本發(fā)明涉及一種檢測方法，尤其是一種用半定量RT-PCR法檢測樹鼩黃嘌呤脫氫酶/氧化酶轉錄水平的方法，屬于分子生物技術領域。

背景技術：
黃嘌呤脫氫酶/氧化酶(xanthinedehydrogenase/oxidase，XDH/XO)是一種非特異性需氧脫氫酶,在嘌呤代謝過程中催化嘌呤代謝的最后兩步，從黃嘌呤和次黃嘌呤形成尿酸代謝產(chǎn)物終產(chǎn)物尿酸，在尿酸的代謝過程中發(fā)揮著重要的作用，是體內尿酸代謝中一種非常重要的酶。近年來隨著人們生活水平的提高,高尿酸血癥的發(fā)病率逐年升高,且常與高血壓、高脂血癥及糖尿病等伴隨出現(xiàn)。國內外文獻報道,高尿酸血癥與冠心病、高血壓、糖尿病、腦卒中等明顯相關,為其獨立危險因子和重要的預后預測因子。痛風及高尿酸血癥的研究正成為醫(yī)藥醫(yī)學界的熱點。無論是藥物的篩選,還是致病機制的研究,都需要選擇一種科學、合理的實驗動物來開展高尿酸血癥致病機理的研究及開發(fā)相關降血尿酸的藥物。樹鼩（Tupaiabelangeri，treeshrews）的分類地位介于靈長目與食蟲目之間，其進化程度高，新陳代謝和大體解剖比犬、大小鼠等動物更與人接近，解剖結構也更近似于人，因此其作為較理想的實驗動物在生物學研究中廣泛應用。為了利用親緣關系與人類接近的實驗動物——樹鼩開展高尿酸血癥致病機理的研究及開發(fā)相關降血尿酸的藥物，需要建立一種樹鼩黃嘌呤脫氫酶/氧化酶mRNA表達的相對定量方法，以研究藥物作用樹鼩體內黃嘌呤脫氫酶/氧化酶的轉錄水平變化，進而為研究黃嘌呤氧化酶功能及其影響因素打下基礎。半定量RT-PCR因其費用低、普通實驗室就能做到，而作為研究基因轉錄水平的有效手段,可用來檢測基因表達及其變化狀況。目前國內外還未見利用樹鼩進行黃嘌呤氧化酶/脫氫酶轉錄水平半定量方法的研究。

技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種用半定量RT-PCR法檢測樹鼩黃嘌呤脫氫酶/氧化酶基因轉錄水平的方法，以在轉錄水平上對樹鼩黃嘌呤脫氫酶/氧化酶基因進行半定量檢測。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過下列技術方案完成：以樣品總RNA反轉錄成的cDNA為模板，利用PCR引物組合進行PCR擴增，得到XDH/XO基因片段的擴增產(chǎn)物的灰度值與內參基因GAPDHPCR擴增產(chǎn)物的灰度值之比,根據(jù)所得灰度值之比即可計算出不同生理狀況下XDH/XOmRNA的相對表達值，并根據(jù)所計算的相對表達值的大小半定量檢測樹鼩黃嘌呤脫氫酶/氧化酶基因轉錄水平。本發(fā)明具體方案是：一種半定量RT-PCR法檢測樹鼩黃嘌呤脫氫酶/氧化酶轉錄水平的方法，其特征在于包括下列步驟：1）設計下列引物：樹鼩XDH/XO基因表達水平的特異性上、下游引物組合及對應的核苷酸序列為：XDH/XOF：5’-GTTGGAGGGAACATCATCACT-3’XDH/XOR：5’-GCAGGGTCTTTCTGTAGCCA-3’；作為內參基因的樹鼩GAPDH基因的特異性上、下游引物及對應的核苷酸序列為：GAPDHF：5’-CAAGAAGGTAGTGAAGCAGGC-3，GAPDHR5’-TGTTGAAGTCGGAGGAGACC-3’2）以樹鼩新鮮肝臟組織提取的總RNA為模板，按常規(guī)逆轉錄合成得樹鼩肝臟組織cDNA第一鏈；3）以步驟2）逆轉錄合成的樹鼩肝臟組織cDNA第一鏈為模板，以步驟1）中的XDH/XOF和XDH/XOR以及GAPDHF和GAPDHR為特異性引物，分別在下列PCR擴增體系下：25μL體系，PremixTaq12.5μL，10μmol/L正向、反向引物各1μL，cDNA模板2μL，8.5μL去離子水，進行下列PCR擴增：94℃預變性5min，98℃變性10S，58℃退火30S，72℃延伸1min，共35個循環(huán)，72℃延伸10min，分別得到XDH/XO和GAPDH的擴增產(chǎn)物；4）將步驟3）的XDH/XO和GAPDH的擴增產(chǎn)物按常規(guī)分別經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別獲得與所設計的目的基因大小相一致的目的基因片段，并在凝膠影像分析儀上分別獲得基因條帶圖像，用Quantityone軟件對所獲基因條帶進行灰度分析，以分別得到XDH/XO基因條帶灰度值和GAPDH基因條帶灰度值；5）根據(jù)步驟4）得到XDH/XO基因條帶灰度值和GAPDH基因條帶灰度值之比，計算出XDH/XOmRNA相對表達值，以根據(jù)該相對表達值的大小即可判定樹鼩黃嘌呤脫氫酶/氧化酶基因轉錄水平的變化情況。所述步驟4）中的與所設計的目的基因大小相一致的產(chǎn)物為：XDH/XO基因的PCR產(chǎn)物大小為150bp，GAPDH基因的PCR大小為100bp，瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2所示。所述步驟3）獲得的PCR擴增產(chǎn)物分別經(jīng)過下列驗證：1）通過商業(yè)生物公司測序分別得到：XDH/XO基因片段擴增序列為：GACTCATCCTGTGTTCATGGCGAGTGTGGCCAAGCTGACCCTCGTGTCCAGAGGCACCAGGAGAACTGTTCGAATGGATCACACCTTCTTCCCTGGCTACAGAAAGACCCTGCA樹鼩內參基因GAPDH片段擴增序列為：AAAGAATTGAGCATCAGGCATCCTGGGCTACACTGAGCACCAGGTGGTCTCCTCCGACTTCAACAA；2）再將上述測序所得核苷酸序列分別通過DNAMAN軟件與NCBI所報道的人及獼猴的XDH/XO基因及GAPDH基因的核苷酸序列進行同源性比對，結果顯示：本發(fā)明引物所擴增的樹鼩肝臟組織中XDH/XO基因與人類的同源性為87.04%，GAPDH與獼猴的同源性為77.3%，說明所擴增出的目的片段分別為樹鼩XDH/XO基因片段及GAPDH基因。本發(fā)明所要解決的技術難點是：樹鼩作為一種新型實驗動物，國內外有關XDH/XO基因序列及GAPDH基因序列未見報道，本發(fā)明以NCBI基因庫中人類的XDH/XO和獼猴（macacamulatta）GAPDH核苷酸序列作為參考,用Primerpremier5.0軟件設計多對引物，經(jīng)過RT-PCR擴增,根據(jù)引物的特點摸索PCR擴增的最佳退火溫度，篩選出上述所述的檢測樹鼩XDH/XO基因表達的特異性上、下游引物組合及PCR擴增條件，獲得了特異的XDH/XO基因片段及內參基因GAPDH片段，并通過對所獲得的的特異的XDH/XO基因片段及內參基因GAPDH片段的測序及序列分析，進一步證實了所提供的PCR引物組合的特異性，可應用于RT-PCR法半定量檢測樹鼩黃嘌呤脫氫酶/氧化酶基因轉錄水平。本發(fā)明具有下列優(yōu)點和效果：1）采用上述方案，可在普通實驗室就能容易地進行樹鼩黃嘌呤脫氫酶/氧化酶基因轉錄，并在轉錄水平上對樹鼩黃嘌呤脫氫酶/氧化酶基因進行半定量檢測。2）本發(fā)明所公開的引物是通過本領域技術人員公知的化學合成方法進行DNA合成后得到的，用該引物序列可實現(xiàn)樹鼩XDH/XO基因及內參基因GAPDH的特異性擴增，對材料中非目的基因沒有擴增信號，通過本發(fā)明的引物，可對樹鼩黃嘌呤脫氫酶/氧化酶基因轉錄水平的變化狀況實施半定量檢測，方法簡單，可重復性高，檢測成本低。并且，本發(fā)明的引物特異性強，不會受到其他基因的干擾，為研究樹鼩黃嘌呤脫氫酶/氧化酶基因的功能及影響因素提供了有效的工具。附圖說明圖1為RNA完整性測定的瓊脂糖電泳圖；圖2為XDH/XO和GAPDH基因擴增瓊脂糖電泳圖；圖3為ALLO對OA所致的高尿酸血癥樹鼩肝組織中XDH/XOmRNA表達水平的影響的瓊脂糖電泳圖；圖4為ALLO對OA所致的高尿酸血癥樹鼩肝組織中XDH/XOmRNA表達水平的影響。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所使用的材料試劑等，如無特殊說明，均為商業(yè)途徑得到。1、本實施例中所使用的實驗動物：中緬樹鼩滇西亞種，普通級別飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20℃～25℃，濕度40%～70%，正常飼喂，自由飲水。體重為110-150g，1～3歲齡，雌雄各半，常規(guī)統(tǒng)一的蒸糕飼料飼喂。2、各種溶液配制1%羧甲基纖維素鈉（縮寫為1%CMC-Na）的配制：稱取3gCMC-Na（昆明誠悅科技公司生產(chǎn)），放入500ml的錐形瓶中，緩慢加入100ml煮沸的滅菌蒸餾水膨脹，再緩慢加100ml滅菌蒸餾水于電爐上煮沸溶解，最后加煮沸的滅菌蒸餾水至300ml溶解定容即可，常溫保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。不同濃度氧嗪酸鉀（oxonicacidpotassiumsalt），縮寫為OA溶液、不同濃度的別嘌醇(allopurinol)，縮寫為ALLO溶液的配制，按10ml/kg體積，以達到每次每只動物腹腔注射體積控制在1-2ml左右，便于動物較好地吸收。按照10mg/ml、5mg/ml不同濃度分別進行OA溶液配制，OA選用Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品，Lot#STBC64180，純度≥97%。配制方法：電子天平準確稱取OA150mg、15mg于15ml離心管內，加入15ml1％CMC-Na溶液，用玻璃棒攪拌，配成10mg/ml、5mg/ml的OA混懸溶液即可，現(xiàn)配現(xiàn)用。使用時分別按動物的公斤體重計算所需濃度體積。使用時分別按動物的公斤體重計算選擇相應濃度混懸液計算所需濃度體積，如樹鼩重量為100g，注射劑量為100mg/kg，則選擇相應濃度10mg/mL混懸液1mL腹腔注射。按照3mg/mL、2mg/mL和0.4mg/mL不同濃度分別進行ALLO的配制，ALLO選用南京都萊生物有限公司產(chǎn)品，純度≥98%，配制方法：電子天平準確稱取ALLO45mg、30mg和6mg分別于單獨的15mL離心管內，均加入15mL1％CMC-Na溶液，用玻璃棒攪拌，配成3mg/mL、2mg/mL和0.4mg/mL的ALLO混懸溶液即可，現(xiàn)配現(xiàn)用。使用時分別按動物的公斤體重計算選擇相應濃度混懸液計算所需濃度體積，如樹鼩重量為100g，注射劑量為30mg/kg，則選擇相應濃度3mg/mL混懸液1mL腹腔注射。3、儀器與耗材Sigma高速冷凍離心機，Sartoyius公司精密電子天平ME235S；美國bio-rad公司凝膠成像分析系統(tǒng)；美國bio-rad公司PCR儀：；美國bio-rad公司PowerPacBasic電泳儀；日本Tomy公司SS-325高壓蒸氣滅菌箱；美國DanoDrop公司ND-1000紫外分光光度計。1000ul、200ul、20ul、10ul、2ul的Gilson移液槍；2mlEP管、500ulEP管；1000ul吸頭、200ul吸頭、10ul吸頭。4、實驗動物的分組選取正常樹鼩30只，♀16只，♂14只，體重120.6±10.6g，隨機分為下列5組，每組6只，分別為：OA組、OA+ALLO1組、OA+ALLO2組、ALLO組、對照組。腹腔注射，注射方法為：0小時對OA組、OA+ALLO1組和OAOA+ALLO2組注射OA80mg/kg，對ALLO組注射ALLO4mg/kg，對照組注射同等體積的1%CMC-Na；0.5小時后對OA+ALLO1組動物注射ALLO4mg/kg、對OA+ALLO2組動物注射ALLO30mg/kg。5、實驗方法5.1樹鼩新鮮肝臟組織的活體手術取樣給藥后2h分別取上述組別每組動物的新鮮肝臟組織各0.1g，迅速放入液氮中保存，供下一步實驗用。5.2肝臟組織總RNA的提取按美國invitrogen公司生產(chǎn)的Trizol試劑盒說明書提取。將各組所獲得的新鮮肝臟組織分別放入預冷的研缽中，邊加液氮邊研磨，直至使肝組織成白色粉末，分別加入1ml的Trizol試劑充分裂解，10min后充分研磨，直至使其成為澄清液體，分別將液體轉移至對應的1.5ml的EP管內，靜止5min，4℃，13500r/m離心5min，取上清液加等體積氯仿，上下振搖20次后靜置10min，4℃，13500r/m離心30min后轉移水相；分別加入等體積的預冷異丙醇上下振搖20次，然后靜置20min，再離心20min，傾去上層液體，此時可見每個管底有少量的白色沉淀為RNA，加入1ml75%乙醇洗脫后，在4℃13500r/m離心5min，傾去上層液體，于室溫干燥，待大部分乙醇揮干后，加入30ulDEPC水溶解，分別得到各提取的總RNA樣品，并做好標記放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.3RNA濃度測定及純度分析將5.2步驟所提取的總RNA樣品分別經(jīng)Nanodrop-1000超微量核酸測定儀測定，以確定反轉錄時所需的添加量，各組樣品的A260/A280nm值均介于1.8～2.0之間，說明純度較高。5.4RNA完整性檢測隨機取二管5.2步驟所提取的總RNA樣品2ul進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳（120V400mA）20min,在凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察28S、18S和5SRNA條帶亮度，分析RNA的完整性。結果可觀察到28S、18S、5S三條帶，見圖1，說明所提取的總RNA無降解且完整性好，可進一步用于后續(xù)實驗。5.5RNA的逆轉錄按Roche公司TranscriptorFirstStrandcDNA說明書（04897030001）逆轉錄；具體步驟如下：分別取5.2步驟所提取的總RNA樣品，分別用DEPC水稀釋至1000ng/ul，按Roche第一鏈cDNA合成試劑盒TranscriptorFirstStrandcDNASynthesisKit說明書操作，如表1所示；分別使每個樣品總體積為13μl，在65°C條件下加熱反應管10min使模板-引物混合物變性，之后立即將反應管置于冰上冷卻。在每個含有模板-引物混合物的試管中分別加入表2中其余的RT反應液組分；每個樣品的最終體積為20μl，在每個反應管中將試劑小心混勻，最后在PCR儀內反應，其程序如下：25°C10min，55°C30min，85°C5min，4℃∞。將獲得的每個逆轉錄產(chǎn)物cDNA置于-30°C保存，備用。表1RNA逆轉錄第1步表2RNA逆轉錄第2步5.6引物設計及合成由于樹鼩作為一種新型實驗動物，國內外有關樹鼩XDH/XO基因序列未見報道，本發(fā)明以NCBI基因庫中人類的XDH/XO和獼猴（macacamulatta）GAPDH核苷酸序列作為參考,用Primerpremier5.0軟件設計引物,經(jīng)北京白泰克公司合成，GAPDH作為內參基因。5.7本實施例的樹鼩XDH/XO基因表達水平定量用引物序列及片段大小見表3。表3引物序列及片段大小5.8PCR擴增體系及退火溫度的確定按TaKaRa生物有限公司產(chǎn)品PCR試劑（PremixTaq?CodeNo.RR003A）分別進行XDH/XO基因及GAPDH基因的PCR擴增，PCR擴增體系如下：25μL體系，PremixTaq12.5μL，10μmol/L正向、反向引物各1μL，cDNA模板2μL，8.5μL去離子水，進行下列PCR擴增：94℃預變性5min，98℃變性10S，58℃退火30S，72℃延伸1min，共35個循環(huán)，72℃延伸10min，分別得到XDH/XO和GAPDH的擴增產(chǎn)物，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測結果見圖2。5.9PCR產(chǎn)物直接測序驗證XDH/XO擴增產(chǎn)物及GAPDH基因擴增產(chǎn)物送北京白泰克公司測序，測序結果如下：樹鼩XDH/XO基因片段擴增序列為：GACTCATCCTGTGTTCATGGCGAGTGTGGCCAAGCTGACCCTCGTGTCCAGAGGCACCAGGAGAACTGTTCGAATGGATCACACCTTCTTCCCTGGCTACAGAAAGACCCTGCA樹鼩內參基因GAPDH片段擴增序列為：AAAGAATTGAGCATCAGGCATCCTGGGCTACACTGAGCACCAGGTGGTCTCCTCCGACTTCAACAA5.10基因測序結果分析及驗證測序結果通過DNAMAN軟件對目的基因與內參基因核苷酸序列與NCBI報道的人類（GI1314286）及獼猴（NM_001195426）cDNA核苷酸序列的同源性進行比對分析，結果顯示得出樹鼩肝臟組織中XDH/XO基因與人類的同源性為87.04%，GAPDH與獼猴的同源性為77.3%。說明所擴增出的目的片段分別為樹鼩XDH/XO基因片段及GAPDH基因。5.11ALLO對氧氰酸鉀所致的高尿酸血癥樹鼩肝組織中XDH/XOmRNA表達水平的變化的半定量檢測以上各組所獲得的新鮮肝臟組織所提起的RNA，經(jīng)RT-PCR擴增后，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠影像分析儀上進行成像,并用Quantityone軟件對條帶進行灰度分析，計算出相對表達量。通過XDH/XO基因產(chǎn)物的灰度與GAPDHPCR產(chǎn)物的灰度之比,計算出不同組別XDH/XOmRNA的相對表達值。本實施例中的實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準誤（Mean±SD）表示，組間兩兩比較選用t-test等方法，應用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析。P<0.01時為極顯著差異，P<0.05時為顯著差異，P>0.05為無顯著差異。圖3顯示了ALLO對氧氰酸鉀所致的高尿酸血癥樹鼩肝組織中XDH/XOmRNA的表達的瓊脂糖電泳圖；如圖4和表4所示，OA組中XDH/XO的基因相對表達值最高，為6.19，與對照組比較具有統(tǒng)計學差異（P﹤0.01），其余組無統(tǒng)計學差異（P﹥0.05）。腹腔注射氧嗪酸鉀2h能顯著上調樹鼩肝臟組織中的XDH/XOmRNA表達水平，注射氧嗪酸鉀0.5h后，再腹腔注射別嘌醇1.5h后的樹鼩肝臟組織中的XDH/XOmRNA表達水平變化與對照組無差異，單獨注射別嘌醇2h后樹鼩肝臟組織中的XDH/XOmRNA表達水平變化與對照組無差異。提示樹鼩在高尿酸狀態(tài)下XDH/XOmRNA表達水平顯著增加。別嘌醇可致高尿酸狀態(tài)下XDH/XOmRNA下調，而不能下調正常樹鼩XDH/XOmRNA表達水平。表4：不同給藥組樹鼩肝組織中XDH/XOmRNA的表達注：±S，n=2.與對照組比較*P＜0.01。與OA組比較＃P＜0.01。6、半定量RT-PCR是目前研究基因轉錄水平的有效手段,因其費用低、普通實驗室容易做到而被經(jīng)常使用，可用來檢測基因表達及其變化狀況,但在實際實驗中為了提高半定量的準確性和可靠性應注意一下問題：在反轉錄和PCR時要控制樣品RNA和模板cDNA的量以提高測定值的可信度。7、RT-PCR法除了要求目的基因和內參因反轉錄和PCR條件完全一致外,相比較樣品之間最好同批進行RT-PCR,對于用凝膠掃描檢測PCR擴增產(chǎn)物來說,更適宜在同一塊凝膠上進行電泳分離，使比對背景一致；8、半定量RT-PCR檢測體系必須防止混在RNA中的基因組DNA帶來的假陽性。為排除可能的污染，在實驗中可同時設置兩個陰性對照，一是以mRNA為模板直接進行PCR反應，另一組不加任何模板，若含有基因組DNA，則會有條帶出現(xiàn)。序列表XDH/XO基因特異性上游引物：XDH/XOF：5’-GTTGGAGGGAACATCATCACT-3’XDH/XO基因特異性下游引物：XDH/XOR：5’-GCAGGGTCTTTCTGTAGCCA-3’內參基因GAPDH特異性上游引物：GAPDHF：5’-CAAGAAGGTAGTGAAGCAGGC-3內參基因GAPDH特異性上下游引物：GAPDHR：5’-TGTTGAAGTCGGAGGAGACC-3’所擴增的樹鼩XDH/XO基因片段的核苷酸序列：GACTCATCCTGTGTTCATGGCGAGTGTGGCCAAGCTGACCCTCGTGTCCAGAGGCACCAGGAGAACTGTTCGAATGGATCACACCTTCTTCCCTGGCTACAGAAAGACCCTGCA所擴增的樹鼩內參基因GAPDH片段的核苷酸序列：AAAGAATTGAGCATCAGGCATCCTGGGCTACACTGAGCACCAGGTGGTCTCCTCCGACTTCAACAA。序列表XDH/XO基因特異性上游引物：XDH/XOF：5’-GTTGGAGGGAACATCATCACT-3’XDH/XO基因特異性下游引物：XDH/XOR：5’-GCAGGGTCTTTCTGTAGCCA-3’內參基因GAPDH特異性上游引物：GAPDHF：5’-CAAGAAGGTAGTGAAGCAGGC-3內參基因GAPDH特異性上下游引物：GAPDHR：5’-TGTTGAAGTCGGAGGAGACC-3’所擴增的樹鼩XDH/XO基因片段的核苷酸序列：GACTCATCCTGTGTTCATGGCGAGTGTGGCCAAGCTGACCCTCGTGTCCAGAGGCACCAGGAGAACTGTTCGAATGGATCACACCTTCTTCCCTGGCTACAGAAAGACCCTGCA所擴增的樹鼩內參基因GAPDH片段的核苷酸序列：AAAGAATTGAGCATCAGGCATCCTGGGCTACACTGAGCACCAGGTGGTCTCCTCCGACTTCAACAA；