一種藤倉(cāng)赤霉菌及其轉(zhuǎn)化丁香酚合成松柏醛的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種藤倉(cāng)赤霉菌及其轉(zhuǎn)化丁香酚合成松柏醛的方法，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以丁香酚為底物，篩選獲得一株的能夠降解丁香酚積累松柏醛的菌株，藤倉(cāng)赤霉(Gibberella fujikuroi)ZH?34，已于2016年4月5日，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)是CCTCC NO:M 2016171，保藏地址是中國(guó)武漢武漢大學(xué)。利用該菌株轉(zhuǎn)化丁香酚合成松柏醛，在丁香酚濃度為1g/L時(shí)，可產(chǎn)0.96g/L松柏醛，摩爾產(chǎn)率94％；當(dāng)分次添加丁香酚進(jìn)行轉(zhuǎn)化，總丁香酚濃度6g/L，可產(chǎn)3.76g/L松柏醛，1.35g/L松柏醇。本發(fā)明提供了一種生物法制備松柏醛的新方法。CCTCC NO: M 201617120160405
【專利說(shuō)明】
-種藤倉(cāng)赤霉菌及其轉(zhuǎn)化T香齡合成松柏酵的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種藤倉(cāng)赤霉菌及其轉(zhuǎn)化下香酪合成松柏醒的方法，屬生物技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 香精香料在食品、飼料、化妝品、化學(xué)和醫(yī)藥領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。市場(chǎng)上的許多香 料化合物仍然是通過(guò)化學(xué)法或從植物和動(dòng)物來(lái)源中萃取生產(chǎn)的。目前市場(chǎng)上的香料物質(zhì)主 要W化學(xué)合成法生產(chǎn)的為主，但隨著人們對(duì)物質(zhì)生產(chǎn)過(guò)程中的關(guān)注及歐洲國(guó)家和美國(guó)法律 對(duì)食品添加物質(zhì)的要求，生物發(fā)酵法及酶法合成的香料物質(zhì)，被認(rèn)為是天然的香料物質(zhì)，越 來(lái)越受到人們的關(guān)注。到2011年市場(chǎng)對(duì)天然香料物質(zhì)的需求達(dá)到218億美元。運(yùn)些天然香料 物質(zhì)主要通過(guò)生物合成、植物法提取、酶和微生物轉(zhuǎn)化獲得。幾種不同的苯酪類物質(zhì)，如下 香酪、異下香酪、阿魏酸都可W作為底物，通過(guò)微生物酶的作用來(lái)合成香料物質(zhì)。其中，下香 酪是下香油的主要成分，從桃金娘科植物下香(Syzigium aromati州m)中提取獲得，具有來(lái) 源較廣價(jià)格便宜（目前市場(chǎng)價(jià)格是5$/Kg)、市場(chǎng)容易獲得的特點(diǎn)，被認(rèn)視為一種具有應(yīng)用價(jià) 值的底物。
[0003] 松柏醒(coniferyl aldehyde),又稱阿魏醒，4-徑基-3-甲氧基肉桂醒，分子式為 Ci〇Hi〇〇3，不易溶于水，純品為淡黃粉末狀，存在于針葉植物樹(shù)材木質(zhì)素中，為生物合成木質(zhì) 素的中間體，松柏醒可被用作調(diào)香劑，抗真菌劑;前列腺素合成抑制劑;化學(xué)合成法主要有 由香草醒(vanillin)與乙醒縮合或W酸或堿分解木質(zhì)素而得，利用微生物轉(zhuǎn)化下香酪合成 的松柏醒的方法還未見(jiàn)報(bào)道。
[0004] 早在1977年，人們就開(kāi)始研究降解下香酪的微生物。日本學(xué)者化dasa發(fā)現(xiàn)一株棒 桿菌(Corynebacterium sp.)具有降解下香酪生成松柏醇、阿魏酸和香蘭素的能力；1996 年，法國(guó)Rabenhorst利用假單胞菌(Pseudomonas sp.)采用分批培養(yǎng)的方法，獲得了3.22g/ L的松柏醇，3.25g/L的香草酸，5.8g/L的阿魏酸。1999年，日本化rukawa等采用真菌純黃絲 衣霉(Byssochlamys化lvaV107)利用下香酪作為底物進(jìn)行轉(zhuǎn)化獲得21.7g/L的松柏醇，并有 少量的松柏醒、阿魏酸和香草酸的生成。2003年，日本化rukawa等篩選出巧光假單胞菌 (Pseudomonas j Iuorescens El 18)，該菌能利用下香酪生成6 . Ig/L阿魏酸；2010年，印度 Kadakol等篩選出一株蠟樣芽抱桿菌(Bacillus cereus PN24)，添加下香酪轉(zhuǎn)化后，轉(zhuǎn)化體 系中能檢測(cè)到愈創(chuàng)木酪、香蘭素、香草酸、原兒茶酸中間代謝物;2011年，伊朗Ashengro曲等 經(jīng)分離獲得了食樹(shù)脂假單胞菌（Pseudomonas resinovorans SPRl)菌株，可轉(zhuǎn)化下香酪獲 得0.24g/L的香蘭素；2014年，立陶宛616(1'曰;[1716等分離到嗜熱溶±壤芽抱桿菌 (Geobacillus sp.AY 946034)菌株，該菌具有降解下香酪生成松柏醇、阿魏酸、香蘭素、香 草酸的能力。運(yùn)些研究中設(shè)及下香酪降解的代謝產(chǎn)物有松柏醇、松柏醒、阿魏酸、香蘭素、香 草酸、原兒茶酸等，并且研究多數(shù)集中于細(xì)菌對(duì)下香酪降解代謝途徑的分析，對(duì)于真菌的報(bào) 道相對(duì)較少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明首先提供了一株高產(chǎn)松柏醒的微生物菌株。
[0006] 所述微生物菌株是藤倉(cāng)赤霉(G;Lbberella化jiku;roi)ZH-34,已于2016年4月5日， 保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中屯、，保藏編號(hào)是CCTCC N0:M 2016171，保藏地址是中國(guó)武漢 武漢大學(xué)。
[0007] 所述藤倉(cāng)赤霉能夠轉(zhuǎn)化下香酪依次生成松柏醇、松柏醒、阿魏酸、香草醒，但積累 松柏醒最多。
[000引所述藤倉(cāng)赤霉在察氏培養(yǎng)基上25~30°C，培養(yǎng)5~7d后，菌落表面呈白色毛絨狀， 底部略顯淺青色，菌落中央質(zhì)地均勻致密呈鍛絨狀，菌落邊沿稀疏，有稍微的青色;光學(xué)顯 微鏡下觀察，菌體為菌絲體，營(yíng)養(yǎng)菌絲有橫隔，能夠進(jìn)行出芽生殖，分生抱子梗自菌絲頂端 生出短小，簡(jiǎn)單，頂端漸細(xì)，抱子單生，圓形，未見(jiàn)串生。
[0009] 本發(fā)明還提供應(yīng)用所述藤倉(cāng)赤霉生產(chǎn)松柏醒的方法，是W藤倉(cāng)赤霉CCTCC NO: M2016171全細(xì)胞或其生產(chǎn)的酶為催化劑，W下香酪為底物，構(gòu)建轉(zhuǎn)化體系生產(chǎn)松柏醒。
[0010] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將藤倉(cāng)赤霉菌體添加到下香酪溶液中，30~35°C，80 ~18化/min震蕩轉(zhuǎn)化24~60h。所述菌體可W是濕菌體或者菌體粉劑。
[0011] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將藤倉(cāng)赤霉種子液按6~10%的接種量接入發(fā)酵培 養(yǎng)基，28~30°C，80~18化/min震蕩培養(yǎng)18~2地，添加底物下香酪，30~35°C，80~18化/ min震蕩轉(zhuǎn)化24~60h。
[0012] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將藤倉(cāng)赤霉種子液按6~10%的接種量接入發(fā)酵培 養(yǎng)基，28~30°C，80~18化/min震蕩培養(yǎng)18~2地，一次性添加終濃度為0.5~1.5g/L的下香 酪，30~35°C，80~180r/min震蕩轉(zhuǎn)化24~60h。
[0013] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將藤倉(cāng)赤霉種子液按6~10%的接種量接入發(fā)酵培 養(yǎng)基，28~30°C，80~18化/min震蕩培養(yǎng)18~2地，先添加終濃度為0.5~1.5g/L的下香酪， 30~35°C，80~18化/min，轉(zhuǎn)化6~化，之后每間隔6~化添加下香酪;下香酪共添加4~6次， 總添加量為2~9g/L。
[0014] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述下香酪W下香酪乳濁液的形式添加到轉(zhuǎn)化體系 中。
[0015] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述下香酪W下香酪乳濁液的形式添加到轉(zhuǎn)化體系 中，下香酪乳濁液的制備:0.5~Iml的吐溫-80加入到50~100mL水中，115~12rC滅菌20~ SOmin后，添加1~2ml的下香酪，80~15化/min震蕩乳化4~12h，制備成乳白色的下香酪乳 濁液。
[0016] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基含:葡萄糖5~20g/L，酵母膏2~Ig/ 1^，1(2冊(cè)04 1~5邑/1，]\%504 7出0 0.2~1.0邑/1，尸6504*7出0 0.1~0.2111邑/1，6曰(：12*2出0 0.1 ~0.4mg/L，H3B03 0.1~0.3mg/L，CuS04?5&0 0.02~0.04mg/L，KI0.05~0.1mg/L， MnS〇4* 7出00.1 ~0.4mg/L，NaMo〇4. 2出0 0~0.2mg/L，抑 6.5~7.5，裝液量為50~10〇1111/ 500ml 搖瓶，115 ~12rC，滅菌 20 ~30min。
[0017] 本發(fā)明通過(guò)篩選，獲得了一株降解下香酪高產(chǎn)松柏醒的藤倉(cāng)赤霉，轉(zhuǎn)化下香酪生 產(chǎn)松柏醒的摩爾產(chǎn)率達(dá)到90% W上。本發(fā)明提供了一種生物法制備松柏醒的新方法。
[001引生物材料保藏
[0019] 藤倉(cāng)赤霉(Gibberellafujiku;roi)ZH-34,已于2016年4月5日，保藏于中國(guó)典型培 養(yǎng)物保藏中屯、，保藏編號(hào)是CCTCC N0:M 2016171，保藏地址是中國(guó)武漢武漢大學(xué)。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1發(fā)酵轉(zhuǎn)化液的高效液相色譜；圖A混合標(biāo)樣，a:香草酸;b:松柏醇;C:香草醒;d: 阿魏酸；e:松柏醒;f:下香酪，保留時(shí)間a: 11.37min;b: 14.32min;c: 15.27min;d: 16.31min; e: 22.86min; f: 26.41min;圖B發(fā)酵轉(zhuǎn)化液樣品，b:松柏醇;C:香草醒;e:松柏醒;f:下香酪保 留時(shí)間b: 14.32min;c: 14.38min;e:22.85min;f :26.39min。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 篩選菌種所用的薄層層析法:所用展開(kāi)劑是正己燒、=氯甲燒、無(wú)水乙酸、乙酸乙 醋和冰醋酸(參照李永紅等化C方法同時(shí)監(jiān)測(cè)生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中的阿魏酸、香草酸和香草醒）， 該法能在較短的時(shí)間內(nèi)，快速檢測(cè)大批量的待篩菌株的轉(zhuǎn)化液。
[0022] 分析菌種轉(zhuǎn)化下香酪生成的產(chǎn)物的高效液相色譜法檢測(cè)條件是:檢測(cè)波長(zhǎng)280~ 300皿，柱溫25~30°C，進(jìn)樣量10~20化，兩種流動(dòng)相A(乙臘），流動(dòng)相B(0.1 %乙酸)進(jìn)行梯 度洗脫，0~4minl0~15%A，85~90%的B，流速0.8~lml/min;4~20min 25~30%A，70~ 75%的B，流速0.8~lml/min;20~30min 70~80%A，20~30%B，流速0.8~lml/min;30~ 35minl0 ~15%A，85 ~90% 的 B，流速 0.8 ~Iml/min。
[0023] 分析菌種轉(zhuǎn)化下香酪生成的產(chǎn)物的高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)條件是:檢測(cè) 波長(zhǎng)200~600皿，柱溫40~45°C，進(jìn)樣量1~化L，兩種流動(dòng)A(乙臘），流動(dòng)相B(0.1%甲酸)進(jìn) 行梯度洗脫，0~17min 5~10%A，90~95%B，流速0.3~0.5ml/min;17~20min 60~70% 八，30~40%8，流速0.3~0.51111/111111;20~22111111，90~100%4,0~10%8，流速0.2~0.31111/ 111111;22~251111115~10%4,90~95%8，流速0.3~0.51111/111111。
[0024] 下香酪乳濁液的制備:0.5~Iml的吐溫-80加入到50~1 OOml水中，115~12 rC滅 菌20~30min后，添加1~2ml的下香酪，震蕩（80~15化/min)乳化4~12h，制備成乳白色的 下香酪乳濁液。
[0025] 斜面培養(yǎng)：1~lOg/L的葡萄糖，馬鈴馨汁100~250g/L，瓊脂20~25g/L，115~121 °C，滅菌20~30min，制成斜面接種，25~30°C，培養(yǎng)5~7d。
[0026] 種子的培養(yǎng)：1~lOg/L的葡萄糖，馬鈴馨汁100~250g/L，酵母膏1~5g/L，115~ 12rC，滅菌20~30min，接種后25~30°C，90~llOr/min，培養(yǎng)18~2地。
[0027] 發(fā)酵培養(yǎng)基：含葡萄糖5~20g/L，酵母膏2~lg/L，K2冊(cè)〇4 1~5g/L，MgS〇4 7出0 0.2~1.0邑/1，尸6504*7此0 0.1~0.2111邑/1，6曰(：12*2出0 0.1~0.4111邑/1，出803 0.1~0.3111邑/ 1，加 504*5出00.02~0.04111邑/1，1(10.05~0.1111邑/1，]\111504*7肥0 0.1~0.4111邑/1，胞]\1〇04* 2此0 0~0.2mg/L，pH 6.5~7.5，裝液量為50~1001111/5001111搖瓶，115~121°(：，滅菌20~ 30111111，按6~10%的接種量進(jìn)行接種，25~30°(：，80~18化/111111，培養(yǎng)18~2411，加0.5~ 1.5g/L 的下香酪，30 ~35°C，80 ~180r/min，轉(zhuǎn)化 24 ~72h。
[00%]選擇培養(yǎng)基:硝酸錠1. Og/L，屯水硫酸儀0.5g/L，硫酸錠0.5g/L，憐酸二氨鐘0.5g/ L，憐酸氨二鐘1.5g/L，氯化鋼0.5g/L，酵母膏2.0g/L，自然抑。
[0029] 富集培養(yǎng)基:5g/L酵母膏，lOg/L蛋白腺，lOg/L葡萄糖，自然抑。
[0030] 實(shí)施例1降解下香酪菌株的篩選與鑒定
[0031] 分別采集福建廈口、安微淮安、河南新鄉(xiāng)、黑龍江撫遠(yuǎn)及江蘇無(wú)錫5個(gè)地方不同地 點(diǎn)的3~IOcmi壤樣品，采集的±樣分別稱3~6g加入到30~60ml，115~12rC滅菌的生理 鹽水中，25~30°C，90~15化/min,震蕩混勻15~30min。無(wú)菌條件下取3~61111上±樣清液按 8~12%的接種量接種到含有下香酪乳濁液的選擇培養(yǎng)基中，25~30°C，90~15化/min,選 擇培養(yǎng)2~5d后，按4~10%的接種量接種到含有下香酪的富集培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)，25 ~30°C，90~15化/min,培養(yǎng)2~5d，分別涂布到含有下香酪的細(xì)菌平板、高氏一號(hào)和蔡氏平 板培養(yǎng)基上，25~3(TC培養(yǎng)3~5d，觀察有無(wú)菌落的生成。有菌落生成的，挑取生長(zhǎng)良好的單 菌落，分別劃線于含有下香酪的斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)2~5d，轉(zhuǎn)接到裝有種子培養(yǎng)基的24孔 培養(yǎng)板中（實(shí)驗(yàn)室保存的霉菌斜面培養(yǎng)后直接接種子培養(yǎng)基），25~30°C，90~15化/min，培 養(yǎng)18~36h，然后加入終濃度為0.5~1.5g/L的下香酪乳濁液轉(zhuǎn)化培養(yǎng)24~4她，轉(zhuǎn)化結(jié)束 后，TLC法檢測(cè)轉(zhuǎn)化結(jié)果，共獲得了 146株能降解下香酪的菌株，將運(yùn)些菌株搖瓶進(jìn)行復(fù)篩 后，高效液相色譜初步檢測(cè)分析生成的產(chǎn)物，最后獲得一株ZH-34菌，能轉(zhuǎn)化下香酪依次生 成松柏醇、松柏醒、阿魏酸、香草醒，但能積累松柏醒。
[0032] 菌株ZH-34進(jìn)行形態(tài)鑒定:在察氏培養(yǎng)基上25~30°C，培養(yǎng)5~7d后，菌落表面呈白 色毛絨狀，底部略顯淺青色，菌落中央質(zhì)地均勻致密呈鍛絨狀，菌落邊沿稀疏，有稍微的青 色，光學(xué)顯微鏡下觀察，菌體為菌絲體，營(yíng)養(yǎng)菌絲有橫隔，能夠進(jìn)行出芽生殖，分生抱子梗自 菌絲頂端生出短小，簡(jiǎn)單，頂端漸細(xì)，抱子單生，圓形，未見(jiàn)串生。
[0033] 將菌體涂布到固體平板培養(yǎng)基上，3(TC培養(yǎng)5-7d，后，按照真菌基因組快速抽提試 劑盒進(jìn)行真菌基因組的提取。選擇真核生物ITS通用擴(kuò)增引物（上游引物ITSl :5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' ；下游引物ITS4:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），PCR擴(kuò)增ITS區(qū) 域，1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后。測(cè)序結(jié)果在GeneBank進(jìn)行Blast序列比對(duì)。該菌經(jīng)形態(tài)學(xué) 和分子生物學(xué)鑒定為藤倉(cāng)赤霉菌(GibberelIafujikuroi)。
[0034] 實(shí)施例2利用G比berella化jikuroi ZH-34轉(zhuǎn)化下香酪生成松柏醒
[0035] 將菌株ZH-34轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基中，25~30°C培養(yǎng)5~7d，轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中，25 ~30°C，90~11化/min,培養(yǎng)18~2地，按6%~8%的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基，25~30°C， 90~1 lOr/min，培養(yǎng)18~24h后，分別加入終濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5g/L的下香酪（W 濃度20g/L的下香酪乳濁液的形式添加），30~35°C，90~11化/min,轉(zhuǎn)化50h;處理后進(jìn)行 HPLC檢測(cè)結(jié)果如下表1，其中1 .Og/L下香酪條件下的摩爾產(chǎn)率為94%。
[0036] 表1底物濃度對(duì)G.fuj化uroi ZH-34轉(zhuǎn)化下香酪產(chǎn)松柏醒的影響 「00371 LUUdUJ 乂/Jtli |7。〇恤戍八」/ T么T口 6王口'J尿夕H鬥
[0039]將菌株ZH-34轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基中，25~30°C培養(yǎng)5~7d，轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中，25 ~30°C，90~11化/min,培養(yǎng)18~2地，按6%~8%的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基，25~30°C， 90~llOr/min，培養(yǎng)18~24h后，加入終濃度為l.Og/L的下香酪m濃度20g/L的下香酪乳濁 液的形式添加），分別在溫度為25°C、30°C、35°C、40°C、45°C條件下，90~11化/min，轉(zhuǎn)化 50h;處理后進(jìn)行HPLC檢測(cè)結(jié)果如下表2,其中35°C條件下，1.0g/L的摩爾產(chǎn)率為92%。
[0040] 表2溫度對(duì)G.fuj化Uroi ZH-34轉(zhuǎn)化下香酪產(chǎn)松柏醒的影響
[0042] 實(shí)施例4利用G比berella化jikuroi ZH-34間歇添加下香酪生成松柏醒
[0043] 將菌株ZH-34轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基中，25~30°C培養(yǎng)5~7d，轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中，25 ~30°C，90~11化/min,培養(yǎng)18~2地，按6%~8%的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基，25~30°C， 90~11化/min,培養(yǎng)18~24h后，加入終濃度為0.5~1.5g/L的下香酪（W濃度20g/L的下香 酪乳濁液的形式添加），30~35°C，90~11化/min,轉(zhuǎn)化6~化，之后每間隔6~8h添加下香酪 乳濁液用于轉(zhuǎn)化，共添加4~6次，下香酪總添加量為2~9g/L，轉(zhuǎn)化結(jié)束能獲得1.2~3.75g/ L的松柏醒，松柏醒的摩爾產(chǎn)率為38.2 %~55 %。
[0044] 實(shí)施例5
[0045] 將菌株ZH-34轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基中，25~30°C培養(yǎng)5~7d，轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基中，25 ~30 °C，90~11化/min，培養(yǎng)18~2地，8000巧m低溫離屯、收集菌體，用pH7.0的憐酸鹽緩沖 液，將收集得到的菌體按質(zhì)量分?jǐn)?shù)50 %制備菌懸液。取50ml菌懸液，添加30化1 (6g/L)下香 酪乳濁液同時(shí)加入15化1吐溫-80，1^巧111，30°(：震蕩搖床培養(yǎng)化后，再加入20化1(4旨/1)的 下香酪乳濁液，繼續(xù)轉(zhuǎn)化4她后。將轉(zhuǎn)化液10倍稀釋后進(jìn)行HPLC檢測(cè)，結(jié)果顯示，游離細(xì)胞轉(zhuǎn) 化下香酪生成4.77g/L的松柏醒和21mg/L的香草醒。此時(shí)轉(zhuǎn)化體系中還有2g/L的下香酪剩 余，松柏醒的摩爾轉(zhuǎn)化率為56.3%。
[0046] 雖然本發(fā)明已W較佳實(shí)施例公開(kāi)如上，但其并非用W限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該W權(quán)利要求書(shū)所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種藤倉(cāng)赤霉(Gibberella fujikuroi)ZH_34,已于2016年4月5日，保藏于中國(guó)典型 培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)是CCTCC NO:M 2016171，保藏地址是中國(guó)武漢武漢大學(xué)。2. -種應(yīng)用權(quán)利要求1所述藤倉(cāng)赤霉生產(chǎn)松柏醛的方法，其特征在于，是以藤倉(cāng)赤霉 CCTCC NO:M 2016171全細(xì)胞或其生產(chǎn)的酶為催化劑，以丁香酚為底物，構(gòu)建轉(zhuǎn)化體系生產(chǎn) 松柏醛。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，將藤倉(cāng)赤霉菌體添加到丁香酚溶液中，30 ~35°C，80~180r/min震蕩轉(zhuǎn)化24~60h。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，將藤倉(cāng)赤霉種子液按6~10%的接種量接 入發(fā)酵培養(yǎng)基，28~30°C，80~180r/min震蕩培養(yǎng)18~24h，添加底物丁香酚，30~35°C，80 ~180r/min震蕩轉(zhuǎn)化24~60h。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，將藤倉(cāng)赤霉種子液按6~10%的接種量接 入發(fā)酵培養(yǎng)基，28~30°C，80~180r/min震蕩培養(yǎng)18~24h，一次性添加終濃度為0.5~ 1.5g/L 的丁香酚，30 ~35°C，80 ~180r/min 震蕩轉(zhuǎn)化 24 ~60h。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，將藤倉(cāng)赤霉種子液按6~10%的接種量接 入發(fā)酵培養(yǎng)基，28~30°C，80~180r/min震蕩培養(yǎng)18~24h，先添加終濃度為0.5~1.5g/L的 丁香酚，30~35°C，80~180r/min，轉(zhuǎn)化6~8h，之后每間隔6~8h添加丁香酚;丁香酚共添加 4~6次，總添加量為2~9g/L。7. 根據(jù)權(quán)利要求4-6任一所述的方法，其特征在于，所述丁香酚以丁香酚乳濁液的形式 添加到轉(zhuǎn)化體系中。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述丁香酚乳濁液的制備:0.5~lml的吐 溫-80加入到50~100ml水中，115~121 °C滅菌20~30min后，添加1~2ml的丁香酸，80~ 150r/min震蕩乳化4~12h，制備成乳白色的丁香酸乳池液。9. 根據(jù)權(quán)利要求4-6任一所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基含:葡萄糖5~20g/ 1^，酵母膏2~18/1，1(2冊(cè)〇4 1~58/1，]\%5〇4 7!12〇0.2~1.(^/1，卩65〇4*7!12〇0.1~0.211^/1， GaCl2.2H20 0.1~0.4mg/L，H3B03 0.1~0.3mg/L，CuS04*5H20 0.02~0.04mg/L，KI0.05 ~0.111^/1，]\111504.7!120 0.1~0.411^/1，恥]\1〇04.2!120 0~0.211^/1印!16.5~7.5，裝液量 為50~100ml/500ml搖瓶，115~121 °C，滅菌20~30min。10. 權(quán)利要求1所述藤倉(cāng)赤霉的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用的領(lǐng)域包括食品、飼料、化 妝品、化學(xué)和醫(yī)藥領(lǐng)域，用于生產(chǎn)包括松柏醛、松柏醇、阿魏酸、香草醛在內(nèi)的化合物。
【文檔編號(hào)】C12N1/14GK105838626SQ201610296678
【公開(kāi)日】2016年8月10日
【申請(qǐng)日】2016年5月6日
【發(fā)明人】鄭璞, 陳鵬程, 張慧
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)