一種酶法合成L-茶氨酸的方法技術領域本發(fā)明涉及一種L-茶氨酸的合成方法，具體是一種利用微生物酶以L-谷氨酰胺和乙胺鹽酸鹽為底物制備L-茶氨酸的方法，屬于生物工程技術領域。

背景技術：
茶氨酸，又稱(C7H14O3N2，又稱γ-谷氨酰乙胺)，是存在于綠茶中的一種非必須氨基酸，也是茶葉的重要風味物質(zhì)。飲茶一直以來被人譽為有益身心，放松明智的健康食品，近年來，越來越多的科學研究證明了茶氨酸是綠茶中的活性物質(zhì)之一，在生理和藥理方面有減輕精神壓力、提高認知行為和學習能力、抑制肥胖、減低血壓、增強免疫力以及防止腫瘤發(fā)生的作用。因此，茶氨酸在飲料、功能食品、功能藥物等方面有著廣泛需求。茶氨酸的主要生產(chǎn)方法有直接提取法、化學合成法和生物法。傳統(tǒng)工業(yè)中，人們通過通過萃取等手段從干綠茶葉片中直接提取茶氨酸，但由于在干茶葉中，茶氨酸含量僅為茶葉重量的1.5%～2%，因此，此法得率低、成本高，不適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。隨著工業(yè)化的發(fā)展，人們發(fā)明了化學合成法生產(chǎn)茶氨酸的工藝，化學合成法只要分為三條合成路線：（1）吡咯烷酮酸（焦谷氨酸）法，即用L-吡咯烷酮酸和乙胺生成茶氨酸。主要代表有：1942年，以色列人N.Lichtenstein首次在實驗室中用乙胺和L-吡咯烷酮酸在水溶液中反應，合成茶氨酸，但收率低。1951年，日本人橋爪斌改進了合成方法，用L-吡咯烷酮酸和無水乙胺在低溫下反應，提高了反應收率。1961年，Yamada等人將L-吡咯烷酮酸先生成銅鹽后與純乙胺反應，利用反應物與生成物的溶解度差異，提高差率。2004年，陳新等人通過營造惰性環(huán)境，使L-茶氨酸收率達58%。（2）N-取代的谷氨酸酯的乙胺解反應產(chǎn)生N-取代茶氨酸。（3）N-取代的谷氨酸酐法。該法先利用保護基將谷氨酸的α-氨基保護起來使其分子內(nèi)脫水形成環(huán)狀谷氨酸酐后，直接與乙胺作用生產(chǎn)N-取代茶氨酸，再除去保護集團獲得茶氨酸?；瘜W合成法主要存在反應時間長、收率低等缺點，同時由于需要采用高壓、惰性氣體保護和保護集團等方式，增加生產(chǎn)成本。近年來，微生物酶法成為茶氨酸合成新趨勢。酶法生產(chǎn)茶氨酸主要利用細菌來源的谷氨酰胺酶、谷氨酰胺合成酶和γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶。實例如下：（1）谷氨酰胺酶：1998年，TachikiT等人利用PseudomonasnitroreducensIFO12694來源的谷氨酰胺酶，利用700mML-谷氨酰胺和1.5M乙胺在30℃，pH11下7小時，獲得38.57%的底物轉(zhuǎn)化率；隨后，AbelianVH等人利用PseudomonasnitroreducensIFO12694的固定化細胞進行連續(xù)生產(chǎn)，實現(xiàn)了95%的底物轉(zhuǎn)化率；但多數(shù)谷氨酰胺酶的最適作用pH在中性，存在在堿性條件下酶的穩(wěn)定性差，同時酶的熱穩(wěn)定性不佳等缺點；（2）谷氨酰胺合成酶：利用合成酶進行茶氨酸的生產(chǎn)要消耗能量，因此，Yamamoto等人利用PseudomonastaetrolensY-30來源的谷氨酰胺合成酶與啤酒酵母中的糖酵解途徑中相關酶偶聯(lián)，形成ATP再生系統(tǒng)生產(chǎn)茶氨酸，以200mM谷氨酸鈉鹽和600mM的乙胺反應，獲得85%的底物轉(zhuǎn)化率；谷氨酰胺合成酶的應用需要提供額外ATP功能，反應只能在細胞中進行，反應周期長達數(shù)十小時，使用受到限制；（3）γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶：2002年，日本人H.Suzuki等首次利用大腸桿菌來源的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶在水溶液歐諾中以L-谷氨酰胺和乙胺為底物，獲得60%底物轉(zhuǎn)化率；帥玉英等利用從中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離篩選得到的BacillussubtilisSK11.004的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，以20mM谷氨酰胺和200mM的乙胺反應，獲得80%的底物轉(zhuǎn)化率，應用γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶進行茶氨酸生產(chǎn)具有反應過程簡單，反應時間短等優(yōu)點，但存在轉(zhuǎn)化率不高，野生酶發(fā)酵酶活力低等缺點，在高底物濃度下的應用研究較少，阻礙其工業(yè)化應用過程。目前為止，利用微生物來源或基因工程來源的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶作為催化劑、在適宜工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模的高底物濃度下進行茶氨酸生產(chǎn)獲得較高底物轉(zhuǎn)化率的例子還未見文獻報道。

技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種酶法合成L-茶氨酸的方法，包括以下步驟：（1）以高產(chǎn)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶；（2）以發(fā)酵所得粗酶液或濃縮酶液為催化劑，以L-谷氨酰胺和乙胺鹽酸鹽為底物合成L-茶氨酸。所述高產(chǎn)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的基因工程菌，是將枯草芽孢桿菌168的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因在大腸桿菌BL21(DE3)中重組表達獲得，包括以下步驟：（1）根據(jù)NCBIGeneID：940001所示的基因序列，通過化學合成法得到γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因；（2）將目的基因擴增后通過割膠回收，與pMD18-Tsimple載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，獲得質(zhì)粒ggt/pMD18-Tsimple，將質(zhì)粒測序驗證；（3）將測序正確的質(zhì)粒ggt/pMD18-Tsimple載體和pET20b(+)空載體進行雙酶切，割膠回收ggt基因片段和pET20b(+)線性載體片段后將兩片段連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，獲得質(zhì)粒ggt/pET20b(+)；（4）將質(zhì)粒ggt/pET20b(+)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，獲得ggt-pET20(b)/E.coliBL21(DE3)。所述以高產(chǎn)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶，包括以下步驟：將基因工程菌ggt-pET20(b)/E.coliBL21(DE3)接種于含有Amp的LB液體培養(yǎng)基，37℃下培養(yǎng)8～10h；以5%接種量轉(zhuǎn)接至含0.75%甘氨酸的TB（含Amp）液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)3h；用0.4mM/LIPTG誘導，降溫至25℃恒溫培養(yǎng)40～48h誘導產(chǎn)酶，發(fā)酵結束后，離心收集上清液，即為粗酶液。所述催化反應是在反應器中分別添加L-谷氨酰胺和乙胺鹽酸鹽，用乙胺水溶液65%～70%（CP）調(diào)節(jié)pH，加入發(fā)酵所得粗酶液或濃縮酶液，在200rpm的水浴搖床中進行反應。所述L-谷氨酰胺的初始濃度為20mM～1000mM。所述乙胺鹽酸鹽的初始濃度為0.5M～5M。所述重組γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶的濃度為0.2U/ml～9.0U/ml。所述反應在pH9.5～10.5、37～50℃下反應2～5h。本發(fā)明通過選擇高底物轉(zhuǎn)化率的菌株進行異源表達，獲得單位酶活較高的發(fā)酵酶液，彌補了野生菌酶活單位低的缺點，為低成本大量制酶奠定基礎。同時，本發(fā)明獲得的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶在堿性pH反應條件下具有良好的活性和穩(wěn)定性，同時，熱穩(wěn)定性良好，在50℃下半衰期高達130h，彌補了其他酶種在堿性反應條件下穩(wěn)定性差的缺點。用該酶進行酶反應生產(chǎn)茶氨酸，具有反應方法簡便、不需要提供額外生物能量、反應時間短等優(yōu)點，在不同底物濃度下，均能得到對應底物濃度下的高底物轉(zhuǎn)化率，為工業(yè)化放大生產(chǎn)奠定基礎。附圖說明圖1重組酶在50℃下的溫度穩(wěn)定性圖2重組酶的最適pH圖3重組酶的pH穩(wěn)定性具體實施方式實施例1：ggt-pET20b(+)/E.coliBL21(DE3)的構建（1）根據(jù)NCBI上枯草芽孢桿菌168的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因(NCBIGeneID：940001)序列，通過化學合成得到γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶基因，以此基因為模版，設計引物P1、P2，P1：5’–ATCCATGGATAAAAAACCGCCCAAAAGCTACGA–3’(下劃線為酶切位點NocI)，P2：5’–GGCGCTCGAGTTATTTACGTTTTAAATTAATGC–3’(下劃線為酶切位點XhoI)，通過PCR擴增基因。PCR體系為50μl，PCR程序為：94℃預變性4min，后以“98℃保溫10s，55℃保溫5s，72℃保溫120s“的程序循環(huán)30次，最后在72℃保溫10min。擴增得到的目的片段通過膠回收、純化后與pMD18-Tsimple載體連接。連接產(chǎn)物通過化學轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109后，將轉(zhuǎn)化混合物涂布于含100mg/L的氨芐青霉素抗性LB平板，37℃培養(yǎng)6～8h，挑取單菌落在LB/Amp液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8～10h后提取質(zhì)粒測序驗證，驗證結果正確。（2）將測序正確的重組質(zhì)粒ggt/pMD18-T和表達載體pET-20b(+)用NocI和XhoI進行雙酶切后，通過膠回收ggt基因片段和pET-20b(+)線性質(zhì)粒，并用T4連接酶連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，通過涂布，液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，獲得pET-20b(+)/ggt質(zhì)粒；（3）將pET-20b(+)/ggt質(zhì)粒通過化學轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，將轉(zhuǎn)化混合物涂布于含100mg/L的氨芐青霉素抗性LB平板后挑取轉(zhuǎn)化子，37℃培養(yǎng)6～8h，挑取單菌落在LB/Amp液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)8～10h后進行菌種保藏。實施例2：發(fā)酵產(chǎn)酶（1）發(fā)酵培養(yǎng)將實施例1中獲得的基因工程菌ggt-pET20(b)/E.coliBL21(DE3)接種于LB/Amp液體培養(yǎng)基中在37℃下培養(yǎng)8～10h后以5%接種量轉(zhuǎn)接至含0.75%甘氨酸的TB/Amp液體培養(yǎng)基，在37℃培養(yǎng)3h后用0.4mM/LIPTG（異丙基硫代-β-D半乳糖苷）誘導，降溫至25℃恒溫培養(yǎng)40～48h誘導產(chǎn)酶。發(fā)酵結束后，離心收集上清液即為粗酶液。（2）酶活測定以γ-谷氨酰對硝基苯胺（γ-GpNA）和雙甘二肽(Gly-Gly)為底物進行顏色反應。酶活測定體系為1mL（含終濃度為5mmol/Lγ-谷氨酰對硝基苯胺（γ-GpNA），80mmol/L雙甘二肽(Gly-Gly)，50mM硼砂-NaOH緩沖液，pH10），在37℃下加入20μL適當稀釋的酶液反應5min后，加入4M醋酸溶液400μl終止反應，在分光光度計410nm處測定吸光值。該條件下每分鐘生成1μmol對硝基苯胺的酶量所需的酶量定義為一個酶活單位（U）。對硝基苯胺標準曲線的繪制：配制0.25mmol/L對硝基苯胺標準樣品，用50mmol/L硼砂-NaOH(pH10)緩沖液稀釋成濃度為0.125、0.0625、0.03125、0.015625mmol/L的溶液，用分光光度計于λ=410nm測定吸光值。以不同對硝基苯胺的濃度值為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制對硝基苯胺的標準曲線。測定結果顯示，發(fā)酵上清液中酶活達80U/ml。實施例3：粗酶液的濃縮將實施例2中獲得的酶液邊攪拌邊緩慢加入濃度為相對于酶液質(zhì)量分數(shù)60%的硫氨酸，攪拌至硫氨酸溶解，在4℃條件下靜置8～10小時沉淀蛋白?；旌衔锝?jīng)離心（8000rpm，10min）收集沉淀，再用最小體積的50mMTris-HCl緩沖液（pH8）復溶，復溶后經(jīng)過再次離心除去固形物，收集上清獲得濃縮酶液。根據(jù)復溶體積的差異，濃縮酶液酶活在300～400U/ml。實施例4：粗酶液溫度穩(wěn)定性的研究將一定體積保存于Tris-HCl緩沖液（50mM,pH8.0）中的酶液（總蛋白含量約1mg/ml，純酶約0.5mg/ml）在50℃下保溫，間隔一定時間取樣測定殘余酶活。由圖1可知，該酶在50℃下半衰期約130h。此外，在30℃和40℃下進行溫度穩(wěn)定性研究，保溫1周后殘余酶活大于90%。實施例5：粗酶液最適pH和pH穩(wěn)定性的研究將適度稀釋的粗酶液置于不同pH緩沖液（磷酸鉀緩沖液，50mM、pH5.0-8.0；Britton-Robinson緩沖液，50mM、pH8.0-10.0；硼酸-NaOH緩沖液，50mmM、pH10.0-11.0）中進行酶活測定，研究重組酶的最適pH，由圖2可知，該酶最適pH為10，與酶反應生產(chǎn)茶氨酸最適pH相適應。將粗酶液（總蛋白含量約1mg/ml，純酶約0.5mg/ml）調(diào)節(jié)至不同pH，室溫下保存24h，測定酶的殘余酶活。由圖3可知，該酶在pH5～pH8條件下殘余酶活大于90%，在pH9～12條件下殘余酶活大于80%，但在酸性條件不穩(wěn)定。實施例6：HPLC檢測L-茶氨酸的產(chǎn)量在反應器中加入一定濃度的L-谷氨酰胺溶液、乙胺溶液和酶液，37℃反應一定時間后，取樣并加入同體積的三氯乙酸溶液（10%，v/v）終止反應并沉淀蛋白，沉淀4小時后將樣品12000rpm離心10min,取上清液適度稀釋后用0.45μm超濾膜過濾，并進行HPLC分析。由于大多數(shù)氨基酸無紫外吸收也無熒光發(fā)射特性。為提高分析測試靈敏度和分離度，通常需要進行衍生化，采用領苯二甲醛（OPA）作為衍生化試劑對樣品進行柱前衍生，衍生化過程參考安捷倫公司ZorabaxEclipse-AAA氨基酸柱分析時使用的指導方法，可對底物L-谷氨酰胺、產(chǎn)物L-谷氨酰胺以及副產(chǎn)物L-谷氨酸進行定量分析。色譜條件如下：Agilent1200HPLC色譜儀，Agilent自動進樣器，EclipseXDB-C185μm(4.6mm×150mm)，LC-9A紫外檢測器；流動相(V/V)為無機鹽相和有機相雙相梯度洗脫，流速0.8mLmin-1；柱溫40℃。實施例7:酶法制備L-茶氨酸在反應器中投入終濃度為20mM的L-谷氨酰胺和0.5M的乙胺鹽酸鹽，用乙胺水溶液65%～70%（CP）將pH調(diào)節(jié)到10，加入0.2U/ml實施例2中獲得的粗酶液或?qū)嵗?中獲得的濃縮酶液，在37℃，200rpm的水浴搖床中反應4小時，反應結束后，采用實施例6中樣品處理方法處理樣品，在高效液相色譜系統(tǒng)分析檢測L-谷氨酰胺、L-谷氨酸和L-茶氨酸的量，L-茶氨酸對底物L-谷氨酰胺的摩爾轉(zhuǎn)化率達89%。實施例8：酶法制備L-茶氨酸在反應器中投入終濃度為200mM的L-谷氨酰胺和2.2M的乙胺鹽酸鹽，用乙胺水溶液65%～70%（CP）將pH調(diào)節(jié)到10，加入3.0U/ml實施例3中獲得的酶液，在50℃，200rpm的水浴搖床中反應2小時，反應結束后，采用實施例6中用樣品處理方法處理樣品，用高效液相色譜系統(tǒng)分析檢測顯示L-茶氨酸對谷氨酰胺的摩爾轉(zhuǎn)化率為75%。實施例9：酶法制備L-茶氨酸在反應器中投入終濃度為0.5M的L-谷氨酰胺和3M的乙胺鹽酸鹽，用乙胺水溶液65%～70%（CP）將pH調(diào)節(jié)到10，加入6.0U/ml實施例2中獲得的酶液，在40℃，200rpm的水浴搖床中反應5小時，反應結束后，采用實施例6中用樣品處理方法處理樣品，用高效液相色譜系統(tǒng)分析檢測顯示L-茶氨酸對谷氨酰胺的摩爾轉(zhuǎn)化率為58%。實施例10：酶法制備L-茶氨酸在反應器中投入終濃度為1M的L-谷氨酰胺和5M的乙胺鹽酸鹽，用乙胺水溶液65%～70%（CP）將pH調(diào)節(jié)到10，加入9.0U/ml實施例2中獲得的酶液，在37℃，200rpm的水浴搖床中反應5小時，反應結束后，將反應液pH調(diào)至弱酸性。采用實施例6中用樣品處理方法處理樣品，用高效液相色譜系統(tǒng)分析檢測顯示L-茶氨酸對谷氨酰胺的摩爾轉(zhuǎn)化率為45%。雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。