一種水稻根系伸長(zhǎng)控制基因OsKASI及編碼的蛋白質(zhì)技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及水稻生長(zhǎng)發(fā)育，具體涉及一種水稻根系伸長(zhǎng)控制基因OsKASI及編碼的蛋白質(zhì)。

背景技術(shù)：
水稻根系是水稻的重要組成部分，其不但是地上部的物理支撐，同時(shí)也是水稻從地下吸收營(yíng)養(yǎng)成分和水分的重要器官。水稻根系構(gòu)型為須根系，能不斷地從莖節(jié)最靠近中柱維管的分生區(qū)細(xì)胞發(fā)生不定根，最后由數(shù)量眾多的不定根及其側(cè)根構(gòu)成了它的根系結(jié)構(gòu)。根型由長(zhǎng)度、數(shù)量和空間范圍等幾個(gè)參數(shù)決定，研究發(fā)現(xiàn)根長(zhǎng)決定了其他根系性狀的遺傳表現(xiàn)，是所有根系性狀中最重要性狀，單株產(chǎn)量等7個(gè)地上部農(nóng)藝性狀與根長(zhǎng)呈極顯著正相關(guān)。根系伸長(zhǎng)的主要細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)之一是根尖分生組織的細(xì)胞分裂，根尖分生組織功能或結(jié)構(gòu)的缺陷會(huì)導(dǎo)致短根發(fā)生。根系的伸長(zhǎng)另外一個(gè)主要細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)是根尖伸長(zhǎng)區(qū)細(xì)胞的伸長(zhǎng)，這與細(xì)胞壁形成、纖維素的合成和微管組織形成等相關(guān)。盡管根長(zhǎng)對(duì)植物產(chǎn)量和抗性有重要的作用，但由于根系生長(zhǎng)在土壤里加大了研究的難度，使對(duì)根系伸長(zhǎng)的遺傳背景和分子機(jī)理所知甚少，使得在水稻育種與栽培上，根長(zhǎng)的因素并沒(méi)有被充分利用。因此，重點(diǎn)挖掘控制水稻根長(zhǎng)的基因，分離、克隆一系列控制根長(zhǎng)的基因便于定向改良水稻根系性狀，如授權(quán)公告號(hào)為CN102161985的發(fā)明專(zhuān)利，就公開(kāi)了與水稻根系生長(zhǎng)有關(guān)的基因KSR1,該基因KSRI及編碼的蛋白質(zhì)有些堿基和氨基酸發(fā)生突變，水稻根系表現(xiàn)為短根系。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種水稻根系伸長(zhǎng)控制基因OsKASI及編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白是β-酮酰-酰基載體蛋白合酶I，在氨基酸取代或缺失等情況下，能抑制水稻根系的伸長(zhǎng)，使水稻出現(xiàn)短根系現(xiàn)象，可以為水稻的根系改良和雜交育種或轉(zhuǎn)基因植物的開(kāi)發(fā)創(chuàng)造條件。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為：一種水稻根系伸長(zhǎng)控制基因OsKASI，該控制基因OsKASI的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示，所示的DNA序列中一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)錯(cuò)義突變。SEQIDNO：1序列由3387個(gè)堿基組成，自5端第88-90位為起始密碼子，編碼具有序列表中SEQIDNO：2所示的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)(命名為OsKASI)，該OsKASI由465個(gè)氨基酸殘基組成，為β-酮酰-?；d體蛋白合酶I，氨基酸序列中一個(gè)或幾個(gè)氨基酸錯(cuò)義突變。如所示的DNA序列中1511位的胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)取代，編碼的氨基酸序列的257位丙氨酸(Ala)突變?yōu)槔i氨酸(Val)，水稻根系表達(dá)為短根系。該OsKASI可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于一種水稻根系伸長(zhǎng)控制基因OsKASI及編碼的蛋白質(zhì)，該蛋白的編碼基因如序列表SEQIDNO：1所示的堿基序列，該蛋白的氨基酸序列如序列表SEQIDNO：2所示，是一個(gè)β-酮酰-?；d體蛋白合酶I，與根系伸長(zhǎng)相關(guān)；該堿基序列若發(fā)生突變，如1511位的胞嘧啶被胸腺嘧啶取代，編碼的氨基酸序列的257位丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸，這樣該蛋白就抑制根系的伸長(zhǎng)，具體在植株表現(xiàn)為主根、不定根和側(cè)根都變短。該蛋白及其編碼基因的應(yīng)用，可以為水稻的根系改良和雜交育種或轉(zhuǎn)基因植物的開(kāi)發(fā)創(chuàng)造條件。附圖說(shuō)明圖1是野生型(WT)和OskasI突變體正常水培8天的表型比較，其中a：8天苗齡的WT和OskasI突變體的全株照，bar＝2cm。b和c：WT和OskasI的主根在體視鏡下的觀測(cè)結(jié)果，bars＝0.5mm。d：WT根成熟區(qū)縱切；e：OskasI突變體根成熟區(qū)縱切，bars＝100μm；圖2是OsKASI基因的圖位克隆和基因結(jié)構(gòu)；其中a：OsKASI基因的精細(xì)定位結(jié)果，RM6734和RM253為定位所用到的SSR標(biāo)記，STS1、STS2和STS3為新發(fā)展的多態(tài)標(biāo)記，P0528E04代表BAC克隆，Rec代表重組子；b：OsKASI基因結(jié)構(gòu)和突變位點(diǎn)，非翻譯區(qū)和內(nèi)含子用實(shí)線表示，外顯子用實(shí)心方框表示，箭頭指示突變位點(diǎn)；圖3是功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)圖：野生型(WT)、OskasI突變體和兩株T2代轉(zhuǎn)基因回復(fù)株系(OV1和OV2)的表型圖；圖4是超表達(dá)轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1300改的結(jié)構(gòu)示意圖。具體實(shí)施方式以下結(jié)合附圖、實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。實(shí)施例1突變體的表型及遺傳分析從甲基磺酸乙酯誘變的秈稻(OryzaSativaL.sspindica)品種Kasalath突變體庫(kù)中篩選到一個(gè)水稻短根系突變體OskasI。8天苗齡的OskasI突變體的根系伸長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，主根、不定根和側(cè)根都變短(圖1a，b，c)，主根的組織切片分析發(fā)現(xiàn)突變體的細(xì)胞伸長(zhǎng)受到抑制(圖1d，e)。以突變體突變體OskasI為父本，與野生型Kasalath(WT)雜交，獲得子一代F1植株與野生型Kasalath完全一致，說(shuō)明OsKASI為隱性突變。F1代自花授粉所得的F2中，正常植株與短根植株的分離比為168/60＝2.8，卡方檢測(cè)結(jié)果為0.21<χ20.05,1＝3.84，正常植株與短根植株的比例符合一對(duì)基因控制的3：1分離比，表明該突變體是隱性單基因突變體。實(shí)施例2OsKASI基因的定位從突變體OskasI和Nipponbare的雜交后代F2中分離出短根突變個(gè)體，利用基因圖位克隆法(Map-basedCloning)對(duì)突變基因進(jìn)行定位。初定位(30個(gè)F2突變個(gè)體)將突變基因定位在第6染色體SSR標(biāo)記為RM6734和RM253之間。之后，擴(kuò)大定位群體，并在該區(qū)間內(nèi)發(fā)展了3對(duì)有多態(tài)的新的STS分子標(biāo)記，分別命名為STS1，STS2和STS3，序列如下：STS1U-5’ACCAGGCTGAATGTATAGAT3’STS1L-5’TTAGGCACATAAACCAAG3’STS2U-5’AAAATTGTAGTGGGTTGGT3’STS2L-5’TACAGAGAAAAAGATTGAAGC3’STS3U-5’CAGTGATTCGTTTGAAAT3’STS3L-5’CCCTGTTGTTTGTATGAC3’最終將基因鎖定在STS標(biāo)記為STS2和STS3(第6染色體上具體物理位置分別為4873357bp和4926248bp)之間，重組子分別為1/1476和3/1476，且重組的號(hào)碼不同。該區(qū)間有52.9kb大小(圖2a)。實(shí)施例3基因預(yù)測(cè)和序列分析根據(jù)精細(xì)定位的結(jié)果，OsKASI基因位于BAC克隆P0528E04上(圖2a)。根據(jù)TIGR(http://www.tigr.org/tdb/e2k1/osa1/)的水稻基因注釋信息，對(duì)定位的染色體區(qū)段內(nèi)基因預(yù)測(cè)分析，該區(qū)間共有7個(gè)預(yù)測(cè)的基因，用Kasalath野生型和OskasI突變體DNA模板對(duì)候選的7個(gè)基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物分別測(cè)序，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)基因號(hào)為L(zhǎng)OC_Os06g09630(β-酮酰-酰基載體蛋白合酶I)基因的DNA序列的1511bp的胞嘧啶(C)被胸腺嘧啶(T)取代，從而導(dǎo)致編碼的氨基酸序列的257位丙氨酸(Ala)突變?yōu)槔i氨酸(Val)。命名該基因?yàn)镺sKASI。實(shí)施例4OsKASI功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)根據(jù)OsKASI基因的CDS序列信息，設(shè)計(jì)擴(kuò)增完整CDS的引物，引物序列如下(加下劃線的為酶切位點(diǎn))：OsKASI-OVU：5’AAAGAGCTCATGCAGAGCCTCCTCCTCCCCA3’OsKASI-OVL：5’AAATCTAGAGTAACGTTGCCGGCTGTC3’；采用上海生工RNA提取試劑盒(SK1321)提取水稻kasalash葉片總RNA，以O(shè)ligo(dt)-18為引物，以所提取的總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。以此cDNA為模板，利用PrimeSTARHSDNAPolymerase擴(kuò)增全長(zhǎng)ORF，PCR條件：98℃預(yù)變性10s，然后進(jìn)入循環(huán)反應(yīng)(98℃10s，58℃10s，72℃，1min)，循環(huán)數(shù)為30，最后再延伸10min結(jié)束。瓊脂糖電泳割膠回收PCR產(chǎn)物，連A尾純化并連接到pMD19-T載體。連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，37℃培養(yǎng)16h后挑陽(yáng)性單克隆測(cè)序，測(cè)序鑒定序列無(wú)誤后用SacI和XbaI在37℃雙酶切過(guò)夜，連入經(jīng)同樣雙酶切的pCAMBIA1300改(35S)載體中(圖4)，命名為35S-OsKSR4OVER。連接產(chǎn)物以相同的方法熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，涂布在含有kan抗性的LB平板培養(yǎng)16h后挑取單克隆，搖菌抽提質(zhì)粒雙酶切并通過(guò)瓊脂糖膠檢測(cè)正確后電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105；酶切檢測(cè)正確的質(zhì)粒通過(guò)農(nóng)桿菌株系EHA105介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系導(dǎo)入到突變體Oskas1中，經(jīng)過(guò)侵染、共培養(yǎng)、篩選具有潮霉素抗性的愈傷、分化、生根、練苗移栽，得到轉(zhuǎn)基因植株。農(nóng)桿菌(EHA105)介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化體系主要應(yīng)用Hiei等人(1994)報(bào)道的方法基礎(chǔ)上進(jìn)行優(yōu)化。該轉(zhuǎn)基因植株中分離的OskasI突變體的根系長(zhǎng)度回復(fù)成野生型(圖3)，說(shuō)明OskasI的表型確實(shí)是有OsKASI突變引起的；為了檢測(cè)表型回復(fù)的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株是否超表達(dá)了OsKASI基因，采用Trizol法分別提取Kasalath和2個(gè)轉(zhuǎn)基因回復(fù)株系葉片的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。半定量反應(yīng)時(shí)，各樣品的cDNA模板量先通過(guò)OsActin基因的表達(dá)量調(diào)成一致(擴(kuò)增條件：58℃，26個(gè)循環(huán))，再擴(kuò)增目的基因。目的基因的上游引物序列(5’-3’)為：GGGCACAGAAAGATAACTCC；下游引物序列(5’-3’)為：CACAGTTCACGGCACC。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4min，然后進(jìn)入循環(huán)反應(yīng)即94℃，30s；58℃，30s；72℃，30s，28個(gè)循環(huán)。最后再延伸10min結(jié)束。最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。<110>寧波大學(xué)<120>一種水稻根系伸長(zhǎng)控制基因OsKASI及編碼的蛋白質(zhì)<160>8<170>PatentInversion3.5<210>1<211>3387<212>DNA<213>水稻根系伸長(zhǎng)控制基因OsKASI<400>1cgagcccagacctccaccatcgccaccacctccgcctcgtttccatcgccaccacctcct60cccgccgccgccgccgccaccgccgcgatgcagagcctcctcctccccaccttcgccgcg120gcctccgccgcccccccgcggagggggcgcgtgcctcccgccggtcgcgcctcggtctcc180gtgcgcgcgtccgcgtccgcggcggcggtggcgccgaggagggagacggatccgaggaag240agggtggtgatcacggggatggggctggtgtccgtgttcgggaacgacgtcgacgcctac300tacgaccgcctcctcgccggggagagcgggattggccccatcgaccgcttcgacgcctcc360aacttccccacccgcttcgccggccagatccggggcttctcctccgagggctacatcgac420ggcaagaacgaccgccgcctcgacgactgcctccgctactgcatcgtcagcggcaagaag480gccctcgagtccgccggcctcgccctcggctccaaatccatggacaaggtatttttcaaa540tgcactagtatcttttgcttcctcatgttctcacatcctgttaaaagttcttagctagtg600gaggtacgagattccgattcgtagaaagtgtctcctgtggtttagcacttttgatagatc660agatcagcagctgattcttttatgaaatggtggtgggatttttttccccatttctgtgat720agtatctgagtgagtatagtagagagtcctagtatcgactcgacaagtggagtaggcatt780attgcaatcctggtgtgtgtatatttctatttaattatcataaagaaggttgttgagggt840ccatgtatttctgttggccatggaaggttatagggggcgtatctgttttaaattgctgtc900aagtatcaatgcaatgcagatggattcatttcaagtttaaaaagattagttcaacactat960agaggttttgtctggagcaaaacgaaaaaaaaaactgtttttgcattttaccattttatg1020atgtagaaatattttcaaatcacacccttttgggcccatgtttcgttggttgtatatagt1080tggcgatagcttcatcagttcactctgctatcaatttttcattgcttgtactatgggtga1140aaggatacctggtgctaattagtaaatgttacatcgttgcagattgaaaagactcgggct1200ggtgtacttgtgggcaccggtatgggtggtcttacagtgttctctgatggtgttcagaat1260cttattgagaaggggcacagaaagataactccattcttcattccgtatgccataacaaac1320atgggatctgcccttcttggaatggacattggtttcatgggtccaaactactccatctca1380actgcatgtgctacctcgaactactgtttctatgctgcagcaaaccatattcgcagaggc1440gaagccgatgtgatgattgctggtggcactgaagccgcaattattccgattggtgtcggt1500gggtttgtcgcgtgtagagcactttcacagaggaacgatgaccccaaaacagcatcaaga1560ccttgggaccaagaccgtgatggttttgtcatgggtgaaggagctggagtactggtatgt1620ttagtgaacatattcaagtttcaggttttcactctgttaaacatcttctaatcatttagc1680tctgccaaattaaaaaaaggtcatggagagcctagaacatgcaatgaagcgtgacgcacc1740aataattgcggagtatttaggaggtgccgtgaactgtgatgcttaccatatgactgaccc1800gagatctgatggccttggtgtttcgtcttgcattaagcaaagtcttgcagatgctggcgt1860tgcaccggaggaggtaatccaaatattacaactttaaagagcactcttatgtgttagttc1920tgtcatctgtaaaattgtatacctttttgatctggcagctgatacataagctatgattta1980taatctgtcctttggttttttgtggggtgttaggattcttgtgtttgttatgccagctat2040ttttaacaccaattccagcgatatttgccctgttggaaaaagaaggttttccgtttgatg2100ttctagaattgatgttttcaccatgagctctggttgctattctgtattttgtttacaatt2160aatcaattgttgtgtgtatttattgcaaattgtatggttttgtttgggcaaataatttga2220tgaaatttcatgtgtatttaaatcacaaacgttttttttgcaggtcaactacataaatgc2280tcatgcaacgtccaccctagctggtgatctggcagaggtgaacgccattaggcaagtctt2340caaggatccatcagagattaaaataaatgcaaccaaggtgcttttatgttccttatgtgt2400tttacctccaaattcaaggagactatacattgccttcctaatacaatcttctgtttgcag2460tccatgattggacattgccttggtgcggctggtggcttggaagccattgcaactgttaaa2520gctataaccactggatgggtccatccaagcataaaccagtttgtaagtaccattttaaaa2580catcacttgctaatttacctagcctgccagtgggaacctgaggcacattatggctagaaa2640aactaagggctacattcttattaatcacagaacccggagccagctgttgaatttgacacg2700gtacctaatgtaaaaaagcaacatgaagtgaatgttggtgagtaacaatgcatgtggttt2760actgtattactccgccatcaatttcctcttcctcatatttgttttgtgttgctatacagg2820tatctcgaattcctttggatttggtggacacaattcagttgtagtatttgcaccatttaa2880gccttaacttgctgcatgttacacaaatcttggccagaatagtaaatgtcttttcaggaa2940gttctgagttattctgcatgtcttttctttgggtgaagcaactgttgatttgacagccgg3000caacgttacaatgaactggatctgagattaattccattttaggcactcccatcttccatt3060gaaattgagagctctgtataacgttgttttgcataatttgcaattgattctacctacttc3120tgtataatggaaaatgtgggaatttctagaattgtcatgtagaagcaaaagttagatctc3180ctgttccatagaaatgcttgagccaaggaattgcttgtctgtaatttgtatctggtctag3240aaaaatgttctcttcatttttttttcttgtccagtatgccaatgtccgtctagtggaata3300aaatgtattcagttttgcttaacttgctcggctaatagcttggttcgatgagatgaaata3360ttctagatttcgccctgaatgtgtaca3387<210>2<211>465<212>PRT<213>水稻根系伸長(zhǎng)控制基因OsKASI編碼的蛋白質(zhì)<400>2MetGlnSerLeuLeuLeuProThrPheAlaAlaAlaSerAlaAla151015ProProArgArgGlyArgValProProAlaGlyArgAlaSerVal202530SerValArgAlaSerAlaSerAlaAlaAlaValAlaProArgArg354045GluThrAspProArgLysArgValValIleThrGlyMetGlyLeu505560ValSerValPheGlyAsnAspValAspAlaTyrTyrAspArgLeu657075LeuAlaGlyGluSerGlyIleGlyProIleAspArgPheAspAla808590SerAsnPheProThrArgPheAlaGlyGlnIleArgGlyPheSer95100105SerGluGlyTyrIleAspGlyLysAsnAspArgArgLeuAspAsp110115120CysLeuArgTyrCysIleValSerGlyLysLysAlaLeuGluSer125130135AlaGlyLeuAlaLeuGlySerLysSerMetAspLysIleGluLys140145150ThrArgAlaGlyValLeuValGlyThrGlyMetGlyGlyLeuThr155160165ValPheSerAspGlyValGlnAsnLeuIleGluLysGlyHisArg170175180LysIleThrProPhePheIleProTyrAlaIleThrAsnMetGly185190195SerAlaLeuLeuGlyMetAspIleGlyPheMetGlyProAsnTyr200205210SerIleSerThrAlaCysAlaThrSerAsnTyrCysPheTyrAla215220225AlaAlaAsnHisIleArgArgGlyGluAlaAspValMetIleAla230235240GlyGlyThrGluAlaAlaIleIleProIleGlyValGlyGlyPhe245250255ValAlaCysArgAlaLeuSerGlnArgAsnAspAspProLysThr260265270AlaSerArgProTrpAspGlnAspArgAspGlyPheValMetGly275280285GluGlyAlaGlyValLeuValMetGluSerLeuGluHisAlaMet290295300LysArgAspAlaProIleIleAlaGluTyrLeuGlyGlyAlaVal305310315AsnCysAspAlaTyrHisMetThrAspProArgSerAspGlyLeu320325330GlyValSerSerCysIleLysGlnSerLeuAlaAspAlaGlyVal335340345AlaProGluGluValAsnTyrIleAsnAlaHisAlaThrSerThr350355360LeuAlaGlyAspLeuAlaGluValAsnAlaIleArgGlnValPhe365370375LysAspProSerGluIleLysIleAsnAlaThrLysSerMetIle380385390GlyHisCysLeuGlyAlaAlaGlyGlyLeuGluAlaIleAlaThr395400405ValLysAlaIleThrThrGlyTrpValHisProSerIleAsnGln410415420PheAsnProGluProAlaValGluPheAspThrValProAsnVal425430435LysLysGlnHisGluValAsnValGlyIleSerAsnSerPheGly440445450PheGlyGlyHisAsnSerValValValPheAlaProPheLysPro455460465