癌癥的標(biāo)志是持續(xù)的新血管形成，被稱為血管生成。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)途徑是調(diào)控血管生成的重要信號(hào)傳導(dǎo)級(jí)聯(lián)；人VEGFR2是VEGF途徑中的關(guān)鍵受體。雷莫蘆單抗(ramucirumab)(IMC-1121B)是靶向人VEGFR2的IgG1抗體，且已顯示在某些臨床研究中具有抗腫瘤效應(yīng)(參見例如Zhu等人,ClinCancerRes(2013)19:6614)。血管生成素-1(Ang1)和Ang2是調(diào)控血管生成的另一關(guān)鍵途徑的成員；Ang1和Ang2是結(jié)合內(nèi)皮細(xì)胞特異性受體酪氨酸激酶Tie2的分泌因子。Ang1由外周細(xì)胞組成型分泌且經(jīng)由Tie2受體穩(wěn)定血管完整性。Ang2僅響應(yīng)于刺激(例如傷口愈合、腫瘤生長(zhǎng))從內(nèi)皮細(xì)胞釋放且經(jīng)由Tie2信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)血管出芽并抑制外周細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞相互作用。當(dāng)與VEGF阻斷劑阿柏西普(aflibercept)組合給藥時(shí)，針對(duì)人Ang2的抗體已顯示在小鼠異種移植腫瘤模型中抑制腫瘤生長(zhǎng)且降低腫瘤血管分布(Daly等人,CancerRes(2013)73(1):108)。多種研究性Ang2抗體目前已用于臨床試驗(yàn)中。已提出抑制血管生成的VEGF和Ang/Tie2途徑兩者可能改善針對(duì)癌癥的結(jié)果(參見，例如，Daly等人,CancerRes(2013)73:108)。目前，VEGFR2抗體和Ang-2抗體的共施用需要注射或輸注兩種單獨(dú)產(chǎn)物或施用抗體混合物的共制劑。單獨(dú)施用允許劑量量和時(shí)機(jī)的靈活性，但由于增加的輸注時(shí)間而對(duì)于患者順從性和不便性存在潛在問題。共配制可提供關(guān)于劑量量的一些靈活性，但可由于兩種不同抗體的不同分子特征對(duì)于發(fā)現(xiàn)允許兩種抗體的化學(xué)和物理穩(wěn)定性的配制條件是挑戰(zhàn)性的。此外，共施用或共配制涉及兩種藥物治療的累加成本。WO2012/009705公開了含有附接至包括抗體的支架的一個(gè)或多個(gè)模塊識(shí)別結(jié)構(gòu)域(MRD)的復(fù)合物。將Ang2列為考慮用于復(fù)合物的MRD部分，且將VEGFR2抗體指定為MRD可附接的抗體。沒有例舉針對(duì)附接至VEGFR2抗體的Ang2的MRD。Brown等人(MolCancerTher(2010)9(1):145)公開了人單克隆Ang2抗體3.19.3。在SW620異種移植物研究中，將3.19.3與DC101(結(jié)合鼠VEGFR2的單克隆抗體)組合給藥。當(dāng)生成含有融合至結(jié)合人Ang2的單鏈Fv(scFv)部分的VEGFR2抗體部分(其在IgG1或IgG4骨架中含有IMC-1121B抗體的輕鏈可變區(qū)(LCVR)和重鏈可變區(qū)(HCVR))的化合物(化合物A和B)時(shí)，作為本發(fā)明的一部分，申請(qǐng)人觀察到表達(dá)和穩(wěn)定性問題。具體地，令人驚訝地觀察到在重組表達(dá)的材料中由于游離輕鏈錯(cuò)誤配對(duì)而導(dǎo)致化學(xué)不穩(wěn)定性和不可接受的產(chǎn)物質(zhì)量。如申請(qǐng)人作為本發(fā)明的一部分所觀察到，改善從細(xì)胞培養(yǎng)物獲得的材料中的化學(xué)不穩(wěn)定性和產(chǎn)物質(zhì)量的化合物工程改造意外地導(dǎo)致某些由于Mab-雙鏈抗體形成而具有增加的產(chǎn)物異質(zhì)性的化合物。仍然需要提供通過結(jié)合和中和人VEGFR2和人Ang2兩者來抑制兩種血管生成途徑的化合物。具體而言，仍然需要提供如下化合物：其通過結(jié)合和中和人VEGFR2和人Ang2兩者來抑制兩種血管生成途徑，且不損害由于使用Ang2scFv而導(dǎo)致的顯著Ang2體外結(jié)合活性，且不損害由于將VEGFR2抗體和Ang2scFv組合成一種化合物而導(dǎo)致的基于細(xì)胞的顯著體外測(cè)定活性。還仍然需要提供通過結(jié)合和中和人VEGFR2和人Ang2來抑制兩種血管生成途徑且避免上文所列的穩(wěn)定性和產(chǎn)物異質(zhì)性問題中的至少一種的化合物。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供包含通過兩個(gè)接頭融合至兩個(gè)單鏈片段可變(scFv)多肽的抗體的化合物，其中：a)所述抗體包含兩個(gè)相同重鏈(HC)和兩個(gè)相同輕鏈(LC)，其中每個(gè)HC包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(HCVR)，且其中每個(gè)LC包含SEQIDNO:13、SEQIDNO:14或SEQIDNO:15的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(LVCR)，b)兩個(gè)scFv多肽相同且各自包含可操作連接至LCVR的HCVR，其中每個(gè)HCVR具有SEQIDNO:21或SEQIDNO:22的氨基酸序列，且其中每個(gè)LCVR具有SEQIDNO:23或SEQIDNO:24的氨基酸序列，且c)兩個(gè)接頭是相同的富含甘氨酸接頭，其各自使抗體的一個(gè)HC的羧基末端可操作連接至scFv多肽之一的氨基末端。在一個(gè)其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含通過兩個(gè)接頭融合至兩個(gè)scFv多肽的抗體的化合物，其中兩個(gè)scFv多肽各自包含可操作連接至一個(gè)scFv多肽的HCVR的氨基末端的一個(gè)scFv多肽的LCVR的羧基末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含通過兩個(gè)接頭融合至兩個(gè)scFv多肽的抗體的化合物，其中抗體的每個(gè)HCVR具有SEQIDNO:1的氨基酸序列，抗體的每個(gè)LCVR具有SEQIDNO:13的氨基酸序列，每個(gè)scFv多肽的HCVR具有SEQIDNO:21的氨基酸序列，且每個(gè)scFv多肽的LCVR具有SEQIDNO:23的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含通過兩個(gè)接頭融合至兩個(gè)scFv多肽的抗體的化合物，其中抗體的每個(gè)HCVR具有SEQIDNO:2的氨基酸序列，抗體的每個(gè)LCVR具有SEQIDNO:14的氨基酸序列，每個(gè)scFv多肽的HCVR具有SEQIDNO:21的氨基酸序列，且每個(gè)scFv多肽的LCVR具有SEQIDNO:23的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含通過兩個(gè)接頭融合至兩個(gè)scFv多肽的抗體的化合物，其中抗體的每個(gè)HCVR具有SEQIDNO:3的氨基酸序列，抗體的每個(gè)LCVR具有SEQIDNO:15的氨基酸序列，每個(gè)scFv多肽的HCVR具有SEQIDNO:21的氨基酸序列，且每個(gè)scFv多肽的LCVR具有SEQIDNO:23的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含通過兩個(gè)接頭融合至兩個(gè)scFv多肽的抗體的化合物，其中抗體的每個(gè)HCVR具有SEQIDNO:4的氨基酸序列，抗體的每個(gè)LCVR具有SEQIDNO:13的氨基酸序列，每個(gè)scFv多肽的HCVR具有SEQIDNO:22的氨基酸序列，且每個(gè)scFv多肽的LCVR具有SEQIDNO:24的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含通過兩個(gè)接頭融合至兩個(gè)scFv多肽的抗體的化合物，其中所述抗體包含兩個(gè)重鏈(HC)和兩個(gè)輕鏈(LC)，其中每個(gè)HC具有SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7或SEQIDNO:8之一的氨基酸序列，且每個(gè)LC具有SEQIDNO:16、SEQIDNO:17或SEQIDNO:18之一的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含通過兩個(gè)接頭融合至兩個(gè)scFv多肽的抗體的化合物，其中抗體的每個(gè)HC具有SEQIDNO:5的氨基酸序列，且抗體的每個(gè)LC具有SEQIDNO:16的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含通過兩個(gè)接頭融合至兩個(gè)scFv多肽的抗體的化合物，其中抗體的每個(gè)HC具有SEQIDNO:6的氨基酸序列，且抗體的每個(gè)LC具有SEQIDNO:17的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含通過兩個(gè)接頭融合至兩個(gè)scFv多肽的抗體的化合物，其中抗體的每個(gè)HC具有SEQIDNO:7的氨基酸序列，且抗體的每個(gè)LC具有SEQIDNO:18的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含通過兩個(gè)接頭融合至兩個(gè)scFv多肽的抗體的化合物，其中抗體的每個(gè)HC具有SEQIDNO:8的氨基酸序列，且抗體的每個(gè)LC具有SEQIDNO:16的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含通過兩個(gè)接頭融合至兩個(gè)scFv多肽的抗體的化合物，其中每個(gè)scFv多肽具有相同的SEQIDNO:19或SEQIDNO:20之一的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含通過兩個(gè)接頭融合至兩個(gè)scFv多肽的抗體的化合物，其中每個(gè)scFv多肽具有SEQIDNO:19的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含通過兩個(gè)接頭融合至兩個(gè)scFv多肽的抗體的化合物，其中每個(gè)scFv多肽具有SEQIDNO:20的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含兩個(gè)第一多肽和兩個(gè)第二多肽的化合物，其中每個(gè)第一多肽具有SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11或SEQIDNO:12的氨基酸序列，且每個(gè)第二多肽具有SEQIDNO:16、SEQIDNO:17或SEQIDNO:18的氨基酸序列。如表1中所顯示，兩個(gè)第一多肽包含抗體的HC、接頭和scFv多肽；兩個(gè)第二多肽包含抗體的LC。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含兩個(gè)第一多肽和兩個(gè)第二多肽的化合物，其中每個(gè)第一多肽具有SEQIDNO:9的氨基酸序列，且每個(gè)第二多肽具有SEQIDNO:16的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含兩個(gè)第一多肽和兩個(gè)第二多肽的化合物，其中每個(gè)第一多肽具有SEQIDNO:10的氨基酸序列，且每個(gè)第二多肽具有SEQIDNO:17的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含兩個(gè)第一多肽和兩個(gè)第二多肽的化合物，其中每個(gè)第一多肽具有SEQIDNO:11的氨基酸序列，且每個(gè)第二多肽具有SEQIDNO:18的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含兩個(gè)第一多肽和兩個(gè)第二多肽的化合物，其中每個(gè)第一多肽具有SEQIDNO:12的氨基酸序列，且每個(gè)第二多肽具有SEQIDNO:16的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步提供包含兩個(gè)第一多肽和兩個(gè)第二多肽的化合物，其中每個(gè)第一多肽與每個(gè)第二多肽形成鏈間二硫鍵，且第一多肽與另一第一多肽形成兩個(gè)鏈間二硫鍵，且每個(gè)第一多肽形成鏈內(nèi)二硫鍵。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合人VEGFR2和人Ang2的化合物，其包含通過兩個(gè)接頭融合至兩個(gè)結(jié)合人Ang2(SEQIDNO:33)的scFv多肽的結(jié)合人VEGFR2(SEQIDNO:32)的抗體，其中：a)所述抗體包含兩個(gè)相同重鏈(HC)和兩個(gè)相同輕鏈(LC)，其中每個(gè)HC包含SEQIDNO:1、SEQIDNO:2、SEQIDNO:3或SEQIDNO:4的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)(HCVR)，且其中每個(gè)LC包含SEQIDNO:13、SEQIDNO:14或SEQIDNO:15的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)(LVCR)，b)兩個(gè)scFv多肽相同且各自包含可操作連接至LCVR的HCVR，其中每個(gè)HCVR具有SEQIDNO:21或SEQIDNO:22的氨基酸序列，且其中每個(gè)LCVR具有SEQIDNO:23或SEQIDNO:24的氨基酸序列，且c)兩個(gè)接頭是相同的富含甘氨酸接頭，其各自使抗體的一個(gè)HC的羧基末端可操作連接至scFv多肽之一的氨基末端。在一個(gè)其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合人VEGFR2和人Ang2的化合物，其包含通過兩個(gè)接頭融合至兩個(gè)結(jié)合人Ang2(SEQIDNO:33)的scFv多肽的結(jié)合人VEGFR2(SEQIDNO:32)的抗體，其中每個(gè)scFv多肽的LCVR的羧基末端可操作連接至HCVR的氨基末端。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合人VEGFR2和人Ang2的化合物，其包含通過兩個(gè)接頭融合至兩個(gè)結(jié)合人Ang2(SEQIDNO:33)的scFv多肽的結(jié)合人VEGFR2(SEQIDNO:32)的抗體，其中抗體的每個(gè)HCVR具有SEQIDNO:1的氨基酸序列，抗體的每個(gè)LCVR具有SEQIDNO:13的氨基酸序列，每個(gè)scFv多肽的HCVR具有SEQIDNO:21的氨基酸序列，且每個(gè)scFv多肽的LCVR具有SEQIDNO:23的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合人VEGFR2和人Ang2的化合物，其包含通過兩個(gè)接頭融合至兩個(gè)結(jié)合人Ang2(SEQIDNO:33)的scFv多肽的結(jié)合人VEGFR2(SEQIDNO:32)的抗體，其中抗體的每個(gè)HCVR具有SEQIDNO:2的氨基酸序列，抗體的每個(gè)LCVR具有SEQIDNO:14的氨基酸序列，每個(gè)scFv多肽的HCVR具有SEQIDNO:21的氨基酸序列，且每個(gè)scFv多肽的LCVR具有SEQIDNO:23的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合人VEGFR2和人Ang2的化合物，其包含通過兩個(gè)接頭融合至兩個(gè)結(jié)合人Ang2(SEQIDNO:33)的scFv多肽的結(jié)合人VEGFR2(SEQIDNO:32)的抗體，其中抗體的每個(gè)HCVR具有SEQIDNO:3的氨基酸序列，抗體的每個(gè)LCVR具有SEQIDNO:15的氨基酸序列，每個(gè)scFv多肽的HCVR具有SEQIDNO:21的氨基酸序列，且每個(gè)scFv多肽的LCVR具有SEQIDNO:23的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合人VEGFR2和人Ang2的化合物，其包含通過兩個(gè)接頭融合至兩個(gè)結(jié)合人Ang2(SEQIDNO:33)的scFv多肽的結(jié)合人VEGFR2(SEQIDNO:32)的抗體，其中抗體的每個(gè)HCVR具有SEQIDNO:4的氨基酸序列，抗體的每個(gè)LCVR具有SEQIDNO:13的氨基酸序列，每個(gè)scFv多肽的HCVR具有SEQIDNO:22的氨基酸序列，且每個(gè)scFv多肽的LCVR具有SEQIDNO:24的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合人VEGFR2和人Ang2的化合物，其包含通過兩個(gè)接頭融合至兩個(gè)結(jié)合人Ang2(SEQIDNO:33)的scFv多肽的結(jié)合人VEGFR2(SEQIDNO:32)的抗體，其中所述抗體包含兩個(gè)重鏈(HC)和兩個(gè)輕鏈(LC)，其中每個(gè)HC具有SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7或SEQIDNO:8之一的氨基酸序列，且每個(gè)LC具有SEQIDNO:16、SEQIDNO:17或SEQIDNO:18之一的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合人VEGFR2和人Ang2的化合物，其包含通過兩個(gè)接頭融合至兩個(gè)結(jié)合人Ang2(SEQIDNO:33)的scFv多肽的結(jié)合人VEGFR2(SEQIDNO:32)的抗體，其中抗體的每個(gè)HC具有SEQIDNO:5的氨基酸序列，且抗體的每個(gè)LC具有SEQIDNO:16的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合人VEGFR2和人Ang2的化合物，其包含通過兩個(gè)接頭融合至兩個(gè)結(jié)合人Ang2(SEQIDNO:33)的scFv多肽的結(jié)合人VEGFR2(SEQIDNO:32)的抗體，其中抗體的每個(gè)HC具有SEQIDNO:6的氨基酸序列，且抗體的每個(gè)LC具有SEQIDNO:17的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合人VEGFR2和人Ang2的化合物，其包含通過兩個(gè)接頭融合至兩個(gè)結(jié)合人Ang2(SEQIDNO:33)的scFv多肽的結(jié)合人VEGFR2(SEQIDNO:32)的抗體，其中抗體的每個(gè)HC具有SEQIDNO:7的氨基酸序列，且抗體的每個(gè)LC具有SEQIDNO:18的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合人VEGFR2和人Ang2的化合物，其包含通過兩個(gè)接頭融合至兩個(gè)結(jié)合人Ang2(SEQIDNO:33)的scFv多肽的結(jié)合人VEGFR2(SEQIDNO:32)的抗體，其中抗體的每個(gè)HC具有SEQIDNO:8的氨基酸序列，且抗體的每個(gè)LC具有SEQIDNO:16的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合人VEGFR2和人Ang2的化合物，其包含通過兩個(gè)接頭融合至兩個(gè)結(jié)合人Ang2(SEQIDNO:33)的scFv多肽的結(jié)合人VEGFR2(SEQIDNO:32)的抗體，其中每個(gè)scFv多肽具有相同的SEQIDNO:19或SEQIDNO:20之一的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合人VEGFR2和人Ang2的化合物，其包含通過兩個(gè)接頭融合至兩個(gè)結(jié)合人Ang2(SEQIDNO:33)的scFv多肽的結(jié)合人VEGFR2(SEQIDNO:32)的抗體，其中每個(gè)scFv多肽具有SEQIDNO:19的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合人VEGFR2和人Ang2的化合物，其包含通過兩個(gè)接頭融合至兩個(gè)結(jié)合人Ang2(SEQIDNO:33)的scFv多肽的結(jié)合人VEGFR2(SEQIDNO:32)的抗體，其中每個(gè)scFv多肽具有SEQIDNO:20的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合人VEGFR2(SEQIDNO:32)和人Ang2(SEQIDNO:33)的化合物，其包含兩個(gè)第一多肽和兩個(gè)第二多肽，其中每個(gè)第一多肽具有SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11或SEQIDNO:12的氨基酸序列，且每個(gè)第二多肽具有SEQIDNO:16、SEQIDNO:17或SEQIDNO:18的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合人VEGFR2(SEQIDNO:32)和人Ang2(SEQIDNO:33)的化合物，其包含兩個(gè)第一多肽和兩個(gè)第二多肽，其中每個(gè)第一多肽具有SEQIDNO:9的氨基酸序列，且每個(gè)第二多肽具有SEQIDNO:16的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合人VEGFR2(SEQIDNO:32)和人Ang2(SEQIDNO:33)的化合物，其包含兩個(gè)第一多肽和兩個(gè)第二多肽，其中每個(gè)第一多肽具有SEQIDNO:10的氨基酸序列，且每個(gè)第二多肽具有SEQIDNO:17的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合人VEGFR2(SEQIDNO:32)和人Ang2(SEQIDNO:33)的化合物，其包含兩個(gè)第一多肽和兩個(gè)第二多肽，其中每個(gè)第一多肽具有SEQIDNO:11的氨基酸序列，且每個(gè)第二多肽具有SEQIDNO:18的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供結(jié)合人VEGFR2(SEQIDNO:32)和人Ang2(SEQIDNO:33)的化合物，其包含兩個(gè)第一多肽和兩個(gè)第二多肽，其中每個(gè)第一多肽具有SEQIDNO:12的氨基酸序列，且每個(gè)第二多肽具有SEQIDNO:16的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明進(jìn)一步提供結(jié)合人VEGFR2(SEQIDNO:32)和人Ang2(SEQIDNO:33)的化合物，其包含兩個(gè)第一多肽和兩個(gè)第二多肽，其中每個(gè)第一多肽與每個(gè)第二多肽形成鏈間二硫鍵，且第一多肽與另一第一多肽形成兩個(gè)鏈間二硫鍵，且每個(gè)第一多肽形成鏈內(nèi)二硫鍵。在一個(gè)其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供對(duì)人VEGFR2的解離平衡常數(shù)KD為約300pM至約1400pM且對(duì)人Ang2的KD為約300pM至約800pM的本發(fā)明化合物。本發(fā)明化合物的特征進(jìn)一步在于對(duì)人VEGFR2的kon速率為約0.1x105M-1sec-1至約0.5x105M-1sec-1且對(duì)人Ang2的kon速率為約1x105M-1sec-1至約3x105M-1sec-1。本發(fā)明化合物的特征進(jìn)一步在于對(duì)人VEGFR2的koff速率為約0.1x10-4sec-1至約0.5x10-4sec-1且對(duì)人Ang2的koff速率為約0.8x10-4sec-1至約1.2x10-4sec-1。通過在25℃下的結(jié)合動(dòng)力學(xué)來確立KD、kon和koff值，如測(cè)定部分中的“結(jié)合動(dòng)力學(xué)、親和力和選擇性”中所述。本發(fā)明化合物以高親和力結(jié)合人VEGFR2和人Ang2。出于本公開的目的，術(shù)語(yǔ)“高親和力”是指人VEGFR2的KD小于約1500pM且人Ang2的小于約1000pM。通過25℃下的結(jié)合動(dòng)力學(xué)如測(cè)定部分中的"結(jié)合動(dòng)力學(xué)、親和力和選擇性"中所述來確立KD值。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含DNA分子的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，所述DNA分子包含編碼選自以下的多肽的多核苷酸序列：由SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12組成的多肽；和編碼選自以下的多肽的多核苷酸序列：由SEQIDNO:16、SEQIDNO:17和SEQIDNO:18組成的多肽，其中所述細(xì)胞能夠表達(dá)包含具有選自SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12的氨基酸序列的第一多肽和具有選自SEQIDNO:16、SEQIDNO:17和SEQIDNO:18的氨基酸序列的第二多肽的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含DNA分子的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，所述DNA分子包含編碼具有SEQIDNO:9的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列和編碼具有SEQIDNO:16的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，其中所述細(xì)胞能夠表達(dá)包含具有SEQIDNO:9的氨基酸序列的第一多肽和具有SEQIDNO:16的氨基酸序列的第二多肽的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含DNA分子的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，所述DNA分子包含編碼具有SEQIDNO:10的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列和編碼具有SEQIDNO:17的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，其中所述細(xì)胞能夠表達(dá)包含具有SEQIDNO:10的氨基酸序列的第一多肽和具有SEQIDNO:17的氨基酸序列的第二多肽的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含DNA分子的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，所述DNA分子包含編碼具有SEQIDNO:11的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列和編碼具有SEQIDNO:18的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，其中所述細(xì)胞能夠表達(dá)包含具有SEQIDNO:11的氨基酸序列的第一多肽和具有SEQIDNO:18的氨基酸序列的第二多肽的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含DNA分子的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，所述DNA分子包含編碼具有SEQIDNO:12的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列和編碼具有SEQIDNO:16的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列，其中所述細(xì)胞能夠表達(dá)包含具有SEQIDNO:12的氨基酸序列的第一多肽和具有SEQIDNO:16的氨基酸序列的第二多肽的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生包含兩個(gè)選自SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12的第一多肽和兩個(gè)選自SEQIDNO:16、SEQIDNO:17和SEQIDNO:18的第二多肽的化合物的方法，其包括在使得表達(dá)所述化合物的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，和回收表達(dá)的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生包含兩個(gè)SEQIDNO:9的第一多肽和兩個(gè)SEQIDNO:16的第二多肽的化合物的方法，其包括在使得表達(dá)所述化合物的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，和回收表達(dá)的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生包含兩個(gè)SEQIDNO:10的第一多肽和兩個(gè)SEQIDNO:17的第二多肽的化合物的方法，其包括在使得表達(dá)所述化合物的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，和回收表達(dá)的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生包含兩個(gè)SEQIDNO:11的第一多肽和兩個(gè)SEQIDNO:18的第二多肽的化合物的方法，其包括在使得表達(dá)所述化合物的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，和回收表達(dá)的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供產(chǎn)生包含兩個(gè)SEQIDNO:12的第一多肽和兩個(gè)SEQIDNO:16的第二多肽的化合物的方法，其包括在使得表達(dá)所述化合物的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，和回收表達(dá)的化合物。在上述方法的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的兩個(gè)多核苷酸序列是相同核酸分子的部分。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供可通過上述方法之一獲得的化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含本發(fā)明化合物和可接受的載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療癌癥的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的本發(fā)明化合物。在一個(gè)其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療癌癥的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的本發(fā)明化合物，其中所述癌癥為乳腺癌、卵巢癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌或肝細(xì)胞癌。在一個(gè)其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療癌癥的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的本發(fā)明化合物，其中所述癌癥為乳腺癌、卵巢癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、膽管癌或肝細(xì)胞癌。在一個(gè)其它實(shí)施方案中，這些方法包括施用有效量的本發(fā)明化合物且同時(shí)、分開或依次組合施用一種或多種選自以下的抗腫瘤劑：順鉑、卡鉑、脂質(zhì)體多柔比星、多西他賽、環(huán)磷酰胺和多柔比星、諾維本、艾瑞布林、用于可注射懸浮液的紫杉醇蛋白結(jié)合顆粒、伊沙匹隆、卡培他濱、雷莫蘆單抗、FOLFOX(甲酰四氫葉酸、氟尿嘧啶和奧沙利鉑)、FOLFIRI(甲酰四氫葉酸、氟尿嘧啶和依立替康)和西妥昔單抗。在一個(gè)其它實(shí)施方案中，這些方法包括施用有效量的本發(fā)明化合物且同時(shí)、分開或依次組合施用一種或多種選自以下的免疫腫瘤學(xué)藥劑：nivolumab、伊匹單抗(ipilimumab)、pidilizumab、派姆單抗(pembrolizumab)和durvalumab。在一個(gè)其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療癌癥的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的本發(fā)明化合物且同時(shí)、分開或依次組合施用一種或多種免疫腫瘤學(xué)藥劑，其中所述癌癥為膀胱癌、腎癌、前列腺癌或睪丸癌，且其中所述免疫腫瘤學(xué)藥劑選自：nivolumab、伊匹單抗、pidilizumab、派姆單抗和durvalumab。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療乳腺癌的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的本發(fā)明化合物。在一個(gè)其它實(shí)施方案中，這些治療乳腺癌的方法包括施用有效量的本發(fā)明化合物且同時(shí)、分開或依次組合施用一種或多種選自以下的抗腫瘤劑：多西他賽、環(huán)磷酰胺和多柔比星、諾維本、艾瑞布林、用于可注射懸浮液的紫杉醇蛋白結(jié)合顆粒、伊沙匹隆和卡培他濱。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療卵巢癌的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的本發(fā)明化合物。在一個(gè)其它實(shí)施方案中，這些治療卵巢癌的方法包括施用有效量的本發(fā)明化合物且同時(shí)、分開或依次組合施用一種或多種選自以下的抗腫瘤劑：順鉑、卡鉑和脂質(zhì)體多柔比星。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療胃癌的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的本發(fā)明化合物。在一個(gè)其它實(shí)施方案中，這些治療胃癌的方法包括施用有效量的本發(fā)明化合物且同時(shí)、分開或依次組合施用雷莫蘆單抗。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療肝細(xì)胞癌的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的本發(fā)明化合物。在一個(gè)其它實(shí)施方案中，這些治療肝細(xì)胞癌的方法包括施用有效量的本發(fā)明化合物且同時(shí)、分開或依次組合施用雷莫蘆單抗。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療結(jié)腸直腸癌的方法，其包括向有需要的患者施用有效量的本發(fā)明化合物。在一個(gè)其它實(shí)施方案中，這些治療結(jié)腸直腸癌的方法包括施用有效量的本發(fā)明化合物且同時(shí)、分開或依次組合施用一種或多種選自以下的抗腫瘤劑：FOLFOX(甲酰四氫葉酸、氟尿嘧啶和奧沙利鉑)、FOLFIRI(甲酰四氫葉酸、氟尿嘧啶和依立替康)和西妥昔單抗。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療中的本發(fā)明化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療癌癥的本發(fā)明化合物。在一個(gè)其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療癌癥的本發(fā)明化合物，其中所述癌癥為乳腺癌、卵巢癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌或肝細(xì)胞癌。在一個(gè)其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療癌癥的本發(fā)明化合物，其中所述癌癥為乳腺癌、卵巢癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、膽管癌或肝細(xì)胞癌。在一個(gè)其它實(shí)施方案中，為了用于治療癌癥，同時(shí)、分開或依次組合本發(fā)明化合物與一種或多種選自以下的抗腫瘤劑：順鉑、卡鉑、脂質(zhì)體多柔比星、多西他賽、環(huán)磷酰胺和多柔比星、諾維本、艾瑞布林、用于可注射懸浮液的紫杉醇蛋白結(jié)合顆粒、伊沙匹隆、卡培他濱、雷莫蘆單抗、FOLFOX(甲酰四氫葉酸、氟尿嘧啶和奧沙利鉑)、FOLFIRI(甲酰四氫葉酸、氟尿嘧啶和依立替康)和西妥昔單抗。在一個(gè)其它實(shí)施方案中，為了用于治療癌癥，同時(shí)、分開或依次組合本發(fā)明化合物與一種或多種選自以下的免疫腫瘤學(xué)藥劑：nivolumab、伊匹單抗、pidilizumab、派姆單抗和durvalumab。在一個(gè)其它實(shí)施方案中，為了用于治療癌癥，同時(shí)、分開或依次組合本發(fā)明化合物與一種或多種免疫腫瘤學(xué)藥劑，其中所述癌癥為膀胱癌、腎癌、前列腺癌或睪丸癌，且其中所述免疫腫瘤學(xué)藥劑選自：nivolumab、伊匹單抗、pidilizumab、派姆單抗和durvalumab。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療乳腺癌的本發(fā)明化合物。在一個(gè)其它實(shí)施方案中，為了用于治療乳腺癌，同時(shí)、分開或依次組合本發(fā)明化合物與一種或多種選自以下的抗腫瘤劑：多西他賽、環(huán)磷酰胺和多柔比星、諾維本、艾瑞布林、用于可注射懸浮液的紫杉醇蛋白結(jié)合顆粒、伊沙匹隆和卡培他濱。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療卵巢癌的本發(fā)明化合物。在一個(gè)其它實(shí)施方案中，為了用于治療卵巢癌，同時(shí)、分開或依次組合本發(fā)明化合物與一種或多種選自以下的抗腫瘤劑：順鉑、卡鉑和脂質(zhì)體多柔比星。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療胃癌的本發(fā)明化合物。在一個(gè)其它實(shí)施方案中，為了用于治療胃癌，同時(shí)、分開或依次組合本發(fā)明化合物與雷莫蘆單抗。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療肝細(xì)胞癌的本發(fā)明化合物。在一個(gè)其它實(shí)施方案中，為了用于治療肝細(xì)胞癌，同時(shí)、分開或依次組合本發(fā)明化合物與一種或多種選自雷莫蘆單抗的抗腫瘤劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療結(jié)腸直腸癌的本發(fā)明化合物。在一個(gè)其它實(shí)施方案中，為了用于治療結(jié)腸直腸癌，同時(shí)、分開或依次組合本發(fā)明化合物與一種或多種選自以下的抗腫瘤劑：FOLFOX(甲酰四氫葉酸、氟尿嘧啶和奧沙利鉑)、FOLFIRI(甲酰四氫葉酸、氟尿嘧啶和依立替康)和西妥昔單抗。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明化合物用于制備用于治療癌癥的藥物的用途。在一個(gè)其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明化合物用于制備用于治療癌癥的藥物的用途，其中所述癌癥為乳腺癌、卵巢癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌或肝細(xì)胞癌。在一個(gè)其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明化合物用于制備用于治療癌癥的藥物的用途，其中所述癌癥為乳腺癌、卵巢癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、膽管癌或肝細(xì)胞癌。在一個(gè)其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明化合物與一種或多種選自以下的抗腫瘤劑同時(shí)、分開或依次組合用于制備用于治療癌癥的藥物的用途：順鉑、卡鉑、脂質(zhì)體多柔比星、多西他賽、環(huán)磷酰胺和多柔比星、諾維本、艾瑞布林、用于可注射懸浮液的紫杉醇蛋白結(jié)合顆粒、伊沙匹隆、卡培他濱、雷莫蘆單抗、FOLFOX(甲酰四氫葉酸、氟尿嘧啶和奧沙利鉑)、FOLFIRI(甲酰四氫葉酸、氟尿嘧啶和依立替康)和西妥昔單抗。本發(fā)明化合物是工程改造的非自然存在的多肽復(fù)合物。本發(fā)明的DNA分子是非自然存在的DNA分子，其包含編碼具有本發(fā)明化合物中的多肽之一的氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列。本發(fā)明化合物的抗體部分被設(shè)計(jì)以具有工程改造的CDR且具有人來源抗體的一些部分(框架、鉸鏈區(qū)和恒定區(qū)的全部或一部分)，所述部分與源自人基因組序列的框架和恒定區(qū)相同或基本上相同(基本上是人)。全人框架、鉸鏈區(qū)和恒定區(qū)是那些人種系序列以及具有自然存在的體細(xì)胞突變的序列和具有工程改造的突變的那些。本發(fā)明化合物的抗體部分可包含源自其中含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失或添加的全人框架、鉸鏈或恒定區(qū)的框架、鉸鏈或恒定區(qū)。此外，本發(fā)明化合物的抗體部分優(yōu)選地在人中是基本上非免疫原性的。本發(fā)明化合物的抗體部分是IgG型抗體且具有四個(gè)經(jīng)由鏈內(nèi)和鏈間二硫鍵共價(jià)穩(wěn)定的氨基酸鏈(兩個(gè)“重”鏈和兩個(gè)“輕”鏈)。各重鏈由N末端HCVR和重鏈恒定區(qū)(“HCCR”)構(gòu)成。各輕鏈由LCVR和輕鏈恒定區(qū)(“LCCR”)構(gòu)成。當(dāng)在某些生物系統(tǒng)中表達(dá)時(shí)，具有天然人Fc序列的抗體在Fc區(qū)中被糖基化。通常，糖基化發(fā)生于抗體的Fc區(qū)中的高度保守的N-糖基化位點(diǎn)處。N-聚糖通常附接至天冬酰胺?？贵w同樣可在其它位置處被糖基化。任選地，本發(fā)明化合物的抗體部分含有源自人IgG4Fc區(qū)的Fc部分，因?yàn)閰⑴cFc受體介導(dǎo)的炎性機(jī)制或活化補(bǔ)體的能力降低，導(dǎo)致效應(yīng)物功能降低。此外，本發(fā)明的某些化合物的抗體部分含有IgG4-PAAFc部分。IgG4-PAAFc部分在224位處具有絲氨酸至脯氨酸突變，在230位處具有苯丙氨酸至丙氨酸突變，且在231位處具有亮氨酸至丙氨酸突變。S224P突變是防止半抗體形成(IgG4抗體中的半分子的動(dòng)態(tài)交換的現(xiàn)象)的鉸鏈突變。F230A和L231A突變進(jìn)一步減小已經(jīng)低的人IgG4同種型的效應(yīng)物功能?？赏ㄟ^使編碼HCVR的DNA可操作連接至編碼重鏈恒定區(qū)的另一DNA分子來將編碼HCVR區(qū)的分離DNA分子轉(zhuǎn)化成全長(zhǎng)重鏈基因。人以及其它哺乳動(dòng)物重鏈恒定區(qū)基因的序列是本領(lǐng)域已知的?？衫缤ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增獲得涵蓋這些區(qū)域的DNA片段。可通過使編碼LCVR的DNA可操作連接至編碼輕鏈恒定區(qū)的另一DNA分子來將編碼LCVR區(qū)的分離DNA轉(zhuǎn)化成全長(zhǎng)輕鏈基因。人以及其它哺乳動(dòng)物輕鏈恒定區(qū)基因的序列是本領(lǐng)域已知的?？赏ㄟ^標(biāo)準(zhǔn)PCR擴(kuò)增獲得涵蓋這些區(qū)域的DNA片段。輕鏈恒定區(qū)可以是κ或λ恒定區(qū)。“單鏈片段可變”或“scFv”或“scFv多肽”是指包含經(jīng)由scFv接頭分子連接的抗體的LCVR和HCVR的工程改造的非天然存在的單一折疊多肽。本發(fā)明化合物的scFv多肽部分是工程改造的非天然存在的scFv，其已被設(shè)計(jì)為具有工程改造的CDR且具有人來源scFv(框架的全部或部分)的與源自人基因組序列的框架相同或基本上相同(基本上人)的一些部分。全人框架是人種系序列以及具有天然存在的體細(xì)胞突變的序列和具有工程改造的突變的那些。本發(fā)明化合物的scFv多肽部分可包含源自其中含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代、缺失或添加的全人框架的框架。此外，本發(fā)明化合物的scFv多肽部分優(yōu)選地在人中是基本上非免疫原性的。任選地，化合物的scFv多肽部分可從HCVR中的半胱氨酸44和LCVR中的半胱氨酸100(Cys44和Cys100編號(hào)對(duì)應(yīng)于開始于scFv多肽的第一氨基酸的編號(hào))具有44-100個(gè)二硫化物。在此類scFv多肽中，HCVR和LCVR結(jié)構(gòu)域可為HCVR-scFv接頭-LCVR或LCVR-scFv接頭-HCVR順序。scFv接頭可以是柔性富含甘氨酸肽接頭，其使得HCVR和LCVR鏈能夠被折疊為用于識(shí)別抗原的功能單體單元。任選地，scFv接頭是富含甘氨酸的接頭，諸如2xG4S接頭、3xG4S接頭、4xG4S接頭或5xG4S接頭。scFv與抗體的融合可允許在表達(dá)和分泌期間形成多種結(jié)構(gòu)。首先，融合至抗體的scFv元件可獨(dú)立地經(jīng)由分子內(nèi)相互作用來折疊，由此位于同一多肽內(nèi)的個(gè)別HCVR和LCVR元件折疊以形成兩個(gè)個(gè)別且自主的單元，在本文中稱為Mab-scFv。其次，經(jīng)由替代折疊途徑，融合至抗體的scFv元件可經(jīng)由分子間相互作用發(fā)生折疊，由此存在于一種多肽中的HCVR與存在于鄰近多肽中的LCVR折疊以形成單一共折疊物質(zhì)，在本文中稱為Mab-雙鏈抗體。術(shù)語(yǔ)“接頭”和“scFv接頭”均是指富含甘氨酸肽接頭。“接頭”在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中用于將抗體連接至scFv，且“scFv接頭”在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中用于將scFv的LCVR連接至scFv的HCVR。優(yōu)選地，肽接頭是具有至少5個(gè)氨基酸、優(yōu)選地至少10個(gè)氨基酸、更優(yōu)選地10至50個(gè)氨基酸的富含甘氨酸肽。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述富含甘氨酸肽接頭是(GxS)n，其中G=甘氨酸，S=絲氨酸，(x=3且n=3、4、5或6)或(x=4且n=2、3、4或5)。例如，在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，所述富含甘氨酸肽接頭是(GxS)n，其中G=甘氨酸，S=絲氨酸，x=4且n=2、3、4或5(即分別為GGGGSGGGGS(SEQIDNO:34)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDNO:35)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDNO:36)或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQIDNO:37)。在序列可操作連接至表達(dá)控制序列之后，在宿主細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸。表達(dá)載體通?？稍谒拗魃矬w中作為附加體或作為宿主染色體DNA的整合部分復(fù)制。通常，表達(dá)載體將含有選擇標(biāo)記(例如，四環(huán)素、新霉素和二氫葉酸還原酶)以允許檢測(cè)用期望DNA序列轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。本發(fā)明化合物可容易在哺乳動(dòng)物細(xì)胞(諸如CHO、NS0、HEK293或COS細(xì)胞)中產(chǎn)生。使用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)培養(yǎng)宿主細(xì)胞。可通過眾所周知方法將含有目標(biāo)多核苷酸序列(例如，編碼化合物多肽和表達(dá)控制序列的多核苷酸)的載體轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞中，所述方法根據(jù)細(xì)胞宿主的類型而變化。可采用各種蛋白純化方法，且此類方法是本領(lǐng)域已知的，且描述于，例如，Deutscher,MethodsinEnzymology182:83-89(1990)和Scopes,ProteinPurification:PrinciplesandPractice,第3版,Springer,NY(1994)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，以分離形式提供化合物或編碼其的核酸。如本文所使用，術(shù)語(yǔ)“分離”是指不含或基本上不含發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞環(huán)境中的任何其它大分子物質(zhì)的蛋白、肽或核酸。如本文所使用的“基本上不含”意指目標(biāo)蛋白、肽或核酸包含大于80%(以摩爾計(jì))、優(yōu)選地大于90%和更優(yōu)選地大于95%的存在的大分子物質(zhì)。本發(fā)明化合物或包含其的藥物組合物可通過腸胃外途徑(例如，皮下和靜脈內(nèi))施用。本發(fā)明化合物可單獨(dú)與藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑以單一或多個(gè)劑量施用于患者。本發(fā)明的藥物組合物可通過本領(lǐng)域眾所周知的方法制備(例如，Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第19版(1995),A.Gennaro等人,MackPublishingCo.)且包含如本文所公開的化合物和一種或多種藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。術(shù)語(yǔ)“治療(treating或treat或treatment)”是指減緩、中斷、阻止、緩解、停止、減輕或逆轉(zhuǎn)現(xiàn)有癥狀、病癥、病況或疾病的進(jìn)展或嚴(yán)重度?；颊呤侵富加械靡嬗赩EGFR2和/或Ang2的抑制的疾病、病癥或病況的哺乳動(dòng)物、優(yōu)選地人。除非另外指明，如本文提及化合物、抗體或scFv多肽對(duì)人VEGFR2或人Ang2的親和力所使用的“結(jié)合”意指小于約1x10-8M、優(yōu)選地小于約1x10-9M的KD，如通過本領(lǐng)域已知的常用方法(包括通過基本上如本文所述在25℃或37℃下使用表面等離振子共振(SPR)生物傳感器)所測(cè)定。本文提及本發(fā)明化合物所使用的術(shù)語(yǔ)“選擇性的”或“選擇性”是指化合物以低于化合物結(jié)合其它蛋白(包括目標(biāo)家族的成員，諸如人Ang1)約1000-、500-、200-、100-、50-或約10倍的KD結(jié)合目標(biāo)(例如人Ang2)，如通過在25℃或37℃下的表面等離振子共振所測(cè)量。額外或可替代地，當(dāng)通過下文實(shí)施例中所述的方法測(cè)定時(shí)，本發(fā)明的Ang2選擇性化合物結(jié)合人Ang2，但不結(jié)合或僅最小水平地結(jié)合人Ang1。“有效量”意指本發(fā)明化合物或包含本發(fā)明化合物的藥物組合物針對(duì)組織、系統(tǒng)、動(dòng)物、哺乳動(dòng)物或人誘發(fā)的研究者、醫(yī)師或其他臨床醫(yī)師尋求的生物或醫(yī)學(xué)反應(yīng)或期望治療效應(yīng)的量?；衔锏挠行Я靠筛鶕?jù)因素而變化，所述因素諸如疾病狀態(tài)、個(gè)體的年齡、性別和體重以及化合物在個(gè)體內(nèi)誘導(dǎo)期望反應(yīng)的能力。有效量也是治療有益效應(yīng)勝過化合物的任何毒性或有害效應(yīng)的量。通過下列非限制性實(shí)例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。實(shí)施例1：化合物表達(dá)和純化化合物C、化合物D、化合物E和化合物F的抗體部分、scFv部分和抗體-接頭-scFv的多肽和編碼其的核苷酸序列下面列于標(biāo)題為“氨基酸和核苷酸序列”的部分中。此外，化合物C、化合物D、化合物E和化合物F的抗體部分、scFv部分和抗體-接頭-scFv的SEQIDNO顯示于表1中?？苫旧先缦轮苽洳⒓兓景l(fā)明化合物，包括，但不限于化合物C、化合物D、化合物E和化合物F)?？捎糜糜诜置诨衔锏谋磉_(dá)系統(tǒng)使用最佳預(yù)定HC-接頭-scFv：LC載體比率(諸如1:3或1:2)或編碼HC-接頭-scFv和LC兩者的單一載體系統(tǒng)瞬時(shí)或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染適當(dāng)宿主細(xì)胞(諸如HEK293或CHO)?？墒褂迷S多常用技術(shù)中的任一種純化其中已分泌化合物的澄清培養(yǎng)基。例如，可將培養(yǎng)基便利地施加至已經(jīng)用相容緩沖液(諸如磷酸鹽緩沖鹽水(pH7.4))平衡的MabSelect柱(GEHealthcare)或KappaSelect柱(GEHealthcare，用于Fab片段)?？上礈煸撝匀コ翘禺愋越Y(jié)合組分?？衫缤ㄟ^pH梯度(諸如20mMTris緩沖液(pH7)至10mM檸檬酸鈉緩沖液(pH3.0)或磷酸鹽緩沖鹽水(pH7.4)至100mM甘氨酸緩沖液(pH3.0))洗脫結(jié)合化合物?？芍T如通過SDS-PAGE檢測(cè)化合物級(jí)分，然后可合并。根據(jù)預(yù)期用途，進(jìn)一步純化是任選的?？墒褂贸Ｓ眉夹g(shù)濃縮和/或無菌過濾化合物。可通過常用技術(shù)(包括大小排阻、疏水性相互作用、離子交換、多態(tài)或羥基磷灰石色譜)有效去除可溶性聚集物和多聚體?；衔镌谶@些色譜步驟之后的純度大于95%。產(chǎn)物可立即在-70℃下冷凍或可凍干。表1:SEQIDNO化合物C化合物D化合物E化合物F抗體的HCVR1234抗體的HC5678抗體的HCof+接頭+scFv多肽9101112抗體的LCVR13141513抗體的LC16171816scFv多肽19191920scFv多肽的HCVR21212122scFv多肽的LCVR23232324測(cè)定結(jié)合動(dòng)力學(xué)、親和力和選擇性可通過使用表面等離振子共振(SPR)生物傳感器(諸如Biacore?2000、Biacore?3000或Biacore?T100(GEHealthCare))根據(jù)本領(lǐng)域已知方法來測(cè)定本發(fā)明化合物對(duì)人Ang2和人VEGFR2的結(jié)合動(dòng)力學(xué)、親和力和選擇性?？稍?5℃或37℃下使用Biacore表面等離振子共振方法測(cè)定本發(fā)明化合物針對(duì)多種物種的可溶性Ang2(人、食蟹猴、小鼠、兔和狗)和VEGFR2細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)(人、食蟹猴、兔和狗)的動(dòng)力學(xué)和平衡解離常數(shù)(KD)?？煞謩e從R&DSystems和SinoBiological購(gòu)買人Ang2和VEGFR2-ECD?？墒褂孟铝蟹椒ㄖ苽溆糜诓东@抗體的蛋白A表面。可使用EDC/NHS胺偶聯(lián)方法(Biacore#BR-1000-50)將可溶性蛋白A(Calbiochem，#539202)固定于CM4(Biacore#BR-1005-34)或CM5(Biacore#BR-1000-99)上。簡(jiǎn)而言之，可通過以10μL/min注入EDC/NHS的1:1混合物7分鐘來活化所有4個(gè)流通室的表面。然后，可將可溶性蛋白A在10mM乙酸鹽緩沖液(pH4.5)中稀釋至50-100μg/mL，且以10μL/min的流速在流通室(Fc)2、3或4上固定7分鐘。可通過以10μL/min注入乙醇胺7分鐘來封閉仍保留于芯片表面上的未反應(yīng)位點(diǎn)。運(yùn)行緩沖液可以是HBS-EP+(Biacore#BR-1006-69)?？梢?μg/mL通過稀釋至運(yùn)行緩沖液中來制備化合物樣品。可使用兩倍連續(xù)稀釋在運(yùn)行緩沖液中而制備范圍為50nM至1.56nM的離散濃度的Ang2配體。每一分析循環(huán)可由以下5個(gè)單獨(dú)步驟的系列組成：(1)將化合物捕獲于單獨(dú)流通室(Fc2、Fc3和Fc4)上，(2)以50μL/min將250μL(300秒表面接觸時(shí)間)離散濃度的Ang2或VEGFR2-ECD注入(使用kinject)所有Fc上，(3)返回緩沖液流20分鐘以監(jiān)測(cè)解離相，(4)用10mM甘氨酸(pH1.5)的10μL(30秒接觸時(shí)間)注入來再生芯片表面，(5)用HBS-EP+運(yùn)行緩沖液的15μL(45秒接觸時(shí)間)注入來平衡芯片表面?？墒褂脴?biāo)準(zhǔn)雙重參照處理所得數(shù)據(jù)且使用Biacore2000評(píng)估軟件4.1版擬合至1:1結(jié)合模型以測(cè)定締合速率(kon，M-1s-1單位)、解離速率(koff，s-1單位)。平衡解離常數(shù)(KD)的計(jì)算可從下列關(guān)系KD=koff/kon來計(jì)算，且以摩爾單位呈現(xiàn)。在基本上如該測(cè)定中所述進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，化合物C、化合物D、化合物E和化合物F在25℃下以407pM至673pM范圍內(nèi)的KD結(jié)合人Ang2(表2)。化合物C、化合物D、化合物E和化合物F在25℃下以528pM至1110pM范圍內(nèi)的KD結(jié)合人VEGFR2-ECD(表3)。這些本發(fā)明化合物對(duì)人Ang2和人VEGFR2兩者均表現(xiàn)出高親和力。在基本上如該測(cè)定中所述進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，化合物F對(duì)人Ang2表現(xiàn)出相對(duì)于對(duì)具有與化合物F的scFv多肽部分相同的HCDR和LCDR的Ang2抗體相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合動(dòng)力學(xué)和親和力(表4和5)。這表明，具有與化合物F的scFv多肽部分相同的HCDR和LCDR的Ang2抗體的有效結(jié)合動(dòng)力學(xué)保留于化合物F中。在基本上如該測(cè)定中所述進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，化合物F以相當(dāng)?shù)母哂H和力結(jié)合人、食蟹猴、小鼠、兔和狗Ang2，且化合物F以相當(dāng)?shù)母哂H和力結(jié)合人、食蟹猴、兔和狗VEGFR2。表2表3表4表5表6人Ang2與人Tie2相互作用的抑制可在固相體外ELISA測(cè)定中測(cè)量本發(fā)明化合物對(duì)人Ang2與其受體人Tie2的結(jié)合的阻斷。也可使用上述基于細(xì)胞的體外測(cè)定確立本發(fā)明化合物與具有與化合物的scFv多肽部分相同的HCDR和LCDR序列的Ang2抗體的相當(dāng)阻斷活性。對(duì)于該測(cè)定，可在室溫下用4μg/ml(100μl中)重組人Tie2-Fc(R&DSystems#313-TI)過夜包被高結(jié)合96孔ELISA板(Costar#2592)。可用TBST(Tris緩沖鹽水，含有0.05%Tween20)將板洗滌3次，然后可用300μl/每孔封閉緩沖液(0.5%BSA/D-PBS)(BSA：JacksonImmunoResearch編號(hào)001-000-162；無IgG，無蛋白酶)在室溫下在軌道振蕩器上封閉1-2小時(shí)。在封閉步驟期間，在單獨(dú)聚丙烯多孔板中，可添加75μl2X測(cè)試抗體(1:3連續(xù)稀釋于封閉緩沖液中)與75μl2X生物素化人Ang2(R&DSystems編號(hào)BT623)(也稀釋于封閉緩沖液中)。然后可將抗體/生物素化Ang2混合物在37℃下孵育1小時(shí)(最終生物素化Ang2濃度為100ng/ml)?？蓮腡ie2-Fc包被的ELISA板去除封閉溶液，其后可添加50μl/孔抗體/生物素化Ang2混合物(在一式兩份孔中)。然后可將板在軌道振蕩器上于室溫下孵育2小時(shí)，用板密封器覆蓋。然后可將板洗滌3次，其后可添加100μl/孔鏈霉抗生物素蛋白-HRP(R&DSystems#DY998，可以1:200稀釋于封閉緩沖液中)。然后可將板在軌道振蕩器上于室溫下孵育45分鐘，使用板密封器覆蓋。然后可將板再次洗滌3次。然后可通過添加100μl/孔單組分TMB底物(可升溫至室溫)(Surmodics/BioFXLabs#TMBW-1000-01)來使板顯色?？墒癸@色在室溫下進(jìn)行10分鐘(可使用鋁箔覆蓋板)?？捎?00μl/孔酸終止溶液(TMB終止溶液，Surmodics/BioFXLabs#LSTP-1000-01)終止顯色。可在軌道振蕩器上混合板，其后可在450nm下在ELISA讀板器(MolecularDevicesSpectraMax190)上使用SOFTmaxPRO5.4.1軟件(MolecularDevicesCorp.)進(jìn)行讀數(shù)。A450值反映了保留結(jié)合Tie-2-Fc的生物素化Ang2的量。A450值的減小反映了生物素Ang2與Tie-2-Fc的結(jié)合的阻斷?？捎肎raphPadPrism6使用Log轉(zhuǎn)換的X值計(jì)算Ang2結(jié)合Tie-2的抑制的IC50值?？蓪?duì)log轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)實(shí)施非線性回歸(曲線擬合)分析(S形劑量反應(yīng)，可變斜率)以獲得IC50值。如果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)多于一次，則可計(jì)算實(shí)驗(yàn)之間的幾何平均IC50值(和95%置信區(qū)間)。在基本上如該測(cè)定中所述進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，化合物F和具有與化合物F的scFv多肽部分相同的HCDR和LCDR的Ang2抗體分別導(dǎo)致0.034nM和0.027nM的幾何平均IC50值(n=2)。與具有與化合物F的scFv多肽部分相同的HCDR和LCDR的Ang2抗體相當(dāng)?shù)兀衔颋劑量依賴性地阻斷人Ang2與人Tie-2的結(jié)合。該數(shù)據(jù)表明，化合物的Ang2scFv多肽部分在該測(cè)定中維持與Ang2抗體相當(dāng)?shù)男Я?。Ang2誘導(dǎo)的Tie2磷酸化、而非Ang1介導(dǎo)的磷酸化的中和?？稍诨诩?xì)胞的測(cè)定中測(cè)量本發(fā)明化合物對(duì)人Ang2的基于細(xì)胞的體外抑制，其中Ang1和Ang2以劑量依賴性方式結(jié)合人Tie-2且誘導(dǎo)人Tie-2磷酸化?？墒褂没诩?xì)胞的體外測(cè)定評(píng)估本發(fā)明化合物以劑量依賴性方式選擇性中和Ang2、而非Ang1介導(dǎo)的Tie-2受體磷酸化的能力?？煞謩e包括Ang2抗體、Ang1抗體和對(duì)照人IgG4PAA同種型抗體作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照?？赏ㄟ^穩(wěn)定轉(zhuǎn)染全長(zhǎng)人Tie2受體(在C末端處具有3XFLAG標(biāo)簽)來生成CHO-Tie-2細(xì)胞系?？稍贖amsF-12(CellGro/Mediatech#10-080-CV)、10%熱滅活FBS(LifeTechnologies/Invitrogen#10082-147)、1X抗生素-抗真菌劑(LifeTechnologies/Invitrogen#15240-062)、1.25mg/mlG418(CorningCellgro#30-234-CI)、10μg/ml嘌呤霉素(Calbiochem#540411)和0.078%碳酸氫鈉(ThermoHyclone#SH30033.01)的完全培養(yǎng)基中維持CHO-Tie-2細(xì)胞。對(duì)于測(cè)定，可將CHO-Tie2細(xì)胞以10,000個(gè)細(xì)胞/孔(在100ul生長(zhǎng)培養(yǎng)基中)再懸浮至聚賴氨酸包被的96孔板(BDBiocoat#356640)的內(nèi)部60個(gè)孔中?？蓪?00μlD-PBS置于邊緣孔中以減少蒸發(fā)。可將細(xì)胞在37℃、95%RH、5%CO2下孵育過夜。第二天，可將細(xì)胞洗滌一次且可用100μl含有0.1%BSA的無血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基(Sigma#A7979，低內(nèi)毒素)替換培養(yǎng)基。然后可使細(xì)胞在37℃、95%RH、5%CO2下在無血清培養(yǎng)基中饑餓7.5至24小時(shí)。在饑餓時(shí)段期間，可將化合物(以6×最終濃度)以1:2連續(xù)稀釋于聚丙烯板中含有0.1%BSA的無血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。還可將人Ang2(R&DSystems#623-AN，重構(gòu)于D-PBS/0.1%BSA中)和人Ang1(R&DSystems#923-AN，重構(gòu)于D-PBS/0.1%BSA中)在含有0.1%BSA的無血清生長(zhǎng)培養(yǎng)基中稀釋至6×最終濃度。然后可將化合物和Ang2或Ang1配體以1:1比率混合于聚丙烯板中且可在37℃下孵育1小時(shí)。然后可將化合物/配體混合物以50μl/孔添加至細(xì)胞中(每次處理三個(gè)孔)且可在37℃、95%RH、5%CO2下孵育13分鐘至21小時(shí)?；衔锏淖罱K濃度范圍可以是0.0625-283nM，且人Ang2和Ang1的最終濃度分別可以是0.3μg/ml(約6nM)和0.5μg/ml(約8.9nM)。在孵育時(shí)間之后，可迅速且完全從細(xì)胞去除培養(yǎng)基，且可在60μl/孔的冷1XTris裂解緩沖液(MesoScaleDiscovery#R60TX;150mMNaCl,20mMTrispH7.5,1mMEDTA,1mMEGTA,1%TritonX-100)中裂解細(xì)胞，所述緩沖液可含有新鮮添加的蛋白酶和磷酸酶抑制劑(1X蛋白酶抑制劑混合制劑，Sigma#P8340；1X磷酸酶抑制劑混合制劑2，Sigma#P5726；1X磷酸酶抑制劑混合制劑3，Sigma#P0044；1mM最終活化原釩酸鈉(EMDChemicals#567540))。然后可將板置于冰上10分鐘，隨后可將其在4℃下置于低速軌道振蕩器上25分鐘。然后可將板密封且在-80℃下冷凍。在分析磷酸-Tie2(用來自R&DSystems的人磷酸-Tie-2DuoSetELISA試劑盒，#DYC2720)前一天，可在4℃下用1XELISA包被緩沖液(Surmodics/BioFXLabs#COAT-1000-01)中的4μg/ml小鼠抗人總Tie2捕獲抗體包被高結(jié)合的ELISA板(GreinerBioOne,#655081)過夜。在測(cè)量磷酸-Tie-2當(dāng)天，可將含有裂解物的板在冰上解凍?？捎孟礈炀彌_液(1XTBST，含有0.05%Tween20)洗滌包被的ELISA板且用300μl/孔封閉緩沖液(1%BSA(JacksonImmunoResearch#001-000-162；無IgG，無蛋白酶)、0.01%疊氮化鈉)在室溫下在軌道振蕩器上封閉最少1小時(shí)(同時(shí)用板密封器覆蓋)。在封閉期間，可將裂解物以1:5或1:10稀釋于聚丙烯板中含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的冷裂解緩沖液中?？煞忾]ELISA板且洗滌4次，且可添加100μl/孔稀釋裂解物(或磷酸-Tie2ELISA標(biāo)準(zhǔn)品)并在室溫下在軌道振蕩器上孵育2小時(shí)，使用密封器覆蓋?？蓪逑礈?次且可添加100μl/孔HRP綴合小鼠抗磷酸酪氨酸(如所推薦稀釋于小瓶中的TBST/0.1%BSA中)。然后可用密封器覆蓋板，且在室溫下在軌道振蕩器上孵育2小時(shí)。然后可將板洗滌6次且可確保從孔去除液體。然后可通過添加100μl/孔單組分TMB底物(Surmodics/BioFXLabs#TMBW-1000-01)來使板顯色。可使板在室溫下顯色20或30分鐘，使用鋁箔覆蓋?？捎?00μl/孔酸終止溶液(TMB終止溶液，Surmodics/BioFXLabs#LSTP-1000-01)終止顯色。然后可在軌道振蕩器上混合板?？稍?50nm下在ELISA讀板器(MolecularDevicesSpectraMax190)上使用SOFTmaxPRO5.4.1軟件(MolecularDevicesCorp.)讀取ELISA板?？蓮臉?biāo)準(zhǔn)曲線(4參數(shù)邏輯擬合)獲得樣品的磷酸-Tie-2值，且乘以稀釋因子5或10?？赏ㄟ^下式來計(jì)算抑制百分比：(處理的pTie2值-單獨(dú)Ang2處理的平均pTie2值)/(平均單獨(dú)培養(yǎng)基的pTie2值-單獨(dú)Ang2處理的平均pTie2值)*100。可用GraphPadPrism4使用Log轉(zhuǎn)換的X值計(jì)算Ang2誘導(dǎo)的磷酸-Tie-2的抑制的IC50值。可對(duì)log轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性回歸(曲線擬合)分析(S形劑量反應(yīng)，可變斜率)以獲得IC50值。如果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)多于一次，則可計(jì)算實(shí)驗(yàn)之間的幾何平均IC50值(和95%置信區(qū)間)。在基本上如該測(cè)定中所述進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，化合物F以0.587nM的IC50劑量依賴性地中和CHO-Tie2細(xì)胞中的人Ang2誘導(dǎo)的磷酸-Tie2(n=3)，而具有與化合物F的scFv多肽部分相同的HCDR和LCDR的Ang2抗體具有0.773nM的IC50。結(jié)果表明，化合物F中和Ang2誘導(dǎo)的磷酸-Tie2，但與陽(yáng)性對(duì)照Ang1抗體相比不中和CHO-Tie-2細(xì)胞中的人Ang1誘導(dǎo)的磷酸-Tie2。此外，該數(shù)據(jù)表明，化合物F的Ang2scFv多肽部分在該測(cè)定中維持與具有與化合物F的scFv多肽部分相同的HCDR和LCDR的Ang2抗體相當(dāng)?shù)男Я?。VEGF165誘導(dǎo)的VEGFR2磷酸化的中和可在基于細(xì)胞的測(cè)定中測(cè)量人VEGFR2的基于細(xì)胞的體外抑制，其中VEGF165與表達(dá)VEGFR2的細(xì)胞系上的VEGFR2的結(jié)合以劑量依賴性方式誘導(dǎo)VEGFR2磷酸化?？墒褂蒙鲜鰷y(cè)定評(píng)估本發(fā)明化合物以劑量依賴性方式選擇性中和VEGFR2受體的VEGF165介導(dǎo)的磷酸化的能力?？煞謩e包括VEGFR2抗體和不相關(guān)抗體人IgG4PAA同種型作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照。對(duì)于測(cè)定，可以14,000個(gè)細(xì)胞/孔(在100μl生長(zhǎng)培養(yǎng)基中)將表達(dá)VEGFR2的人ECFC(內(nèi)皮集落形成細(xì)胞，源自臍帶血內(nèi)皮祖細(xì)胞)(EndgenitorTechnologies，批號(hào)100506-14-P4，第10-12代)接種至膠原I包被的96孔板(BDBiocoat#35-4407)的內(nèi)部60個(gè)孔中的生長(zhǎng)培養(yǎng)基：EGM-2MVBulletKit(Lonza#CC-4147)中。可將包括的EGM-2MVSinglequot袋的組分添加至500mlEBM-2基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，所述EBM-2基礎(chǔ)培養(yǎng)基被調(diào)節(jié)至10%最終FBS濃度(LifeTechnologies/Invitrogen#10082-147，熱滅活)?？蓪?50μl生長(zhǎng)培養(yǎng)基置于邊緣孔中以減少蒸發(fā)。可將細(xì)胞在37℃、95%RH、5%CO2下孵育過夜。第二天，可將培養(yǎng)基去除且用100μl含有0.1%BSA的無血清EBM-2基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Sigma#A7979，低內(nèi)毒素)替換?？蓪⒓?xì)胞在37℃、95%RH、5%CO2下饑餓6?小時(shí)。在饑餓時(shí)段期間，可將化合物(以6×最終濃度)以1:4連續(xù)稀釋于聚丙烯板中的EBM-2/0.1%BSA中?？蓪⑷薞EGF165在EBM-2/0.1%BSA中稀釋至6×最終濃度。可將化合物(或單獨(dú)EBM-2/0.1%BSA培養(yǎng)基)以25μl一式三份添加至細(xì)胞，且可將細(xì)胞在37℃、95%RH、5%CO2下孵育45分鐘?？捎?5μl6XVEGF165在37℃、95%RH、5%CO2下處理處理5分鐘。(化合物的最終濃度范圍可以是0.018-300nM，且人VEGF165的最終濃度可以是0.16nM)?？蓮募?xì)胞去除培養(yǎng)基，且可在含有新鮮添加的1X蛋白酶和磷酸酶抑制劑(包括磷酸-VEGFR2測(cè)定試劑盒)的60μl/孔的冷1XTris裂解緩沖液(MesoScaleDiscovery#R60TX;150mMNaCl,20mMTrispH7.5,1mMEDTA,1mMEGTA,1%TritonX-100)中裂解細(xì)胞?？蓪逯糜诒?0分鐘，然后在4℃下置于低速軌道振蕩器上20分鐘。然后可將板密封且在-80℃下冷凍。在測(cè)量磷酸-VEGFR2當(dāng)天，可將含有裂解物的板在冰上解凍。可使用磷酸-VEGFR2(Tyr1054)全細(xì)胞裂解物試劑盒(MesoScaleDiscovery#K151DJD)測(cè)量磷酸-VEGFR2水平?？捎?50μl/孔封閉緩沖液(TBST中的3%封閉劑A)將用針對(duì)磷酸-VEGFR2的抗體預(yù)包被的MesoScale測(cè)定板在室溫下在軌道振蕩器上封閉最少1小時(shí)(同時(shí)用板密封器覆蓋)?？捎?XMesoScale洗滌緩沖液將板洗滌3次，且可每孔添加50μl裂解物(可在室溫下在軌道振蕩器上孵育1小時(shí)，用密封器覆蓋)?？蓪逑礈?次，且可添加25μl/孔的1XMSDSULFO-TAG?綴合的抗總VEGFR2(稀釋于制造商推薦的抗體稀釋劑中)，并在室溫下在軌道振蕩器上孵育1小時(shí)，用密封器覆蓋?？蓪逑礈?次且可確保從孔去除液體?？蓪?50ul/孔的1X讀數(shù)緩沖液T添加至板，且其可立即在MesoScaleDiscoverySECTOR成像儀MA6000上讀取。可通過下式來計(jì)算抑制百分比：(處理的信號(hào)值-VEGF+huIgG處理的平均信號(hào)值)/(平均單獨(dú)饑餓培養(yǎng)基信號(hào)值-VEGF+huIgG處理的平均信號(hào)值)*100?？捎肎raphPadPrism6使用Log轉(zhuǎn)換的X值計(jì)算VEGF165誘導(dǎo)的磷酸-VEGFR2的抑制的IC50值。可對(duì)log轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性回歸(曲線擬合)分析(S形劑量反應(yīng)，可變斜率)以獲得IC50值。如果進(jìn)行實(shí)驗(yàn)多于一次，則可計(jì)算實(shí)驗(yàn)之間的幾何平均IC50值(和95%置信區(qū)間)。在基本上如該測(cè)定中所述進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，化合物F以0.83nM的平均IC50劑量依賴性地中和ECFC中的人VEGF165誘導(dǎo)的磷酸-VEGFR2(n=3)，而IMC-1121B具有0.52nM的平均IC50(n=3)。這表明，在該基于細(xì)胞的測(cè)定中，化合物的VEGFR2抗體部分在化合物F中維持與IMC-1121B相當(dāng)?shù)男Я?。VEGF165誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖的中和。可在基于細(xì)胞的測(cè)定中測(cè)量本發(fā)明化合物對(duì)人VEGFR2的基于細(xì)胞的體外抑制，其中VEGF165以劑量依賴性方式誘導(dǎo)人VEGFR2增殖?？稍谌薍MVEC-d(真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞)中測(cè)量本發(fā)明化合物中和人VEGF165誘導(dǎo)的增殖(經(jīng)由VEGFR2)的能力?？砂╒EGFR2、Ang2和不相關(guān)人IgG4PAA抗體作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照?？蓮男律行园し蛛x人真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞，且可證實(shí)CD31、VEGFR2和乙酰化LDL表達(dá)?？蓪MVEC-d維持于完整生長(zhǎng)培養(yǎng)基MCDB131(Mediatech#15-100-CV)、2mML-谷氨酰胺(ThermoScientific#SH30034.01)、1X青霉素-鏈霉素(LifeTechnologies/Invitrogen#15140)、MGVS補(bǔ)充劑(LifeTechnologies/Invitrogen#S-005-25)中，如針對(duì)500ml培養(yǎng)基；其可補(bǔ)充以含有4.9%FBS、1μg/ml氫化可的松、3ng/ml人FGF、10μg/ml肝素、1ng/ml人EGF和0.08mM二丁?；h(huán)AMP。對(duì)于測(cè)定，可將第5代的HMVEC-d細(xì)胞在預(yù)溫?zé)嵘L(zhǎng)培養(yǎng)基中洗滌一次，且可以2,000個(gè)細(xì)胞/孔(在100μl生長(zhǎng)培養(yǎng)基中)再懸浮于白璧透明底96孔板(BD#35-3377)的內(nèi)部60個(gè)孔中。可將250μl無補(bǔ)充劑培養(yǎng)基添加至邊緣孔中以減少蒸發(fā)?？蓪⒒衔锖腿薞EGF165(批號(hào)ALY-BE01241-033，4X最終濃度)以1:4連續(xù)稀釋于聚丙烯板中的無補(bǔ)充劑培養(yǎng)基中?？蓪⒒衔?或僅無補(bǔ)充劑培養(yǎng)基)以50μl/孔一式三份添加至細(xì)胞，隨后可添加50μl/孔的4XVEGF165。然后可將板在37℃、95%RH、5%CO2下孵育5天?；衔锏淖罱K濃度范圍可以是0.012-800nM，且人VEGF165的最終濃度可以是0.5nM。在孵育時(shí)段之后，可將板和CellTiterGlo底物(Promega#G7571)平衡至室溫，持續(xù)30分鐘。可添加100μl/孔的CellTiterGlo試劑，且可將板在室溫下置于軌道振蕩器上2分鐘。可將板再孵育10分鐘，然后可在PerkinElmerWallacVictor3模型1420讀板器上記錄(1秒整合時(shí)間)發(fā)光?？捎肎raphPadPrism6使用Log轉(zhuǎn)換的X值計(jì)算VEGF165誘導(dǎo)的增殖的抑制的IC50值?？砂▎为?dú)培養(yǎng)基值作為曲線的最高點(diǎn)；可將單獨(dú)培養(yǎng)基的X值(濃度)設(shè)定至比最高X值高100倍。此外，可包括單獨(dú)VEGF值作為曲線的最低點(diǎn)；可將單獨(dú)VEGF的濃度設(shè)定至比最低X值低100倍?？蓪?duì)log轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性回歸(曲線擬合)分析(S形劑量反應(yīng)，可變斜率)以獲得IC50值。在基本上如該測(cè)定中所述進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，類似于IMC-1121B，化合物F分別以19.24nM和31.36nM的IC50平均值劑量依賴性地中和人VEGF165誘導(dǎo)的HMVEC-d增殖(n=2)。這表明，在該基于細(xì)胞的測(cè)定中，化合物的VEGFR2抗體部分在化合物F中維持與IMC-1121B相當(dāng)?shù)男ЯΑEGF165誘導(dǎo)的臍帶(cord)形成的抑制可在體外共培養(yǎng)系統(tǒng)中測(cè)量VEGF誘導(dǎo)的臍帶(cord)形成的體外抑制?？墒褂蒙鲜鰷y(cè)定來測(cè)量本發(fā)明化合物對(duì)VEGF誘導(dǎo)的臍帶(cord)形成的抑制?？砂╒EGFR2抗體作為陽(yáng)性對(duì)照。對(duì)于該測(cè)定，可在Corning培養(yǎng)燒瓶(Corning#431082)中在EGM-2MV培養(yǎng)基(Lonza#CC3202)中培養(yǎng)脂肪來源的干細(xì)胞(ADSC;Lonza#PT5006,批號(hào)OF4505-01)?？稍谀z原I包被燒瓶(BDBiosciences#356486)中在補(bǔ)充有5%熱滅活FBS(Gibco#10082-147)的EGM-2MV培養(yǎng)基中培養(yǎng)內(nèi)皮集落形成細(xì)胞(ECFC；Lonza，批號(hào)EGT-ECFC100506r)?？蓮呐囵B(yǎng)燒瓶收獲第4-6代的ADSC，可用DPBS(Hyclone#SH30028.03)沖洗燒瓶，隨后用TrypLEExpress(Gibco#12605-010)沖洗?？蓪DSC細(xì)胞懸浮于基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MCDC-131(Gibco#10372-019)，其補(bǔ)充有10μg/ml胰島素、1μM地塞米松、30μg/ml抗壞血酸、10μg/ml人轉(zhuǎn)鐵蛋白和50μg/ml妥布霉素)中?？蓽y(cè)定活細(xì)胞計(jì)數(shù)且可將細(xì)胞以4x104個(gè)細(xì)胞/孔接種于黑色透明底96孔板(BDFalcon#353219)中的100μl基礎(chǔ)培養(yǎng)基中?？蓪⒓?xì)胞在37℃下在5%CO2中孵育過夜以允許貼壁。第二天，可如上在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中收獲第7-10代的ECFC且可將活細(xì)胞計(jì)數(shù)調(diào)節(jié)至4x104個(gè)細(xì)胞/ml?？蓮腁DSC細(xì)胞去除培養(yǎng)基且可將100μlECFC細(xì)胞懸浮液添加至每孔?？蓪逶?7℃下在5%CO2中孵育2-3小時(shí)以允許細(xì)胞沉降至ADSC單層頂部?？蓪MC-1121B和本發(fā)明化合物在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中稀釋至80μg/ml，然后可用基礎(chǔ)培養(yǎng)基以1:3連續(xù)稀釋以產(chǎn)生9點(diǎn)劑量反應(yīng)系列?？蓪?0μl每一化合物的稀釋液添加至共培養(yǎng)物中。可將50μl在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中制備的rhVEGF(R&D#293-VE/CF，50μg/ml，DPBS中)的80ng/ml溶液添加至共培養(yǎng)物+化合物組合中?；衔锖蛂hVEGF的最終濃度可分別為20μg/ml和20ng/ml。用于測(cè)定的陽(yáng)性對(duì)照可在化合物不存在的情況下包括20ng/mlrhVEGF。用于測(cè)定的陰性對(duì)照可包括不含rhVEGF的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。然后可將板在37℃下在5%CO2中孵育3天以形成臍帶(cord)。在孵育時(shí)段結(jié)束時(shí)，可從每個(gè)孔抽吸培養(yǎng)基且可小心添加100ul室溫80%乙醇。可在室溫下將板孵育20分鐘?？沙槲掖既芤呵铱捎?50ulDPBS將孔洗滌兩次?？蓪⒖筯uCD31(R&D#AF806親和力純化的綿羊IgG，200ug/ml)和MAB抗肌動(dòng)蛋白α-平滑肌-Cy3(Sigma#C6198)各自在2.5%FBS/DPBS中以1:250稀釋?？蓪?00μl抗體混合物添加至各孔且可將板在37℃下在5%CO2中孵育2小時(shí)。然后可抽吸板且可用150ulDPBS將孔洗滌兩次。可在2.5%FBS/DPBS中1:400稀釋AlexaFluor488驢抗綿羊IgG(H+L)(LifeTechnologies#A11015)且可在2.5%FBS/DPBS中1:1000稀釋Hoescht33342(LifeTechnologies#H3570)，且可將100μl/孔添加至各板?？蓪逶谑覝叵卤芄夥跤?0分鐘。然后可用150μlDPBS將孔洗滌兩次?？蓪?50μlDPBS添加至每個(gè)孔且可用黑色粘合密封件(PerkinElmer#6050173)密封板?？稍贏rrayScanVTIHCS讀板器(Cellomics-ThermoFisher)上使用TubeFormationBio-application讀取板?？稍贕raphPadPrism6中將總管面積數(shù)據(jù)針對(duì)化合物濃度(以nM計(jì))進(jìn)行繪圖?？蓪⒒衔餄舛绒D(zhuǎn)換成log數(shù)據(jù)且可通過非線性回歸(S形劑量反應(yīng)，可變斜率)計(jì)算抑制的IC50值。每個(gè)實(shí)驗(yàn)可代表一式三份的平均值且一式三份實(shí)驗(yàn)可表示為幾何平均值并可計(jì)算95%置信區(qū)間。在基本上如該測(cè)定中所述進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，化合物F劑量依賴性地抑制ADSC/ECFC共培養(yǎng)物系統(tǒng)中的人VEGF誘導(dǎo)的臍帶(cord)形成，這與IMC-1121B相當(dāng)，平均IC50分別為6.04nM和5.6nM(n=3)。這表明，在該基于細(xì)胞的測(cè)定中，化合物的VEGFR2抗體部分在化合物F中維持與IMC-1121B相當(dāng)?shù)男Я?。Ang2誘導(dǎo)的血管發(fā)育的抑制?？稍谛∈笠暰W(wǎng)膜的血管發(fā)育模型中測(cè)量Ang2抗體對(duì)生理學(xué)血管生成的體內(nèi)抑制?？墒褂蒙鲜鰷y(cè)定研究本發(fā)明化合物抑制小鼠視網(wǎng)膜中的生理學(xué)血管生成的能力。對(duì)于該測(cè)定，可將懷孕雌性的小鼠幼崽分娩的日期標(biāo)記為P0(出生后第0天)。在分娩后，在第二天和第四天(P2和P4)，可向幼崽注射媒介物對(duì)照(PBS)或10mg/kgAng2抗體或13.5mg/kg化合物以維持相當(dāng)摩爾量的分子。在P5，可將小鼠處死且可收獲眼睛，且可固定于福爾馬林中5小時(shí)并可用PBS洗滌。然后可解剖視網(wǎng)膜，且可使用以1:200稀釋的抗CD31(BDPharmingen；克隆MEC13.3；目錄號(hào)553370)和以1:200稀釋的抗SMA-FTIC(Sigma；Clone1A4，目錄號(hào)F3777)染色。對(duì)于抗CD31處理的視網(wǎng)膜，可使用以1:400稀釋的抗大鼠Alexa-647(JacksonImmunoResearch；目錄號(hào)712-606-153)作為二級(jí)抗體?？赏ㄟ^使用NikonTi來獲取視網(wǎng)膜，且可通過使用FIJI軟件來定量血管進(jìn)展、芽尖細(xì)胞數(shù)和重塑叢的血管密度?？墒褂霉簿劢筃ikonA1獲取高放大率圖像。在基本上如該測(cè)定中所述進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，化合物F和具有與化合物F的scFv多肽部分相同的HCDR和LCDR的Ang-2Ab相當(dāng)?shù)匾种蒲苓M(jìn)展，減少內(nèi)皮尖端細(xì)胞數(shù)和血管密度，以及增加外周細(xì)胞覆蓋率(表7)。來自該體內(nèi)模型的這些結(jié)果表明，化合物F的Ang2scFv多肽部分維持與具有與化合物F的scFv多肽部分相同的HCDR和LCDR的Ang2抗體相當(dāng)?shù)墓δ芎托Я?。?物理穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性和產(chǎn)物質(zhì)量評(píng)估產(chǎn)物質(zhì)量(包括聚集物水平、表達(dá)期間的均質(zhì)性、物理穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性)以鑒定任何問題且確保用于治療應(yīng)用的適合性。游離輕鏈錯(cuò)誤配對(duì)在純化和分析化合物A(兩個(gè)SEQIDNO:38的第一多肽和兩個(gè)SEQIDNO:39的第二多肽)和化合物B(兩個(gè)SEQIDNO:40的第一多肽和兩個(gè)SEQIDNO:39的第二多肽)期間，檢測(cè)來自化合物的抗體部分的非共價(jià)輕鏈的存在。純化以去除錯(cuò)誤折疊物質(zhì)導(dǎo)致期望化合物的最終產(chǎn)率較差。發(fā)現(xiàn)化合物的抗體部分的VH和VL之間的界面的不穩(wěn)定性和scFv多肽的結(jié)構(gòu)域折疊均有助于該問題。使用化合物的抗體部分的框架中的突變來消除該輕鏈錯(cuò)誤配對(duì)問題，然而，該問題僅僅減輕，并未解決。嘗試scFv多肽中的許多種系框架，但表達(dá)概況沒有改善。需要工程改造化合物的抗體部分的CDR和框架且工程改造scFv多肽以產(chǎn)生可接受水平的輕鏈錯(cuò)誤配對(duì)的期望結(jié)果。質(zhì)譜分析證實(shí)存在作為非共價(jià)連接締合或共價(jià)連接物質(zhì)與化合物A締合的游離LC。為了進(jìn)一步定量LC締合的百分比，采用HIC-HPLC(TSKgel丁基-NPR4.6mmIDx10cm,2.5um;TOSOH目錄#42168)方法。在該分析中，將蛋白樣品注入丁基-NPR柱上且根據(jù)其疏水性洗脫。經(jīng)由弱疏水性相互作用，在洗脫期間依次拆分單體、聚集物和各種狀態(tài)的LC締合物質(zhì)。開發(fā)方法，使得在1mg/ml溶液中在50mM磷酸鉀、1M硫酸銨的緩沖液(pH6.7)中制備測(cè)試物品且將50μg樣品以1ml/min的流速注射于AgilentLC1260系統(tǒng)上的TSKgel丁基-NPR柱上。用50mM磷酸鉀緩沖液(pH6.7)中的從1M硫酸銨至零的鹽梯度，拆分三種蛋白峰且分級(jí)分離。通過LCMS分析每個(gè)分級(jí)分離峰且鑒定為單體Mab-scFv、具有一個(gè)額外半胱氨酸化LC的雙半胱氨酸化Mab-scFv和具有兩個(gè)額外半胱氨酸化LC的雙半胱氨酸化Mab-scFv。用通過LCMS證實(shí)的峰指定，對(duì)最終色譜(A214檢測(cè))進(jìn)行積分以計(jì)算LC締合的總百分比。在如上文所述進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)具有固定氧化的化合物B的M111L突變的化合物表現(xiàn)出55%LC締合。經(jīng)由工程改造VR2和框架的可變結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)最終分子化合物C、化合物D、化合物E和化合物F表現(xiàn)出沒有任何可檢測(cè)的LC締合，如通過HIC-HPLC分析所檢測(cè)(表8)。表8LC%具有M111L的化合物B55化合物C0化合物D0化合物E0化合物F0Mab-雙鏈抗體形成為了促進(jìn)本發(fā)明化合物中的Mab-雙鏈抗體/Mab-scFv比率的測(cè)量，進(jìn)行下列處理。通常，使用AmiconUltra-0.5mL離心過濾裝置將20μg本發(fā)明化合物緩沖液交換至含有150mM氯化鈉的50mM磷酸鈉(pH6.6)中。將樣品濃縮至大約30μl,然后與1μl新鮮制備的FABricator酶(Genovis,目錄:A0-FR1-020；將2000U溶解于30μlddH2O中)混合且在37℃下孵育過夜。使用偶聯(lián)至WatersXevoG2-S質(zhì)譜儀的WatersAcquityUPLC對(duì)消化樣品(1μl)進(jìn)行LC/UV/MS分析。以0.3ml/min的流速和80℃的柱溫度將樣品上樣于PLRP-S50x1.0mm,1000?,5um反相柱(Proxeon,目錄:PL1312-1502)上。使用乙腈中的TFA梯度從柱洗脫樣品。首先通過UV在214nm和流動(dòng)下分析洗脫物，然后引導(dǎo)至質(zhì)譜儀用于使用靈敏度模式、正極性用400-4000m/z的獲取范圍進(jìn)行分析。在基本上如該測(cè)定中所述進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，化合物B表現(xiàn)出小于1%的Mab-雙鏈抗體。并入為減少氧化和輕鏈錯(cuò)誤配對(duì)問題而對(duì)化合物B進(jìn)行的所有修飾的化合物C、化合物D和化合物E令人驚訝地具有大約5-6%Mab-雙鏈抗體。并入化合物F中的序列變化具有小于1%的Mab-雙鏈抗體的Mab-雙鏈抗體百分比，這與化合物B相當(dāng)。氧化可通過產(chǎn)生可經(jīng)受溫度保持應(yīng)激的各種配制條件來評(píng)估本發(fā)明化合物的化學(xué)穩(wěn)定性?？赏ㄟ^確立的LCMS肽譜技術(shù)來監(jiān)測(cè)化學(xué)穩(wěn)定性變化。簡(jiǎn)而言之，可獲得測(cè)試物品且在下列制劑緩沖液中稀釋至1mg/ml的最終濃度：10mM檸檬酸鹽(pH5.0)、10mM檸檬酸鹽(pH6.5)、1XPBS(pH7.4)和10mMTris(pH8.0)，然后在4℃下在每種個(gè)別緩沖液中實(shí)施徹底透析以確保完全緩沖液交換。然后可將緩沖液交換的樣品在4℃或40℃下孵育4周，其后可如下通過LCMS分析樣品?？蓪?yīng)激材料緩沖液交換至8M胍中以進(jìn)行變性，然后用DTT還原，隨后通過碘乙酰胺進(jìn)行烷基化。然后可將還原和烷基化的蛋白緩沖液交換至Tris(pH7.5)中，且用胰蛋白酶以20：1摩爾比率在37℃下消化4小時(shí)?？赏ㄟ^添加1μL冰乙酸來淬滅消化?？赏ㄟ^捕獲至用水中的0.2%甲酸預(yù)平衡的Zorbax1.8μmC182.1mmx50mm上來實(shí)現(xiàn)消化肽片段的分離，隨后使用以0.3ml/min操作的乙腈中的0.2%甲酸梯度進(jìn)行洗脫?？闪⒓词褂肁gilentESI-QTOF(設(shè)定為以正離子模式從300m/z至2000m/z以1次掃描/秒進(jìn)行掃描)分析洗脫的肽。ESI源可設(shè)定為4000V和350℃的溫度、40psi的霧化器氣體和12psi的圓錐氣體?？墒褂肁gilentMassHunterBio-confirm軟件比對(duì)胰蛋白酶肽質(zhì)譜與蛋白序列。在基本上如該測(cè)定中所述進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)在40℃和pH8.0下經(jīng)受溫度應(yīng)激時(shí)，化合物B在化合物的VEGFR2抗體部分的重鏈上的M111位處表現(xiàn)出14.2%氧化。為了防止與該位置處的氧化相關(guān)的問題，進(jìn)行將化合物C、D、E和F中的甲硫氨酸111變?yōu)榱涟彼岬膯吸c(diǎn)突變以消除該位置處的化學(xué)修飾的可能性。在向雄性食蟹猴單一靜脈內(nèi)給藥后的血漿藥代動(dòng)力學(xué)(PK)和藥效動(dòng)力學(xué)(PD)可在單一靜脈內(nèi)劑量之后在食蟹猴中測(cè)量本發(fā)明化合物的PK和PD?？上蛐坌允承泛?n=2/組)施用單一靜脈內(nèi)劑量的本發(fā)明化合物?？稍趧┝亢?-672小時(shí)對(duì)血液進(jìn)行采樣且分離血漿用于使用三種ELISA方法定量化合物血漿水平?？?cè)薎gG方法可利用ELISA形式來測(cè)量本發(fā)明化合物的濃度(總?cè)薎gG)?？蓪?biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照和測(cè)試樣品與固定在微量滴定板上的山羊抗人F(ab’)2一起孵育。在孵育之后，可將小鼠抗人IgG4-HRP(辣根過氧化酶)添加至孔中。一旦洗掉未結(jié)合的酶，就將SureBlue?TMB(四甲基聯(lián)苯胺)底物溶液添加至各孔?？赏ㄟ^添加酸性溶液來終止顯色且在450nm下用設(shè)定至630nm的波長(zhǎng)校正測(cè)量光密度。測(cè)定范圍可以是30-700ng/ml。VEGFR2抗原捕獲方法可利用ELISA形式來測(cè)量本發(fā)明化合物的濃度(VEGFR2抗原捕獲)?？蓪?biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照和測(cè)試樣品在用人VEGFR2包被的微量滴定板上孵育。在孵育之后，可將小鼠抗人IgG4-HRP(辣根過氧化酶)添加至孔中。一旦洗掉未結(jié)合的酶，就將SureBlue?TMB(四甲基聯(lián)苯胺)底物溶液添加至各孔?？赏ㄟ^添加酸性溶液來終止顯色且在450nm下用設(shè)定至630nm的波長(zhǎng)校正測(cè)量光密度。測(cè)定范圍可以是80-2,000ng/ml。Ang2抗原捕獲方法利用ELISA形式來測(cè)量本發(fā)明化合物的濃度(Ang2抗原捕獲)。可將標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照和測(cè)試樣品在用人Ang2包被的微量滴定板上孵育。在孵育之后，將小鼠抗人IgG4-HRP(辣根過氧化酶)添加至孔中。一旦洗掉未結(jié)合的酶，就將SureBlue?TMB(四甲基聯(lián)苯胺)底物溶液添加至各孔?？赏ㄟ^添加酸性溶液來終止顯色且在450nm下用設(shè)定至630nm的波長(zhǎng)校正測(cè)量光密度。測(cè)定范圍可以是30-700ng/ml?？墒褂肞hoenixWinNonlin6.3進(jìn)行非隔室分析?？墒褂肧igmaPlotv11生成圖，且可使用MicrosoftExcel2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。在基本上如該測(cè)定中所述進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，測(cè)量在1、10和25mg/kg的一個(gè)劑量之后化合物E和化合物F的PK。對(duì)于化合物E，終末半衰期(如在所有三次測(cè)定中所測(cè)量)在8.96-37.9h的范圍內(nèi)，這取決于劑量組(表9)，而化合物F的終末半衰期在18.6-79.5h的范圍內(nèi)，這取決于劑量組(表10)。這些來自三種不同結(jié)合測(cè)定(各自測(cè)量化合物的不同部分)的結(jié)果各自表明化合物F的終末半衰期與化合物E相比更高。表9表10氨基酸和核苷酸序列SEQIDNO:1(抗體的HCVR–化合物C)SEQIDNO:2(抗體的HCVR–化合物D)SEQIDNO:3(抗體的HCVR–化合物E)SEQIDNO:4(抗體的HCVR–化合物F)SEQIDNO:5(抗體的HC–化合物C)SEQIDNO:6(抗體的HC–化合物D)SEQIDNO:7(抗體的HC–化合物E)SEQIDNO:8(抗體的HC–化合物F)SEQIDNO:9(抗體的HC/接頭/scFv多肽–化合物C)SEQIDNO:10(抗體的HC/接頭/scFv多肽–化合物D)SEQIDNO:11(抗體的HC/接頭/scFv多肽–化合物E)SEQIDNO:12(抗體的HC/接頭/scFv多肽–化合物F)SEQIDNO:13(抗體的LCVR–化合物C和化合物F)SEQIDNO:14(抗體的LCVR–化合物D)SEQIDNO:15(抗體的LCVR–化合物E)SEQIDNO:16(抗體的LC–化合物C和化合物F)SEQIDNO:17(抗體的LC–化合物D)SEQIDNO:18(抗體的LC–化合物E)SEQIDNO:19(scFv多肽–化合物C,化合物D,化合物E)SEQIDNO:20(scFv多肽–化合物F)SEQIDNO:21(ScFv多肽的HCVR–化合物C、化合物D、化合物E)SEQIDNO:22(ScFv多肽的HCVR–化合物F)SEQIDNO:23(ScFv多肽的LCVR–化合物C、化合物D、化合物E)SEQIDNO:24(ScFv多肽的LCVR–化合物F)SEQIDNO:25(抗體的HC/接頭/scFv多肽的DNA–化合物C)SEQIDNO:26(抗體的LC的DNA–化合物C和化合物F)SEQIDNO:27(抗體的HC/接頭/scFv多肽的DNA–化合物D)SEQIDNO:28(抗體的LC的DNA–化合物D)SEQIDNO:29(抗體的HC/接頭/scFv多肽的DNA–化合物E)SEQIDNO:30(抗體的LC的DNA–化合物E)SEQIDNO:31(抗體的HC/接頭/scFv多肽的DNA–化合物F)SEQIDNO:32(人VEGFR2ECD)SEQIDNO:33(人Ang2)SEQIDNO:38(抗體的HC/接頭/scFv多肽-化合物A)SEQIDNO:39(抗體的LC-化合物A和化合物B)SEQIDNO:40(抗體的HC/接頭/scFv多肽-化合物B)。序列表<110>EliLillyandCompany<120>VEGFR2/Ang2化合物<130>X20051<150>62/000227<151>2014-05-19<160>40<170>PatentInversion3.5<210>1<211>116<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>1GluValGlnLeuValGlnSerGlyGlyGlyLeuValLysProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530SerMetAsnTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerAlaIleSerSerSerSerSerTyrIleTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAlaLysAsnSerLeuTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgValThrGluAlaPheAspIleTrpGlyGlnGlyThrLeuVal100105110ThrValSerSer115<210>2<211>116<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>2GluValGlnLeuValGlnSerGlyGlyGlyLeuValLysProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530SerMetLeuTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerAlaIleSerSerSerSerSerTyrThrTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAlaLysAsnSerLeuTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgValThrAspAlaPheAspIleTrpGlyGlnGlyThrLeuVal100105110ThrValSerSer115<210>3<211>116<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>3GluValGlnLeuValGlnSerGlyGlyGlyLeuValLysProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530SerMetAsnTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerAlaIleSerSerSerSerSerTyrIleTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAlaLysAsnSerLeuTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgValThrAspAlaPheAspIleTrpGlyGlnGlyThrLeuVal100105110ThrValSerSer115<210>4<211>116<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>4GluValGlnLeuValGlnSerGlyGlyGlyLeuValLysProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530SerMetLeuTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerAlaIleSerSerSerSerSerTyrIleTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAlaLysAsnSerLeuTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgValThrAspAlaPheAspIleTrpGlyGlnGlyThrLeuVal100105110ThrValSerSer115<210>5<211>442<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>5GluValGlnLeuValGlnSerGlyGlyGlyLeuValLysProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530SerMetAsnTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerAlaIleSerSerSerSerSerTyrIleTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAlaLysAsnSerLeuTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgValThrGluAlaPheAspIleTrpGlyGlnGlyThrLeuVal100105110ThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSerValPheProLeuAla115120125ProCysSerArgSerThrSerGluSerThrAlaAlaLeuGlyCysLeu130135140ValLysAspTyrPheProGluProValThrValSerTrpAsnSerGly145150155160AlaLeuThrSerGlyValHisThrPheProAlaValLeuGlnSerSer165170175GlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValProSerSerSerLeu180185190GlyThrLysThrTyrThrCysAsnValAspHisLysProSerAsnThr195200205LysValAspLysArgValGluSerLysTyrGlyProProCysProPro210215220CysProAlaProGluAlaAlaGlyGlyProSerValPheLeuPhePro225230235240ProLysProLysAspThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThr245250255CysValValValAspValSerGlnGluAspProGluValGlnPheAsn260265270TrpTyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArg275280285GluGluGlnPheAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrVal290295300LeuHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSer305310315320AsnLysGlyLeuProSerSerIleGluLysThrIleSerLysAlaLys325330335GlyGlnProArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerGlnGlu340345350GluMetThrLysAsnGlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPhe355360365TyrProSerAspIleAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGlu370375380AsnAsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhe385390395400PheLeuTyrSerArgLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGluGly405410415AsnValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyr420425430ThrGlnLysSerLeuSerLeuSerLeuGly435440<210>6<211>442<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>6GluValGlnLeuValGlnSerGlyGlyGlyLeuValLysProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530SerMetLeuTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerAlaIleSerSerSerSerSerTyrThrTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAlaLysAsnSerLeuTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgValThrAspAlaPheAspIleTrpGlyGlnGlyThrLeuVal100105110ThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSerValPheProLeuAla115120125ProCysSerArgSerThrSerGluSerThrAlaAlaLeuGlyCysLeu130135140ValLysAspTyrPheProGluProValThrValSerTrpAsnSerGly145150155160AlaLeuThrSerGlyValHisThrPheProAlaValLeuGlnSerSer165170175GlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValProSerSerSerLeu180185190GlyThrLysThrTyrThrCysAsnValAspHisLysProSerAsnThr195200205LysValAspLysArgValGluSerLysTyrGlyProProCysProPro210215220CysProAlaProGluAlaAlaGlyGlyProSerValPheLeuPhePro225230235240ProLysProLysAspThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThr245250255CysValValValAspValSerGlnGluAspProGluValGlnPheAsn260265270TrpTyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArg275280285GluGluGlnPheAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrVal290295300LeuHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSer305310315320AsnLysGlyLeuProSerSerIleGluLysThrIleSerLysAlaLys325330335GlyGlnProArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerGlnGlu340345350GluMetThrLysAsnGlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPhe355360365TyrProSerAspIleAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGlu370375380AsnAsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhe385390395400PheLeuTyrSerArgLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGluGly405410415AsnValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyr420425430ThrGlnLysSerLeuSerLeuSerLeuGly435440<210>7<211>442<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>7GluValGlnLeuValGlnSerGlyGlyGlyLeuValLysProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530SerMetAsnTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerAlaIleSerSerSerSerSerTyrIleTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAlaLysAsnSerLeuTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgValThrAspAlaPheAspIleTrpGlyGlnGlyThrLeuVal100105110ThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSerValPheProLeuAla115120125ProCysSerArgSerThrSerGluSerThrAlaAlaLeuGlyCysLeu130135140ValLysAspTyrPheProGluProValThrValSerTrpAsnSerGly145150155160AlaLeuThrSerGlyValHisThrPheProAlaValLeuGlnSerSer165170175GlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValProSerSerSerLeu180185190GlyThrLysThrTyrThrCysAsnValAspHisLysProSerAsnThr195200205LysValAspLysArgValGluSerLysTyrGlyProProCysProPro210215220CysProAlaProGluAlaAlaGlyGlyProSerValPheLeuPhePro225230235240ProLysProLysAspThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThr245250255CysValValValAspValSerGlnGluAspProGluValGlnPheAsn260265270TrpTyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArg275280285GluGluGlnPheAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrVal290295300LeuHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSer305310315320AsnLysGlyLeuProSerSerIleGluLysThrIleSerLysAlaLys325330335GlyGlnProArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerGlnGlu340345350GluMetThrLysAsnGlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPhe355360365TyrProSerAspIleAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGlu370375380AsnAsnTyrLysThrThrProProValLeuAspSerAspGlySerPhe385390395400PheLeuTyrSerArgLeuThrValAspLysSerArgTrpGlnGluGly405410415AsnValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeuHisAsnHisTyr420425430ThrGlnLysSerLeuSerLeuSerLeuGly435440<210>8<211>442<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成構(gòu)建體<400>8GluValGlnLeuValGlnSerGlyGlyGlyLeuValLysProGlyGly151015SerLeuArgLeuSerCysAlaAlaSerGlyPheThrPheSerSerTyr202530SerMetLeuTrpValArgGlnAlaProGlyLysGlyLeuGluTrpVal354045SerAlaIleSerSerSerSerSerTyrIleTyrTyrAlaAspSerVal505560LysGlyArgPheThrIleSerArgAspAsnAlaLysAsnSerLeuTyr65707580LeuGlnMetAsnSerLeuArgAlaGluAspThrAlaValTyrTyrCys859095AlaArgValThrAspAlaPheAspIleTrpGlyGlnGlyThrLeuVal100105110ThrValSerSerAlaSerThrLysGlyProSerValPheProLeuAla115120125ProCysSerArgSerThrSerGluSerThrAlaAlaLeuGlyCysLeu130135140ValLysAspTyrPheProGluProValThrValSerTrpAsnSerGly145150155160AlaLeuThrSerGlyValHisThrPheProAlaValLeuGlnSerSer165170175GlyLeuTyrSerLeuSerSerValValThrValProSerSerSerLeu180185190GlyThrLysThrTyrThrCysAsnValAspHisLysProSerAsnThr195200205LysValAspLysArgValGluSerLysTyrGlyProProCysProPro210215220CysProAlaProGluAlaAlaGlyGlyProSerValPheLeuPhePro225230235240ProLysProLysAspThrLeuMetIleSerArgThrProGluValThr245250255CysValValValAspValSerGlnGluAspProGluValGlnPheAsn260265270TrpTyrValAspGlyValGluValHisAsnAlaLysThrLysProArg275280285GluGluGlnPheAsnSerThrTyrArgValValSerValLeuThrVal290295300LeuHisGlnAspTrpLeuAsnGlyLysGluTyrLysCysLysValSer305310315320AsnLysGlyLeuProSerSerIleGluLysThrIleSerLysAlaLys325330335GlyGlnProArgGluProGlnValTyrThrLeuProProSerGlnGlu340345350GluMetThrLysAsnGlnValSerLeuThrCysLeuValLysGlyPhe355360365TyrProSerAspIleAlaValGluTrpGluSerAsnGlyGlnProGlu370375380AsnAsnTyrLysThrThrProPr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