高粘度迪優(yōu)坦膠及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明描述了迪優(yōu)坦多糖的生產(chǎn)，所述多糖顯示粘度特性提高。通過(guò)產(chǎn)生鞘氨醇單孢菌ATCC53159的衍生物生產(chǎn)這種改進(jìn)的迪優(yōu)坦多糖，所述衍生物含有其中克隆了迪優(yōu)坦多糖的生物合成基因的多拷貝廣譜宿主性質(zhì)粒。所述質(zhì)粒能在宿主鞘氨醇單孢菌菌株內(nèi)產(chǎn)生用于這種多糖合成的多個(gè)基因拷貝。以這種方式提供的方法不僅能提高靶迪優(yōu)坦多糖的產(chǎn)量，還能產(chǎn)生物理特性改進(jìn)(上述較高的粘度)的迪優(yōu)坦多糖。已證實(shí)這種迪優(yōu)坦多糖在油田應(yīng)用和水泥材料中作為增粘劑可能特別有用。本發(fā)明還包括產(chǎn)生這種改進(jìn)迪優(yōu)坦多糖的創(chuàng)造性方法以及這種方法中產(chǎn)生改進(jìn)迪優(yōu)坦所需的新克隆基因。此外，本發(fā)明包括含有所需DNA序列的工程改造的新鞘氨醇單孢菌菌株。
【專利說(shuō)明】高粘度迪優(yōu)坦膠及其制備方法
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2006年10月31日，申請(qǐng)?zhí)枮椤?00680048801.9”，發(fā)明名稱為“高粘度迪優(yōu)坦膠及其制備方法”的申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
發(fā)明領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明描述了與重復(fù)單元類型相同的以前生產(chǎn)的多糖相比，顯示粘度特性增加的迪優(yōu)坦(diutan)多糖。通過(guò)產(chǎn)生鞘氨醇單孢菌(Sphingomonas sp.)ATCC53159的衍生物來(lái)制備這種改進(jìn)的迪優(yōu)坦多糖，所述衍生物含有其中克隆了迪優(yōu)坦多糖的生物合成基因的多拷貝廣譜宿主性質(zhì)粒。所述質(zhì)粒能在宿主鞘氨醇單孢菌菌株內(nèi)產(chǎn)生用于這種多糖合成的多個(gè)基因拷貝。以此方式提供的方法不僅能提高靶迪優(yōu)坦多糖的產(chǎn)量，還能產(chǎn)生物理特性改進(jìn)(上述較高的粘度)的迪優(yōu)坦多糖。現(xiàn)已證實(shí)這種迪優(yōu)坦多糖在油田應(yīng)用和水泥材料中作為增粘劑(viscosifier)可能特別有用。本發(fā)明還包括產(chǎn)生這種改進(jìn)迪優(yōu)坦多糖的創(chuàng)造性方法以及這種方法中產(chǎn)生改進(jìn)迪優(yōu)坦所需的新克隆基因。此外，本發(fā)明包括含有所需DNA序 列的工程改造的新鞘氨醇單孢菌菌株。
[0003]發(fā)明背景
[0004]多糖或樹(shù)膠一般用于使水溶液增稠或使之成為凝膠狀，通常分為兩類:增稠劑和膠凝劑。典型的增稠劑包括:淀粉、黃原膠、迪優(yōu)坦膠、文萊膠(welan gum)、瓜爾膠、羧甲基纖維素、海藻酸鹽、甲基纖維素、刺梧桐樹(shù)膠和黃蓍膠。常見(jiàn)的膠凝劑包括明膠、結(jié)冷膠、淀粉、海藻酸鹽、果膠、角叉菜聚糖、瓊脂和甲基纖維素。
[0005]多年來(lái)，某些多糖，或者更具體地說(shuō)，生物膠，例如黃原膠、結(jié)冷膠、文萊膠和迪優(yōu)坦膠通過(guò)微生物發(fā)酵生產(chǎn)。這些生物膠表現(xiàn)出不同特征，例如使其應(yīng)用于許多不同領(lǐng)域的粘度改進(jìn)能力。用于食品，例如糖果凝膠(confectionery jelly)、果醬和果凍、甜食凝膠、糖霜和乳制品，以及微生物培養(yǎng)基組分的膠凝劑屬于該清單。此外，可將增稠劑用于許多最終應(yīng)用領(lǐng)域以改進(jìn)靶液體的粘度。特別感興趣的是這些膠能改變地下和/或水下石油液體粘度，從而有助于收集這些液體，雖然可能有許多其它不同的最終應(yīng)用存在(例如，包括水泥生產(chǎn))。已從不同的細(xì)菌來(lái)源產(chǎn)生了不同的生物膠，例如野油菜黃單孢菌(Xanthomonascampestris)的黃原膠、伊樂(lè)藻鞘氨醇單孢菌(Sphingomonas elodea)的結(jié)冷膠、鞘氨醇單孢菌ATCC31555的文萊膠和鞘氨醇單孢菌ATCC53159的迪優(yōu)坦膠(S-657)。在過(guò)去已對(duì)這些菌株進(jìn)行了遺傳修飾以求明顯改變通過(guò)上述發(fā)酵方法產(chǎn)生的膠物質(zhì)。這種修飾能導(dǎo)致諸如除去?；茸兓?，從而產(chǎn)生表現(xiàn)出不同物理特性的不同膠物質(zhì)。這些遺傳修飾的類型一般是:通過(guò)改變宿主生物內(nèi)的基因表達(dá)來(lái)最終改變靶生物膠的組成，或者通過(guò)引入單獨(dú)顯示基因擴(kuò)增的質(zhì)粒來(lái)提高靶生物膠產(chǎn)量(例如授予Pollock等的美國(guó)專利號(hào)5，854，034，5，985，623和6，284，516以及授予Pollock個(gè)人的美國(guó)專利號(hào)6，709，845)。
[0006]迪優(yōu)坦膠(也稱為雜多糖(heterpolysaccharide) S-657)通過(guò)發(fā)酵菌株鞘氨醇單孢菌ATCC53159制備，其在水溶液中表現(xiàn)出增稠、助懸和穩(wěn)定特性。迪優(yōu)坦通常表現(xiàn)為六聚體重復(fù)單元，所述重復(fù)單元由主鏈中的4個(gè)糖(葡萄糖-葡糖醛酸-葡萄糖-鼠李糖)以及與所述葡萄糖殘基之一相連的兩鼠李糖殘基的側(cè)鏈構(gòu)成。迪優(yōu)坦膠的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)見(jiàn) Chowdhury, T.A.，B.Lindberg, U.Lindquist 和 J.Baird, CarbohydrateResearchl64(1987) 117-122。迪優(yōu)坦顯示每個(gè)重復(fù)單元具有兩個(gè)乙?；〈?參見(jiàn)Diltz等，Carbohydrate Research331 (2001) 265-270。兩篇參考文獻(xiàn)均通過(guò)引用全文納入本文。制備迪優(yōu)坦膠的細(xì)節(jié)可參見(jiàn)通過(guò)引用全文納入本文的美國(guó)專利號(hào)5，175，278?？刹捎脴?biāo)準(zhǔn)發(fā)酵技術(shù)，例如利用碳水化合物源(非限制性例子如葡萄糖、麥芽糖等)、氮源和其它鹽類從鞘氨醇單孢菌菌株制備迪優(yōu)坦。
[0007]某些工業(yè)需要各種野生型迪優(yōu)坦生物膠賦予的物理特征，特別是其粘度改進(jìn)特性和/或保水特性。不幸的是，已證實(shí)產(chǎn)生迪優(yōu)坦的成本效率低。此外，目前這些成本問(wèn)題妨礙了迪優(yōu)坦的廣泛應(yīng)用，因?yàn)檫@種生物膠所表現(xiàn)出的粘度不足以替代其它更便宜但有效的生物膠(例如，黃原膠)。因此，需要提供至少能以較低成本生產(chǎn)這種有效迪優(yōu)坦的方法，和/或提供生產(chǎn)物理特性顯示明顯改進(jìn)的迪優(yōu)坦型生物膠的方式。目前，對(duì)任何類型的相關(guān)結(jié)冷膠類多糖(sphingan)生產(chǎn)的唯一描述(對(duì)于迪優(yōu)坦未證明有任何特異性)涉及較高的產(chǎn)率(見(jiàn)上述Pollock等的專利)?，F(xiàn)在還沒(méi)有任何方式討論或合理地提出能提供某種方法來(lái)生產(chǎn)分子量較高的迪優(yōu)坦膠，借助這種生產(chǎn)方法，所述迪優(yōu)坦膠在粘度測(cè)量值會(huì)體現(xiàn)出改善。
[0008]發(fā)明簡(jiǎn)述
[0009]現(xiàn)已知道，在宿主鞘氨醇單孢菌微生物內(nèi)擴(kuò)增迪優(yōu)坦生物合成所用的某些新分離的DNA序列不僅能提高迪優(yōu)坦膠產(chǎn)量，還產(chǎn)生了表現(xiàn)出粘度特性增加的迪優(yōu)坦膠。因此，這種新的DNA序列(通過(guò)任何熟知的方法，例如但不限于利用質(zhì)粒引入宿主微生物內(nèi))提供了迪優(yōu)坦合成方法所尋求的所需結(jié)果。采用質(zhì)粒擴(kuò)增這些基因的這種方法的明顯優(yōu)點(diǎn)在于將這種分離DNA序列摻入迪優(yōu)坦合成過(guò)程較為簡(jiǎn)單。另一優(yōu)點(diǎn)是能產(chǎn)生這種粘度特性較高的靶迪優(yōu)坦膠，同時(shí)還 可能提高發(fā)酵生產(chǎn)效率(如果需要的話)。
[0010]因此，本發(fā)明包括在許多不同的粘度測(cè)試中表現(xiàn)出改進(jìn)的迪優(yōu)坦膠。其中:i)固有粘度高于150，優(yōu)選高于155，更優(yōu)選高于160dL/g ；ii)海水3rpm粘度高于35，優(yōu)選高于37,更優(yōu)選高于40,最優(yōu)選高于42表盤(pán)讀數(shù)(dialreading) ；iii)海水0.3rpm粘度高于35，000，優(yōu)選高于39，000，更優(yōu)選高于40，000，最優(yōu)選高于41，000厘泊(cP) ；PEG低剪切率粘度高于3500，優(yōu)選高于3700，更優(yōu)選高于3900，最優(yōu)選高于4000cP。如以上術(shù)語(yǔ)所定義的，本發(fā)明還包括產(chǎn)生這種迪優(yōu)坦膠的方法，所述方法通過(guò)將特定的基因簇引入宿主鞘氨醇微生物并發(fā)酵所述微生物以產(chǎn)生迪優(yōu)坦膠。此外，本發(fā)明包括特定的DNA序列和任何載體(例如質(zhì)粒)來(lái)提供基因的多個(gè)拷貝或利用更強(qiáng)的啟動(dòng)子來(lái)提高這些基因表達(dá)，等等。另外，還包括遺傳修飾的鞘氨醇菌株，所述菌株含有這種獨(dú)特的分離DNA序列所確定的迪優(yōu)坦生物合成基因的多個(gè)拷貝。
[0011]本發(fā)明的另一方面提供了一種生產(chǎn)迪優(yōu)坦膠的方法，所述方法包括:
[0012]將至少一種迪優(yōu)坦生物合成酶的編碼序列引入產(chǎn)生迪優(yōu)坦的鞘氨醇單孢菌宿主微生物；
[0013]在發(fā)酵條件下培養(yǎng)該宿主微生物，從而使得該宿主微生物產(chǎn)生至少顯示以下特征之一的迪優(yōu)坦膠:
[0014]a)固有粘度大于150dL/G ；
[0015]b)海水3rpm粘度高于35表盤(pán)讀數(shù)；[0016]c)海水0.3rpm粘度高于35，000厘泊；和
[0017]d)聚乙二醇分散劑存在時(shí)的低剪切率粘度高于3500厘泊。
[0018]發(fā)現(xiàn)這種獨(dú)特的分離DNA序列需要至少一種迪優(yōu)坦生物合成酶，即DpsG聚合酶。在另一可能的實(shí)施方式中，這種迪優(yōu)坦生物合成酶包括DpsG聚合酶和葡萄糖-1-磷酸胸苷基轉(zhuǎn)移酶；dTDP-6-脫氧-葡萄糖-3-5-差向異構(gòu)酶；dTDP-D-葡萄糖-4，6-脫水酶；和dTDP-6-脫氧-L-甘露糖-脫氫酶。在還有另一可能的實(shí)施方式中，這種迪優(yōu)坦生物合成酶包括DpsG聚合酶和鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶IV ;β-1，4-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶II ;葡糖基-異戊二烯基磷酸轉(zhuǎn)移酶I ;和葡糖基轉(zhuǎn)移酶III。在還有另一可能的實(shí)施方式中，這種迪優(yōu)坦生物合成酶包括DpsG聚合酶和多糖輸出蛋白DpsD、DpsC和DpsE。在還有另一可能的實(shí)施方式中，這種diutab生物合成酶包括鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶IV ； β -1, 4-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶II ；葡糖基-異戊二烯基磷酸轉(zhuǎn)移酶I;葡糖基轉(zhuǎn)移酶in ;葡萄糖-1-磷酸胸苷基轉(zhuǎn)移酶；dTDP-6-脫氧-D-葡萄糖-3-5-差向異構(gòu)酶；dTDP_D-葡萄糖-4，6-脫水酶；和dTDP_6-脫氧-L-甘露糖-脫氫酶。本發(fā)明方法和屬于本發(fā)明產(chǎn)物的迪優(yōu)坦生物合成酶一般選自--聚合酶；裂合酶；鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶IV ； β -1, 4-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶II ;葡糖基轉(zhuǎn)移酶III ;多糖輸出蛋白；分泌蛋白；葡糖基-異戊二烯基磷酸轉(zhuǎn)移酶I;葡萄糖-1-磷酸胸苷基轉(zhuǎn)移酶；dTDP-6-脫氧-D-葡萄糖-3-5-差向異構(gòu)酶；dTDP-D-葡萄糖-4，6-脫水酶；dTDP_6-脫氧-L-甘露糖-脫氫酶和它們的組合。本發(fā)明還包括分離的核酸分子(除靶染色體上可能存在的DNA外)，其編碼如以下SEQIDN0所示的至少一種迪優(yōu)坦生物合成酶:5、7、9、11、13、
15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41 和 43 ;或編碼與以下 SEQIDN0 有至少 95%相同的酶 5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41 和 43。
[0019]在某些實(shí)施方案中，所述核酸分子可編碼迪優(yōu)坦聚合酶。
[0020]在某些實(shí)施方案中，所述核酸分子可編碼迪優(yōu)坦聚合酶和多糖輸出蛋白。
[0021]在某些實(shí)施方案中，所述核酸分子可編碼迪優(yōu)坦聚合酶和鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶IV ;葡糖基-異戊二烯基磷酸轉(zhuǎn)移酶I ;β-1，4-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶II ;和葡糖基轉(zhuǎn)移酶III。
[0022]在某些實(shí)施方案中，所述核酸分子可編碼迪優(yōu)坦聚合酶和葡萄糖-1-磷酸胸苷基轉(zhuǎn)移酶；dTDP-6-脫氧-D-葡萄糖-3-5-差向異構(gòu)酶；dTDP_D-葡萄糖-4，6-脫水酶；和dTDP-6-脫氧-L-甘露糖_脫氫酶。
[0023]在某些實(shí)施方案中，所述核酸分子可編碼迪優(yōu)坦聚合酶；裂合酶；鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶IV ;β-1，4-葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶II ;葡糖基轉(zhuǎn)移酶III ;多糖輸出蛋白；分泌蛋白；葡糖基-異戊二烯基磷酸轉(zhuǎn)移酶I ;葡萄糖-1-磷酸胸苷基轉(zhuǎn)移酶；dTDP-6-脫氧-D-葡萄糖-3-5-差向異構(gòu)酶；dTDP-D-葡萄糖-4，6-脫水酶；和dTDP-6-脫氧-L-甘露糖-脫氫酶。
[0024]在某些實(shí)施方案中，所述核酸分子可包含SEQIDN0:1所示核酸序列。
[0025]本發(fā)明的又一方面提供了一種制備結(jié)冷膠類多糖膠的方法，所述結(jié)冷膠類多糖的平均聚合物長(zhǎng)度較長(zhǎng)，所述方法包括:
[0026]將至少一種結(jié)冷膠類多糖聚合酶的編碼序列引入產(chǎn)生結(jié)冷膠類多糖的鞘氨醇單孢菌宿主微生物；
[0027]在發(fā)酵條件下培養(yǎng)該宿主微生物，從而使得該宿主微生物產(chǎn)生的結(jié)冷膠類多糖膠的平均聚合物長(zhǎng)度長(zhǎng)于引入所述編碼序列前該鞘氨醇微生物產(chǎn)生的。[0028]因此，本發(fā)明方法(以及由此制備的產(chǎn)品)涉及結(jié)冷膠類多糖膠，特別是迪優(yōu)坦型，包括但不限于:S88、S60和S657。
[0029]如上所述，本發(fā)明是發(fā)展的頂點(diǎn)，并且實(shí)現(xiàn)了將多拷貝的特定DNA序列引入某些鞘氨醇單孢菌菌株增加高粘度迪優(yōu)坦多糖的生物合成產(chǎn)量。與非工程改造的細(xì)菌相比，含有用于提高產(chǎn)量的這些基因的工程改造細(xì)菌產(chǎn)生的迪優(yōu)坦多糖量明顯較高，同時(shí)產(chǎn)生了上述的高粘度特性。
[0030]按照本發(fā)明，可通過(guò)本領(lǐng)域熟知的技術(shù)分離、回收和克隆引入宿主微生物中的DNA序列(采取任何熟知的形式，例如非限制性的例子還是質(zhì)粒)，從而產(chǎn)生上述產(chǎn)量增加和粘度增加的特性(不想依賴于任何具體的科學(xué)理論，但據(jù)信這是經(jīng)由分子量范圍特性增加所致)。然后，將多拷貝的所述DNA遞送入鞘氨醇單孢菌屬細(xì)菌中(借助質(zhì)粒，其它已知的方式)或借助合適的例如更強(qiáng)啟動(dòng)子提高基因表達(dá)。插入靶細(xì)菌后，可通過(guò)發(fā)酵該工程改造細(xì)菌并根據(jù)所產(chǎn)生的數(shù)量和質(zhì)量來(lái)比較產(chǎn)量從而測(cè)定迪優(yōu)坦的生產(chǎn)情況。通過(guò)比較本發(fā)明方法所得的迪優(yōu)坦產(chǎn)量和野生型迪優(yōu)坦生產(chǎn)菌株(ATCC53159)的可同時(shí)測(cè)定產(chǎn)量增加和粘度增加(量)。
[0031]發(fā)明詳述
[0032]與本發(fā)明有關(guān)的以下術(shù)語(yǔ)用于通篇說(shuō)明書(shū)中，其意義如下所示:
[0033]通篇說(shuō)明書(shū)利用術(shù)語(yǔ)“鞘氨醇單孢菌”指鞘氨醇單孢菌屬的革蘭氏陰性細(xì)菌菌株。
[0034]通篇說(shuō)明書(shū)利用術(shù)語(yǔ)“提高的生產(chǎn)者”或“提高的生產(chǎn)”描述含有多拷貝DNA序列的工程改造細(xì)菌，所述DNA序列分離自與野生型細(xì)菌的相同菌株相比產(chǎn)生顯著較高(以重量計(jì)至少高約5%) 迪優(yōu)坦多糖的相同菌株。
[0035]利用術(shù)語(yǔ)“分離的”描述從某微生物中取出并經(jīng)歷至少一定程度純化，即一步或多步純化步驟的DNA，可利用限制性酶切割所述DNA并將其克隆或插入質(zhì)粒載體，或者插入或摻入細(xì)菌中。
[0036]利用術(shù)語(yǔ)“序列”描述根據(jù)其核苷酸單位鑒定的具體DNA區(qū)段。通篇說(shuō)明書(shū)利用術(shù)語(yǔ)“插入”描述將從生產(chǎn)迪優(yōu)坦的鞘氨醇單孢菌菌株的染色體DNA分離的DNA區(qū)段轉(zhuǎn)移入鞘氨醇單孢菌菌株的過(guò)程和結(jié)果(非限制性例子是借助質(zhì)粒)。首先可采用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)將這種分離的DNA引入(依然是非限制性的可能性)所需質(zhì)粒(此處是PLAFR3)，然后通過(guò)，例如接合或遷移將其轉(zhuǎn)移入受者鞘氨醇單孢菌細(xì)菌。插入受者鞘氨醇單孢菌細(xì)菌后，含有相關(guān)DNA序列的質(zhì)粒在受:者細(xì)胞中復(fù)制，從而獲得廣生聞?wù)扯?仍然相/[目是聞分子量范圍的)迪優(yōu)坦多糖所需的DNA區(qū)段的若干(至少兩個(gè)，一般是4-10個(gè))拷貝。采用接合或遷移將所述質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)移入受者細(xì)菌通常是有效的。還可利用純化的DNA以電穿孔或化學(xué)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。可利用其它載體或噬菌體將DNA轉(zhuǎn)移入宿主細(xì)胞中。在產(chǎn)生迪優(yōu)坦的受者鞘氨醇單孢菌中，無(wú)需使DNA區(qū)段維持在質(zhì)粒(或其它熟知的遞送載體)上。將其它的數(shù)拷貝DNA區(qū)段引入細(xì)菌染色體是慣常的，從而可通過(guò)復(fù)制細(xì)菌DNA的相同機(jī)制復(fù)制各代區(qū)段?；蛘?，可利用更強(qiáng)的啟動(dòng)子元件提高基因表達(dá)。
[0037]利用術(shù)語(yǔ)“基因擴(kuò)增”表示例如通過(guò)將靶基因克隆到多拷貝質(zhì)粒上(例如，4-10個(gè)拷貝)或?qū)⒒虻亩鄠€(gè)拷貝(例如，4-10個(gè))插入細(xì)菌基因組中來(lái)增加基因的拷貝數(shù)，或者表示通過(guò)修飾啟動(dòng)子元件來(lái)增加基因表達(dá)。這些方法和其它方法均可增加所編碼蛋白質(zhì)的數(shù)量。[0038]通篇說(shuō)明書(shū)利用術(shù)語(yǔ)“生物合成”描述通過(guò)鞘氨醇單孢菌細(xì)菌生物學(xué)產(chǎn)生或合成迪優(yōu)坦。通過(guò)許多細(xì)菌酶所調(diào)控的一系列步驟從單個(gè)碳水化合物單元合成迪優(yōu)坦多糖。
[0039]可以任何選擇的形式(例如仍然優(yōu)選質(zhì)粒形式，但不一定)摻入受者細(xì)菌的相關(guān)DNA序列編碼已知對(duì)迪優(yōu)坦多糖的產(chǎn)量增加和分子量增加有益或必需的遺傳信息。此外，不依賴于具體的科學(xué)理論，雖然據(jù)信本發(fā)明具體DNA序列(例如質(zhì)粒pS8中的)能誘導(dǎo)，而不只是提高產(chǎn)量，但還增加了在迪優(yōu)坦本身的各聚合物內(nèi)聚合的重復(fù)單元數(shù)量。因此，據(jù)信重復(fù)單元的這種增加使得迪優(yōu)坦膠提供的粘度特性出乎意料地高。由于檢測(cè)到固有粘度增加，因而可假定分子量增加，二者有冪定律關(guān)系。因此，已知線形聚合物(如迪優(yōu)坦膠)的固有粘度實(shí)際上以那種關(guān)系與分子量成比例。
[0040]采用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和方法分離相關(guān)DNA序列，所述DNA序列是本發(fā)明方法的基礎(chǔ)并產(chǎn)生了粘度增加的迪優(yōu)坦多糖。因此，可采用標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)產(chǎn)生迪優(yōu)坦的鞘氨醇單孢菌菌株，進(jìn)而從中產(chǎn)生這些序列。然后可通過(guò)，例如先將細(xì)菌細(xì)胞離心并重懸，再經(jīng)純化柱洗脫DNA進(jìn)行DNA提取。純化完成后，可用限制性核酸內(nèi)切酶消化分離的DNA，克隆入所需質(zhì)?；蚱渌f送載體中，然后轉(zhuǎn)移至受者菌株?？刹捎帽绢I(lǐng)域已知的其它技術(shù)而不作具體限定。
[0041]在本發(fā)明中，DNA的克隆取決于本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的常規(guī)技術(shù)和方法。應(yīng)該注意，可采用任何方法克隆本發(fā)明DNA區(qū)段，本發(fā)明不限于，例如利用質(zhì)粒克隆載體。例如，可通過(guò)插入噬菌體載體來(lái)克隆DNA片段。
[0042]然后可利用質(zhì)粒或其它遞送載體將克隆的DNA序列引入鞘氨醇單孢菌菌株。然后可通過(guò)發(fā)酵，利用遺傳修飾的鞘氨醇單孢菌菌株產(chǎn)生迪優(yōu)坦。適于發(fā)酵的培養(yǎng)基基本上是水性培養(yǎng)基，其通常含有碳源，例如包括葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖或麥芽糖糊精在內(nèi)的碳水化合物；氮源，例如無(wú)機(jī)銨，有機(jī)硝酸酯，有機(jī)氨基酸或蛋白物質(zhì)，如水解酵母菌、大豆粉或酪蛋白、蒸餾酒廠廢液濃縮物或玉米漿；和無(wú)機(jī)鹽。各種發(fā)酵培養(yǎng)基支持產(chǎn)生本發(fā)明迪優(yōu)坦。
[0043]發(fā)酵肉湯中可含有各種含量的碳水化合物，但以重量計(jì)通常在發(fā)酵培養(yǎng)基的約1-10%之間(優(yōu)選2-8%)。可先加入碳水化合物，再發(fā)酵，或者可在發(fā)酵期間加入。以重量計(jì)，水性培養(yǎng)基中的氮含量在約0.01%-約0.4%。可使用一種碳源或氮源，也可使用這些碳氮源的混合物。發(fā)酵鞘氨醇單孢菌細(xì)菌可用的無(wú)機(jī)鹽是含有鈉、鉀、銨、硝酸根、鈣、磷酸根、硫酸根、氯、碳酸根和相似離子的鹽類。還優(yōu)選包含痕量金屬，例如鎂、錳、鈷、鐵、鋅、銅、鑰、碘化物和硼酸鹽。
[0044]發(fā)酵可在約25V -40°C之間，優(yōu)選約27°C -35°C的溫度范圍進(jìn)行。可通過(guò)體積放大的標(biāo)準(zhǔn)方法制備接種物，包括搖瓶培養(yǎng)和小規(guī)模的深層攪拌發(fā)酵。制備接種物的培養(yǎng)基可以與生產(chǎn)培養(yǎng)基相同，或者可以是本領(lǐng)域熟知的幾種標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中的任一種，例如Luria肉湯或YM培養(yǎng)基。可采用多個(gè)種子階段(seed stage)以獲得所需的接種體積。典型的接種體積范圍是最終發(fā)酵總體積的約0.5%-約10%。
[0045]發(fā)酵容器可裝有攪拌器來(lái)攪拌內(nèi)含物。該容器還可裝有自動(dòng)pH和氣泡控制裝置?？蓪⑸a(chǎn)培養(yǎng)基加入容器中，通過(guò)加熱來(lái)適當(dāng)滅菌?；蛘?，可先將碳水化合物或碳源單獨(dú)滅菌再加入容器中。可將經(jīng)培養(yǎng)的種子培養(yǎng)液加入冷卻的培養(yǎng)基中(通常在約27°C -約35°C的優(yōu)選發(fā)酵溫度)，攪拌發(fā)酵培養(yǎng)液約48-約110小時(shí)，從而產(chǎn)生高粘度的肉湯。通過(guò)用醇，一般是異丙醇沉淀等標(biāo)準(zhǔn)方法從肉湯中回收迪優(yōu)坦多糖。[0046]本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式
[0047]提供以下實(shí)施例是為說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例的描述不應(yīng)誤解為以任何方式限制了本發(fā)明的范圍。
[0048]DNA序列分離/質(zhì)粒產(chǎn)牛
[0049]為首先分離和測(cè)定上述創(chuàng)造性結(jié)果的合適序列，如下所示構(gòu)建ATCC53159微生物的基因文庫(kù):分離鞘氨醇單孢菌ATCC53159的染色體DNA，用Sau3AI限制性核酸內(nèi)切酶部分消化。用瓊脂糖凝膠純化15-50kb范圍內(nèi)的DNA片段，將這些片段連接入BamHI消化的粘粒克隆載體pLAFR3(根據(jù)Staskawicz等,“分子表征丁香假單胞菌大豆致病變種群 O 和群 I 的克隆無(wú)毒力基因”(Molecular characterization of cloned avirulencegenes from raceOand racelof Pseudomonas syrinae pv.Glycinea), J.Bacteriology.1987.169:5789-94),該載體分離自大腸桿菌(Eschericia coli)菌株 JZ279 (Harding 等，“在野油菜黃單孢菌中生物合成黃原膠必需的基因簇的遺傳學(xué)和物理分析”(Genetic andphysical analysis of a cluster of genes essential for xanthan gum biosynthesisin Xanthomonas campestris), J.Bacteriology.1987.169:2854-61)。將連接反應(yīng)(產(chǎn)物)包裝入λ噬菌體顆粒(利用吉格帕克III金包裝提取物(Gigapack III Gold packagingextract),斯特拉基因公司(Stratagene),拉霍亞，加利福尼亞州)，并轉(zhuǎn)染入文庫(kù)效率(Library Efficiency)大腸桿菌 DH5 a MCR 細(xì)胞中(生命技術(shù)公司(Life Technologies),羅克維爾，馬里蘭州)。合并約10，000個(gè)四環(huán)素耐受性菌落以形成基因文庫(kù)。然后分離該文庫(kù)的各序列。該實(shí)施例所進(jìn)行的這項(xiàng)工作包括從鞘氨醇單孢菌ATCC53159微生物分離用于多糖生物合成的特定基因。
[0050]通過(guò)與多糖合成缺 陷型突變體，特別是第一個(gè)步驟，即葡糖基轉(zhuǎn)移酶I被阻斷的那些突變體互補(bǔ)來(lái)鑒定用于多糖生物合成的這些基因。由于最初未獲得ATCC53159的轉(zhuǎn)移酶I缺陷型突變體，利用與伊樂(lè)藻鞘氨醇單孢菌和野油菜黃單孢菌的轉(zhuǎn)移酶I缺陷型突變體互補(bǔ)來(lái)鑒定用于迪優(yōu)坦多糖生物合成的基因?？衫锰峁㊣ncP轉(zhuǎn)移功能的輔助質(zhì)粒，通過(guò)三-親本接合(tr1-parental conjugation)將質(zhì)粒pLAFR3從其大腸桿菌宿主轉(zhuǎn)移至其它革蘭氏陰性細(xì)菌(根據(jù)Ditta等，“革蘭氏陰性細(xì)菌的廣譜宿主性DNA克隆系統(tǒng):構(gòu)建苜猜根瘤菌的基因庫(kù)”(Broad host range DNA cloning system forgram-negative bacteria:construction of a gene bank of Rhizobium meliloti),Proc.Natl.Acad.Sc1.1980.77:7347-51.)。大腸桿菌中每個(gè)染色體的RK2型質(zhì)粒拷貝數(shù)估計(jì)有5-7個(gè)(Figurski等，“利用體外構(gòu)建的雜交質(zhì)粒中的IncP-1質(zhì)粒RK2抑制ColEl復(fù)制特性，，(Suppression of CoIEl replication properties by the Inc P-1 plasmid RK2inhybrid plasmids constructed in vitro), J.Mo1.Biol.1979133:295-318.)。
[0051]通過(guò)三親本接合將大腸桿菌中的ATCC53159染色體DNA的基因文庫(kù)轉(zhuǎn)移入伊樂(lè)藻鞘氨醇單孢菌ATCC31461的非黏液突變體(nonmucoid mutant) (GPS2),選擇四環(huán)素和氯霉素耐受性。所用的輔助質(zhì)粒是pRK2013(大腸桿菌菌株JZ279中)，其含有窄宿主性復(fù)制起點(diǎn)，但顯示出遷移PLAFR3所需的反式作用功能(trans acting function)。質(zhì)粒pRK2013在鞘氨醇單孢菌菌株中不復(fù)制。伊樂(lè)藻鞘氨醇單孢菌ATCC31461產(chǎn)生多糖結(jié)冷膠。結(jié)冷膠和迪優(yōu)坦多糖均具有由[—4) - a -L-鼠李糖-(I — 3) - β -D-葡萄糖-(I — 4) - β -D-葡糖醛酸-(I — 4)-13-D-葡萄糖-(I —]構(gòu)成的相同四糖重復(fù)單元。然而，迪優(yōu)坦還包含與所述葡萄糖殘基之一相連的兩個(gè)鼠李糖分子構(gòu)成的側(cè)鏈，該側(cè)鏈經(jīng)乙?；揎?，而結(jié)冷膠不具有側(cè)鏈糖并經(jīng)乙?；透视突揎棥Ｍ蛔冃虶PS2在多糖生物合成的第一步中有缺陷，即通過(guò)葡糖基轉(zhuǎn)移酶I將葡萄糖-1-磷酸從m)P-D-葡萄糖轉(zhuǎn)移至細(xì)菌異戊二烯基(bactoprenyl)磷酸脂質(zhì)載體。以非黏液菌落為背景，從四環(huán)素選擇平板分離產(chǎn)生多糖(黏液)的菌落。推測(cè)恢復(fù)產(chǎn)生多糖的克隆包含編碼葡糖基轉(zhuǎn)移酶I的ATCC53159基因加上約20-25kb毗連DNA。從8個(gè)黏液GPS2轉(zhuǎn)接合子分離質(zhì)粒DNA，通過(guò)電穿孔轉(zhuǎn)移至大腸桿菌菌株DH5ci (生命技術(shù)公司)。從大腸桿菌分離質(zhì)粒以而獲得用于限制性核酸內(nèi)切酶HindIII/Ec0RI(切割多接頭中BamHI限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)的任一側(cè))進(jìn)行雙重消化的足夠DNA，進(jìn)而從載體上切下插入的DNA。通過(guò)凝膠電泳測(cè)定克隆中插入DNA的大小。通過(guò)從側(cè)接載體的BamHI位點(diǎn)的質(zhì)粒序列的特異性引物開(kāi)始測(cè)序來(lái)測(cè)定幾種質(zhì)粒的終序列。利用BLASTX比較計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列來(lái)分析各序列。類似地，通過(guò)三親本接合將ATCC53159基因文庫(kù)轉(zhuǎn)移入轉(zhuǎn)移酶I缺陷的利福平耐藥性非黏液野油菜黃單孢菌突變體(CXC109)中(例如，上述Harding等的參考文獻(xiàn)所述)，選擇四環(huán)素和利福平耐藥性。野油菜黃單孢菌產(chǎn)生黃原膠多糖，轉(zhuǎn)移酶I將葡萄糖-1-磷酸從M)P-D-葡萄糖轉(zhuǎn)移至細(xì)菌異戊二烯基磷酸脂質(zhì)載體也能啟動(dòng)其合成(Ielpi等，“在野油菜黃單孢菌中順序裝配和聚合黃原膠多糖的聚異戍烯醇連接的五糖重復(fù)單兀”(Sequential assembly and polymerization of thepolypreno1-1 inked pentasaccharide repeating unit of the xanthan polysaccharidein Xanthomonas campestris), J.Bacteriology.1993.175:2490-500)。如上所述從黏液轉(zhuǎn)接合子純化質(zhì)粒并如上所述測(cè)定末端序列。
[0052]德克薩斯州休斯頓市的拉克技術(shù)公司(Lark Technologies Inc.,Houston,TX)采用雙鏈鳥(niǎo)槍測(cè)序?qū)寺≡谫|(zhì)粒PS8和pX6中的S657DNA進(jìn)行了完全測(cè)序。分析了這些序列以鑒定用于迪優(yōu)坦生物合成的基因。根據(jù)與數(shù)據(jù)庫(kù)中其它基因，特別用于S-88結(jié)冷膠類多糖(例如，上述‘516Pollock等的專利所述的)、GeneBan k登錄號(hào)U51197和結(jié)冷膠(GenBankAY217008和AY220099)生物合成的公布基因的同源性指定基因功能。鑒定了編碼主鏈中四種糖的轉(zhuǎn)移酶的基因和用于dTDP-鼠李糖合成的4種基因。用于多糖分泌的基因基于與生物合成其它多糖的基因的同源性。兩種基因編碼與參與蛋白質(zhì)分泌的蛋白質(zhì)同源的蛋白質(zhì)。推測(cè)兩種基因編碼聚合酶和裂合酶。質(zhì)粒PX6中的插入物含有17種基因，包括編碼轉(zhuǎn)移酶I (啟動(dòng)迪優(yōu)坦合成的第一步)的基因dpsB，用于分泌的基因和用于dTDP-鼠李糖合成的4種基因，但缺乏轉(zhuǎn)移酶I1、III和IV的基因，和聚合酶及裂合酶的推測(cè)基因。質(zhì)粒pS8含有dps基因簇的20種基因，包括所有4種主鏈糖轉(zhuǎn)移酶的基因，用于dTDP-鼠李糖合成的四種基因，用于多糖分泌的基因，包括聚合酶和連接酶的推測(cè)基因，但缺乏功能未知的基因，orf6和orf7。質(zhì)粒pS6含有用于分泌和4種糖轉(zhuǎn)移酶的基因，但不含用于dTDP-鼠李糖合成的所有基因或聚合酶的基因。質(zhì)粒PX4只含有dps區(qū)域的一小部分，但包含Pollock等報(bào)道的用于dTDP-鼠李糖合成的4種基因和編碼轉(zhuǎn)移酶I的基因，從而足以導(dǎo)致鞘氨醇菌株中多糖產(chǎn)量增加。
[0053]菌株產(chǎn)牛
[0054]然后通過(guò)上述的三親本接合將上述四種質(zhì)粒引入鞘氨醇單孢菌ATCC53159號(hào)菌株中，從而形成新的S657工程改造菌株(S657/pS8、S657/pS6、S657/pX6和S657/pX4)。然后如上所述進(jìn)行發(fā)酵，從而產(chǎn)生了下述的生物膠物質(zhì)。所有4種質(zhì)粒對(duì)迪優(yōu)坦生產(chǎn)量均產(chǎn)生有益作用；然而，PS8質(zhì)粒還出乎意料地極大提高了迪優(yōu)坦粘度并增加了其分子量。提供了 pS8的DNA序列(26278bp) (I號(hào)DNA序列)，下表1中以表格的形式列出了編碼的基因。質(zhì)粒pS8中的插入物DNA包含基因DpsG到rmlD和基因dpsS和orf7的一部分。
[0055]以下基因列表基本上是質(zhì)粒pS8中插入物的DNA序列所代表基因的清單。
[0056]表1
[0057]
【權(quán)利要求】
1.一種迪優(yōu)坦膠，其顯示固有粘度高于約150deciL/g多至約170.7deciL/g。
2.如權(quán)利要求1所述的迪優(yōu)坦膠，其顯示固有粘度高于約155deciL/g多至約170.7deciL/g。
3.如權(quán)利要求2所述的迪優(yōu)坦膠，其顯示固有粘度高于約160deciL/g多至約170.7deciL/g。
4.一種迪優(yōu)坦膠，其顯示海水3rpm粘度高于約35表盤(pán)讀數(shù)多至約47表盤(pán)讀數(shù)。
5.如權(quán)利要求4所述的迪優(yōu)坦膠，其顯示海水3rpm粘度高于約37表盤(pán)讀數(shù)多至約47表盤(pán)讀數(shù)。
6.如權(quán)利要求5所述的迪優(yōu)坦膠，其顯示海水3rpm粘度高于約40表盤(pán)讀數(shù)多至約47表盤(pán)讀數(shù)。
7.如權(quán)利要求6所述的迪優(yōu)坦膠，其顯示海水3rpm粘度高于約42表盤(pán)讀數(shù)多至約47表盤(pán)讀數(shù)。
8.—種迪優(yōu)坦膠,其顯示海水0.3rpm粘度高于約35，OOOcp多至約41，500cp。
9.如權(quán)利要求8所述的迪優(yōu)坦膠,其顯示海水0.3rpm粘度高于約38，OOOcp多至約41，500cp。`
10.如權(quán)利要求9所述的迪優(yōu)坦膠,其顯示海水0.3rpm粘度高于約39，OOOcp多至約41，500cp。
11.如權(quán)利要求10所述的迪優(yōu)坦膠,其顯示海水0.3rpm粘度高于約40，OOOcp多至約41，500cp。
12.如權(quán)利要求11所述的迪優(yōu)坦膠，其顯示海水0.3rpm粘度高于約41，OOOcp多至約41，500cp。
13.—種迪優(yōu)坦膠，其在聚乙二醇分散劑存在下顯示低剪切率粘度高于約3500cp多至約 4980cp。
14.如權(quán)利要求13所述的迪優(yōu)坦膠，其在聚乙二醇分散劑存在下顯示低剪切率粘度高于約3700cp多至約4980cp。
15.如權(quán)利要求14所述的迪優(yōu)坦膠，其在聚乙二醇分散劑存在下顯示低剪切率粘度高于約3900cp多至約4980cp。
16.如權(quán)利要求15所述的迪優(yōu)坦膠，其在聚乙二醇分散劑存在下顯示低剪切率粘度高于約4000cp多至約4980cp。
【文檔編號(hào)】C08B37/00GK103772520SQ201310209621
【公開(kāi)日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2006年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2005年11月1日
【發(fā)明者】Y·N·帕特爾, R·科爾曼, S·馬茨克 申請(qǐng)人:Cp凱爾科美國(guó)股份有限公司