本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種內(nèi)切木葡聚糖酶及其應(yīng)用，具體涉及RCOPoXEG12A蛋白質(zhì)及其作為內(nèi)切木葡聚糖酶的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：在自然界中，木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成。纖維素和半纖維素分別是地球上含量第一和第二大的生物質(zhì)資源。植物細胞壁是天然的木質(zhì)纖維素復(fù)合材料，含有大量的纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，是大自然中主要的纖維素和半纖維素資源。研究者致力于將木質(zhì)纖維素中纖維素和半纖維素降解用于生產(chǎn)第二代燃料乙醇(NaikSN,GoudVV,RoutPK,DalaiAK.2010.Productionoffirstandsecondgenerationbiofuels:Acomprehensivereview.RenewableandSustainableEnergyReviews,14:578-597)。在植物細胞壁中，纖維素被包裹在木質(zhì)素和半纖維素基質(zhì)中，使得纖維素酶難以接觸導(dǎo)致難以降解纖維素。如果采取措施將木質(zhì)素去除和將半纖維素降解使纖維素暴露出來，就可以促進纖維素被纖維素酶水解(FrySC.1989.Thestructureandfunctionsofxyloglucan.JournalofExperimentalBotany,40:1-11)。木葡聚糖是一種半纖維素，存在于高等植物的初生細胞壁、胞間層、膠質(zhì)層中，并且是植物初生細胞壁中的主要組成成分之一。在高等植物的初生細胞壁中，木葡聚糖占據(jù)了其干重質(zhì)量的20-25％(FrySC.1989.Thestructureandfunctionsofxyloglucan.JournalofExperimentalBotany,40:1-11)。木葡聚糖交叉結(jié)合結(jié)晶纖維素，在增加細胞壁結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的同時也阻礙了纖維素酶對纖維素的降解(HayashiT，KaidaR.2011.Functionsofxyloglucaninplantcells.MolecularPlant,4:17-24；RoseJKC,BennettAB.1999.Cooperativedisassemblyofthecellulose-xyloglucannetworkofplantcellwalls:parallelsbetweencellexpansionandfruitripening.TrendsinPlantScience,4:176-183)。植物細胞壁中的木葡聚糖含量越少，纖維素就被包裹得越不嚴(yán)密，就更易于被纖維素酶降解(HayashiT,KaidaR,KakuT,BabaK.2010.Looseningxyloglucanpreventstensilestressintreestembendingbutacceleratestheenzymaticdegradationofcellulose.RussianJournalofPlantPhysiology,57:316-320)。木葡聚糖僅有一條主鏈,其主鏈上含有多種短側(cè)鏈。自然存在的木葡聚糖的分子量可高達300kDa(TalbottLD,RayPM.1992.Molecularsizeandseparabilityfeaturesofpeacellwallpolysaccharides:implicationsformodelsofprimarywallstructure.PlantPhysiology,98:357-368)。木葡聚糖的主鏈由葡萄糖(glucose，G)通過β-1,4糖苷鍵連接而成，同一個木葡聚糖分子中可能含有多種側(cè)鏈，側(cè)鏈由木糖(xylose，X)、半乳糖(galactose，L)、阿拉伯糖(arabinose，A)、巖藻糖(fucose，F(xiàn))之中的一種或幾種組成。由于木葡聚糖的側(cè)鏈較為復(fù)雜，為了便于辨識，一般采用Fry等提出的系統(tǒng)命名法來表述(FrySC,YorkWS,AlbersheimP,DarvillA,HayashiT.1993.Anunambiguousnomenclatureforxyloglucan-derivedoligosaccharides.PhysiologiaPlantarum,89:1-3)。在該系統(tǒng)命名法中，木葡聚糖主鏈上不含側(cè)鏈的葡萄糖殘基簡寫為“G”；常見的有五種側(cè)鏈，分別為：1、主鏈上的葡萄糖連接一個木糖分子，主鏈上的葡萄糖殘基連同木糖殘基構(gòu)成的化合物結(jié)構(gòu)為G-X，簡寫為“X”；2、主鏈上的葡萄糖依次連接一個木糖分子和一個半乳糖分子(YorkWS,HarveyLK,GuillenR,AlbersheimP,DarvillAG.1993.Structuralanalysisoftamarindseedxyloglucanoligosaccharidesusingβ-galactosidasedigestionandspectroscopicmethods.CarbohydrateResearch,248:285-301)，主鏈上的葡萄糖殘基連同木糖、半乳糖殘基構(gòu)成的化合物結(jié)構(gòu)為G-X-L，簡寫為“L”；3、主鏈上的葡萄糖兩側(cè)分別連接一個木糖分子和一個阿拉伯糖分子，主鏈上的葡萄糖殘基連同分別處于兩側(cè)的木糖、阿拉伯糖殘基一起構(gòu)成的化合物結(jié)構(gòu)為A-G-X，簡寫為“A”(FrySC,YorkWS,AlbersheimP,DarvillA,HayashiT.1993.Anunambiguousnomenclatureforxyloglucan-derivedoligosaccharides.PhysiologiaPlantarum，89:1-3)；4、主鏈上的葡萄糖依次連接一個木糖分子和一個阿拉伯糖分子(VinckenJP,YorkWS,BeldmanC,VoragenAGJ.1997.Twogeneralbranchingpatternsofxyloglucan,XXXGandXXGG.PlantPhysiology,114:9-13)，主鏈上的葡萄糖殘基連同木糖、阿拉伯糖殘基一起構(gòu)成的化合物結(jié)構(gòu)為G-X-A，簡寫為“S”；5、主鏈上的葡萄糖依次連接一個木糖分子、一個半乳糖分子和一個巖藻糖分子(VinckenJP,BeldmanG,NiessenWMA,VoragenAGJ.1996.Degradationofapplefruitxyloglucanbyendoglucanase.CarbohydratePolymers,29:75-85)，主鏈上的葡萄糖殘基連同木糖、半乳糖、巖藻糖殘基一起構(gòu)成的化合物結(jié)構(gòu)為G-X-L-F，簡寫為“F”。側(cè)鏈具有改變木葡聚糖物理性能的特性。木葡聚糖酶是能將木葡聚糖轉(zhuǎn)化成低聚木葡聚糖的一系列酶的總稱，主要有五種，分別為：1、內(nèi)切木葡聚糖酶(EC3.2.1.151,endo-xyloglucanase，或稱為xyloglucan-specificendo-β-D-1,4-glucanase，簡稱為XEG)；2、外切木葡聚糖酶(EC3.2.1.155,exo-xyloglucanase)；3、木葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖苷酶(EC2.4.1.207,xyloglucanendotransglycosylase)；4、寡木葡聚糖β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.120，oligoxyloglucanβ-glycosidase)；5、寡木葡聚糖還原端特異性的纖維二糖水解酶(EC3.2.1.150,oligoxyloglucanreducing-end-specificcellobiohydrolase)。內(nèi)切木葡聚糖酶(EC3.2.1.151)作用于木葡聚糖內(nèi)部，隨機水解木葡聚糖主鏈上連接葡萄糖殘基之間的β-1,4糖苷鍵，產(chǎn)生短的木葡聚糖鏈(SongS,TangYB,YangS,YanSQ,ZhouP,JiangZQ.2013.Characterizationoftwonovelfamily12xyloglucanasesfromthethermophilicRhizomucormiehei.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,97:10013-10024)。內(nèi)切木葡聚糖酶主要分布在糖苷水解酶家族5，12，16，44和74，這些酶有不同的結(jié)構(gòu)和作用機制，但是都偏好以木葡聚糖作為底物，對木葡聚糖的特異性酶活力是對其它底物的特異性酶活力的10倍以上，甚至檢測不到對其它底物有酶活力(GrishutinSG,GusakovAV,MarkovAV,UstinovBB,SemenovaMV,SinitsynAP.2004.Specificxyloglucanasesasanewclassofpolysaccharide-degradingenzymes.BiochimicaetBiophysicaActa,1674:268-281)。外切木葡聚糖酶(EC3.2.1.155)由外向內(nèi)水解木葡聚糖，每次釋放出主鏈上的含四個葡萄糖單位的寡糖，但具體從非還原性末端還是還原性末端進行水解仍未被研究清楚(GrishutinSG,GusakovAV,MarkovAV,UstinovBB,SemenovaMV,SinitsynAP.2004.Specificxyloglucanasesasanewclassofpolysaccharide-degradingenzymes.BiochimicaetBiophysicaActa,1674:268-281)。木葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖苷酶(EC2.4.1.207)通過催化木葡聚糖的內(nèi)部斷裂，將產(chǎn)生的木葡聚糖片段轉(zhuǎn)移到其它木葡聚糖分子或低聚木葡聚糖分子的非還原端來完成斷裂和重新連接木葡聚糖的作用(FrySC,SmithRC,RenwickKF,MartinDJ,HodgeSK,etal.1992.Xyloglucanendotransglycosylase,anewwall-looseningenzymeactivityfromplants.BiochemicalJournal,282:821-828；NishitaniK,TominagaR.1992.Endo-xyloglucantransferase,anovelclassofglycosyltransferasethatcatalysestransferofasegmentofxyloglucanmoleculetoanotherxyloglucanmolecule.JournalofBiologicalChemistry，267：21058-21064)。寡木葡聚糖β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.120)從木葡聚糖的非還原性末端由外向內(nèi)依次進行水解，這種酶的底物特異性要求木葡聚糖非還原性末端的第一個葡萄糖殘基上側(cè)鏈為1個木糖(即結(jié)構(gòu)為G-X，簡寫為X)，當(dāng)為其它側(cè)鏈時則不能水解(KatoY,MatsushitaJ,KuboderaT,MatsudaK.1985.AnovelenzymeproducingisoprimeverosefromoligoxyloglucansofAspergillusoryzae.JournalofBiochemistry,97:801-810)。寡木葡聚糖纖維二糖水解酶(EC3.2.1.150)從木葡聚糖的還原性末端由外向內(nèi)依次以主鏈上的兩個葡萄糖殘基為單位進行水解，但對底物的結(jié)構(gòu)要求較高，要求還原性末端的第一個葡萄糖殘基上沒有側(cè)鏈(即結(jié)構(gòu)為G，簡寫為G)，同時第二個葡萄糖殘基上有一個木糖側(cè)鏈(即結(jié)構(gòu)為G-X，簡寫為X)，并且第三個葡萄糖殘基上最好有一個木糖側(cè)鏈(即結(jié)構(gòu)為G-X，簡寫為X)，當(dāng)符合這三個條件中的前兩個時，僅可進行一次水解；當(dāng)這三個條件都符合時，水解可連續(xù)進行(YaoiK,MitsuishiY.2002.Purification,characterization,cloning,andexpressionofanovelxyloglucan-specificglycosidase,oligoxyloglucanreducingend-specificcellobiohydrolase.TheJournalofBiologicalChemistry,277:48276-48281)。木葡聚糖酶的來源很廣，其中微生物是木葡聚糖酶最主要的來源。迄今已有報道產(chǎn)木葡聚糖酶的微生物有地霉屬(Geotrichum)(YaoiK,MitsuishiY.2004.Purification,characterization,cDNAcloning,andexpressionofaxyloglucanendoglucanasefromGeotrichumsp.M128.FEBSLetters,560:45-50)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)(YaoiK,NakaiT,KamedaY,HiyoshiA,MitsuishiY.2005.CloningandcharacterizationoftwoxyloglucanasesfromPaenibacillussp.strainKM21.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,71:7670-7678)、曲霉屬(Aspergillus)(HakamadaY,ArataS,OhashiS.2011.Purificationandcharacterizationofaxyloglucan-specificglycosylhydrolasefromAspergillusoryzaeRIB40.JournalofAppliedGlycoscience,58：47-51)、里氏木霉(Trichodermareesei)(GrishutinSG,GusakovAV,MarkovAV,UstinovBB,SemenovaMV,SinitsynAP.2004.Specificxyloglucanasesasanewclassofpolysaccharide-degradingenzymes.BiochimicaetBiophysicaActa,1674:268-281)、高溫單孢菌屬(Thermomonospora)(PolD,MenonV,RaoM.2012.BiochemicalcharacterizationofanovelthermostablexyloglucanasefromanalkalothermophilicThermomonosporasp.Extremophiles,16:135-146)和青霉屬(Penicillium)(SinitsynaOA,FedorovaEA,PravilnikovAG,RozhkovaAM,SkomarovskyAA,MatysVY,BubnovaTM,OkunevON,VinetskyYP,SinitsynAP.2010.IsolationandpropertiesofxyloglucanasesofPenicilliumsp.Biochemistry(Moscow),75：41-49)等等。其中以曲霉屬的菌株最多，例如日本曲霉(Aspergillusjaponicus)、黑曲霉(Aspergillusniger)(GrishutinSG,GusakovAV.MarkovAV,UstinovBB,SemenovaMV,SinitsynAP.2004.Specificxyloglucanasesasanewclassofpolysaccharide-degradingenzymes.BiochimicaetBiophysicaActa,1674:268-281)、棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)(PaulyM,AndersenLN,KauppinenS,KofodLV,YorkWS,AlbersheimP,DarvillA.1999.Axyloglucan-specificendo-β-1,4-glucanasefromAspergillusaculeatus:expressioncloninginyeast,purificationandcharacterizationoftherecombinantenzyme.Glycobiology,9:93-100)。在植物中，已發(fā)現(xiàn)旱金蓮屬(Nasturtium)(MarkP,BaumannMJ,JM,GullfotF,MichelG,KallasTeeriTT,BrumerH,CzjzekM.2009.AnalysisofnasturtiumTmNXG1complexesbycrystallographyandmoleculardynamicsprovidesdetailedinsightintosubstraterecognitionbyfamilyGH16xyloglucanendo-transglycosylasesandendo-hydrolases.Proteins,75:820-836)和白楊(Populustremulaxtremuloides)(JohanssonP,BrumerH,BaumannMJ,KallasHenrikssonH,DenmanSE,TeeriTT,JonesTA.2004.Crystalstructuresofapoplarxyloglucanendotransglycosylaserevealdetailsoftransglycosylationacceptorbinding.ThePlantCell,16:874-886)產(chǎn)生木葡聚糖酶；另外，也發(fā)現(xiàn)水生無脊椎動物可產(chǎn)生木葡聚糖酶(NiiyamaT,ToyoharaH.2011.Widespreaddistributionofcellulaseandhemicellulaseactivitiesamongaquaticinvertebrates.FisheriesScience,77:649-655)。目前國際上對木葡聚糖酶進行研究，主要的目的是用于去除包裹著纖維素的木葡聚糖，使得纖維素酶更容易接觸纖維素并降解纖維素釋放出葡萄糖，再利用酵母菌將葡萄糖轉(zhuǎn)化成為乙醇(NaikSN,GoudVV,RoutPK,DalaiAK.2010.Productionoffirstandsecondgenerationbiofuels:Acomprehensivereview.RenewableandSustainableEnergyReviews,14:578-597；FrySC.1989.Thestructureandfunctionsofxyloglucan.JournalofExperimentalBotany,40:1-11；RoseJKC,BennettAB.1999.Cooperativedisassemblyofthecellulose-xyloglucannetworkofplantcellwalls:parallelsbetweencellexpansionandfruitripening.TrendsinPlantScience,4:176-183；HayashiT,KaidaR,KakuT,BabaK.2010.Looseningxyloglucanpreventstensilestressintreestembendingbutacceleratestheenzymaticdegradationofcellulose.RussianJournalofPlantPhysiology,57:316-320)。同時，木葡聚糖酶可以與β-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase，EC3.2.1.23)(CrombieHJ,ChengappaS,HellyerA,ReidJSG.1998.Axyloglucanoligosaccharide-active,transglycosylatingβ-D-glucosidasefromthecotyledonsofnasturtium(TropaeolummajusL)seedlings-purification,propertiesandcharacterizationofacDNAclone.ThePlantJournal,15:27-38)、α-木糖苷酶(α-D-xylosidase，EC3.2.1.117)(LarsbrinkJ,IzumiA,IbatullinF,NakhaiA,GilbertHJ,DaviesGJ,BrumerH.2011.Structuralandenzymaticcharacterisationofaglycosidehydrolasefamily31α-xylosidasefromCellvibriojaponicusinvolvedinxyloglucansaccharification.BiochemJ,436:567-580)、α-巖藻糖苷酶(α-L-fucosidase，EC3.2.1.51)(delaTorreF,SampedroJ,ZarraI,RevillaG.2002.AtFXG1,anArabidopsisgeneencodingα-L-fucosidaseactiveagainstfucosylatedxyloglucanoligosaccharides.PlantPhysiology,128:247-255)和α-阿拉伯呋喃糖苷酶(non-reducingendα-L-arabinofuranosidase，EC3.2.1.55)(SimsIM,MunroSLA,CurrieG,CraikD,BacicA.1996.Structuralcharacterisationofxyloglucansecretedbysuspension-culturedcellsofNicotianaplumbaginifolia.CarbohydrateResearch,293:147-172)一起協(xié)同將木葡聚糖徹底降解釋放出葡萄糖、木糖、巖藻糖和阿拉伯糖，這些單糖也能夠被發(fā)酵微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化為乙醇(B,KarhumaaK,FonsecaC,Spencer-MartinsI,Gorwa-GrauslundMF.2007.Towardsindustrialpentose-fermentingyeaststrains.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,74:937-953)。在木葡聚糖和纖維素的降解及葡萄糖的轉(zhuǎn)化過程中使用的工藝是同步糖化發(fā)酵工藝，需要在酸性pH5.0下進行(K,BuraR,LesnickiG,SaddlerJ,ZacchiG.2007.Acomparisonbetweensimultaneoussaccharificationandfermentationandseparatehydrolysisandfermentationusingsteam-pretreatedcornstover.ProcessBiochemistry,42:834-839)，所以對酸性、酸穩(wěn)定的內(nèi)切木葡聚糖酶的研究，對于高效地降解木質(zhì)纖維素以生產(chǎn)燃料乙醇具有重要意義。但是目前報道的內(nèi)切木葡聚糖酶都不能同時具備“最適作用pH值為酸性”和“在酸性pH下穩(wěn)定”的酶學(xué)特性，例如：來自棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)菌株KSM510的1個內(nèi)切木葡聚糖酶XEG的pH穩(wěn)定范圍是pH3.0-3.8，但穩(wěn)定范圍很狹窄，而且沒有報道其最適作用pH值(PaulyM,AndersenLN,KauppinenS,KofodLV,YorkWS,AlbersheimP,DarvillA.1999.Axyloglucan-specificendo-β-1,4-glucanasefromAspergillusaculeatus：expressioncloninginyeast,purificationandcharacterizationoftherecombinantenzyme.Glycobiology,9:93-100)。來自黑曲霉(Aspergillusniger)菌株CBS120.49的1個內(nèi)切木葡聚糖酶EglC的最適作用pH值是pH4.5，但是沒有報道其pH穩(wěn)定性(HasperAA,DekkersE,vanMilM,vanderVondervoortPJI,derGraaffLH.2002.EglC,anewendoglucanasefromAspergillusnigerwithmajoractivitytowardsxyloglucan.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,68:1556-1560)。來自黑曲霉(Aspergillusniger)的另1個內(nèi)切木葡聚糖酶AnXEG12A的最適作用pH值是pH4.5，但是也沒有報道其pH穩(wěn)定性(MasterER,ZhengY,StormsR,TsangA,PowlowskiJ.2008.Axyloglucan-specificfamily12glycosylhydrolasefromAspergillusniger:recombinantexpression,purificationandcharacterization.BiochemistryJournal,411:161-170)。來自雪白曲霉(Aspergillusniveus)菌株A773的1個內(nèi)切木葡聚糖酶XegA的最適作用pH值是pH6.0，沒有報道其pH穩(wěn)定性(DamásioARL,RibeiroLFC,RibeiroLF,FurtadoGP,SegatoF,AlmeidaFBR,CrivellariAC,BuckeridgeMS,SouzaTACB,MurakamiMT,WardRJ,PradeRA,PolizeliMLTM.2012.Functionalcharacterizationandoligomerizationofarecombinantxyloglucan-specificendo-β-1,4-glucanase(GH12)fromAspergillusniveus.BiochimicaetBiophysicaActa-ProteinsProteom,1824:461-467)。來自地霉屬(Geotrichumsp.)菌株M128的1個內(nèi)切木葡聚糖酶XEG的最適作用pH值是pH5.5，其pH穩(wěn)定范圍為pH5.5-8.5(YaoiK,MitsuishiY.2004.Purification,characterization,cDNAcloning,andexpressionofaxyloglucanendoglucanasefromGeotrichumsp.M128.FEBSLetters,560:45-50)。來自類芽孢桿菌屬(Paenibacillussp.)菌株KM21的兩個內(nèi)切木葡聚糖酶之中的XEG5的最適作用pH值是pH5.5-6.5，其pH穩(wěn)定范圍為pH5.0-8.0；XEG74的最適作用pH值是pH6.0-6.5，其pH穩(wěn)定范圍為pH5.0-7.5(YaoiK,NakaiT,KamedaY,HiyoshiA,MitsuishiY.2005.CloningandcharacterizationoftwoxyloglucanasesfromPaenibacillussp.strainKM21.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,71:7670-7678)。來自變灰青霉(Penicilliumcanescens)菌株P(guān)CA10的1個內(nèi)切木葡聚糖酶XGA的最適作用pH值是pH4.0，但沒有報道其pH穩(wěn)定性；來自疣狀青霉(Penicilliumverruculosum)菌株B221-151的兩個內(nèi)切木葡聚糖酶，其中XG25的最適作用pH值是pH4.6，但沒有報道其pH穩(wěn)定性；XG70的最適作用pH值是pH4.7，但也沒有報道其pH穩(wěn)定性(SinitsynaOA,FedorovaEA,PravilnikovAG,RozhkovaAM,SkomarovskyAA,MatysVY,BubnovaTM,OkunevON,VinetskyYP,SinitsynAP.2010.IsolationandpropertiesofxyloglucanasesofPenicilliumsp..Biochemistry(Moscow),75:41-49)。來自米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)菌株CAU432的兩個內(nèi)切木葡聚糖酶之中的RmXEG12A的最適作用pH值為pH6.5，其只在pH7.5下穩(wěn)定；而另一個內(nèi)切木葡聚糖酶RmXEG12B的最適作用pH為pH5.0，但其只在pH5.0下穩(wěn)定(SongS,TangYB,YangSQ,YanQJ，ZhouP，JiangZQ.2013.Characterizationoftwonovelfamily12xyloglucanasesfromthethermophilicRhizomucormiehei.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,97:10013-10024)。來自天藍色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)菌株A3(2)的1個內(nèi)切木葡聚糖酶Sco6545的最適作用pH值為pH6.0，沒有報道其pH穩(wěn)定范圍(EnkhbaatarB,TemuujinU,LimJH,ChiWJ,ChangYK,HongaSK.2012.Identificationandcharacterizationofaxyloglucan-specificfamily74glycosylhydrolasefromStreptomycescoelicolorA3(2).AppliedandEnvironmentalMicrobiology,78：607-611)。由此可見，迄今報道的內(nèi)切木葡聚糖酶的最適作用pH值大部分為弱酸性或接近中性，而且在酸性環(huán)境下的穩(wěn)定性較差，這三個缺點限制了它們的應(yīng)用前景。因為內(nèi)切木葡聚糖酶在對木葡聚糖的水解過程中起非常重要的作用，所以對酸性、酸穩(wěn)定的內(nèi)切木葡聚糖酶的研究，對于高效降解木質(zhì)纖維素以生產(chǎn)燃料乙醇具有重要意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的一個目的是提供一種蛋白質(zhì)。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，是如下1)-3)中任一蛋白質(zhì)：1)由序列表中序列8所示的氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，或由序列表中序列8自N末端第9-239位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；2)由序列表中序列4自N末端第21-251位氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)；3)將1)或2)的氨基酸序列殘基經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白質(zhì)。上述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。序列4中的第1-20位氨基酸殘基是信號肽序列，在蛋白質(zhì)被分泌到細胞外的時候是會被切掉的。編碼上述蛋白質(zhì)的DNA分子也是本發(fā)明保護的范圍。上述DNA分子為如下1)-5)中任一所述的DNA分子：1)編碼區(qū)為序列表中序列7所示的核苷酸或序列表中序列7自5’末端第25-717位核苷酸；2)編碼區(qū)為序列表中序列6自5’末端第9-719位核苷酸或序列表中序列6自5’末端第9-701位核苷酸；3)編碼區(qū)為序列表中序列5所示的核苷酸；4)在嚴(yán)格條件下與1)或2)或3)雜交且編碼與上述蛋白質(zhì)具有相同功能的DNA分子；5)與1)或2)或3)具有90％以上同源性且編碼與上述蛋白質(zhì)具有相同功能的DNA分子。含有上述DNA分子的表達盒、重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌也是本發(fā)明保護的范圍。上述重組載體為將上述DNA分子插入表達載體得到的重組載體。上述表達載體為在巴氏畢赤酵母(Pichiapastoris)中表達的載體，如pPIC9、pPIC3、pA0804、pA0815、pHIL-D1、pPSC3K或pPIC9K。在本發(fā)明的實施例中，所使用的表達載體為pPIC9K；本發(fā)明的重組載體具體為在pPIC9K的EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點間插入序列表中序列6自5’末端第9-719位核苷酸得到的重組載體pPIC9K-RCOPoXEG12A。上述重組菌為將所述重組載體導(dǎo)入宿主菌中得到的重組菌。上述宿主菌可為酵母菌、大腸桿菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞或枯草桿菌和植物細胞等，優(yōu)選為酵母菌；所述酵母菌具體可為巴氏畢赤酵母。在本發(fā)明的實施例中，宿主菌均為畢赤酵母，優(yōu)選為巴氏畢赤酵母GS115、KM71(可購自美國Invitrogen公司)或SMD1168(可購自美國Invitrogen公司)。上述的蛋白質(zhì)作為內(nèi)切木葡聚糖酶的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。上述的DNA分子或上述的表達盒、重組載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系或重組菌在制備內(nèi)切木葡聚糖酶中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護的范圍。本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備內(nèi)切木葡聚糖酶的方法。本發(fā)明提供的方法，為在甲醇誘導(dǎo)下發(fā)酵上述的重組菌，即得到內(nèi)切木葡聚糖酶。上述方法中，所述甲醇在發(fā)酵體系中的體積百分含量為1-1.5％。所述發(fā)酵具體為將重組菌在BMMY培養(yǎng)基中在28℃下、250rpm振蕩培養(yǎng)；且每12小時向培養(yǎng)物中加入甲醇，前24小時加入甲醇至終濃度1％(體積百分含量)，24小時以后加入甲醇至終濃度1.5％(體積百分含量)；振蕩培養(yǎng)48小時，離心去除菌體后，得到內(nèi)切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A的粗酶液。上述的蛋白質(zhì)在降解木葡聚糖中的應(yīng)用；所述降解所需的pH值具體為4.5-5.5。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明從草酸青霉(Penicilliumoxalicum)菌株EU2106的基因組序列中發(fā)現(xiàn)了一個編碼內(nèi)切木葡聚糖酶的基因PoXEG12A，進行巴氏畢赤酵母密碼子優(yōu)化，可在宿主細胞中表達該基因以生產(chǎn)內(nèi)切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A，用于降解木葡聚糖。對該內(nèi)切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A進行酶活力相關(guān)檢測，其酶促反應(yīng)的最適pH為pH5.0、最適溫度為60℃；在最適pH和最適溫度下，該酶對底物木葡聚糖的比酶活力為172U/mg；而且5mMol/L的Fe2+可以把內(nèi)切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A的活性提高20％，達到206U/mg。該酶在pH3.5-7.0下穩(wěn)定。本發(fā)明的內(nèi)切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A作為內(nèi)切木葡聚糖酶，同時具有“最適作用pH值為強酸性”和“在強酸性pH值下穩(wěn)定”的特性，這個特性是已被報道的內(nèi)切木葡聚糖酶所不具備的，同時，這個特性可使得RCOPoXEG12A在用含有木葡聚糖的纖維素原料生產(chǎn)燃料乙醇的工業(yè)生產(chǎn)中具有應(yīng)用潛力。附圖說明圖1為草酸青霉EU2106的基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖圖2為草酸青霉EU2106基因組中含有一個假定內(nèi)切木葡聚糖酶全長基因的一段核苷酸序列的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖圖3為草酸青霉EU2106基因組的一個假定內(nèi)切木葡聚糖酶全長基因的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖圖4為草酸青霉EU2106的總RNA的瓊脂糖凝膠電泳圖圖5為草酸青霉EU2106的一個假定內(nèi)切木葡聚糖酶的cDNA的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖圖6為草酸青霉EU2106的一個假定內(nèi)切木葡聚糖酶的成熟蛋白質(zhì)的編碼區(qū)序列優(yōu)化密碼子以后的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖圖7為重組質(zhì)粒pPIC9K-RCOPoXEG12A的構(gòu)建圖8為載體pPIC9K和重組質(zhì)粒pPIC9K-RCOPoXEG12A分別進行SalⅠ酶切線性化產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖圖9為重組巴氏畢赤酵母菌株GHP9K13202的菌落PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖圖10為純化的重組內(nèi)切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A的SDS-PAGE分析圖11為純化的重組內(nèi)切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A水解木葡聚糖的產(chǎn)物的MALDI-TOF-MS圖譜圖12為內(nèi)切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A的最適作用pH曲線圖13為內(nèi)切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A的最適作用溫度曲線圖14為內(nèi)切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A的pH耐受性曲線圖15為內(nèi)切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A的溫度耐受性曲線圖16為內(nèi)切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A的酶反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)Km和Vmax的測定具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中的百分比(％)，如無特殊說明，均為質(zhì)量百分含量。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值或平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。以下實施例中的轉(zhuǎn)速，均為在半徑為4.5-5.5cm的離心半徑下的轉(zhuǎn)速。1、菌株、載體、限制性內(nèi)切酶、抗生素和試劑盒草酸青霉EU2106為本實驗室篩選得到的高產(chǎn)纖維素酶菌株，已保存于中國普通微生物菌種保存中心，保藏號為CGMCCNo.6471，并記載在一項已獲授權(quán)的發(fā)明專利中(馮家勛，農(nóng)清棟，劉君梁，等。一株青霉突變株及其在制備纖維素酶中的應(yīng)用。專利號：ZL201210395227.1，公開號為CN102876590A)。巴氏畢赤酵母(Pichiapastoris)菌株GS115購自Invitrogen公司(California,USA)，產(chǎn)品目錄號為C18100。表達載體pPIC9K購自Invitrogen公司(California,USA)，產(chǎn)品目錄號為V17520。限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ(產(chǎn)品目錄號為1040B)，NotⅠ(產(chǎn)品目錄號為1166B)和SalⅠ(產(chǎn)品目錄號為1080B)購自TaKaRa公司(遼寧，中國)。遺傳霉素(簡稱G418)購自Solarbio公司(北京，中國)，產(chǎn)品目錄號為G8161-1000。PrimeSTAR試劑盒購自TaKaRa公司(遼寧，中國)，產(chǎn)品目錄號為R045A。2×EasyTaqSuperMix試劑盒(產(chǎn)品目錄號為AS111-02)和T載體克隆試劑盒(pEASY-BluntCloningKit)(產(chǎn)品目錄號為CB101)購自全式金公司(北京，中國)。DNA純化回收試劑盒購自天根公司(北京，中國)，產(chǎn)品目錄號為DP214-03。Trizol試劑盒購自Invitrogen公司(California,USA)，產(chǎn)品目錄號為10296-010。mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司(遼寧，中國)，產(chǎn)品目錄號為6210A。基因組DNA快速抽提試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司(上海，中國)，產(chǎn)品目錄號為SK8230。BCA試劑盒購自Pierce公司(Rockford,USA)，產(chǎn)品目錄號為23225。Ni-NTAagrose填料購自QIAGEN公司(Hilden,Germany)，產(chǎn)品目錄號為30210。2、多糖羅望子木葡聚糖(產(chǎn)品目錄號為P-XYGLN)和地衣多糖(產(chǎn)品目錄號為P-LICHN)購自Magazyme公司；大麥葡聚糖(產(chǎn)品目錄號為G6513)、甲基纖維素(產(chǎn)品目錄號為M0512)、羧甲基纖維素鈉(產(chǎn)品目錄號為C-5678)、Avicel(產(chǎn)品目錄號為11365)、樺樹木聚糖(產(chǎn)品目錄號為X0502)、山毛櫸木聚糖(產(chǎn)品目錄號為X4252)、海帶多糖(產(chǎn)品目錄號為L9634)、半乳聚糖(產(chǎn)品目錄號為A9788)購自Sigma公司。3、培養(yǎng)基(1)真菌培養(yǎng)用培養(yǎng)基固態(tài)培養(yǎng)基平板采用馬鈴薯-葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司，目錄號為CM123，配制方法依照公司說明書進行。110-115℃滅菌20分鐘后備用。提取DNA和RNA所用真菌液態(tài)培養(yǎng)基每升含有：Avicel30g,麥麩(粉碎且通過80目篩)20g,KH2PO44g,(NH4)2SO42.8g,CaCl20.6g,MgSO4·7H2O0.6g,FeSO4·7H2O5×10-7g,MnSO41.6×10-7g,ZnSO41.4×10-7g,CoCl22×10-7g,pH5.0。121℃滅菌20分鐘。(2)酵母用培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基配方及配制方法如下(如果配制固體培養(yǎng)基，則需加入3％瓊脂粉)：配制培養(yǎng)基所需母液和緩沖液的配制：10×葡萄糖為10％葡萄糖；1M磷酸鉀緩沖液(K2HPO4-KH2PO4緩沖液，pH6.0)的配制方法為：132mL1MK2HPO4溶液與868mL1MKH2PO4溶液混合，用磷酸或氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH至6.0；10×YNB(即13.4％YNB)的配制方法為：100mL水中加入13.4g無氨基酸酵母氮源(Yeastnitrogenbasewithoutaminoacids，簡寫為YNB。購自Solarbio，廠家地址為中國北京，產(chǎn)品目錄號為Y8040)。500×生物素(即0.002％生物素)的配制方法為：100mL水中加入20mg生物素。10×YNB、500×生物素需單獨配制并過濾除菌并4℃保存。BMMY培養(yǎng)基每升含有：胰蛋白胨20g，酵母提取物10g，100mL1M磷酸鉀緩沖液(pH6.0)，100mL10×YNB，2mL500×生物素，8mL甲醇。BMMY培養(yǎng)基的配制方法為先將20g胰蛋白胨和10g酵母提取物溶于700mL去離子水并在121℃蒸汽滅菌20分鐘，其它成分單獨配制且用0.45μm濾膜過濾除菌后于使用前添加。YPD培養(yǎng)基每升含有：胰蛋白胨20g，酵母粉10g，葡萄糖20g，pH值自然。115℃蒸汽滅菌20分鐘。YPG培養(yǎng)基每升含有：胰蛋白胨20g，酵母粉10g，甘油20g，pH值自然。121℃蒸汽滅菌20分鐘。MD液體每升含有：10×YNB100mL，10×葡萄糖100mL，500×生物素2mL，pH值自然。115℃蒸汽滅菌20分鐘。4、內(nèi)切木葡聚糖酶酶活力的測定以羅望子木葡聚糖為底物測定內(nèi)切木葡聚糖酶的活力，參照Pol等所描述的方法并進行了一些修改(PolD,MenonV,RaoM.2012.BiochemicalcharacterizationofanovelthermostablexyloglucanasefromanalkalothermophilicThermomonosporasp..Extremophiles,16:135-146)，具體操作如下：(1)、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作用去離子水配制1g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，用該標(biāo)準(zhǔn)溶液和去離子水在1.5ml離心管中配制6個500μL不同濃度的葡萄糖溶液，分別為0.1g/L、0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L和0.6g/L。每個樣品濃度分別設(shè)三個重復(fù)，在所有樣品中加入2倍體積的DNS試劑，混勻，沸水中煮5分鐘，冷卻至室溫，12000rpm離心1分鐘，每個樣品分別取200μL上清液加入到96孔酶標(biāo)板中，在波長540nm下測定樣品的吸光值。以葡萄糖濃度為橫軸(X軸)，以光吸收值為縱軸(Y軸)作散點圖，添加趨勢線得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為y＝0.004x-0.0342(相關(guān)系數(shù)R2＝0.9994)。(2)、酶活力的測定酶活力的測定設(shè)置反應(yīng)組和對照組。反應(yīng)組為在2mL的離心管中加入450μL含0.5％羅望子木葡聚糖的緩沖液(具體的pH值可依據(jù)不同的實驗需要來設(shè)定)，在設(shè)定溫度的水浴鍋中保溫5分鐘后(溫度可依據(jù)不同的實驗需要來設(shè)定)，加入50μL酶液并快速混勻。保溫反應(yīng)一段時間后加入1mL的DNS試劑終止反應(yīng)并沸水浴5分鐘顯色。冷卻至室溫后，取200μL反應(yīng)液加入到96孔酶標(biāo)板中，用酶標(biāo)儀于540nm處測定光吸收值。對照組為將酶液沸水浴5分鐘滅活，該滅活酶液按上述反應(yīng)組同樣操作進行反應(yīng)作為對照，同樣用酶標(biāo)儀于540nm處測定光吸收值。將反應(yīng)組的光吸收值減去對照組的光吸收值，得到差值，將差值代入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得出反應(yīng)體系中含有還原糖的量，計算出酶活力。內(nèi)切木葡聚糖酶活力單位(U)的定義：在設(shè)定的測定條件下，每分鐘水解木葡聚糖釋放出1μmol還原糖所需的酶量，定義為一個酶活力單位(U)。蛋白質(zhì)含量的測定使用BCA法(SmithPK,KrohnRI,HermansonGT,MalliaAK,GartnerFH,ProvenzanoMD,FujimotoEK,GoekeNM,OlsonBJ,KlenkDC.1985.Measurementofproteinusingbicinchoninicacid.AnalyticalBiochemistry,150:76-85)。酶比活力定義：在設(shè)定的測定條件下，每mg蛋白質(zhì)所具有的酶活力(U/mg)。實施例1、內(nèi)切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A的編碼基因RCOPoXEG12A的獲得(1)、草酸青霉EU2106基因組DNA的提取草酸青霉EU2106孢子懸浮液的制備為：將草酸青霉EU2106的孢子液接種到PDA平板上，28℃靜置培養(yǎng)5天后，取新鮮孢子置于無菌超純水中制備孢子懸浮液，借助于顯微鏡放大400倍來計數(shù)，將孢子懸浮液的濃度調(diào)整為1×108個/mL。草酸青霉EU2106液態(tài)培養(yǎng)為：使用前述真菌液態(tài)培養(yǎng)基，500mL規(guī)格的三角瓶中裝液量為100mL，121℃滅菌20分鐘后可用。將1mL孢子懸浮液加入其中，置于28℃、180rpm搖床培養(yǎng)2天后，生長的菌絲體可用于提取基因組DNA和RNA。使用基因組DNA快速抽提試劑盒提取草酸青霉EU2106的基因組DNA，按照產(chǎn)品使用說明書進行。將提取所得的DNA溶液進行濃度為0.8％的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖1所示。圖1中的泳道1為λ噬菌體DNA用DNA限制性內(nèi)切酶HindⅢ進行完全酶切之后得到的產(chǎn)物，含有7個DNA片段，從大到小分別為23.13、9.416、6.557、4.361、2.322、2.027和0.564kb；泳道2為草酸青霉EU2106的基因組DNA。電泳結(jié)果表明已經(jīng)成功提取得到草酸青霉EU2106的基因組DNA。(2)、基因PoXEG12A的獲得設(shè)計一對引物，上游引物為5’-GACTCATATTCCATCCACTACCTGG-3’，下游引物為5’-CACTCGCACGAATAAACCCATCCTCC-3’，以提取得到的草酸青霉EU2106基因組DNA作為模板，使用PrimeSTAR試劑盒進行PCR擴增，反應(yīng)體系如下：PCR反應(yīng)程序如下：這5個步驟的具體實施先后順序為依次從①至⑤，具體為步驟①僅運行1次，步驟②、③和④依次進行一次構(gòu)成一個循環(huán)，持續(xù)30個循環(huán)之后進入步驟⑤，步驟⑤僅運行1次。在本專利的所有PCR擴增實驗中，如果沒有特別提及，則為使用此反應(yīng)體系和反應(yīng)程序。將PCR得到的產(chǎn)物進行濃度為0.8％的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示。圖2中的泳道1為1kbDNAladder，含有14個DNA片段，從大到小分別為10.00、8.00、6.00、5.00、4.00、3.50、3.00、2.50、2.00、1.50、1.00、0.75、0.50和0.25kb；泳道2為草酸青霉EU2106基因組中含有一個假定內(nèi)切木葡聚糖酶全長基因的一段核苷酸序列的PCR產(chǎn)物。電泳結(jié)果表明成功得到一段長度約為1kb的基因組DNA。將該段基因組DNA所在的凝膠切下，使用DNA純化回收試劑盒進行回收，回收所得產(chǎn)物使用T載體克隆試劑盒連接至T載體上并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中。使用2×EasyTaqSuperMix試劑盒和T載體通用上游引物5’-TGTAAAACGACGTCCAGT-3’及下游引物5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’進行菌落PCR，將含有重組質(zhì)粒的陽性大腸桿菌送去測序，得到該段基因組DNA的序列為序列表中的序列1，序列1長度為1028bp。經(jīng)過用ORFfinder分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/orfig.cgi)，在序列1中共發(fā)現(xiàn)8個開放閱讀框(openreadingframe，ORF)，分別是ORF1：核苷酸3-173(共171個核苷酸)、ORF2：核苷酸73-432(共360個核苷酸)、ORF3：核苷酸258-566(共309個核苷酸)、ORF4：核苷酸451-804(共354個核苷酸)、ORF5：核苷酸558-995(共438個核苷酸)、ORF6：核苷酸629-757(共129個核苷酸)。以O(shè)RF2的起始序列設(shè)計上游引物5’-ATGAAGTCGTTCACACCACT-3’，以O(shè)RF5的3’端序列設(shè)計下游引物5’-TCAAACAACAGCCACGGAGTAAG-3’，以草酸青霉EU2106基因組DNA為模板，成功擴增得到一條約0.95kb的DNA片段(如圖3所示，泳道1為1kbDNAladder，含有14個DNA片段，從大到小分別為10.00、8.00、6.00、5.00、4.00、3.50、3.00、2.50、2.00、1.50、1.00、0.75、0.50和0.25kb；泳道2為草酸青霉EU2106基因組的一個假定內(nèi)切木葡聚糖酶基因的核苷酸序列的PCR產(chǎn)物)，其序列為序列表中的序列2。序列2包含于序列1之中，為序列1的從5’端起第73-995位核苷酸，長度為923bp。使用Trizol試劑盒提取草酸青霉EU2106的總RNA，提取方法按照說明書進行，提取得到的RNA進行1.2％瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果如圖4所示，成功提取得到草酸青霉EU2106的總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照說明書上所述的操作方法將其中的mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，用上游引物5’-ATGAAGTCGTTCACACCACT-3’和下游引物5’-TCAAACAACAGCCACGGAGTAAG-3’進行PCR擴增，成功擴增得到一條約0.75kb的DNA片段(如圖5所示，泳道1為1kbDNAladder，含有14個DNA片段，從大到小分別為10.00、8.00、6.00、5.00、4.00、3.50、3.00、2.50、2.00、1.50、1.00、0.75、0.50和0.25kb；泳道2為草酸青霉EU2106的一個假定內(nèi)切木葡聚糖酶的cDNA的PCR產(chǎn)物)，其序列為序列表中的序列3，長度為756bp。將序列2和序列3進行比對分析，發(fā)現(xiàn)從基因組中所得到的序列2中含有兩個外顯子和一個內(nèi)含子。序列2中的第1-3個核苷酸ATG為起始密碼子，第1-356個核苷酸為第一個外顯子，第357-523個核苷酸為內(nèi)含子，第524-920個核苷酸為第二個外顯子，第921-923個核苷酸為終止密碼子。序列3中的第1-3個核苷酸ATG為起始密碼子；第1-753個核苷酸為序列2中的兩個外顯子依次相接而成的編碼區(qū)，編碼含251個氨基酸的多肽，該多肽序列為序列表中的序列4；第754-756個核苷酸為終止密碼子。使用SMART軟件對序列4進行分析(http://smart.embl-heidelberg.de/)，結(jié)果表明其第1-20個氨基酸為信號肽(由序列3中的第1-60位核苷酸編碼)，第21-251個氨基酸所構(gòu)成的多肽(由序列3中的第61-753位核苷酸編碼)為一個糖苷水解酶家族12的假定內(nèi)切木葡聚糖酶。由于信號肽在蛋白質(zhì)被分泌到細胞外的過程中會被切除，成熟蛋白質(zhì)不含有信號肽序列，于是將序列3的第61-753個核苷酸命名為基因PoXEG12A，編碼的多肽命名為PoXEG12A，其氨基酸序列為序列表中序列4的第21-251位氨基酸。(3)、基因PoXEG12A的密碼子優(yōu)化同一個氨基酸可以由不同的三聯(lián)體密碼子來編碼，這些編碼同一個氨基酸的密碼子被稱為“同義密碼子”。對于大多數(shù)物種來說，編碼某個特定氨基酸時都偏好于使用編碼這個氨基酸的“同義密碼子”之中的某一個，這種現(xiàn)象被稱為“密碼子的偏好性”，而這個被偏好用于編碼這個氨基酸的密碼子則被稱為該物種的“偏好密碼子”，其它非偏好密碼子被稱為“稀有密碼子”。例如“GCA”、“GCT”、“GCG”、“GCC”這四個密碼子都可以編碼丙氨酸，但由于巴氏畢赤酵母(Pichiapastoris)這個物種偏好于使用“GCT”來編碼丙氨酸，則巴氏畢赤酵母用來編碼丙氨酸的“偏好密碼子”為“GCT”，“稀有密碼子”為“GCA”、“GCG”和“GCC”。當(dāng)將基因在宿主菌中重組表達時，根據(jù)“密碼子的偏好性”現(xiàn)象，在不改變基因編碼的蛋白質(zhì)序列的前提下，依據(jù)宿主菌的密碼子偏好性，將基因中的“稀有密碼子”替換為宿主菌的“偏好密碼子”則有利于獲得更大量的表達產(chǎn)物，這個過程被稱為“密碼子優(yōu)化”(FuhrmannM,HausherrA,FerbitzL,T,HeitzerM，HegemannP.2004.MonitoringdynamicexpressionofnucleargenesinChlamydomonasreinhardtii.PlantMolecularBiology，55:869-881)。在GCUA網(wǎng)站(http://gcua.schoedl.de/sequential_v2.html)上對基因PoXEG12A的密碼子進行在線分析，發(fā)現(xiàn)以巴氏畢赤酵母為表達宿主時有多個密碼子不是巴氏畢赤酵母最常用的偏好密碼子，于是將基因PoXEG12A進行密碼子優(yōu)化。優(yōu)化后所得的序列為序列表中序列5的第1-693位核苷酸，仍然編碼序列表中序列4的第21-251位氨基酸。將優(yōu)化后所得的核苷酸序列命名為基因COPoXEG12A(CO為英文單詞codonoptimized的首字母，意思為“經(jīng)過密碼子優(yōu)化后所得到的”)。將基因COPoXEG12A交由上海捷瑞生物公司進行人工合成，合成之后使用含有限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ酶切位點的上游引物5’-CGGAATTCGCTGCTGTTCCAGCTACT-3’和含有限制性內(nèi)切酶NotⅠ酶切位點的下游引物5’-ATAAGAATGCGGCCGCTTAGTGGTGATGGTGGTGGTGAACAACAGCAAC-3’進行PCR。PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖6所示。泳道1為1kbDNAladder，含有14個DNA片段，從大到小分別為10.00、8.00、6.00、5.00、4.00、3.50、3.00、2.50、2.00、1.50、1.00、0.75、0.50和0.25kb；泳道2為基因COPoXEG12A的PCR產(chǎn)物，長度為738bp。經(jīng)過測序，該PCR產(chǎn)物具有序列表中序列6所示的核苷酸。序列6中從5’端起第1-2個核苷酸為限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ酶切位點的保護堿基；第3-8個核苷酸為限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ的酶切位點，第9-701個核苷酸為基因COPoXEG12A，第702-719個核苷酸為6個組氨酸的編碼序列，第720-722個核苷酸為終止密碼子，第723-730個核苷酸為限制性內(nèi)切酶NotⅠ的酶切位點，第731-738個核苷酸為限制性內(nèi)切酶NotⅠ的酶切位點的保護堿基。實施例2、蛋白質(zhì)RCOPoXEG12A的功能驗證一、重組質(zhì)粒pPIC9K-RCOPoXEG12A的構(gòu)建將載體pPIC9K用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ進行雙酶切，雙酶切產(chǎn)物用DNA純化回收試劑盒進行回收，回收產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢驗，得到9.3kb長的載體條帶(圖7A，泳道1為1kbDNAladder，含有14個DNA片段，從大到小分別為10.00、8.00、6.00、5.00、4.00、3.50、3.00、2.50、2.00、1.50、1.00、0.75、0.50和0.25kb；泳道2為用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ將質(zhì)粒pPIC9K進行雙酶切后再進行瓊脂糖凝膠電泳膠回收得到的產(chǎn)物)。將實施例1獲得的具有序列6所示的PCR產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ進行雙酶切，雙酶切產(chǎn)物用DNA純化回收試劑盒進行回收，回收產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢驗，得到約0.7kb長的外源DNA條帶(圖7B，泳道1為1kbDNAladder，含有14個DNA片段，從大到小分別為10.00、8.00、6.00、5.00、4.00、3.50、3.00、2.50、2.00、1.50、1.00、0.75、0.50和0.25kb；泳道2為用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和NotⅠ將序列6所示的PCR產(chǎn)物進行雙酶切后再進行瓊脂糖凝膠電泳后回收得到的產(chǎn)物)，將該回收的DNA片段與載體pPIC9K酶切產(chǎn)物連接，得到重組質(zhì)粒。經(jīng)過測序，該重組質(zhì)粒為將序列表中序列6自5’末端第9-719位核苷酸插入到pPIC9K載體的EcoRl和Notl的酶切位點，得到重組的核苷酸序列如序列表中序列7所示，將含有序列7所示序列的重組質(zhì)粒命名為pPIC9K-RCOPoXEG12A(“R”為英文單詞recombinant的首字母，意為“重組的”)。在使用載體pPIC9K表達外源基因時，由于載體pPIC9K上自帶有信號肽的編碼序列，所以在重組蛋白質(zhì)翻譯和折疊完成之后，巴氏畢赤酵母會在細胞內(nèi)切除信號肽并將成熟蛋白質(zhì)分泌到細胞外。但由于切除信號肽有特定的位點，使得使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ克隆時，表達的分泌到細胞外的成熟重組蛋白質(zhì)的N末端會額外多出8個氨基酸殘基(詳細的描述記載在載體pPIC9K的商品說明書上)。在核苷酸序列上，有24個核苷酸編碼該8個氨基酸，序列表中序列7所示的735個核苷酸序列是編碼經(jīng)EcoRl和Notl酶切的序列6克隆到載體pPIC9K后在巴氏畢赤酵母中表達的分泌到細胞外的成熟重組蛋白質(zhì)的編碼序列，該序列被命名為RCOPoXEG12A(“R”為英文單詞recombinant的首字母，意為“重組的”)，其在巴氏畢赤酵母中表達的分泌到細胞外的成熟重組蛋白質(zhì)被命名為RCOPoXEG12A，具有序列8的氨基酸序列，共有245個氨基酸殘基。序列8所示蛋白質(zhì)N末端第1-8個氨基酸由載體pPIC9K上的序列編碼，該編碼序列為序列7中第1-24個核苷酸(詳細的描述記載在載體pPIC9K的商品說明書上)；序列7中第25-717位核苷酸為基因PoXEG12A進行密碼子優(yōu)化之后得到的基因COPoXEG12A，編碼序列8所示的蛋白質(zhì)中自N末端第9-239位氨基酸(其氨基酸序列與序列表中序列4的第21-251位氨基酸序列相同)；序列7中第718-735位核苷酸編碼序列8中第240-245位氨基酸，為6個組氨酸構(gòu)成的標(biāo)簽。經(jīng)過在線計算(http://www.cnhupo.cn/CalMW/MyMW.asp)，重組蛋白質(zhì)RCOPoXEG12A的理論分子量為26.57kDa。二、含有質(zhì)粒pPIC9K-RCOPOXEG12A的重組巴氏畢赤酵母的構(gòu)建將不攜帶外源基因的載體pPIC9K用限制性內(nèi)切酶SalⅠ進行單酶切，得到線性化質(zhì)粒如圖8A所示，圖8A中的泳道1為1kbDNAladder，含有14個DNA片段，從大到小分別為10.00、8.00、6.00、5.00、4.00、3.50、3.00、2.50、2.00、1.50、1.00、0.75、0.50和0.25kb；泳道2為載體pPIC9K的SalⅠ單酶切線性化產(chǎn)物)。將重組質(zhì)粒pPIC9K-RCOPoXEG12A用限制性內(nèi)切酶SalⅠ進行單酶切，得到線性化質(zhì)粒如圖8B所示(泳道1為1kbDNAladder，含有10個DNA片段，從大到小分別為10.00、9.00、8.00、7.00、6.00、5.00、4.00、3.00、2.00和1.00kb；泳道2為重組質(zhì)粒pPIC9K-RCOPoXEG12A的SalⅠ單酶切線性化產(chǎn)物)。這兩個線性化質(zhì)粒都被分別用電擊法轉(zhuǎn)化至巴氏畢赤酵母菌株GS115中。具體操作如下：1、巴氏畢赤酵母GS115感受態(tài)的制備從-80℃冰箱中取出保存于20％甘油中的巴氏畢赤酵母菌株GS115，用無菌蒸餾水稀釋后涂布于YPD平板上，在28℃下培養(yǎng)2-3天后，挑取較大的單個菌落接種到液體YPD培養(yǎng)基中，在28℃、250rpm的搖床中振蕩培養(yǎng)16-20小時，此時測定菌液的OD600在1.0左右。在無菌條件下將菌液轉(zhuǎn)至無菌的40mLBeckman圓底離心管中，在4℃、2500rpm下離心3分鐘，菌體為沉淀，棄去上清液；用30mL冷的無菌水(用前放置4℃冰箱)重懸菌體，在4℃、2500rpm下離心3分鐘，菌體為沉淀，棄去上清液；用10mL冷的1M無菌山梨醇(用前放置4℃冰箱)重懸菌體，在4℃、2500rpm下離心3分鐘，菌體為沉淀，棄去上清液；重復(fù)上一步驟，利用殘余的山梨醇溶液懸浮沉淀菌體，分別向1.5mLEP管中加入100μL菌體。2、重組質(zhì)粒pPIC9K-RCOPoXEG12A和載體pPIC9K電擊轉(zhuǎn)化巴氏畢赤酵母GS115用限制性內(nèi)切酶SalⅠ對載體pPIC9K和重組質(zhì)粒pPIC9K-RCOPoXEG12A進行單酶切，瓊脂糖凝膠電泳純化單酶切產(chǎn)物，得到所需要的它們的線性化產(chǎn)物(圖8，其中圖8A為線性化載體pPIC9K,圖8B為線性化重組質(zhì)粒pPIC9K-RCOPoXEG12A)。用移液槍吸取10μl線性化的重組質(zhì)粒和載體pPIC9K分別加入到100μl的巴氏畢赤酵母GS115感受態(tài)細胞中，混勻，轉(zhuǎn)至冰上預(yù)冷后的2毫米間距寬的電擊杯中，設(shè)置電轉(zhuǎn)儀參數(shù)為：電壓1500V、電容25μF、電阻200Ω、電擊時間為4-10毫秒，進行電擊。電擊后快速倒入800μL預(yù)冷的1M山梨醇并混勻，轉(zhuǎn)入無菌的EP管中，置于冰水混合物中5分鐘。取100μL菌液涂在MD平板上，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3天。3、重組巴氏畢赤酵母的篩選與鑒定用MD液體培養(yǎng)基洗下MD平板上的菌落至指形瓶中，從10-1到10-6依次稀釋6個梯度，分別取100μL各個梯度的菌液涂在G418濃度為2.5mg/mL的YPD平板上，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2-3天。將含2.5mg/mLG418的YPD平板上較大的菌落用牙簽劃線在新的含2.5mg/mLG418的YPD平板上，并將牙簽上剩余的細胞用來做菌體PCR，鑒定重組子。用正向引物5’AOX:5’-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3’和反向引物3’AOX:5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’引物進行菌體PCR。菌體PCR體系和反應(yīng)條件如下：(1)菌體PCR體系為：2×EasyTaqSuperMix12.5μL，5’AOX(10μM)和3’AOX(10μM)均為1μL，巴氏畢赤酵母細胞適量，加ddH2O補足體系總體積到25μL。(2)反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5分鐘，92℃變性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸2分鐘，35個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。以轉(zhuǎn)化載體pPIC9K得到的對照單菌落為模板進行PCR擴增，結(jié)果如圖9A所示。圖9A中的泳道1為1kbDNAladder，含有14個DNA片段，從大到小分別為10.00、8.00、6.00、5.00、4.00、3.50、3.00、2.50、2.00、1.50、1.00、0.75、0.50和0.25kb；泳道2為質(zhì)粒pPIC9K轉(zhuǎn)化得到的重組巴氏畢赤酵母的菌體PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物中有一條500bp長的條帶，長度與載體pPIC9K的商品說明書上所述相符合(詳情請看載體pPIC9K的商品說明書)，為載體上的原有序列。將該陰性重組菌株命名為GHP9K。以轉(zhuǎn)化pPIC9K-RCOPoXEG12A得到的單菌落為模板進行PCR擴增，結(jié)果如圖9B所示。圖9B中的泳道1為1kbDNAladder，含有14個DNA片段，從大到小分別為10.00、8.00、6.00、5.00、4.00、3.50、3.00、2.50、2.00、1.50、1.00、0.75、0.50和0.25kb；泳道2為質(zhì)粒pPIC9K-RCOPoXEG12A轉(zhuǎn)化得到的重組巴氏畢赤酵母的菌體PCR產(chǎn)物。最終得到一個陽性重組菌株的PCR產(chǎn)物中有一條1200bp的條帶，長度為載體上的原有序列長度(詳情請看載體pPIC9K的商品說明書)與外源DNA長度之和，將該陽性重組菌株命名為GHP9K13202。三、重組巴氏畢赤酵母中RCOPoXEG12A基因的表達和重組蛋白質(zhì)RCOPoXEG12A的純化(一)、重組巴氏畢赤酵母中RCOPoXEG12A基因的表達1、誘導(dǎo)重組巴氏畢赤酵母菌株GHP9K13202表達重組蛋白質(zhì)RCOPoXEG12A將GHP9K13202接種至5mL的液態(tài)YPG培養(yǎng)基中，28℃、250rpm培養(yǎng)12小時；再轉(zhuǎn)至覆蓋八層紗布的含40mLYPG的500ml三角瓶中，28℃、250rpm振蕩培養(yǎng)16小時，此時菌液OD600達到16-18；在無菌條件下，將每瓶中的全部菌液轉(zhuǎn)移至無菌40mLBeckman圓底離心管中，在4℃、2500rpm條件下離心3分鐘，去上清；向每個管中倒入40mL的液態(tài)BMMY培養(yǎng)基，輕輕拍打管的底部，重懸菌體；再將菌液轉(zhuǎn)移至無菌的覆蓋六層紗布的500ml三角瓶中，繼續(xù)在28℃、250rpm搖床培養(yǎng)，每隔12小時加入一定量的甲醇，前24小時加入甲醇至終濃度1％，24小時以后加入甲醇至終濃度1.5％；培養(yǎng)48小時后用無菌的50mL離心管收集菌液，12000rpm離心10分鐘，收集上清液即為重組巴氏畢赤酵母GHP9K13202的培養(yǎng)液。采用同樣的方法誘導(dǎo)陰性重組巴氏畢赤酵母GHP9K為對照，得到對照培養(yǎng)液。2、重組巴氏畢赤酵母發(fā)酵液木葡聚糖酶活力的測定分別測定陽性重組巴氏畢赤酵母GHP9K13202和陰性重組巴氏畢赤酵母GHP9K培養(yǎng)液的木葡聚糖酶活力，結(jié)果陽性重組巴氏畢赤酵母GHP9K13202發(fā)酵液的木葡聚糖酶活力3.6U/mL，陰性重組巴氏畢赤酵母GHP9K的培養(yǎng)液檢測不到木葡聚糖酶活力。上述結(jié)果說明，RCOPoXEG12A基因表達的蛋白質(zhì)RCOPoXEG12A具有木葡聚糖酶活力。陽性重組巴氏畢赤酵母GHP9K13202培養(yǎng)液離心之后得到的上清液含有木葡聚糖酶，作為粗酶液可進行木葡聚糖酶RCOPoXEG12A的蛋白質(zhì)純化。木葡聚糖酶是葡聚糖酶中的一種，由于有的葡聚糖酶可以降解多種底物，所以需要進一步區(qū)分RCOPoXEG12A到底是特異性降解木葡聚糖的木葡聚糖酶、還是其它同時兼具木葡聚糖酶活性的葡聚糖酶。(二)、重組蛋白質(zhì)RCOPoXEG12A的純化使用QIAGEN公司的Ni-NTA層析柱純化重組蛋白質(zhì)RCOPoXEG12A，純化步驟如下：(1)加入2-3mL的Ni-Agarose填料到Ni-NTA親和層析柱中，待液體流干后，加入兩倍柱體積的去離子水洗柱子；(2)待去離子水流干后，加入一倍柱體積的10mM的咪唑平衡柱子；(3)將填料倒入裝有50mL巴氏畢赤酵母GHP9K13202發(fā)酵上清液的離心管中，于脫色搖床上快速振蕩1小時；(4)將混合液轉(zhuǎn)至親和層析柱中，讓液體自然流盡；(5)用20mM的咪唑洗滌兩倍柱體積，讓液體自然流盡；(6)依次用40mM、60mM、80mM、100mM咪唑分別洗3ml，收集洗脫液；(7)依次用250mM和300mM的咪唑(Elutionbuffer)分別洗滌5ml(每次加入1ml，流盡之后再加)，收集洗脫液。將所有的收集液保存在4℃冰箱。參照Laemmli的方法用SDS-PAGE檢測洗脫液中的蛋白質(zhì)純度(LaemmliUK.1970.CleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophageT4.Nature,227:680-685)，結(jié)果如圖10所示。圖10中的泳道1為蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記。包含7條帶，從上到下依次為116、66.2、45.0、35.0、25.0、18.4和14.4kDa；泳道2為純化的重組蛋白質(zhì)RCOPoXEG12A。從圖10可以看到，泳道2中僅有一條蛋白質(zhì)條帶，該條帶對應(yīng)的分子量約為26.6kDa，與經(jīng)過在線計算(http://www.cnhupo.cn/CalMW/MyMW.asp)得到的重組蛋白質(zhì)RCOPoXEG12A的理論分子量26.57kDa相符合，表明依照上述方法成功純化得到了重組蛋白質(zhì)RCOPoXEG12A。四、純化的重組蛋白質(zhì)RCOPoXEG12A的酶學(xué)特性1、重組蛋白質(zhì)RCOPoXEG12A的底物特異性檢測由于有的葡聚糖酶可以降解多種底物，為了區(qū)分RCOPoXEG12A到底是對木葡聚糖有高特異性的木葡聚糖酶、還是其它同時兼具木葡聚糖酶活性的葡聚糖酶，就必須檢測該酶的底物特異性。分別配置0.5％的木葡聚糖，大麥葡聚糖，地衣多糖，甲基纖維素，羧甲基纖維素，Avicel，樺樹木聚糖，山毛櫸木聚糖，海帶多糖和半乳聚糖，在最適作用條件下(pH5.0,60℃)測定重組蛋白質(zhì)RCOPoXEG12A對不同底物的酶活力。結(jié)果見表1，RCOPoXEG12A只對木葡聚糖有酶解作用(RCOPoXEG12A對木葡聚糖的比活力達到172U/mg)，證實RCOPoXEG12A為對木葡聚糖有高特異性的木葡聚糖酶，而不是其它同時兼具木葡聚糖酶活性的葡聚糖酶。表1.重組蛋白質(zhì)RCOPoXEG12A的底物特異性檢測2、重組蛋白質(zhì)RCOPoXEG12A水解木葡聚糖的產(chǎn)物的鑒定與分析在5個無菌的2mL離心管中，分別加入450μL含0.5％木葡聚糖的0.1M檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH5.0)和50μL上述純化制備的重組蛋白質(zhì)RCOPoXEG12A，酶的添加量為3U/g底物，置于45℃水浴鍋中反應(yīng)8小時，沸水煮5分鐘滅活重組蛋白質(zhì)RCOPoXEG12A，冷卻后將降解產(chǎn)物交由上海微譜化工技術(shù)服務(wù)有限公司做基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(英文全稱為Matrix-AssistedLaserDesorption/IonizationTimeofFlightMassSpectrometry，簡稱為MALDI-TOF-MS)分析，結(jié)果見圖11。在圖11中，橫軸“Mass(m/z)”中的“Mass”是指分子量，括號中的“m/z”全稱為“mass-to-chargeratio”，翻譯為“質(zhì)荷比”，“質(zhì)荷比”意為相對分子質(zhì)量與電荷的比值。由于在MALDI-TOF-MS中，每個產(chǎn)物分子都是與一個鈉離子形成加合物，所以產(chǎn)物的質(zhì)荷比等于“(產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量+鈉離子的相對分子質(zhì)量)/鈉離子所帶的電荷數(shù)”。由于鈉離子只帶1個正電荷，所以實際上測定產(chǎn)物得到的質(zhì)荷比等于“產(chǎn)物的相對分子質(zhì)量+鈉的相對分子質(zhì)量”。產(chǎn)物的表現(xiàn)形式為與橫軸垂直的狹窄的正向峰，每個峰的出峰位置對應(yīng)于橫軸“Mass(m/z)”中的某一個特定的質(zhì)荷比數(shù)值，這個特定的質(zhì)荷比數(shù)值已經(jīng)被儀器在每個峰的頂點處自動標(biāo)記出來了。依照這個質(zhì)荷比數(shù)值和木葡聚糖的分子結(jié)構(gòu)組成的特點，再對照已經(jīng)發(fā)表的論文中的介紹，就可以判斷出哪個峰對應(yīng)于哪個產(chǎn)物。即使某個峰在已經(jīng)發(fā)表的論文中并沒有分析得出對應(yīng)于哪個產(chǎn)物，但只要依照這個質(zhì)荷比數(shù)值和木葡聚糖的分子結(jié)構(gòu)特點，再結(jié)合各個參與組成木葡聚糖的單糖的分子量，就可以計算得出這個峰是由哪幾個單糖、每個單糖各自有多少個來構(gòu)成的?？v軸“％Intensity”表示峰的強度，是以最高的峰的強度設(shè)定為100％，其它峰的強度折算為相對強度。每個產(chǎn)物的相對含量都是不同的，它們的相對含量表現(xiàn)在峰的高度差異上。本實驗所用的來自于羅望子的木葡聚糖的構(gòu)成為葡萄糖：木糖：半乳糖：阿拉伯糖＝45:34:18:3，不含巖藻糖(http://secure.megazyme.com/Xyloglucan_Tamarind)。以1條主鏈形式存在，其構(gòu)建單位(buildingunit)主要為由4個葡萄糖為基礎(chǔ)而衍生出來的木葡聚糖寡糖(four-glucosebasedxyloglucanoligosaccharide，簡寫為Glc4-basedXGOs)XXXG(G4X3)、XXLG/XLXG(G4X3L1)和XLLG(G4X3L2)，少量構(gòu)建單位為上述組成單位中的1個半乳糖被1個阿拉伯糖取代而得的XXAG/XAXG(G4X3A1)和XALG/XLAG(G4X3L2A1)，或XXSG/XSXG(G4X3A1)和XSLG/XLSG(G4X3L2A1)，更稀有的構(gòu)建單位為由3個葡萄糖為基礎(chǔ)衍生出來的木葡聚糖寡糖(three-glucosebasedxyloglucanoligosaccharide，簡寫為Glc3-basedXGOs)，這些組成單位之間隨機組合連接構(gòu)成了木葡聚糖長鏈(YorkWS,HarveyLK,GuillenR,AlbersheimP,DarvillAG.1993.Structuralanalysisoftamarindseedxyloglucanoligosaccharidesusingβ-galactosidasedigestionandspectroscopicmethods.CarbohydrateResearch,248:285-301)。對照文獻(SongS,TangYB,YangSQ,YanQJ，ZhouP，JiangZQ.2013.Characterizationoftwonovelfamily12xyloglucanasesfromthethermophilicRhizomucormiehei.AppliedMicrobiologyandBiotechnology,97:10013-10024)，可以確認(rèn)圖11中m/z為1085.2107的峰是XXXG(G4X3)，m/z為1247.2363的峰是XXLG/XLXG(G4X3L1)，m/z為1409.2653的峰是XLLG(G4X3L2)，這3個峰都是Glc4-basedXGOs。由于質(zhì)譜只能鑒定出分子量而不能鑒定出分子結(jié)構(gòu)，而阿拉伯糖可以以兩種方式參與構(gòu)成側(cè)鏈，所以不能鑒定出由葡萄糖(G)、木糖(X)和阿拉伯糖(A)各一個分子構(gòu)成的結(jié)構(gòu)式到底是阿拉伯糖直接與葡萄糖相連接構(gòu)成結(jié)構(gòu)A-G-X(簡寫為A)、還是與木糖相連接構(gòu)成結(jié)構(gòu)G-X-A(簡寫為S)，只能計算出各個單糖的數(shù)量。m/z分別為2291.3811、2423.3875、2585.4053和2747.4226的四個峰為主鏈為含2個構(gòu)成羅望子木葡聚糖的重復(fù)單元的木葡聚糖寡糖，都是Glc8-basedXGOs，依據(jù)其分子量、各個組成羅望子木葡聚糖的單糖的分子量、羅望子木葡聚糖的組成方式，計算出其結(jié)構(gòu)式分別為G8X6L1、G8X6L1A1、G8X6L2A1和G8X6L3A1；m/z為3599.4512、3761.4876和3923.4990的3個峰則為主鏈為含3個構(gòu)成羅望子木葡聚糖的重復(fù)單元的木葡聚糖寡糖，都是Glc12-basedXGOs，依據(jù)其分子量、各個組成羅望子木葡聚糖的單糖的分子量、羅望子木葡聚糖的組成方式，計算出其結(jié)構(gòu)式分別為G12X9L1A2、G12X9L2A2和G12X9L3A2。由于在底物特異性的實驗中就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了重組蛋白質(zhì)RCOPoXEG12A對木葡聚糖的專一性極強(結(jié)果見表1)，確定了重組蛋白質(zhì)RCOPoXEG12A是木葡聚糖酶。而圖11的結(jié)果表明，重組蛋白質(zhì)RCOPoXEG12A降解木葡聚糖釋放出含有1個木葡聚糖的構(gòu)建單位Glc4-basedXGOs、含有2個木葡聚糖的構(gòu)建單位的Glc8-basedXGOs和含有3個木葡聚糖的構(gòu)建單位的Glc12-basedXGOs，表明是以內(nèi)切方式降解羅望子木葡聚糖，因此可以確定重組蛋白質(zhì)RCOPoXEG12A是一個內(nèi)切木葡聚糖酶(EC3.2.1.151,endo-xyloglucanase，或稱為xyloglucan-specificendoβ-D-1,4-glucanase，簡稱為XEG)(GrishutinSG,GusakovAV,MarkovAV,UstinovBB,SemenovaMV,SinitsynAP.2004.Specificxyloglucanasesasanewclassofpolysaccharide-degradingenzymes.BiochimicaetBiophysicaActa-GeneralSubjects,1674:268-281)。3、最適作用pH值分別配制含0.5％羅望子木葡聚糖的pH分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0、8.5、9.0、9.5、10、10.5的緩沖液，其中pH3.0-7.0使用0.1M的檸檬酸-0.2M磷酸氫二鈉緩沖液，pH6.0-8.0使用0.1M的Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液，pH7.0-9.0使用0.1M的Tris-HCl緩沖液，pH8.5-10.0使用0.1M的Glycine-NaOH緩沖液。在37℃下,按前述方法測定不同pH值對純化的RCOPoXEG12A內(nèi)切木葡聚糖酶活力的影響。設(shè)測定的最高酶活力為100％，其它pH值的酶活力與最高酶活力的比值折算為相對酶活力；以pH值為x軸，以相對酶活力為y軸作圖，結(jié)果見圖12。結(jié)果表明，內(nèi)切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A在pH4.5-5.5有較高酶活力，最適作用pH值為pH5.0。4、最適作用溫度用pH5.0的0.1M的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液配置0.5％的木葡聚糖溶液，按照前述測定內(nèi)切木葡聚糖酶活力的方法分別測定純化的RCOPOXEG12A在30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃，和70℃下的木葡聚糖酶活力。設(shè)最適溫度下的酶活力為100％，其它溫度下的酶活力折算為相對酶活力。以溫度為x軸，相對酶活力為y軸作圖，結(jié)果見圖13。結(jié)果表明，內(nèi)切木葡聚糖酶的RCOPoXEG12A的最適作用溫度為60℃。5、pH穩(wěn)定性將純化的內(nèi)切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A進行pH穩(wěn)定性檢測，分別采用0.1M檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(pH3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)，0.1M磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)，0.1MTris-HCl緩沖液(pH7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)，0.1M甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH8.5、9.0、9.5、10.0)，參照Eckert和Schneider所描述的方法(EckertK,SchneiderE.2003.Athermoacidophilicendoglucanase(CelB)fromAlicyclobacillusacidocaldariusdisplayshighsequencesimilaritytoarabinofuranosidasesbelongingtofamily51ofglycosidehydrolases.EuropeanJournalofBiochemistry,270:3593-3602)，將酶保存于不同pH值的緩沖液中，于4℃放置24小時后，在pH5.0、60℃條件下測定不同pH緩沖液中的殘余酶活力。以不做如上處理的保存酶液的酶活力為100％，不同pH值保存液的酶活力折算為相對酶活力。以pH值為x軸，相對酶活力為y軸作圖，結(jié)果見圖14。結(jié)果表明，在pH3.5-7.0之間，RCOPoXEG12A的pH耐受性最好，相對酶活力均在90％以上。6、溫度耐受性將純化的內(nèi)切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A進行溫度耐受性檢測，分別采用不同的保存溫度(30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、和60℃)，參照Inoue等所描述的方法(InoueT,MoriyaS,OhkumaM,KudoT.2005.Molecularcloningandcharacterizationofacellulasegenefromasymbioticprotistofthelowertermite,Coptotermesformosanus.Gene,349:67-75)，將酶在上述溫度的水浴鍋中保溫1個小時，之后在最適pH值(pH5.0)和最適溫度(60℃)下測定酶活力。以不做如上處理的酶液的酶活力為100％，不同溫度保溫后的殘余酶活力折算為相對酶活力。以溫度為x軸，相對酶活力為y軸作圖，結(jié)果見圖15。結(jié)果表明RCOPoXEG12A在低于45℃的條件下穩(wěn)定。7、RCOPoXEG12A的酶反應(yīng)動力學(xué)常數(shù)Km、Vmax的測定分別配置0.25，0.5，0.75，1，2，3,4,5,6,7,8,9,10g/L的木葡聚糖溶液，按照本研究中測定內(nèi)切木葡聚糖酶活力的反應(yīng)體系，在RCOPoXEG12A的最適作用條件(pH5.0、60℃)和相同酶蛋白質(zhì)濃度(0.009706μg/μL)下，測定RCOPoXEG12A以上述不同濃度木葡聚糖溶液為底物的酶活力。圖16A為木葡聚糖濃度對反應(yīng)速度的影響曲線，可以看出當(dāng)木葡聚糖濃度從0.25g/L增加到3g/L時，酶的反應(yīng)速度隨底物濃度的增加而增加；當(dāng)木葡聚糖濃度從3g/L增加到10g/L時，酶的反應(yīng)速度除了剛開始還能有所增加之外，后來就漸漸趨于恒定。底物濃度和反應(yīng)速度的雙倒數(shù)圖見圖16B，根據(jù)雙倒數(shù)作圖得出的方程來計算得到RCOPoXEG12A的Km值為2.79mg/ml，Vmax為275.63U/mg。8、金屬離子、EDTA與變性劑對RCOPoXEG12A酶活性的影響分別將一定量的一定濃度的金屬離子、EDTA與變性劑加入到一定量的pH5.0的0.5％木葡聚糖底物中，混合均勻，使金屬離子、變性劑與EDTA在反應(yīng)體系中的終濃度為5mM，在RCOPoXEG12A的最適作用條件(pH5.0、60℃)下，測定RCOPoXEG12A以木葡聚糖為底物的酶活力。以不加任何添加劑的反應(yīng)體系為對照，測得比酶活力為172.26±0.01U/mg，設(shè)定該酶活力為100％，計算加入添加劑金屬離子、變性劑與EDTA后折算為RCOPoXEG12A的相對酶活力。結(jié)果見表2。發(fā)現(xiàn)Cr3+、Fe2+、Ni2+和DTT對RCOPoXEG12A的酶活力有增強作用。表2.金屬離子和試劑對內(nèi)切木葡聚糖酶RCOPoXEG12A酶活力的影響當(dāng)前第1頁1 2 3