本發(fā)明涉及血清/血漿微小RNA(microRNA，簡(jiǎn)稱miRNA)的應(yīng)用，具體涉及檢測(cè)輕度認(rèn)知障礙患者血清/血漿微小RNA標(biāo)志物及其應(yīng)用，屬生物技術(shù)和神經(jīng)認(rèn)知技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
阿爾茨海默病(Alzheimer’sdisease，AD)是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的神經(jīng)退行性疾病。輕度認(rèn)知障礙(Mildcognitiveimpairment，MCI)是介于阿爾茨海默病與正常老齡化之間的一種過(guò)渡狀態(tài)。研究提示有23％的輕度認(rèn)知障礙患者在2年內(nèi)，50％患者在4年內(nèi)進(jìn)展為阿爾茨海默病，故輕度認(rèn)知障礙被認(rèn)為是阿爾茨海默病早期干預(yù)治療的最適階段。隨著全球人口的老齡化，輕度認(rèn)知障礙患病率逐年增加，給社會(huì)帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)。因此，如何在疾病的早期甚至體檢中發(fā)現(xiàn)輕度認(rèn)知障礙患者，及早治療是防治這些疾病的關(guān)鍵問(wèn)題。目前有關(guān)輕度認(rèn)知障礙檢測(cè)方法包括:應(yīng)用神經(jīng)心理學(xué)測(cè)試(對(duì)綜合認(rèn)知功能進(jìn)行評(píng)估)、神經(jīng)影像學(xué)(結(jié)構(gòu)和功能)、腦脊液生物學(xué)標(biāo)志等,單獨(dú)或者相互結(jié)合進(jìn)行研究,可能有助于診斷輕度認(rèn)知障礙，但這些方法在診斷上都有一定的缺陷。神經(jīng)心理學(xué)測(cè)試收到測(cè)試者和受試者主觀因素的影響以，測(cè)試結(jié)果往往有較大的不確定性和局限性。由于輕度認(rèn)知障礙是阿爾茨海默病的臨床前階段，在神經(jīng)影像學(xué)檢查中可能并未發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能的改變或者人為經(jīng)驗(yàn)不足等都會(huì)導(dǎo)致誤診或漏診。盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些腦脊液標(biāo)志物(如Aβ1-42、T-tau、P-tau等)(Alexopoulosetal.,2013)，但由于腦脊液標(biāo)本采集有一定的創(chuàng)傷性,因此,臨床應(yīng)用中必須要嚴(yán)格掌握其適應(yīng)證和禁忌證，此外，腦脊液檢查對(duì)輕度認(rèn)知障礙診斷的敏感性和特異性均有限。因此，尋找新的特異性高和敏感性好的輕度認(rèn)知障礙標(biāo)志物越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外的重視。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供檢測(cè)輕度認(rèn)知障礙患者血清/血漿微小RNA標(biāo)志物及其應(yīng)用。本發(fā)明的目的在于檢測(cè)輕度認(rèn)知障礙患者血清/血漿miRNA標(biāo)志物，為臨床上輕度認(rèn)知障礙患者的早期發(fā)現(xiàn)、早期治療及干預(yù)提供支持。為解決上述技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的技術(shù)方案為：檢測(cè)輕度認(rèn)知障礙患者血清/血漿微小RNA的標(biāo)志物，其特征在于，所述標(biāo)志物為miR-206和miRNA-132的任意一種或者兩者組合，所述miR-206序列為SEQIDNO:1所示，所述miR-132序列為SEQIDNO:2所示，其中，SEQIDNO:1UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGGSEQIDNO:2UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG所述標(biāo)志物應(yīng)用于診斷輕度認(rèn)知障礙患者。所述標(biāo)志物應(yīng)用于制備診斷輕度認(rèn)知障礙患者的試劑盒。所述試劑盒中含有SEQIDNO:3所示的miR-206的RT引物、SEQIDNO:4所示的miR-206的F端引物、SEQIDNO:5所示的miR-132的RT引物、SEQIDNO:6所示的miR-132的F端引物，其中各端引物序列如下：SEQIDNO:3GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCACACSEQIDNO:4TGGAATGTAAGGAAGTGTGTGGSEQIDNO:5GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGACCASEQIDNO:6TAACAGTCTACAGCCATGGTCG所述的檢測(cè)輕度認(rèn)知障礙患者血清/血漿微小RNA標(biāo)志物的應(yīng)用，通過(guò)檢測(cè)被試者的血清/血漿miR-206和/或miRNA-132的含量，并與認(rèn)知正常者的含量相比來(lái)診斷輕度認(rèn)知障礙，所述miR-206的診斷臨界值lg(2-△Ct)為-1.15，所述miRNA-132的診斷臨界值lg(2-△Ct)為-2.05，miR-206和miRNA-132的聯(lián)合診斷的診斷臨界值lg(2-△Ct)為1.52。所述的檢測(cè)輕度認(rèn)知障礙患者血清/血漿微小RNA標(biāo)志物的應(yīng)用，采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)被測(cè)試者的血清/血漿miR-206和/或miRNA-132含量。MicroRNAs(miRNAs)為非編碼小RNA，長(zhǎng)度為19-24bp。成熟的miRNAs主要通過(guò)識(shí)別靶mRNA的3′-UTR并與之結(jié)合，抑制靶mRNA的翻譯或?qū)е掳衜RNA降解從而發(fā)揮基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)功能。miRNAs調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、分化及凋亡的各個(gè)環(huán)節(jié),并與生理狀態(tài)的改變以及疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。近年來(lái),miRNA已成為分子生物學(xué)、遺傳學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。miRNAs是小分子，易于通過(guò)血腦屏障，比腦脊液、腦組織中檢測(cè)更具有可行性，所以異常表達(dá)的miRNAs可以作為診斷學(xué)指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，血清/血漿miRNA非常穩(wěn)定，反復(fù)凍融、不同酸堿環(huán)境、高溫、長(zhǎng)期保存等條件下，血清/血漿miRNA含量變化不大，而此時(shí)大多數(shù)RNA都會(huì)降解。這就為血清miRNA作為生物標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)提供了可能。血清/血漿miRNA檢測(cè)靈敏度高、創(chuàng)傷性小、可重復(fù)性好、費(fèi)用低、操作簡(jiǎn)單，聯(lián)合檢測(cè)特定miRNA表達(dá)譜的改變將有助于多種疾病的早期診斷，也利于連續(xù)動(dòng)態(tài)檢測(cè)和人群的大規(guī)模篩查。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比顯著的優(yōu)點(diǎn)是：本次發(fā)明首次將AD模型鼠(SAMP8)海馬組織miRNA芯片表達(dá)譜與血清/血漿miRNA的表達(dá)聯(lián)合運(yùn)用，以此篩選出的miRNA標(biāo)志物更具有認(rèn)知損傷特異性，診斷輕度認(rèn)知障礙操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，適用于大規(guī)模篩查。附圖說(shuō)明圖1是miR-206在66例輕度認(rèn)知障礙患者和76例認(rèn)知正常者血清/血漿中的表達(dá)水平；圖2是miR-132在66例輕度認(rèn)知障礙患者和76例認(rèn)知正常者血清/血漿中的表達(dá)水平；圖3是miR-193b在66例輕度認(rèn)知障礙患者和76例認(rèn)知正常者血清/血漿中的表達(dá)水平；圖4是miR-130b在66例輕度認(rèn)知障礙患者和76例認(rèn)知正常者血清/血漿中的表達(dá)水平；圖5是miR-20a在66例輕度認(rèn)知障礙患者和76例認(rèn)知正常者血清/血漿中的表達(dá)水平；圖6是miR-296在66例輕度認(rèn)知障礙患者和76例認(rèn)知正常者血清/血漿中的表達(dá)水平；圖7是miR-329在66例輕度認(rèn)知障礙患者和76例認(rèn)知正常者血清/血漿中的表達(dá)水平；圖8是miR-206、miR-132以及miR-206和miR-132結(jié)合對(duì)輕度認(rèn)知障礙的診斷價(jià)值；圖9是miR-206水平與輕度認(rèn)知障礙患者認(rèn)知功能的相關(guān)性分析；圖10是miR-132水平與輕度認(rèn)知障礙患者認(rèn)知功能的相關(guān)性分析。。具體實(shí)施方式以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過(guò)程，但本發(fā)明的包含范圍不限于下述的實(shí)施例。下面的實(shí)施例中未注明的條件和方法等均按照常規(guī)或者制造商采用的條件進(jìn)行。本發(fā)明的技術(shù)方案為：檢測(cè)輕度認(rèn)知障礙患者血清/血漿微小RNA的標(biāo)志物，其特征在于，所述標(biāo)志物為miR-206和miRNA-132的任意一種或者兩者組合，所述miR-206序列為SEQIDNO:1所示，所述miR-132序列為SEQIDNO:2所示，其中，SEQIDNO:1UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGGSEQIDNO:2UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG所述標(biāo)志物應(yīng)用于診斷輕度認(rèn)知障礙患者。所述標(biāo)志物應(yīng)用于制備診斷輕度認(rèn)知障礙患者的試劑盒。所述試劑盒中含有SEQIDNO:3所示的miR-206的RT引物、SEQIDNO:4所示的miR-206的F端引物、SEQIDNO:5所示的miR-132的RT引物、SEQIDNO:6所示的miR-132的F端引物，其中各端引物序列如下：SEQIDNO:3GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCACACSEQIDNO:4TGGAATGTAAGGAAGTGTGTGGSEQIDNO:5GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGACCASEQIDNO:6TAACAGTCTACAGCCATGGTCG所述的檢測(cè)輕度認(rèn)知障礙患者血清/血漿微小RNA標(biāo)志物的應(yīng)用，通過(guò)檢測(cè)被試者的血清/血漿miR-206和/或miRNA-132的含量，并與認(rèn)知正常者的含量相比來(lái)診斷輕度認(rèn)知障礙，所述miR-206的診斷臨界值lg(2-△Ct)為-1.15，所述miRNA-132的診斷臨界值lg(2-△Ct)為-2.05，miR-206和miRNA-132的聯(lián)合診斷的診斷臨界值lg(2-△Ct)為1.52。所述的檢測(cè)輕度認(rèn)知障礙患者血清/血漿微小RNA標(biāo)志物的應(yīng)用，采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法檢測(cè)被測(cè)試者的血清/血漿miR-206和/或miRNA-132含量。實(shí)施例1：檢測(cè)幾種miRNAs在輕度認(rèn)知障礙患者和認(rèn)知正常者血清/血漿中的表達(dá)水平。1.篩選與輕度認(rèn)知障礙相關(guān)的miRNA。快速老化鼠P8(SAMP8鼠)海馬組織miRNA表達(dá)譜的檢測(cè)將SAMP8鼠海馬神經(jīng)元隨機(jī)分為2組：(1)正常對(duì)照組；(2)過(guò)氧化氫(H2O2)刺激組：200μM的H2O2刺激海馬神經(jīng)元6h。提取海馬神經(jīng)元中的總RNA:應(yīng)用總RNA提取試劑盒(MiRNeasyMiniKit，Qiagen，德國(guó))提取總RNA。采用AffymetrixmiRNA基因表達(dá)譜芯片GeneChipmiRNA2.0Array進(jìn)行雜交。PartekGenomicSuite軟件處理得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，檢測(cè)海馬神經(jīng)元miRNA的表達(dá)譜。篩選出H2O2刺激組和正常對(duì)照組海馬神經(jīng)元差異表達(dá)的miRNA。選取差異表達(dá)上調(diào)的7個(gè)miRNAs,在輕度認(rèn)知障礙患者和認(rèn)知正常者的血清/血漿中進(jìn)行檢測(cè)。2.輕度認(rèn)知障礙患者和認(rèn)知正常者血清/血漿總RNA的提取。研究對(duì)象的收集：主要以60歲以上的輕度認(rèn)知障礙患者和健康對(duì)照者為研究對(duì)象。研究對(duì)象主要來(lái)先前研究中的輕度認(rèn)知障礙基線調(diào)查庫(kù)，所有研究對(duì)象均由至少2名以上經(jīng)驗(yàn)豐富的神經(jīng)科醫(yī)生進(jìn)行臨床診斷及評(píng)估。診斷依據(jù)Petersen診斷標(biāo)準(zhǔn)(PetersenRCetal.ArchNeurol.1999)。健康對(duì)照者則經(jīng)過(guò)認(rèn)知功能檢查正常并排除神經(jīng)系統(tǒng)疾病和精神疾病。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合輕度認(rèn)知障礙的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②所有研究對(duì)象均為中國(guó)漢族人群；③基線調(diào)查具備完整的人口學(xué)資料和臨床資料。排除標(biāo)準(zhǔn)：①排除嚴(yán)重軀體疾?。虎谂懦R床抑郁癥狀和嚴(yán)重精神疾??；③排除其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病；④排除腦器質(zhì)性疾病和腦外傷。血液樣本的收集：經(jīng)所有研究對(duì)象的知情同意后，空腹抽取5ml靜脈血，EDTA抗凝，離心后，將血細(xì)胞于-80℃進(jìn)行保存，建立完善的血液樣本庫(kù)和對(duì)應(yīng)的臨床資料庫(kù)。血清/血漿總RNA的提?。翰捎醚?血漿總RNA提取試劑盒(miRNeasySerum/Plasma試劑盒，Qiagen,德國(guó))，從輕度認(rèn)知障礙患者和認(rèn)知正常者的血清/血漿中提取總RNA。取100μL血清/血漿樣本加入500μLQIAzolLysisReagent裂解液。RNA提取參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。以miR-39為外源性內(nèi)參(miRNeasySerum/PlasmaSpike-InControl試劑盒，Qiagen,德國(guó))3.檢測(cè)血清/血漿中miRNAs的表達(dá)水平。將血清/血漿提取的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄：采用RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(miScriptIIRT試劑盒,Qiagen,德國(guó))，反應(yīng)體系為20μl：5×miScriptHiSpecbuffer(4μl),10×miScriptNucleicsmix(2μl),miScriptReversetranscriptionmix(2μl),RNase-free水(2μl),和RNA模板(10μl)。反應(yīng)條件為：37℃for60min，95℃for5min。實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-timePCR)檢測(cè)血清/血漿中miRNAs的表達(dá)水平:采用SYBRGreen染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，反應(yīng)體系為25μl：2×QuantiTectSYBRGreenPCRMastermix(12.5μl),10×miScriptUniversalprimer(2.5μl),10×miScriptPrimerAssay(2.5μl),RNase-free水(5.5μl),cDNA模板(2μl)。每個(gè)miRNA檢測(cè)實(shí)驗(yàn)實(shí)施3平行，以cel-miR-39為內(nèi)參。使用ABI7500Fast型熒光定量PCR儀(ABI,美國(guó))，反應(yīng)條件為：94℃反應(yīng)15s,55℃反應(yīng)30s,70℃反應(yīng)34s，40個(gè)循環(huán)，添加熔解曲線。4.分析幾種miRNAs在輕度認(rèn)知障礙患者和認(rèn)知正常者血清/血漿中的表達(dá)水平。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)累積實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析的方法。Ct值是指每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。待測(cè)miRNA起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小，反之越大。在目的miRNA與內(nèi)參擴(kuò)增效率相同的情況下可以直接得到目的miRNA相對(duì)于內(nèi)參的定量△Ct＝Ct待測(cè)miRNA-Ctcel-miR-39。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS16.0軟件進(jìn)行分析。5.分析血清/血漿miR-206和miR-132及其聯(lián)合對(duì)輕度認(rèn)知障礙的診斷價(jià)值。利用GraphPad作圖軟件，繪制受試者工作特征曲線(ROC曲線)，計(jì)算ROC曲線下面積。評(píng)價(jià)miR-206和miR-132分別診斷輕度認(rèn)知障礙以及聯(lián)合診斷輕度認(rèn)知障礙的敏感性和特異性。ROC曲線下面積的取值范圍為0.5～1，當(dāng)ROC曲線下面積<0.5時(shí)，表示診斷無(wú)意義，ROC曲線下面積在0.5～0.7之間時(shí)診斷價(jià)值較低，在0.7～0.9之間時(shí)診斷價(jià)值中等，在0.9以上時(shí)診斷價(jià)值較高。結(jié)果如下:表1.輕度認(rèn)知障礙患者和認(rèn)知正常者的基本信息表2.幾種miRNAs在輕度認(rèn)知障礙患者和認(rèn)知正常者血清/血漿中的表達(dá)情況。alg(2-△Ct)＝lg[2-(Ct待測(cè)miRNA-Ctcel-miR-39)]經(jīng)篩選得出miR-206和miR-132在輕度認(rèn)知障礙患者血清/血漿中表達(dá)顯著高于認(rèn)知正常者。miR-206序列為SEQIDNO:1所示，所述miR-132序列為SEQIDNO:2所示，其中，SEQIDNO:1UGGAAUGUAAGGAAGUGUGUGGSEQIDNO:2UAACAGUCUACAGCCAUGGUCG檢測(cè)輕度認(rèn)知障礙患者和認(rèn)知正常者血清/血漿miR-206的RT引物、miR-132的RT引物、miR-206的F端引物和miR-132的F端引物如SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示，其中各端引物序列如下：SEQIDNO:3GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCACACSEQIDNO:4TGGAATGTAAGGAAGTGTGTGGSEQIDNO:5GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGACCASEQIDNO:6TAACAGTCTACAGCCATGGTCG圖1顯示miR-206在輕度認(rèn)知障礙患者血清/血漿中表達(dá)顯著高于認(rèn)知正常者P<0.001。圖2顯示miR-132在輕度認(rèn)知障礙患者血清/血漿中表達(dá)顯著高于認(rèn)知正常者P<0.001。miR-193b(P＝0.051)(圖3),miR-130b(P＝0.161)(圖4),miR-20a(P＝0.064)(圖5),miR-296(P＝0.616)(圖6),andmiR-329(P＝0.631)(圖7)在兩組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。miR-206和miR-132對(duì)輕度認(rèn)知障礙的診斷價(jià)值圖8顯示miR-206、miR-132以及miR-206和miR-132聯(lián)合對(duì)輕度認(rèn)知障礙的診斷價(jià)值。表3.受試者工作特征曲線分析結(jié)果表中顯示miRNA-206的ROC曲線下面積為0.880(95％CI：0.815-0.928)，靈敏度為86.4％，特異度為76.3％，臨界值為-1.15，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為76％，陰性預(yù)測(cè)值為86.6％，約登指數(shù)為0.627；miRNA-132的ROC曲線下面積為0.912(95％CI：0.853-0.953)，靈敏度為69.7％，特異度為100.0％，臨界值為-2.05，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為100％，陰性預(yù)測(cè)值為79.2％，約登指數(shù)為0.697。miR-206和miR-132聯(lián)合對(duì)輕度認(rèn)知障礙的診斷價(jià)值利用logistic回歸模型預(yù)測(cè)miR-206和miR-132聯(lián)合對(duì)輕度認(rèn)知障礙的診斷價(jià)值。根據(jù)miR-206和miR-132△Ct值建立回歸方程logit＝10.999+(2.345×expressionlevelofmiR-206)+(4.511×expressionlevelofmiR-132)。miR-206和miR-132聯(lián)合的ROC曲線下面積為0.981(95％CI：0.942-0.996)，靈敏度為85.5％，特異度為98.5％，臨界值為1.52，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為85.5％，陰性預(yù)測(cè)值為98.5％，約登指數(shù)為0.840。miR-206和miR-132與輕度認(rèn)知障礙患者蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估(MoCA)得分的相關(guān)性分析圖9顯示miR-206水平與輕度認(rèn)知障礙患者認(rèn)知功能呈正相關(guān)性；圖10顯示miR-132水平與輕度認(rèn)知障礙患者認(rèn)知功能呈正相關(guān)性。綜上，miR-206和miR-132對(duì)輕度認(rèn)知障礙均具有一定的診斷價(jià)值，聯(lián)合診斷的效能、靈敏度、特異度明顯優(yōu)于單個(gè)miRNA。miR-206和miR-132聯(lián)合的AUC最大，靈敏度和特異度較高，診斷性能最高。由此，本次發(fā)明篩選出的miRNA標(biāo)志物更具有認(rèn)知損傷特異性，診斷輕度認(rèn)知障礙操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，適用于大規(guī)模篩查。