和一種或多種另外的治療劑的給藥，無論是聯(lián)合給藥還是依次給藥，可如上文針對(duì)治療應(yīng)用的描述來進(jìn)行。技術(shù)人員將了解，用于聯(lián)合給藥的適合的藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、和賦形劑取決于聯(lián)合給藥的具體治療劑的個(gè)性(identity)。

當(dāng)以除了凍干劑型之外的含水劑型存在時(shí)，一般將蛋白質(zhì)配制為約0.1mg/ml到100mg/ml的濃度，不過也允許這些范圍之外的廣泛變化。對(duì)于疾病的治療，適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)劑量將取決于有待治療的疾病的類型、該疾病的嚴(yán)重性和病程、所述蛋白質(zhì)是為預(yù)防目的還是治療目的、先前治療的過程、患者的臨床病史和對(duì)融合物的反應(yīng)、以及主治醫(yī)師的裁量。適當(dāng)?shù)匾砸淮位蚪?jīng)過一系列治療向患者施用蛋白質(zhì)。

示例性實(shí)施方案

1.一種分離的特異性地與靶標(biāo)結(jié)合的基于纖連蛋白的支架(FBS)蛋白，其中所述FBS是非天然存在的FBS，并且其中該FBS在其C端與由氨基酸序列PmXn組成的部分連接，其中P是脯氨酸，X是任何氨基酸，m是至少為1的整數(shù)，n是0或至少為1的整數(shù)，并且其中PmXn部分對(duì)FBS蛋白提供了相對(duì)于未與PmXn部分連接的FBS蛋白增強(qiáng)的特性。

2.實(shí)施方案1的分離的FBS蛋白，其中該部分由P組成(m是1并且n是0)。

3.實(shí)施方案1的分離的FBS蛋白，其中該部分由PP組成(m是2并且n是0)。

4.實(shí)施方案1的分離的FBS蛋白，其中該部分由PmXn組成，其中n是1-150。

5.實(shí)施方案1的分離的FBS蛋白，其中該部分由PmXn組成，其中n是1-10。

6.實(shí)施方案1的分離的FBS蛋白，其中該部分由PmXn組成，其中n是1-5。

7.實(shí)施方案1的分離的FBS蛋白，其中該部分由PI、PC、PID、PIE、PIDK(SEQ ID NO:61)、PIEK(SEQ ID NO:63)、PIDKP(SEQ ID NO:65)、PIEKP(SEQ ID NO:67)、PIDKPS(SEQ ID NO:69)、PIEKPS(SEQ ID NO:71)、PIDKPC(SEQ ID NO:73)、PIEKPC(SEQ ID NO:75)、PIDKPSQ(SEQ ID NO:77)、PIEKPSQ(SEQ ID NO:79)、PIDKPCQ(SEQ ID NO:81)、PIEKPCQ(SEQ ID NO:83)、PHHHHHH(SEQ ID NO:87)或PCHHHHHH(SEQ ID NO:86)組成。

8.實(shí)施方案1-7的任一項(xiàng)的分離的FBS蛋白，其中該FBS蛋白是Fn3蛋白。

9.實(shí)施方案8的分離的FBS蛋白，其中該Fn3蛋白是¹⁰Fn3蛋白。

10.實(shí)施方案9的分離的FBS蛋白，其中該¹⁰Fn3蛋白是人¹⁰Fn3蛋白。

11.實(shí)施方案1-10的任一項(xiàng)的分離的FBS蛋白，其包含與SEQ ID NO:1具有至少50％同一性的氨基酸序列。

12.實(shí)施方案1-11的任一項(xiàng)的分離的FBS蛋白，其在至少一個(gè)環(huán)區(qū)或一個(gè)支架區(qū)中包含至少一個(gè)氨基酸突變。

13.實(shí)施方案1-12的任一項(xiàng)的分離的FBS蛋白，其包含氨基酸序列VSDVPRDLEVVAA(X)_uLLISW(X)_vYRITY(X)_wFTV(X)_xATISGL(X)_yY TITVYA(X)_zISINYRT(SEQ ID NO:9)，其中(X)_u、(X)_v、(X)_w、(X)_x、(X)_y和(X)_z由野生型氨基酸序列(SEQ ID NO:1)組成或相對(duì)于相應(yīng)野生型序列包含至少一個(gè)氨基酸差異，并且該序列任選地包含1-10個(gè)支架、N端和/或C端突變。

14.實(shí)施方案1-13的任一項(xiàng)的分離的FBS蛋白，其包含與SEQ ID NO:1至少50％相同的氨基酸序列，其中FBS蛋白的C端氨基酸殘基與由PmXn組成的部分融合，其中FBS蛋白以小于500nM的Kd與靶標(biāo)特異性地結(jié)合，所述靶標(biāo)不被包含SEQ ID NO:1的野生型¹⁰Fn3分子所結(jié)合。

15.實(shí)施方案14的分離的FBS蛋白，其包含與SEQ ID NO:1至少70％相同的氨基酸序列。

16.實(shí)施方案1-15的任一項(xiàng)的分離的FBS蛋白，其中由PmXn組成的部分通過肽鍵與FBS蛋白的C端氨基酸殘基連接。

17.實(shí)施方案1-16的任一項(xiàng)的分離的FBS蛋白，其中PmXn是P或PC。

18.實(shí)施方案1-17的任一項(xiàng)的分離的FBS蛋白，其包含與SEQ ID NO:1至少60％相同的氨基酸序列，其中FBS蛋白的C端氨基酸殘基通過肽鍵與脯氨酸連接，其中FBS蛋白以小于500nM的Kd與靶標(biāo)特異性地結(jié)合，所述靶標(biāo)不被包含SEQ ID NO:1的野生型¹⁰Fn3分子所結(jié)合。

19.實(shí)施方案1-18的任一項(xiàng)的分離的FBS蛋白，其中PmXn的至少一個(gè)X是半胱氨酸并且其中該半胱氨酸

20.實(shí)施方案19的分離的FBS蛋白，其中該半胱氨酸與異源部分偶聯(lián)。

21.實(shí)施方案20的分離的FBS蛋白，其中該異源分子是可檢測(cè)部分。

22.實(shí)施方案20或21的分離的FBS蛋白，其中該異源分子是藥物部分，并且該藥物部分和FBS形成FBS-藥物偶聯(lián)物。

23.實(shí)施方案1-22的任一項(xiàng)分離的FBS蛋白，其中由PmXn部分賦予的增強(qiáng)特性是增強(qiáng)的穩(wěn)定性。

24.實(shí)施方案23的分離的FBS蛋白，其中增強(qiáng)的穩(wěn)定性是Tm增加至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃或更多。

下列代表性實(shí)施例包含適用于本發(fā)明在其不同的實(shí)施方案及其等同方案中的實(shí)踐的重要附加信息、范例和指導(dǎo)。這些實(shí)施例旨在幫助說明本發(fā)明，而不意圖構(gòu)成也不應(yīng)解釋為對(duì)本發(fā)明范圍的限制。

實(shí)施例

實(shí)施例1：通過在¹⁰Fn3分子的C端添加脯氨酸而增強(qiáng)熱穩(wěn)定性

在自然界中，¹⁰Fn3是一長串纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域中的一部分；緊接在¹⁰Fn3下游的結(jié)構(gòu)域被命名為¹¹Fn3。以下序列顯示了¹⁰Fn3的野生型序列(斜體)和¹¹Fn3(粗體)結(jié)構(gòu)域，以及它們之間的接合部(加下劃線)。

基于¹⁰Fn3的晶體和NMR結(jié)構(gòu)以及在¹⁰Fn3與¹¹Fn3之間的序列比對(duì)(Dickinson等人，"Crystal structure of the tenth type III cell adhesion module of human fibronectin",J.Mol.Biol.,36:1079-1092(1994))，這個(gè)序列的頭兩個(gè)殘基，RT，是¹⁰Fn3的最后β鏈(“鏈G”)的一部分，并且該序列的剩余部分EIDKPSQ是一個(gè)柔性接頭，位于結(jié)構(gòu)化的纖連蛋白III型第十和第十一結(jié)構(gòu)域之間。

基于¹⁰Fn3的工程化的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的C端常常自野生型序列加以修飾，以幫助其克隆、表達(dá)和純化。在針對(duì)不同的Adnectin的工程化C端的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，從RTE到RTP的突變導(dǎo)致了幾種不同的Adnectin的熱穩(wěn)定性增加。表4列出了在本研究中使用的不同C端。

表4：在¹⁰Fn3和¹¹Fn3之間的野生型接頭以及在本研究中進(jìn)行比較的工程化Adnectin C端序列?！熬哂蠵和His標(biāo)簽的短的工程化C端”和“具有PC的短的工程化C端”含有RTE到RTP的突變。

通過比較幾對(duì)在C端有差異的Adnectin，測(cè)試了從RTE到RTP突變對(duì)Adnectin熱穩(wěn)定性的影響。表5描述了在本研究中使用的幾對(duì)Adnectin，包括其名稱、靶標(biāo)、和熱力學(xué)特性。Adnectin 1為與靶標(biāo)X結(jié)合的Adnectin。所有列出的Adnectin均是使用PROfusion(mRNA-展示)技術(shù)從高復(fù)雜度文庫中選擇的，并通過定向誘變將其C端再工程化。全蛋白質(zhì)序列列出如下。

表5：克隆名稱、C端、靶標(biāo)、和解鏈溫度(如通過差示掃描量熱法在0.5mg/ml在PBS(pH 7.4)中測(cè)定的)。Adnectin PRD-1414和PRD-1417與40kDa的2分支的PEG(NOF,Cat.#GL2-400MA01)偶聯(lián)

在本實(shí)施例中使用的蛋白質(zhì)的氨基酸序列：

ADX_2382_D09:

MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAEGYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPGVDYTITVYAVEFDFPGAGYYHRPISINYRTEIDKPSQHHHHHH*(SEQ ID NO:96)

ADX_5484_A03:

MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAEGYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPGVDYTITVYAVEFDFPGAGYYHRPISINYRTPHHHHHH*(SEQ ID NO:97)

ADX_2987_H07:

MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWTLPHAGRAHYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGRGVTATISGLKPGVDYTITVYAVTVTTTKVIHYKPISINYRTEIDKPSQHHHHHH*(SEQ ID NO:97)

ADX_5484_A04:

MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWTLPHAGRAHYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGRGVTATISGLKPGVDYTITVYAVTVTTTKVIHYKPISINYRTPHHHHHH*(SEQ ID NO:98)

PRD-1414:

MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAEGYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPGVDYTITVYAVEFDFPGAGYYHRPISINYRTEC*(SEQ ID NO:99)

PRD-1417:

MGVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAEGYGYYRITYGETGGNSPVQEFTVPVSKGTATISGLKPGVDYTITVYAVEFDFPGAGYYHRPISINYRTPC*(SEQ ID NO:100)

在以上每個(gè)序列中的“*”表示終止密碼子，以及每個(gè)Adnectin的C端。

在每種蛋白質(zhì)的細(xì)菌表達(dá)過程中，N端M被去除。在表征每種蛋白質(zhì)之前，純化的PRD-1414和PRD-1417蛋白中的C殘基與PEG偶聯(lián)。

如表5中所示，具有在C端含有脯氨酸取代野生型谷氨酸(RTE到RTP突變)的C端的Adnectin顯示出更高的熱穩(wěn)定性。對(duì)于幾個(gè)實(shí)施例，當(dāng)以人¹⁰Fn3和¹¹Fn3之間的天然接頭為模型的較長C端被取代為僅含有脯氨酸和六聚組氨酸純化標(biāo)簽的較短的工程化C端時(shí)，觀察到這種穩(wěn)定性的增加。在具有短的工程化C端和聚乙二醇(PEG)的¹⁰Fn3蛋白中，在添加C端脯氨酸之后，也觀察到熱穩(wěn)定性的提高。這種穩(wěn)定性的增加可能因?yàn)樵撎囟ㄎ恢蒙系母彼岬拇嬖凇?/p>

實(shí)施例2：具有C端脯氨酸的第二PCSK9Adnectin的穩(wěn)定化

這個(gè)實(shí)施例顯示，通過添加C端脯氨酸也增強(qiáng)了另一種PCSK9adnectin分子的熱穩(wěn)定性。

在這個(gè)實(shí)施例中，聚乙二醇化的(40kDa分支的PEG)PCSK9adnectin ADX_2013_E01的C端來自NYRTEIEKPCQ(SEQ ID NO:101)到NYRTPC(SEQ ID NO:102)的修飾，并通過TSF測(cè)量穩(wěn)定性。這種adnectin的氨基酸序列提供在WO 2011/130354中。這些結(jié)果指示，具有NYRTEIEKPCQ(SEQ ID NO:101)C端的聚乙二醇化的adnectin具有70℃的Tm，而具有NYRTPC(SEQ ID NO:102)C端的聚乙二醇化的adnectin具有76℃的Tm。

因此，這種PCSK9adnectin的熱穩(wěn)定性由于C端脯氨酸的存在而提高了6℃。

實(shí)施例3：不同的C端關(guān)于熱穩(wěn)定性的比較

本實(shí)施例顯示了在其C端有或沒有脯氨酸的adnectin以及在其C端具有2個(gè)脯氨酸的adnectin的熱穩(wěn)定性的比較。

對(duì)于兩種實(shí)施例1中描述的adnectin(與PCSK9結(jié)合的ADX_2392_D09和與肌肉生長抑制素結(jié)合的ADX_2987_H07)以及另一種與不同的靶標(biāo)結(jié)合的Adnectin(Adnectin 1，與靶標(biāo)X結(jié)合)，修飾它們的C端，如表6中所示，并確定了它們的熱穩(wěn)定性和單體％。針對(duì)不同靶標(biāo)(X)的Adnectin(“Adnectin1”)也用相同的C端序列加以修飾。通過TSF確定熱穩(wěn)定性并通過SEC確定單體％。

表6：具有不同C端的adnectin的單體百分比和熱穩(wěn)定性

如表6所示的結(jié)果表明，C端的身份對(duì)單體％沒有顯著影響，然而，它對(duì)解鏈溫度(Tm)有影響。如實(shí)施例1中描述的，對(duì)兩種adnectin而言，NYRTPH₆(SEQ ID NO:105)相對(duì)于NYRTH₆(SEQ ID NO:104)都增加了熱穩(wěn)定性：對(duì)PCSK9adnectin增加了4℃，對(duì)肌肉生長抑制素adnectin增加了6℃。另外，第二個(gè)脯氨酸的存在提供了與單一脯氨酸所提供的相似的穩(wěn)定作用。

因此，相對(duì)于沒有C端脯氨酸的相同分子，一個(gè)或兩個(gè)C端脯氨酸的存在增強(qiáng)了adnectin的熱穩(wěn)定性。

實(shí)施例4：C端脯氨酸的添加提高了溶解度

本實(shí)施例證明，相對(duì)于沒有C端脯氨酸的相同串聯(lián)adnectin，C端脯氨酸的存在提高了串聯(lián)adnectin的溶解度。

串聯(lián)adnectin，即，由接頭連接的兩個(gè)adnectin，其各自與不同靶標(biāo)結(jié)合并含有NYRTE(SEQ ID NO:107)C端或NYRTP(SEQ ID NO:108)C端，在大腸桿菌BLR細(xì)胞中表達(dá)并且在30℃發(fā)酵。沒有脯氨酸的串聯(lián)物的效價(jià)為1.2g/L可溶蛋白和2.8g/L總蛋白，表明所表達(dá)的蛋白質(zhì)的43％可溶。具有脯氨酸的串聯(lián)物的效價(jià)為2.56g/L可溶蛋白和2.61g/L總蛋白。即使在使沒有脯氨酸的串聯(lián)物的不溶部分復(fù)性、并且獲得98％純和2.5mg/ml的單體的溶液之后，此蛋白質(zhì)組成亦未顯示出與其靶標(biāo)的顯著結(jié)合，表明它可能沒有正確地重折疊。

因此，鑒于在兩種蛋白質(zhì)之間的唯一差異是在C端分別存在E和P，這些結(jié)果表明脯氨酸的存在為串聯(lián)物提供了提高的溶解度。

在背景、詳述、附圖簡述、和實(shí)施例中引證的每篇文獻(xiàn)(包括專利、專利申請(qǐng)、期刊論文、摘要、實(shí)驗(yàn)手冊(cè)、書籍、登錄號(hào)、登錄號(hào)、或其他公開內(nèi)容)的全部公開內(nèi)容特此通過提述完整并入本文。

本發(fā)明在范圍上不受本文中公開的具體實(shí)施方案的限制，這些實(shí)施方案旨在作為本發(fā)明的單獨(dú)方面的簡單說明，并且在功能上等效者均在本發(fā)明的范圍內(nèi)。根據(jù)前述說明和教導(dǎo)，除了在本文中描述的那些之外，對(duì)本發(fā)明的模型和方法的多種修改對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的，并且類似地預(yù)期落入本發(fā)明的范圍內(nèi)?？梢詫?shí)施這樣的修改或其他實(shí)施方案而不脫離本發(fā)明的真正范圍和精神。