多肽本申請是申請日為2006年12月5日，申請?zhí)枮椤?00680052351.0”，發(fā)明名稱為“多肽”的申請的分案申請。發(fā)明領域本發(fā)明涉及結合表皮生長因子受體(EGFR)的多肽。該多肽在醫(yī)藥學、獸醫(yī)學、成像、分離技術和診斷學中具有工業(yè)應用。背景在表皮生長因子受體家族中(EGFR-家族，也稱為ErbB受體家族)，受體異常表達通常與肺、胸、前列腺、結腸、卵巢、頭和頸的各種惡性腫瘤相關。研究該受體家族以獲得對受體與病人預后和治療之間聯(lián)系的更好理解，這是令人感興趣的。該家族由四個跨膜受體組成，表皮生長因子受體EGFR(ErbB1/HER1)、HER2(ErbB2/neu)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)(GullickWJ.EndocrReICanc2001；8：75-82；WittonCJ.etalJPathol2003；200：290-297)。每個受體包含細胞外配體結合結構域，跨膜結構域和細胞內(nèi)酪氨酸激酶結構域(除了HER3，其缺少功能性酪氨酸激酶結構域)(CitriA，etal.ExpCellRes2003；284(1)：54-65；HarariDandYardenY.Oncogene2002；19：6102-6114)。存在一個幾乎沒有ECD-EGFRvIII的EGFR變體，WikstrandCJetalCancerRes.55：3140-3148，1995；HuangHSetalJBiol.Chem.272：2927-2935，1997；KuanCT，etalEndocr.Relat.Cancer8：83-96，2001。當配體與EGFR家族的受體結合，受體被刺激形成二聚體，或者與另一個同樣受體結合(同二聚化)或者與家族內(nèi)的另一個受體結合(異二聚化)(OlayioyeMA，etal.EmboJ.2000；19：3159-67；YardenY，SliwkowskiMX.CellBiol2001；2：127-37)。受體二聚化激活細胞內(nèi)酪氨酸激酶結構域，導致增殖、遷移、凋亡、分化或其他細胞過程(YardenY，SliwkowskiMX.CellBiol2001；2：127-37；WellsA.IntJBiochemCellBiol1999；31：637-643；VermeerPDetal.Nature2003；422：322-6)。EGFR和HER2是家族4個受體中研究最多的受體并且在許多惡性腫瘤中過表達。(NordbergEetal.EurJNuclMedMolImaging.2005Jul；32(7)：771-7)。這些特定受體的高表達通常與預后不良相關。(HendriksBSetal.JBiolChem2003；278：23343-23351；ArteagaCL.Oncologist2002；7Suppl4：31-9；EarpHSetal.BreastCancerResTreat1995；35：115-32；WesterK，etal.ActaOncol2002；41：282-8.LorenzoGDetal.ClinProstateCancer2003；2(1)：50-7)。幾個配體與EGFR受體家族成員相結合。沒有任何已知天然配體的唯一受體是HER2。(CitriA，etal.ExpCellRes2003；284(1)：54-65；YardenY，SliwkowskiMX.CellBiol2001；2：127-37；LenferinkAEG，etal.EMBOJ1998；17：3385-3397)。與細胞外結構域結合的抗體trastuzumab(Herceptin)可被用于靶定HER2受體，特別是在乳腺癌的HER2表達腫瘤中。trastuzumab的結合可阻斷生長刺激性胞內(nèi)信號傳導，減少化療和放療后細胞修復能力和也可能改良凋亡能力。BookmanMAetal.JClinOncol2003；21：283-290；PegramMDetal.CancerTreatRes2000；103：747-75；McKeageK，PerryCM.Drugs2002；62：209-43)。在W02005/003156中揭示的affibody分子也可用于靶定HER2。使用抗體例如cetuximab(Erbitux，ImClone/BristolMyersSquibb)(BaselgaJ.EurJCancer37：Suppl4，S16-22，2001，ABX-EGFRansonM，CurrOpinMolTher5：541-546，2003或mab425/EMD55900(Merck)或抗體片段(BoskovitzAetal：ExpertOpinBiolTher4：1453-1471，2004)，通過阻斷配體結合受體胞外部分可以抑制EGFR功能。在一些但不是所有病人中，使用低分子量酪氨酸激酶抑制劑如結合受體的胞內(nèi)部分的Iressa(Gefitinib，AstraZeneca)(SundbergALetal：EurJNuclMedMoIImaging30：1348-1356，2003；HerbstRSetal：NatRevCancer4：956-965，2004)或Tarceva(Erlotinib，OSI-774)(KrozelyP.ClinJOncolNurs8：163-168，2004)也可阻斷受體功能。在兩種情況中，目的是阻斷生長刺激信號傳導，并因此抑制腫瘤細胞增殖(RichJN，BignerDD：NatRevDrugDiscov3：430-446，2004)。但是，仍存在改良的空間。例如，由于在一小部分過表達EGFR的病人中起作用，已證實Iressa令人失望。對于cetuximab，其仍然是可增加治療效果的最佳化療聯(lián)合治療藥征。這些治療結合基于放療的方法可殺死腫瘤細胞(CarlssonJ，etal：RadiotherapyandOncology，66(2)，107-117，2003)，一個有趣的實例是近來應用Gefitinib可修飾放射標記的(砹標記的)EGF的吸收和治療效果(SundbergALetal：EurJNuclMedMolImaging30：1348-1356，2003)。為診斷(成像)和治療目的輸送放射性核素，多肽抗EGFR靶向物質的發(fā)展為天然激動性(腫瘤刺激性)生物學EGF配體提供了令人感興趣的選擇，如先前關于HER-2所述(WikmanMetal.ProteinEngineering，Design&Selection(PEDS)，17(5)，455-462，2004；SteffenACetal.CancerBiotherapyandRadiopharmaceuticals，20，239-248，2005；SteffenACetal.EurJNuclearMedicine，Inpress，2005)。這樣的多肽也具有生物學作用，甚至沒有放射性，對于治療也是令人感興趣的。如WO2005/0003156所揭示，Z變體，也稱為“分子”是分子量(6-15kDa)中間產(chǎn)物，因此在腫瘤組織中比抗體(150kDa)具有更好的穿透性，同時比通過腎排泄被快速清除的低分子量物質如Iressa和Tarceva(≈1kDa)具有更好的體循環(huán)特性。事實上，Z變體典型地具有范圍適于體內(nèi)成像應用的半衰期，并且若治療或其他應用需要，通過基因融合技術可顯著延長半衰期(見例如WO2005/097202A)。通常在頭頸鱗狀細胞癌(HNSCC)中EGFR過表達(Rikimaru，Ketal.HeadNeck，1992.14(1)：p.8-13；Santini，Jetal，HeadNeck，1991.13(2)：p.132-9.EkbergTetal.IntJOncology，26(5)，1177-1185，2005)。在一些HNSCC的研究中已提示HER2水平增加(Craven，J.Metal.AnticancerRes，1992.12(6B)：p.2273-6)，在口腔鱗狀細胞癌(SCC)中具有可能的預后價值(Werkmeister，etal.OralOncol，2000.36(1)：p.100-5；Werkmeister，R.AmJSurg，1996.172(6)：p.681-3；Xia，Wetal.ClinCancerRes，1997.3(1)：p.3-9；Xia，Wetal.ClinCancerRes，1999.5(12)：p.4164-74)。HER3顯示在HNSCC細胞系中過表達并與臨床惡性進展相關(Xia，Wetal.ClinCancerRes，1999.5(12)：p.4164-74；Shintani，Setal.CancerLett，1995.95(1-2)：p.79-83)并且也在其他類型的惡性腫瘤中過表達(Gullick，W.J.CancerSurv，1996.27：p.339-49)。一些人乳腺癌細胞系有HER4轉錄物(Plowman，G.Detal.ProcNatlAcadSciUSA，1993.90(5)：p.1746-50)但是HER4在癌癥中的作用不甚清楚(Srinivasan，R.etal.CancerRes，2000.60(6)：p.1483-7)。研究四個受體的共表達是非常有趣的，因為已經(jīng)有提示共表達模式可能與惡性表型相關(Xia，Wetal.ClinCancerRes，1999.5(12)：p.4164-74；Bei，R.etal.JPathol，2001.195(3)：p.343-8；Krahn，G.etal.EurJCancer，2001.37(2)：p.251-9)。EGFR和HER2的免疫組化染色顯示明顯的膜著色。相反，HER3和HER4染色主要在胞質中(Plowman，G.Detal.ProcNatlAcadSciUSA，1993.90(5)：p.1746-50；Srinivasan，R.etal.CancerRes，2000.60(6)：p.1483-7)。而且，已經(jīng)報道在腫瘤和轉移癌中，EGFR和HER2高水平表達。因此，似乎EGFR和HER2是基于大分子和肽的體內(nèi)成像和治療應用的潛在靶位，然而HER3和HER4可能不是這樣。EGFR-蛋白質的增加的水平也在膀胱癌中被發(fā)現(xiàn)并且過表達涉及腫瘤階段和惡性腫瘤分級(Harney，J.V.etal，JUrol，146，227-31.(1991)；Messing，E.M.CancerRes，50，2530-7.(1990)；Neal，D.E.etal，Cancer，65，1619-25.(1990)；Sauter，G.etal.IntJCancer，57，508-14.(1994)；GardmarkT，etal.BritishJournalofUrology(BJU)，95，982-986，2005)。神經(jīng)膠質瘤是常見的原代中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，在其最惡性形式多形性成膠質細胞瘤(GBM)中，在所有分析的腫瘤中至少半數(shù)中可檢測到EGFR過表達(BoskovitzA，etal.ExpertOpinBiolTher4：1453-1471，2004；ShinojimaN，etal.CancerRes63：6962-6970，2003；EkstrandAJ，etal.CancerRes51：2164-2172，1991；RainovNGetal.JournalofNeuro-Oncology3513-28(1997)；CarlssonJetal.JNeurooncol.2005Sep8；[Epubaheadofprint])。過表達是由于基因擴增和/或增加的轉錄速率，并且已報道每個腫瘤細胞有106受體(RichJN，BignerDD：NatRevDrugDiscov3：430-446，2004；BignerSHetal.JNeuropatholExpNeurol47，191-205(1998)；CarpenterG.AnnRevBiochem56，881-914(1987)；CollinsVP.CancerBiology4，27-32(1993)；LibermannTAetal.Nature313，144-147，(1985)；KleihuesP，OhgakiH.Neuro-oncol1，44-51，(1999)；KleihuesP，OhgakiH.ToxicolPathol28，164-170，(2000)；BoskovitzAetal.ExpertOpinBiolTher4，1453-1471，(2004))。EGFR過表達與增加的神經(jīng)膠質瘤生長速率以及降低的存活有關(RichJN，BignerDD：NatRevDrugDiscov3，430-446，(2004)；CarlssonJetal.JNeurooncol.2005Sep8；[Epubaheadofprint]；SchlegelJetal.IntJCancer56，72-77，(1994)；WikstrandCJ，BignerDD.JNatlCancerInst90，799-801，(1998)；ShinojimaNetal.CancerRes63，6962-6970，(2003))并且已指出在腫瘤細胞浸潤邊緣EGFR過表達最明顯(OkadaY，etal.CancerRes63，413-416，)(2003))。EFGR特異性結合多肽可潛在地被用于神經(jīng)膠質瘤治療的治療應用，例如，通過局部區(qū)域給予進入術后空腔。上皮來源的其他幾種惡性腫瘤，例如在肺和胸中發(fā)現(xiàn)的那些，也與EGFR高表達相關(Salomon，D.S.etal.Crit.Rev.Oncol.Hematol.，19(3)：183-232，(1995))。EGFR受體也分布在不同的正常組織中并且特別是在肝臟的肝細胞和皮膚上皮中表達至相當高的水平(Gusterson，B.etal.CellBiolIntRep，8，649-58.(1984)；Damjanov，I.etal.LabInvest，55，588-92.(1986))。這在治療應用中可潛在地產(chǎn)生問題，特別是在放射性治療中，但是，在給予少量的結合EGFR受體的診斷或成像標記物的診斷和成像應用中可能不是很重要。然而，在考慮局部用藥的某些癌癥中可發(fā)現(xiàn)EGFR-結合多肽的應用。本發(fā)明的目的是提供新的EGFR-結合物質，其可被用于診斷、體外或體內(nèi)成像，也可用于治療應用。另外，這種EGFR-結合多肽可用于分期(staging)和直接評價目的為下調靶受體的基于SME治療。除了標記的分子成像物質的發(fā)展之外，應用還包括在藥物發(fā)展和篩選程序中的使用，其中期望特異性成像物質測量體內(nèi)模型和隨后的臨床發(fā)展階段的治療結果。分子成像提供用于下調生長因子受體的藥效的直接讀數(shù)，也用于評估抗腫瘤效果。發(fā)明簡述依據(jù)一個方面，本發(fā)明提供表皮生長因子受體(EGFR)結合多肽，其包含表皮生長因子受體結合基序EBM，基序由選自如下的氨基酸序列組成：i)EX2X3X4AX6X7EIX10X11LPNLNX17X18QX20X21AFIX25SLX28D，其中彼此獨立地，X2選自M、F、V、L、I和S；X3選自W、D、E和L；X4選自I、V、G、S、M、L、A、T、N、D和W；X6選自W、V、L、I、M和S；X7選自D、E、N和K；X10選自R、G、H和K；X11選自D、N、E、Y和S；X17選自G、W和A；X18選自W、G和A；X20選自M、L、F、A和E；X21選自T、D、N、A和Q；X25選自A、S、N、G和L；以及X28選自L、W、V、F和A；以及ii)一個氨基酸序列，其與i)中定義序列至少具有85％相同性；EGFR-結合多肽與EGFR結合，因此相互作用的KD值至多是10μM。本發(fā)明EGFR-結合多肽的一類相關序列的上述定義是基于在幾個不同的選擇實驗中通過與EGFR的相互作用來進行選擇的大量親代支架隨機多肽變體的統(tǒng)計學分析?？设b別的EGFR-結合基序或“EBM”相應于親代支架的靶結合區(qū)域，該區(qū)域組成3-螺旋束蛋白質結構域內(nèi)的2個α螺旋。在親代支架中，2個EBM螺旋的不同氨基酸殘基組成與抗體的恒定Fc部分相互作用的結合表面。在本發(fā)明中，結合表面殘基的隨機變化以及隨后的變體選擇以與EGFR相互作用的能力取代了Fc相互作用能力。正如本領域技術人員將認識到的，任何多肽的功能例如本發(fā)明多肽的EGFR-結合能力依賴于多肽的三級結構。因此可能多肽氨基酸序列的微小改變不會影響其功能。因此，本發(fā)明包含i)中修飾的EBM變體，以至產(chǎn)生的序列與屬于i)所定義的一類序列是至少85％相同的。例如，屬于某個氨基酸殘基官能團的一個氨基酸殘基(如疏水的、親水的、極性的等)有可能交換為來自同一個官能團的另一個氨基酸殘基。在本發(fā)明多肽的一個實施方案中，X2是M。在本發(fā)明多肽的一個實施方案中，X3是W。在本發(fā)明多肽的一個實施方案中，X4選自I、V、G和S。在本發(fā)明多肽的一個實施方案中，X6選自V和W。在本發(fā)明多肽的一個實施方案中，X10選自R和G。在本發(fā)明多肽的一個實施方案中，X11選自D、N和E。在本發(fā)明多肽的一個實施方案中，X17選自W和G。在本發(fā)明多肽的一個實施方案中，X18選自W和G，并且特別可能是W。在本發(fā)明多肽的一個實施方案中，X20是M。在本發(fā)明多肽的一個實施方案中，X21選自T和D，并且特別可能是T。在本發(fā)明多肽的一個實施方案中，X25選自A、S和N。在本發(fā)明多肽的一個實施方案中，X28選自L和W。在本發(fā)明多肽的一個實施方案中，X18是W和X21是T。在本發(fā)明多肽的一個實施方案中，X18是W和X20是M。在本發(fā)明多肽亞類的一個更特異性的定義中，i)的氨基酸序列至少滿足6個、至少滿足7個、至少滿足8個或所有9個如下9個條件：X2是M；X3是W；X6是W；X10是R；X17是G；X18是W；X20是M；X21是T；X28是L。在所有9個條件都滿足的情況中，i)的序列是EMWX4AWX7EIRX11LPNLNGWQMTAFIX25SLLD。在本發(fā)明多肽亞類的另一個特異性定義中，i)的氨基酸序列至少滿足3個、至少滿足4個或所有5個如下5個條件：X17是G；X18是W；X20是M；X21是T；X25是A。在所有5個條件都滿足的情況中，i)的序列是EX2X3X4AX6X7EIX10X11LPNLNGWQMTAFIASLX28D。在另一個亞類中，i)的序列是EX2X3X4AX6X7EIGX11LPNLNWGQX20X21AFIX25SLWD，例如EX2X3IAVX7EIGELPNLNWGQX20DAFINSLWD。如隨后的實驗部分所詳述，選擇EGFR-結合變體已經(jīng)鑒定了大量各個EGFR-結合基序(EBM)序列。在本發(fā)明這方面的EGFR-結合多肽定義中，這些序列組成EBM序列i)的各個實施方案。各個EGFR-結合基序的序列在圖1中顯示并且標識為SEQIDNO：1-163。在本發(fā)明這方面的實施方案中，EBM序列i)可特別地選自SEQIDNO：33、SEQIDNO：48、SEQIDNO：57、SEQIDNO：87、SEQIDNO：88和SEQIDNO：147。在本發(fā)明的實施方案中，EBM可形成3-螺旋束蛋白質結構域的一部分。例如，EBM基本上組成或形成部分在所述3-螺旋束蛋白質結構域內(nèi)帶有互接環(huán)(interconnectingloop)的2個α螺旋。在一些實施方案中，所述EGFR結合基序基本上可形成位于所述3-螺旋束蛋白質結構域內(nèi)的2個α螺旋和連接它們的環(huán)的一部分。在本發(fā)明的特定實施方案中，這樣的3-螺旋束蛋白質結構域選自細菌受體蛋白質的結構域。這種結構域的非限制性例子是5個不同的金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的蛋白質A的3-螺旋結構域及其衍生物。因此，本發(fā)明的EGFR-結合多肽可包含選自以下的氨基酸序列：ADNNFNK-[EBM]-DPSQSANLLSEAKKLNESQAPK(EBM在葡萄球菌蛋白質A的結構域A內(nèi))；ADNKFNK-[EBM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK(EBM在葡萄球菌蛋白質A的結構域B內(nèi))；ADNKFNK-[EBM]-DPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK(EBM在葡萄球菌蛋白質A的結構域C內(nèi))；ADAQQNNFNK-[EBM]-DPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK(EBM在葡萄球菌蛋白質A的結構域D內(nèi))；AQHDE-[EBM]-DPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK(EBM在葡萄球菌蛋白質A的結構域E內(nèi))；和VDNKFNK-[EBM]-DPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK(EBM在葡萄球菌蛋白質A的結構域B的蛋白質Z衍生物中)；其中[EBM]是如上定義的EGFR-結合基序。本發(fā)明另一方面提供了EGFR-結合多肽，其包含衍生自氨基酸序列SEQIDNO：327：VDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK的氨基酸序列，所述衍生的氨基酸序列通過在以上序列的9到11、13到14、17到18、24到25、27到28、32到35位的任一或所有位置或與這些位置相應的位置的氨基酸取代而衍生，與包含未修飾氨基酸序列的多肽比較，所述取代可改良多肽與EGFR的結合，并且其中EGFR-結合多肽與EGFR-結合，由此相互作用的KD值至多是10μM。另一方面，本發(fā)明提供了EGFR-結合多肽，其氨基酸序列包含滿足選自如下一個定義的序列：iii)其選自SEQIDNO：164-326，及iv)其是與選自SEQIDNO：164-326的一個序列具有85％或更高的相同性的氨基酸序列。在本發(fā)明這個方面的實施方案中，EGFR-結合多肽特別地可包含選自SEQIDNO：196、SEQIDNO：211、SEQIDNO：220、SEQIDNO：250、SEQIDNO：251、SEQIDNO：310的序列和與其具有85％或更高的相同性的序列。在一些實施方案中，EGFR結合多肽可通過C末端和/或N末端氨基酸而被延伸。在一些實施方案中，所述或每個氨基酸延伸可增強多肽與EGFR的結合。在一些實施方案中，所述或每個氨基酸延伸可改良多肽的生產(chǎn)、純化、體內(nèi)或體外穩(wěn)定性、偶聯(lián)或檢測。在一些實施方案中，所述延伸可包含鏈球菌蛋白質G的白蛋白結合結構域或其衍生物，在治療應用中改良了EGFR結合多肽的半衰期。本發(fā)明任何方面的EGFR-結合多肽可結合EGFR，以致相互作用的KD值至多是1x10-6M，例如至多是1x10-7M。在一些實施方案中，所述EGFR結合多肽可與EGFR胞外結構域結合。在一些實施方案中，所述EGFR結合多肽可與相應于SEQIDNO：329的EGFR的胞外結構域的一部分結合。當本文參考不同多肽的氨基酸序列之間的相同性程度時，在此給出了與本文揭示的序列85％相同性的下限。在一些實施方案中，本發(fā)明的多肽可具有與本文描述的序列是至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的序列。通過相應于被比較的最短序列窗口(window)，或通過相應于至少一個被比較序列內(nèi)的EGFR-結合基序的窗口，可完成比較。多肽具有的優(yōu)點是其與EGFR很好地結合。典型地，多肽可以相當?shù)亩滩⑶矣捎谒鼈冃。谀[瘤組織中它們比抗體具有更好的滲透性，同時比常規(guī)低分子量EGFR-結合物質(通常其半衰期太短)和單克隆抗體(通常循環(huán)時間太長)具有更好的體循環(huán)特性。本發(fā)明的另一方面涉及一種EGFR結合多肽，其包含以上描述的本發(fā)明的EGFR結合多肽的片段。在一些實施方案中，所述片段可包含以上描述的本發(fā)明的多肽的N末端減少。本發(fā)明多肽在長度上可大約有53-58個氨基酸。但是，長度可以更長或更短。例如，多肽的長度可在N末端最多減少4個氨基酸。術語“位置”的使用是相對的。在長度與上述未修飾多肽相同為53個氨基酸的本發(fā)明多肽中，如果例如N末端延伸與未修飾多肽相比時，修飾多肽中相應于未修飾多肽中的那些氨基酸殘基具有相同的位置數(shù)，則本發(fā)明多肽中氨基酸的位置與未修飾多肽中的那些精確對應。例如，若在修飾的多肽上存在6氨基酸殘基延伸，則從N末端計算的修飾多肽的氨基酸數(shù)7相應于未修飾多肽的第1位的氨基酸。因此，在不同醫(yī)學、獸醫(yī)、診斷和成像應用中，本發(fā)明的多肽可用作常規(guī)抗體或低分子量物質的另一個可選擇方法。例如，本發(fā)明的EGFR-結合多肽可用于治療EGFR相關癌癥如上述EGFR過表達導致的那些，特別當應用于局部分布時，例如神經(jīng)膠質瘤。本發(fā)明的EGFR-結合多肽也可用于通過結合細胞表面的EGFR而抑制細胞信號傳導，用于癌癥診斷，在體內(nèi)和體外用作表達EGFR細胞特別是過表達EGFR的細胞的靶向物質，用于檢測EGFR的組化方法，用于分離方法和其他應用。除了用于臨床的分子成像物質的發(fā)展之外，也可用于測量體內(nèi)模型中的治療結果的特異性臨床前成像物質以及隨后的臨床開發(fā)中。分子成像應提供下調生長因子受體例如HER2或EGFR的藥物效力的直接讀數(shù)，也可以評估抗腫瘤作用。在依賴于試劑與EGFR親和力的任何方法中，本發(fā)明的多肽都是有用的。因此，在這種方法中，多肽可被用作檢測試劑，捕獲試劑或分離試劑，但是憑借它們自身情況，也可用作治療藥物或用作靶向其他治療藥物的手段，對于EGFR蛋白質具有直接(例如，毒性分子，毒素)或間接治療作用(例如，癌癥疫苗，免疫刺激分子)。以不同形式進行體外使用本發(fā)明多肽的方法，例如微孔板，在蛋白質陣列上，在生物傳感器表面，在珠上，在流式細胞儀中，在組織切片上等等。本領域技術人員將意識到可以對本發(fā)明多肽進行不同的修飾和/或添加以便裁剪多肽適于不偏離本發(fā)明范圍的特異應用。以下更詳細的描述了這些修飾和添加，其可以包括在同一多肽鏈中的額外的氨基酸，或與本發(fā)明多肽化學綴合或結合的標記和/或治療藥物。此外，本發(fā)明也包含保留EGFR-結合的衍生自蛋白質A的EGFR-結合多肽的片段。BraistedACetal在ProcNatlAcadSciUSA93：5688-5692(1996)中示出了產(chǎn)生具有保留的結合特異性的野生型SPA結構域片段的可能性。在該文章描述的實驗中，使用基于結構的設計和噬菌體展示方法，59個殘基的3-螺旋束的結合結構域被減少為所得的33個殘基的2-螺旋衍生物。這通過逐步選擇不同區(qū)域的隨機突變來實現(xiàn)，其導致穩(wěn)定性和結合親和力被重復改良。同樣道理，使用本發(fā)明的多肽，本領域技術人員將能夠獲得“最小的”EGFR-結合多肽，其具有與“親代”EGFR-結合多肽同樣的結合特性。因此，組成本發(fā)明多肽的片段的多肽在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在本說明書中使用的術語“EGFR-結合”和“EGFR的結合親和力”指例如在Biacore儀器上通過使用表面等離子共振技術檢測的多肽特性。例如如下實例所述，在EGFR-結合親和力可在實驗中測試，所述實驗中EGFR或EGFR片段例如其細胞外結構域被固定在儀器的傳感器芯片上，含有待測多肽的樣品經(jīng)過所述芯片?；蛘撸郎y多肽被固定在儀器的傳感器芯片上，并且含有EGFR或EGFR片段例如其細胞外結構域的樣品經(jīng)過所述芯片。在這點上，EGFR可以是包含氨基酸序列SEQIDNO：328的多肽，并且其細胞外結構域可以是包含氨基酸序列SEQIDNO：329的多肽。然后，本領域技術人員可解釋通過這個實驗獲得的結果以確定至少一個多肽與EGFR的結合親和力的定性測量方法。如果需要定性測量方法，例如需確定相互作用的KD值，也可以使用表面等離子共振方法。例如通過Biacore2000儀器(BiacoreAB)可定義結合值。EGFR被固定在儀器的傳感器芯片上，待測親和力的多肽樣品通過系列稀釋制備并以隨機順序注射。然后，例如使用由儀器廠商(BiacoreAB)提供的BIAevaluation4.1軟件的1∶1Langmuir結合模型從結果計算KD值。在導入氨基酸取代的位置，這些將不會影響多肽的基本結構。例如，多肽的Cα主鏈的整體折疊與相關的Z“野生型”結構域基本上相同，即具有同樣順序的相同二級結構元件。因此，具有這個基本結構的多肽將具有與Z“野生型”結構域相似的CD光譜。本領域技術人員意識到相關的其他參數(shù)。保存基本結構的要求對可以進行取代的氨基酸序列的位置產(chǎn)生了限制。例如，優(yōu)選取代位于多肽表面的氨基酸殘基，但是掩藏在多肽“3-螺旋束”核心內(nèi)的氨基酸殘基應保持恒定以便于保持分子的結構特性。同樣道理應用于本發(fā)明的多肽片段。本發(fā)明也涵蓋了這樣的多肽，其中如上所述的EGFR-結合多肽呈現(xiàn)為在任一末端添加了額外氨基酸殘基的EGFR-結合結構域。這些額外氨基酸殘基在多肽結合EGFR中發(fā)揮作用，但是也同樣用于其他目的，例如涉及多肽的生產(chǎn)、純化、穩(wěn)定性、偶聯(lián)或檢測的一或多個。這種額外氨基酸殘基可包含加入用于化學偶聯(lián)目的的一或多個氨基酸殘基。這樣的一個實例是在多肽鏈非常前面或非常后面的位置即在N或C末端附加半胱氨酸殘基。這種額外氨基酸殘基也提供用于多肽純化或檢測的“標記”，如與特異于標記的抗體相互作用的His6標記或者″myc″標記或者″flag″標記。本發(fā)明也涵蓋了這樣的EGFR-結合多肽，其中如上所述的EGFR-結合多肽呈現(xiàn)為如下的EGFR-結合結構域，其中額外的肽或蛋白質或其他官能團與其N-或C-末端偶聯(lián)或通過化學綴合(使用已知有機化學方法)與任何其他殘基(特異性或非特異性)偶聯(lián)。以上討論的“額外的氨基酸殘基”也可以提供一或多個具有任何所需功能的多肽結構域，例如與最初EGFR-結合結構域同樣的結合功能，或另一種結合功能，或酶功能，毒性功能(例如免疫毒素)，或熒光信號傳導功能，或其組合。本發(fā)明的多肽可以是單體或多聚體形式。多肽的多聚體形式具有優(yōu)勢，因為它們可具有增強的結合特性。優(yōu)選的多聚體形式包括二聚體和三聚體形式。多肽的多聚體形式可包含適當數(shù)目的本發(fā)明多肽。本質上，這些多肽在多聚體內(nèi)形成結構域。這些結構域都具有相同的氨基酸序列，但是或者它們可以具有不同的氨基酸序列。使用已知的有機化學方法通過共價偶聯(lián)連接多肽，或在多肽的重組表達系統(tǒng)中表達為一個或多個融合多肽，或直接或通過接頭例如氨基酸接頭以任何其他方式連接。在一些實施方案中，本發(fā)明涉及多聚體形式的以上描述的本發(fā)明的EGFR結合多肽，其可包含至少2個EGFR結合多肽單體單位，其氨基酸序列可以相同或不同。在一些實施方案中，所述EGFR結合多肽單體單位可共價偶聯(lián)在一起。在一些實施方案中，所述EGFR結合多肽單體單位可表達為融合蛋白。另外，其中本發(fā)明的EGFR-結合多肽提供第一個結構域或部分并且第二個或其他部分具有結合EGFR以外其他功能的融合多肽也被預期并在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這種融合多肽的第二個或其他部分可包含對EGFR之外的另一個靶分子具有親和力的結合結構域。這種結合結構域可以是另一個相似的多肽結合物(binder)。例如，多肽結合物可以是Z變體。這可能產(chǎn)生多特異性試劑，其可用于一些類型的應用例如醫(yī)學、獸醫(yī)學、診斷、分離和成像。通常，通常如上所述可進行這種多特異性融合多肽的制備。在本發(fā)明的另一個實施方案中，第二個或其他部分可包含不相關的天然產(chǎn)生或重組的對靶具有結合親和力的蛋白質(或其保留了結合或天然產(chǎn)生或重組蛋白質的其他能力的片段)。例如，本發(fā)明的EGFR-結合多肽可被連接到鏈球菌蛋白質G的白蛋白結合結構域上或任何其他對血清蛋白質有親和力的蛋白質/多肽上以改良用于治療應用的EGFR-結合多肽的半衰期。本發(fā)明的EGFR-結合多肽可以其他融合多肽的形式提供。例如，EGFR-結合多肽或其片段可被共價偶聯(lián)到第二個或另一個或另幾個部分，除了靶結合或代替靶結合，其呈現(xiàn)其他功能。一個實例是一個或多個EGFR-結合多肽和用作報道基因或效應部分的具有酶活性的多肽之間的融合物?？杀慌悸?lián)到EGFR-結合多肽以形成融合蛋白質的報道酶的例子是本領域技術人員熟知的，包括的酶如β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶、羧肽酶。本發(fā)明融合多肽的第二個和其他部分的其它選擇包括熒光多肽，例如綠色熒光蛋白質，紅色熒光蛋白質，熒光素酶和其變體。本發(fā)明融合多肽的第二個和其他部分的其它選擇包括用于治療應用的一個部分或多個部分。在治療應用中，通過其他方法，其他分子也可被共價或非共價偶聯(lián)到本發(fā)明的EGFR-結合多肽上。例如，其他分子如用于“ADEPT”(抗體導向酶-前體藥物療法)應用的酶，其使用本發(fā)明的多肽導向效應酶(例如羧肽酶)或RNase或DNase融合；募集效應細胞和其他免疫系統(tǒng)組分的蛋白質；細胞因子，如IL-2、IL-12、TNFα、IP-10；促凝血因子，如組織因子、vonWillebrand因子；毒素，如篦麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素、calcheamicin、maytansinoid，毒素小分子，如auristatin類似物、阿霉素。在一些實施方案中，還提供了二聚體形式的以上描述的本發(fā)明的EGFR結合多肽。以上描述的額外的氨基酸(特別是六組氨酸、半胱氨酸)可用于偶聯(lián)放射性同位素螯合劑于EGFR-結合多肽以容易地摻入放射性核素用于診斷(例如68Ga，76Br，111In，99Tc，125I)或治療(例如90Y，131I，211At，177Lu)。本發(fā)明的另一方面涉及多核苷酸，其編碼以上描述的本發(fā)明的多肽。本發(fā)明的又一方面涉及生產(chǎn)以上描述的本發(fā)明的多肽的方法，所述方法包括表達上述多核苷酸。本發(fā)明也包含多肽，其中如上所述的EGFR-結合多肽已具有標記基團例如至少一個熒光團、生物素或放射性同位素例如用于檢測多肽的目的。本發(fā)明的其他方面涉及以上描述的本發(fā)明的EGFR結合多肽和可檢測物質的組合物。在一些實施方案中，所述可檢測物質可以是用于放射成像的放射性物質。在一些實施方案中，所述放射性物質可以是放射性核素。在一些實施方案中，所述可檢測物質可以是酶。本發(fā)明的另一方面涉及以上描述的本發(fā)明的EGFR結合多肽和治療藥物的組合物。在一些實施方案中，EGFR結合多肽和可檢測物質或治療藥物可共價偶聯(lián)在一起。在一些實施方案中，EGFR結合多肽和可檢測物質或治療藥物可表達為融合蛋白。關于如上所述的融合多肽和摻入本發(fā)明EGFR-結合多肽的蛋白質，需要注意的是第一個、第二個和其他部分的命名一方面是為區(qū)別EGFR-結合部分，另一方面是區(qū)別呈現(xiàn)其他功能的部分。這些命名不是指融合蛋白或多肽的多肽鏈內(nèi)不同結構域的實際順序。因此，例如，第一個部分可出現(xiàn)在融合蛋白或者多肽的N末端，中間，或C末端。本發(fā)明的另一方面提供了放射成像方法，其中上述本發(fā)明的組合物被用作放射成像物質。本發(fā)明的另一方面提供了檢測EGFR的方法，包括提供疑似含有EGFR的樣品，將樣品上述本發(fā)明的EGFR結合多肽或組合物相接觸并檢測所述多肽或組合物的結合以指示樣品中EGFR的存在。本發(fā)明的另一方面提供了從樣品分離或捕獲EGFR的方法，所述方法包括將樣品與上述本發(fā)明的EGFR結合多肽或組合物相接觸，由此EGFR與多肽結合并從樣品中去除。本發(fā)明的另一方面提供了確定哺乳動物對象中EGFR存在的診斷方法，所述方法包括將所述對象或來源于對象的樣品與上述本發(fā)明的EGFR結合多肽或組合物相接觸并檢測所述多肽或組合物的結合。在一些實施方案中，所述對象可以是人類。在一些實施方案中，可在體內(nèi)進行所述方法。在一些實施方案中，可在體外的樣品上進行所述方法。本發(fā)明的另一方面涉及治療哺乳動物對象內(nèi)或來源于哺乳動物對象的材料中的EGFR相關病癥的方法，其中所述對象或材料用上述本發(fā)明的EGFR結合多肽或組合物處理。在一些實施方案中，所述EGFR結合多肽或所述組合物與所述對象或材料中的EGFR的結合可抑制或刺激受體的活化。在一些實施方案中，所述EGFR結合多肽與所述對象的或材料中的EGFR的結合可抑制細胞信號傳導。在一些實施方案中，EGFR相關病癥可以是癌癥。在一些實施方案中，所述癌癥可選自肺癌、乳腺癌、前列腺癌、結腸癌、卵巢癌、頭頸癌。在一些實施方案中，所述對象可以是人類。本發(fā)明的另一方面涉及將上述本發(fā)明的EGFR結合多肽用作藥物。本發(fā)明的另一方面涉及將上述本發(fā)明的EGFR結合多肽用作診斷藥物。本發(fā)明的另一方面涉及將上述本發(fā)明的組合物用作診斷藥物。本發(fā)明的另一方面涉及上述本發(fā)明的EGFR結合多肽或上述本發(fā)明的組合物在制備用于體內(nèi)診斷癌癥的診斷藥物中的應用。本發(fā)明的其他方面涉及上述本發(fā)明的EGFR結合多肽或上述本發(fā)明的組合物在制備用于治療癌癥的藥物中的應用。根據(jù)如下的實施方案和所附的權利要求書，本發(fā)明其他優(yōu)選方面和實施方案將會清楚。所有本發(fā)明提及的科學文章和專利文件均并入本文參考。本發(fā)明的實施方案1.一個EGFR-結合多肽，其包含衍生自如下氨基酸序列的氨基酸序列：VDNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNAFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK，所述衍生的氨基酸序列通過在如上序列的9到11、13到14、17到18、24到25、27到28、32和35位的任一或所有位置或這些位置的相應位置包含氨基酸取代而衍生，與包含未修飾氨基酸序列的多肽比較，所述取代改良了多肽與EGFR的結合，其中EGFR-結合多肽與EGFR結合，因此相互作用的KD值至多是10μM。2.實施方案1的EGFR-結合多肽，其中第9位的氨基酸取代是疏水性氨基酸。3.實施方案1或2的EGFR-結合多肽，其中第9位的氨基酸取代是非極性氨基酸。4.實施方案1到3任一項的EGFR-結合多肽，其中第9位的氨基酸取代具有脂肪族R基團。5.實施方案1到4任一項的EGFR-結合多肽，其中第9位的氨基酸取代具有芳香族R基團。6.實施方案1到2或4或5任一項的EGFR-結合多肽，其中第9位的氨基酸取代是極性氨基酸。7.實施方案1到5任一項的EGFR-結合多肽，其中第9位的氨基酸取代是不帶電荷的。8.實施方案1到7任一項的EGFR-結合多肽，其中第9位的氨基酸取代是堿性氨基酸。9.實施方案1到8任一項的EGFR-結合多肽，其中第9位的氨基酸取代選自W、M、T、F、H、S、L、A和V。10.實施方案3的EGFR-結合多肽，其中第9位的氨基酸取代是M、F、L或V。11.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第10位的氨基酸取代是疏水性氨基酸。12.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第10位的氨基酸取代是親水性氨基酸。13.實施方案1到11任一項的EGFR-結合多肽，其中第10位的氨基酸取代是中性的。14.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第10位的氨基酸取代是極性氨基酸。15.實施方案1到13任一項的EGFR-結合多肽，其中第10位的氨基酸取代是非極性氨基酸。16.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第10位的氨基酸取代是酸性氨基酸。17.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第10位的氨基酸取代是選自S、L、G、Y、A、E、W和Q。18.實施方案17的EGFR-結合多肽，其中第10位的氨基酸取代是L、Y、E或Q。19.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第11位的氨基酸取代是疏水性的。20.實施方案1到18任一項的EGFR-結合多肽，其中第11位的氨基酸取代是中性的。21.實施方案1到19任一項的EGFR-結合多肽，其中第11位的氨基酸取代是親水性的。22.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第11位的氨基酸取代是非極性氨基酸。23.實施方案22的EGFR-結合多肽，其中第11位的氨基酸取代具有脂肪族R基團。24.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第11位的氨基酸取代具有正電荷R基團。25.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第11位的氨基酸取代是堿性氨基酸。26.實施方案1到21任一項的EGFR-結合多肽，其中第11位的氨基酸是極性氨基酸。27.實施方案1到23任一項的EGFR-結合多肽，其中第11位的氨基酸是不帶電荷的。28.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第11位的氨基酸取代選自A、I、K、P和N。29.實施方案28的EGFR-結合多肽，其中第11位的氨基酸取代是A、I或K。30.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第13位的氨基酸取代是疏水性的。31.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第13位的氨基酸取代是非極性的。32.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第13位的氨基酸取代具有脂肪族R基團。33.實施方案1到30任一項的EGFR-結合多肽，其中第13位的氨基酸取代是有極性的。34.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第13位的氨基酸取代是不帶電荷的。35.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第13位的氨基酸取代具有芳香族R基團。36.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第13位的氨基酸取代選自A、S、V、M、I、Y、W和T。37.實施方案8的EGFR-結合多肽，其中第13位的氨基酸取代是M、I、Y或V。38.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第14位的氨基酸是親水性的。39.實施方案1到37任一項的EGFR-結合多肽，其中第14位的氨基酸取代是中性的。40.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第14位的氨基酸取代是極性的。41.實施方案40的EGFR-結合多肽，其中第14位的氨基酸取代是不帶電荷的。42.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第14位的氨基酸取代是酸性的。43.實施方案1到41任一項的EGFR-結合多肽，其中第14位的氨基酸取代是堿性的。44.實施方案1到39任一項的EGFR-結合多肽，其中第14位的氨基酸取代是非極性的。45.實施方案44的EGFR-結合多肽，其中第14位的氨基酸取代具有脂肪族R基團。46.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第14位的氨基酸取代具有負電荷R基團。47.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第14位的氨基酸取代選自S、E、R、T、W、V、N、T和A。48.實施方案47的EGFR-結合多肽，其中第14位的氨基酸取代是S或T。49.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第17位的氨基酸取代是中性的。50.實施方案1到48任一項的EGFR-結合多肽，其中第17位的氨基酸取代是親水性的。51.實施方案1到48任一項的EGFR-結合多肽，其中第17位的氨基酸取代是疏水性的。52.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第17位的氨基酸取代是極性的。53.實施方案52的EGFR-結合多肽，其中第17位的氨基酸取代是不帶電荷的。54.實施方案1到52任一項的EGFR-結合多肽，其中第17位的氨基酸是帶正電荷的。55.實施方案1到51任一項的EGFR-結合多肽，其中第17位的氨基酸取代是非極性的。56.實施方案55的EGFR-結合多肽，其中第17位的氨基酸帶有脂肪族R基團。57.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第17位的氨基酸是堿性的。58.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第17位的氨基酸取代選自S、G、N和V。59.實施方案12的EGFR-結合多肽，其中第17位的氨基酸取代選自G、N和V。60.實施方案的EGFR-結合多肽，其中第18位的氨基酸是中性的。61.實施方案1到59任一項的EGFR-結合多肽，其中第18位的氨基酸取代是親水性的。62.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第18位的氨基酸取代是非極性的。63.實施方案1到61任一項的EGFR-結合多肽，其中第18位的氨基酸取代是極性的。64.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第18位的氨基酸取代是不帶電荷的。65.實施方案1到63任一項的EGFR-結合多肽，其中第18位的氨基酸取代是帶正電荷的。66.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第18位的氨基酸取代是酸性的。67.實施方案1到65任一項的EGFR-結合多肽，其中第18位的氨基酸取代是堿性的。68.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第18位的氨基酸取代選自G、S、D、R、N、H、E和K。69.實施方案68的EGFR-結合多肽，其中第18位的氨基酸取代是R或N。70.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第24位的氨基酸取代是疏水性的。71.實施方案1到69任一項的EGFR-結合多肽，其中第24位的氨基酸取代是中性的。72.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第24位的氨基酸取代是堿性的。73.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第24位的氨基酸取代是非極性的。74.實施方案73的EGFR-結合多肽，其中第24位的氨基酸取代具有脂肪族R基團。75.實施方案1到72任一項的EGFR-結合多肽，其中第24位的氨基酸取代是極性的。76.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第24位的氨基酸取代具有芳香族R基團。77.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第24位的氨基酸取代選自K、W、N、G、L、R和M。78.實施方案77的EGFR-結合多肽，其中第24位的氨基酸取代是V或G。79.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第25位的氨基酸取代是中性的。80.實施方案的EGFR-結合多肽，其中第25位的氨基酸取代是疏水性的。81.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第25位的氨基酸取代是非極性的。82.實施方案81的EGFR-結合多肽，其中第25位的氨基酸取代具有脂肪族R基團。83.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第35位的氨基酸取代具有芳香族R基團。84.實施方案1到80任一項的EGFR-結合多肽，其中第25位的氨基酸是極性的。85.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第25位的氨基酸取代是堿性的。86.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第25位的氨基酸取代選自L、G、W、V、S、H和W。87.實施方案86的EGFR-結合多肽，其中第25位的氨基酸取代是G或W。88.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第27位的氨基酸取代是親水性的。89.實施方案1到88任一項的EGFR-結合多肽，其中第27位的氨基酸取代是疏水性的。90.實施方案1到88任一項的EGFR-結合多肽，其中第27位的氨基酸取代是中性的。91.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第27位的氨基酸取代是非極性的。92.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第27位的氨基酸取代是酸性的。93.實施方案1到90任一項的EGFR-結合多肽，其中第27位的氨基酸取代是極性的。94.實施方案93的EGFR-結合多肽，其中第27位的氨基酸取代是不帶電荷的。95.實施方案1到91任一項的EGFR-結合多肽，其中第27位的氨基酸取代是堿性的。96.實施方案1到93任一項的EGFR-結合多肽，其中第27位的氨基酸取代具有負電荷R基團。97.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第27位的氨基酸取代選自A、E、F、M、L、C、K、G和S。98.實施方案97的EGFR-結合多肽，其中第27位的氨基酸取代是E、M或S。99.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第28位的氨基酸取代是中性的。100.實施方案1到98任一項的EGFR-結合多肽，其中第28位的氨基酸取代是疏水性的。101.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第28位的氨基酸取代是非極性的。102.實施方案101的EGFR-結合多肽，其中第28位的氨基酸取代具有脂肪族R基團。103.實施方案的EGFR-結合多肽，其中第28位的氨基酸取代是極性的。104.實施方案103的EGFR-結合多肽，其中第28位的氨基酸取代是不帶電荷的。105.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第28位的氨基酸取代是堿性的。106.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第28位的氨基酸取代選自F、Q、V、A、K、V和T。107.實施方案106的EGFR-結合多肽，其中第28位的氨基酸取代是T、Q或V。108.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第32位的氨基酸取代是疏水性的。109.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第32位的氨基酸取代是中性的。110.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第32位的氨基酸取代是非極性的。111.實施方案110的EGFR-結合多肽，其中第32位的氨基酸具有脂肪族R基團。112.實施方案1到109任一項的EGFR-結合多肽，其中第32位的氨基酸取代是極性的。113.實施方案112的EGFR-結合多肽，其中第32位的氨基酸取代是不帶電荷的。114.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第32位的氨基酸取代是堿性的。115.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第32位的氨基酸取代選自V、L、S、F、A和R。116.實施方案115的EGFR-結合多肽，其中第32位的氨基酸取代是L、S或A。117.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第35位的氨基酸取代是疏水性的。118.實施方案1到116任一項的EGFR-結合多肽，其中第35位的氨基酸取代是中性的。119.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第35位的氨基酸取代是非極性的。120.實施方案119的EGFR-結合多肽，其中第35位的氨基酸取代具有脂肪族R基團。121.實施方案1到118任一項的EGFR-結合多肽，其中第35位的氨基酸取代是極性的。122.實施方案121的EGFR-結合多肽，其中第35位的氨基酸取代是不帶電荷的。123.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第35位的氨基酸取代是堿性的。124.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第35位的氨基酸取代具有芳香族R基團。125.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中第35位的氨基酸取代選自V、W、S、R、M、H和L。126.實施方案125的EGFR-結合多肽，其中第35位的氨基酸取代是W、S或V。127.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中位于多肽表面上的氨基酸殘基被取代。128.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其中在多肽三維結構核心內(nèi)的氨基酸殘基不被取代。129.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其通過C末端和/或N末端氨基酸延伸而被延長。130.實施方案129的EGFR-結合多肽，其中所述或每個氨基酸延伸增強了多肽與EGFR的結合。131.實施方案129或130的EGFR-結合多肽，其中所述或每個氨基酸延伸改良了多肽的生成、純化、體內(nèi)或體外穩(wěn)定性、偶聯(lián)或檢測。132.實施方案131的EGFR-結合多肽，其中所述或每個氨基酸延伸包括在多肽氨基酸序列開始或最后位置上的半胱氨酸殘基。133.實施方案131的EGFR-結合多肽，其中氨基酸殘基延伸包含His6標記或″myc″或″flag″標記。134.實施方案131的EGFR-結合多肽，其中所述延伸包含鏈球菌蛋白質G的白蛋白-結合結構域或其衍生物，其改良了治療應用中EGFR-結合多肽的半衰期。135.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其包含大約53個氨基酸。136.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其結合EGFR，因此相互作用的KD值至多是1×10-6M。137.實施方案136的EGFR-結合多肽，其結合EGFR，因此相互作用的KD值至多是1×10-7M。138.任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其結合EGFR胞外結構域。139.實施方案138的EGFR-結合多肽，其結合相應于成熟EGFR(SEQIDNO：328)的核苷酸259-2127的EGFR胞外結構域(SEQIDNO：329)部分。140.EGFR-結合多肽，其包含任何前述實施方案的EGFR-結合多肽的片段。141.實施方案140的EGFR-結合多肽，其中所述片段包含實施方案1到139任一項的多肽的N末端減少。142.實施方案141的EGFR-結合多肽，其中所述N末端減少是最多4個氨基酸。143.多聚體形式的任何前述實施方案的EGFR-結合多肽，其包含EGFR-結合多肽單元。144.實施方案143的EGFR-結合多肽，其中EGFR-結合多肽單體單元共價偶聯(lián)在一起。145.實施方案143的EGFR-結合多肽，其中EGFR-結合多肽單體單元表達為融合蛋白。146.二聚體形式的實施方案143到145任一項的EGFR-結合多肽。147.編碼任何前述實施方案的多肽的核苷酸。148.生產(chǎn)實施方案1到146任一項的多肽的方法，該方法包含表達實施方案147的核苷酸。149.實施方案1到146任一項的EGFR-結合多肽與可檢測物質的組合。150.實施方案149的組合，其中可檢測物質是用于放射成像的放射性物質。151.實施方案150的組合，其中放射性物質是放射性核素。152.實施方案149的組合，其中可檢測物質是酶。153.實施方案152的組合，其中酶選自β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶和羧肽酶。154.實施方案149的組合，其中可檢測物質是熒光多肽。155.實施方案1到146任一項的EGFR-結合多肽與治療藥物的組合。156.實施方案149到155任一項的組合，其中EGFR-結合多肽和可檢測物質或治療藥物共價連接在一起。157.實施方案149到155任一項的組合，其中EGFR-結合多肽和可檢測物質或治療藥物表達為融合蛋白。158.一種放射成像的方法，其中實施方案150到151任一項的組合被用作一個放射成像物質。159.一種檢測EGFR的方法，包含提供懷疑含有EGFR的樣品，將樣品與實施方案1到146任一項的EGFR-結合多肽或實施方案149到154任一項的組合相接觸，并檢測多肽或組合的結合或樣品以指示樣品中EGFR的存在。160.實施方案159的檢測方法，其中超過一個的EGFR被檢測。161.一種從樣品分離或捕獲EGFR的方法，該方法包含將樣品與實施方案1到146任一項的EGFR-結合多肽或實施方案149到154任一項的組合相接觸，因此EGFR結合多肽并從樣品中去除。162.一種用于確定個體內(nèi)EGFR存在的診斷方法，該方法包括將個體或來自于個體的樣品與實施方案1到146任一項的EGFR-結合多肽或實施方案149到154任一項的組合相接觸，并檢測多肽或組合的結合。163.實施方案162的方法，其中個體是人或動物。164.實施方案162的方法，其中所述方法在體內(nèi)進行。165.實施方案162或163的方法，其中所述方法在體外樣品上進行。166.一種治療個體或衍生自個體的材料內(nèi)EGFR-相關病癥的方法，其中所述個體或材料用實施方案1到146任一項的EGFR-結合多肽或實施方案155到157任一項的組合處理。167.實施方案166的治療方法，其中實施方案1到146任一項的EGFR-結合多肽或實施方案155到157任一項的組合與個體或材料內(nèi)的EGFR的結合抑制或刺激受體激活。168.實施方案166或167的治療方法，其中所述EGFR-結合多肽與個體或材料內(nèi)的EGFR的結合抑制細胞信號傳導。169.實施方案166到168任一項的治療方法，其中EGFR-相關病癥是癌癥。170.實施方案169的治療方法，其中癌癥選自肺癌、乳腺癌、前列腺癌、結腸癌、卵巢癌、頭頸癌。171.實施方案166到170任一項的方法，其中個體是人或動物。附圖簡述本發(fā)明多肽及其應用方法通過參考附圖1-12作為例子進行描述，其中：圖1是包含在本發(fā)明EFGR-結合多肽內(nèi)的EGFR結合基序實例(SEQIDNO：1-163)、本發(fā)明EGFR-結合多肽實例(SEQIDNO：164-326)、金黃色葡萄球菌蛋白質A的結構域B的蛋白質Z衍生物實例(SEQIDNO：327)、全部人類EGFR(SEQIDNO：328)和人類EGFR胞外結構域(SEQIDNO：329)的氨基酸序列列表。圖2A顯示本發(fā)明從實施例1選擇的不同EGFR-結合多肽氨基酸序列與蛋白質Z序列相比較。該圖指示堿性、酸性、非極性和極性氨基酸殘基；圖2B顯示圖2A中4個多肽的氨基酸序列并指示疏水性、中性和親水性氨基酸殘基，圖2C顯示圖2B的具有高亮的明顯其他特征的多肽的氨基酸序列，圖2D舉例說明產(chǎn)生本發(fā)明多肽的親和力成熟策略；圖3顯示SDS-PAGE分析EGFR-結合多肽His6-ZEGFR：942(泳道1)、His6-ZEGFR：948(泳道2)、His6-ZEGFR：955(泳道3)、His6-(ZEGFR：942)2(泳道4)、His6-(ZEGFR：948)2(泳道5)和His6-(ZEGFR：955)2(泳道6)的結果。泳道M含有蛋白質標準分子量。從右起，分子量以千道爾頓表示。圖4顯示使用本發(fā)明的不同EGFR-結合多肽進行的生物傳感器結合研究的結果；圖5顯示本發(fā)明3個EGFR-結合多肽對于天然EGFR親和力的流式細胞儀分析結果；圖6是暴露于本發(fā)明熒光標記的EGFR-結合多肽的細胞的一系列共焦顯微術圖像；圖7是顯示用本發(fā)明放射性標記的EGFR-結合多肽的細胞結合研究的結果的圖；圖8是一效力顯示飽和度結果和用本發(fā)明放射性標記的EGFR-結合多肽研究結果的圖；圖9顯示使用依據(jù)本發(fā)明的不同EGFR-結合多肽進行的生物傳感器結合研究的結果；圖10是一系列細胞圖像，細胞暴露于本發(fā)明EGFR-結合多肽，使用A)熒光檢測和B)酶促檢測；圖11是顯示在A431細胞上本發(fā)明EGFR-結合多肽的銦-111標記的苯甲基-DTPA綴合物的體外特異性測試的結果的圖。所有數(shù)據(jù)點是3次測量的平均值，誤差線代表SEM。圖12是一系列顯示在攜帶A431移植物的小鼠內(nèi)111In-苯甲基-DTPA-EGFR結合綴合物的生物分布以及腫瘤與正常組織比例的圖。每個數(shù)據(jù)點代表4只動物±標準差的平均數(shù)并表示為每克器官或組織注射的放射性百分率。在以下實驗中，使用噬菌體展示選擇衍生自金黃色葡萄球菌蛋白質A的B結構域的蛋白質Z衍生物的EGFR-結合變體。EGFR-結合Z變體有時共同表示為ZEGFR。每個Z變體被給予一個唯一的鑒定號碼#####，并且各個變體可互換表示為Z#####和ZEGFR：####。實施例1本發(fā)明EGFR結合多肽的第一輪選擇材料和方法多肽結合物、菌株、載體和噬菌粒文庫的制備大腸桿菌菌株RRIΔM15(Ruther，U.(1982)NucleicAcidsRes.，10，5765-5772)的琥珀抑制基因被用作噬菌體生產(chǎn)和克隆程序的細菌宿主。GronwallC，JonssonA，LindstromS，GunneriussonE，StahlS，HemeN：″SelectionandcharacterizationofAffibodyligandsbindingtoAlzheimeramyloidbetapeptides″，J.Biotechnol.(2006)待發(fā)表，Epub27Sep2006中揭示了用于這個研究的嗜菌粒載體pAffil以及構建嗜菌粒文庫Zlib2002(3x109成員)。選擇克隆的嗜菌粒插入物被亞克隆到表達載體pAY442和pAY430中，其含有T7啟動子(Studieretal.，(1990)MethodsEnzymol.，185，60-89)、編碼六組氨酸(His6)標記和多克隆位點的DNA片段和卡那霉素抗性基因，以及用于直接標記pAY430的C末端額外的半胱氨酸。大腸桿菌菌株BL21(DE3)(Novagen，Madison，WI)用于從表達載體產(chǎn)生蛋白質。制備噬菌體原液從文庫(Zlib2002的一部分)制備噬菌體原液和選擇使用輔助噬菌體M13K07(NewEnglandBiolabs，Beverly，MA)依據(jù)前述程序(Nord，Ketal.，(1997)Nat.Biotechnol.，15，772-777；Hanssonetal.，(1999)Immunotechnology，4，237-252)進行。PEG/NaCl沉淀產(chǎn)生的噬菌體滴度大約是1013pfu/ml。噬菌體選擇包含623個氨基酸的、相應于核苷酸259-2127的EGFR的～100kDa重組胞外結構域(ECD)在選擇過程中用作靶蛋白質(SEQIDNO：329)。使用EZ-LinkTM-Sulfo-NHS-LC-生物素(Pierce，Rockford，IL)將蛋白質體外生物素化。在磷酸緩沖鹽溶液(PBS；10mM磷酸鹽，137mMNaCl，pH7.2)中的EGFR-ECD內(nèi)加入20倍摩爾過量的生物素，并且混合物在室溫保溫1小時，然后在4℃對PBS廣泛透析去除多余的生物素。然后，生物素化的靶蛋白質被固定在鏈霉抗生物素蛋白包被的順磁珠上(DynabeadsM-280Streptavidin；DynalA.S.，Oslo，Norway)。每一輪選擇，使用添加0.1％Tween-20(PBST)的PBS洗珠2次。為避免非特異性結合物，在這個程序中使用的所有試管用添加0.1％明膠的PBST預處理。為了進一步避免針對順磁珠上存在的鏈霉抗生物素蛋白的結合物，第1和第2輪使用0.2mg珠(預先使用PBST洗2次)與添加0.1％明膠的PBST中的噬菌體原液預保溫。未結合的噬菌體原液在連續(xù)顛倒(end-over-end)旋轉下在室溫進行生物淘選EGFR-ECD靶蛋白1小時45分鐘，隨后與鏈霉抗生物素蛋白包被的順磁珠保溫15分鐘(室溫，連續(xù)顛倒旋轉)。如下進行2次分離選擇，在每輪淘選中使用2個不同的遞減的靶蛋白濃度。第1輪；12和1.2μg靶蛋白與6和0.6mg珠分別保溫；第2輪；5、2.5、0.5和0.35μg靶蛋白與2.5、1.25、0.25、0.125mg珠分別保溫；第3輪和第4輪；5、1、0.5和0.1μg靶蛋白與1、0.5、0.1、0.05mg珠分別保溫。這個程序導致每mg珠固定～2μg靶蛋白，由SDS-PAGE分析來確定。按如下進行4輪生物淘選。在第1輪中使用PBST洗珠2次，在第2輪中5次，在第3輪中7次以及在第4輪中10次。隨后，使用500μl50mM甘氨酸-HCl，pH2.1洗脫結合的噬菌體，室溫10分鐘，隨后立即使用50μl1MTris-HCl，pH8.0和450μlPBS中和。洗脫的噬菌體用于感染對數(shù)生長期的RRIΔM15細胞，37℃，30分鐘。被感染的細胞懸液涂布在添加2％葡萄糖和100mg/1氨芐青霉素的TYE瓊脂板上(15g/1瓊脂，8g/1NaCl，10g/1胰蛋白胨和6g/1酵母提取物)，隨后37℃保溫過夜。在補加了5g/l酵母提取物、2％葡萄糖和100μg/ml氨芐青霉素的胰蛋白酶大豆肉湯(TSB，30g/1；Merck，Darmstadt，Germany)中重懸收集生長的菌落，并將級分(與洗脫后噬菌體滴度比較～500倍過量細胞)用于接種，以生產(chǎn)下一代噬菌體原液。通過滴定選擇前和洗脫后的噬菌體原液來監(jiān)測選擇過程。一系列噬菌體稀釋液被允許感染對數(shù)生長期RRIΔM15細胞，室溫5分鐘，隨后接種在添加2％葡萄糖和100μg/ml氨芐青霉素的TYE瓊脂板上，37℃保溫過夜。鏈霉抗生物素蛋白ELISA4輪生物淘選之后，在從全部4輪選擇中隨機挑選的372個菌落上進行ELISA，以排除具有鏈霉抗生物素蛋白結合能力的噬菌粒(pAffil)插入物。隨機挑選菌落的細胞裂解物在預封閉(添加2％奶粉的PBST)的鏈霉抗生物素蛋白包被的96孔板(Nunctransparent，c96，236001)中保溫，室溫1.5小時。使用一抗兔IgG泛抗多肽特異性結合物(1.5小時，室溫，連續(xù)搖動)和二抗兔免疫球蛋白-HRP(P0448DacoCytomatation；1小時，室溫，連續(xù)搖動)。在加入底物溶液(ImmunopureTMB；Pierce)后，使用TecanSunrise分光光度計測量A405nm吸光度。DNA測序在第4輪淘選的非鏈霉抗生物素蛋白結合克隆上進行噬菌粒(pAffi1)插入物的DNA測序，其中64個克隆來自選擇1和2，32個來自選擇3和4。使用特異性引物和BigDye終止物(AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden)和在DNA測序儀ABIprism3700Analyzer(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)上分析Sanger片段。同樣的程序驗證亞克隆DNA片段。在排除具有琥珀終止密碼子(3個)、超過一個的半胱氨酸(1個)以及在其他靶選擇中已被發(fā)現(xiàn)的序列(3個)后，選擇10個序列進行進一步的研究。這些多肽結合物各自的氨基酸序列顯示在圖1和在SEQIDNO：164-173中揭示。這些變體的推測的EGFR結合基序在SEQIDNO：1-10中顯示。選擇的變體的序列也在圖2A中顯示。特別地，在圖2A中，相應于“野生型”Z結構域的氨基酸序列與針對EGFR-EDC選擇的10個不同多肽結合物的推測的氨基酸序列進行排列對比，在圖中以及在本說明書別處使用的破折號代表與“野生型”序列內(nèi)相應氨基酸相同的氨基酸。顯示13個隨機化的氨基酸殘基(Q9，Q10，N11，F(xiàn)13，Y14，L17，H18，E24，E25，R27，N28，Q32，K35)。在超過一種變體內(nèi)相同位置出現(xiàn)的氨基酸殘基以粗體表示。水平線指示氨基酸特性。右圖顯示每個多肽結合物在372個菌落的DNA測序中被檢測到的次數(shù)?？騼?nèi)顯示野生型Z結構域內(nèi)的3個α-螺旋。圖2B和圖2C給出本發(fā)明多肽結合物內(nèi)的氨基酸取代的更多的特性。在疏水性/親水性上下文中，“中性”表示相對既不是疏水性也不是親水性的氨基酸。圖2D圖解說明改良最初確定的多肽結合物的成熟策略。就此而論，在第9、10、11、13和14位的殘基可能不太重要并且被取代，而第17和18位，天冬酰胺和精氨酸是特別優(yōu)選的，盡管由于技術原因也可能是優(yōu)選的絲氨酸和組氨酸也可以被產(chǎn)生并作為密碼子類似性的結果而用于結合。在第35位，優(yōu)選纈氨酸和絲氨酸，盡管由于技術原因也可以特別選擇亮氨酸和丙氨酸。第24、25、27、28和32位分別預期為氨基酸G、W、M、T和A，雖然在任何這些位點可以出現(xiàn)具有保留的分子結合EGFR-能力的單取代。DNA構建體編碼不同EGFR多肽結合物的DNA片段被亞克隆進表達載體pAY442和pAY430。使用在3’和5’都導入AccI位點的特異性引物從載體pAffi1擴增片段，并與用同樣酶預先限制的pAY442和pAY430載體連接，并使用牛小腸堿性磷酸酶(CIAP；Fermentas)去磷酸化。使用QIAuickPCR純化試劑盒(QiagenGmbH，Hilden，Germany)純化擴增的DNA片段并雜交，然后用T4DNA連接酶(NewEnglandBiolabs)連接。連接產(chǎn)生表示為pAY442-ZEGFR：no和pAY430-ZEGFR：no的表達載體，編碼與N末端His6標記融合的不同多肽結合物，通過固定金屬離子親和層析(IMAC)純化。在轉化的大腸桿菌細胞培養(yǎng)過夜后，按照廠商說明書使用QIAprepSpinMiniprep試劑盒進行所有的質粒制備。蛋白質生產(chǎn)和純化選擇的多肽結合物從大腸桿菌菌株BL21(DE3)內(nèi)的pAY442和pAY430質粒中表達為His6-標記的融合蛋白。細胞接種于含有50mg/l卡那霉素的5mlTSB培養(yǎng)基中(30g/L胰蛋白酶大豆肉湯)，并在深孔平板中生長過夜，37℃，～150rpm。添加了5g/l酵母提取物和50mg/l卡那霉素的新鮮TSB(5ml)用20μl過夜培養(yǎng)物接種，細胞37℃生長4小時，當加入異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)到達終濃度1mM時誘導基因表達。25℃過夜培養(yǎng)后，離心(10000g，10分鐘)收獲細胞并凍融(-80℃，40分鐘)裂解細胞。隨后，細胞沉淀重懸于尿素緩沖液(8M，pH8.0)。在變性條件(Qiagen)下使用BR3000自動裝置通過在Ni-NTASuperflow柱上的IMAC純化回收His6-ZEGFR融合蛋白。使用低pH尿素緩沖液(8M，pH4.5)洗脫結合的蛋白質并且在NAPTM-5大小排阻層析柱(AmershamBiosciences)上通過改變緩沖液為HBS(10mMHEPES，150mMNaCl，3.4mMEDTA，0.005％表面活性劑P20，pH7.4)進行純化的融合蛋白的復性。每個蛋白質使用合適的消光系數(shù)，由280nm吸光度測量值計算多肽的蛋白濃度。通過SDS-PAGE在PhastgelTM20％均勻凝膠上使用Phast系統(tǒng)(AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden)進一步分析純化的多肽。通過氨基酸分析也確定選擇的ZEGFR變體的蛋白濃度(Aminosyraanalyscentralen，Uppsala，Sweden)。圖3顯示SDS-PAGE分析表達的和IMAC-純化的EGFR-結合多肽His6-ZEGFR：942(泳道1)、His6-ZEGFR：948(泳道2)、His6-ZEGFR：955(泳道3)、HiS6-(ZEGFR：942)2(泳道4)、His6-(ZEGFR：948)2(泳道5)和His6-(ZEGFR：955)2(泳道6)。泳道M，蛋白標準分子量，以千道爾頓表示。生物傳感器分析使用2000儀器(BiacoreAB，Uppsala，Sweden)用于選擇的多肽結合物和靶蛋白質之間的實時生物特異性相互作用(BIA)。按照廠商說明書，EGFR-ECD(于10mMNaAc，pH4.5中稀釋)通過胺偶聯(lián)固定(～2600RU)在CM5傳感器芯片(Biacore)的一個流動池表面的羧化葡聚糖層上。激活并去活化另一個流動池表面以作為參考表面，HER2-ECD和人IgG(AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden)被固定在CM5傳感器芯片上分開的流動池表面，作為陰性對照。實驗下的所有多肽結合物樣品以運行緩沖液HBS(10mMHEPES，150mMNaCl，3.4mMEDTA，0.005％表面活性劑P20，pH7.4)稀釋并過濾(0.45μm；Millipore，Billerica，MA)，之后在25℃進行結合分析。在第一個實驗中，試驗下的～1μM每個多肽結合物(HBS稀釋)以流速20μl/分鐘被注射所有表面。與EGFR無親和力的不相關的53個氨基酸多肽結合物用作陰性對照，和天然配體hEGF(ChemiconInternational，Temecula，CA，USA)和商品單克隆抗體cetuximab(MERCKDarmstadt，Germany)用作陽性對照，也都注射。在第二個實驗中，單體His6-ZEGFR和二聚體His6-(ZEGFR)2多肽結合物進行動力學分析，其中以30μl/分鐘的流速，濃度范圍從0.00625μμM到12.8μμM，蛋白被注射在EGFR-ECD表面。假定是一對一的結合，使用BIAevaluation3.2軟件(Biacore)計算解離平衡常數(shù)(KD)、結合速率常數(shù)(ka)和解離速率常數(shù)(kD)。在第二個實驗中，樣品以隨機順序一式二份進行實驗，每次注入后，注射10mMHCl再生流動池。生物傳感器隊列分析結果在表1和圖4中描述。表1給出在BIAcore上生物傳感器分析的一價和二價EGFR-ECD結合多肽結合物的動力學參數(shù)比較。通過基因重復策略，產(chǎn)生二聚化EFGR-結合多肽構建體，如前述SteffenetalCancerBiother.&Radiopharmaceuticals，20，239-248制備并親和純化。額外克隆測序后包括額外的多肽ZEGFR：1239(確定與ZEGFR：955序列相關)，并揭示了其作為單體性能的數(shù)據(jù)。解離平衡常數(shù)給出如下的4個His6-ZEGFR多肽結合物的親和力排列His6-ZEGFR：1239＜His6-ZEGFR：955＜His6-ZEGFR：948＜His6-ZEGFR：942。表1EGFR結合多肽KDa(nM)Kab(M-1s-1)kdc(s-1)His6-ZEGFR：942～130～3.0×105～4.0×10-2His6-(ZEGFR：942)2～30～6.0×105～1.6×10-2His6-ZEGFR：948～180～4.2×105～7.7×10-2His6-(ZEGFR：948)2～40～1.9×105～8.1×10-3His6-ZEGFR：955～190～6.2×104～1.2×10-2His6-(ZEGFR：955)2～50～4.8×104～2.4×10-3His6-ZEGFR：1239～490～1.9×105～9.2×10-2a解離平衡常數(shù)b結合速率常數(shù)c解離速率常數(shù)體外結合分析可見，所有4個EFGR-結合多肽以相當高的親和力結合EFGR并且在它們的結合動力學特征上稍有不同。圖4A顯示將純化的His6-(ZEGFR：942)2(正方形)、His6-(ZEGFR：948)2(三角形)和His6(ZEGFR：955)2(圓形)變體注射到含有胺偶聯(lián)的EGFR-ECD(閉合正方形/三角形/圓形)或HER2-ECD(開放正方形/三角形/圓形)的傳感器芯片流動池表面之后獲得的傳感圖結果。這證明3個His6-ZEGFR變體(His6-ZEGFR：942、His6-ZEGFR：948和His6-ZEGFR：955)特異性結合EGFR-ECD固定流動池表面，但是未見與HER2-ECD固定的流動池表面的結合。圖4B顯示將一價(灰線)和二價(黑線)EGFR-結合多肽注射到EGFR-ECD流動池表面之后獲得的傳感圖結果。圖表顯示3個候選的結合物，已證實一價和二價EGFR-結合多肽解離速率(off-rate)不同，證明在第二代克隆中主要通過獲得較慢解離速率實現(xiàn)了通過親和力(avidity)作用改善表觀親和力(affinity)。細胞培養(yǎng)為如下的熒光團標記FACS和共焦顯微鏡研究，已知每個細胞表達～2×106EGFR的人上皮癌細胞A431(EuropeanCollectionofCellCultures，Wiltshire，UK)在含有添加10％胎牛血清、2mML-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸和1％抗生素-抗真菌劑的EMEM培養(yǎng)基(所有試劑來自Gibco，InvitrogenAB)的補充培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細胞在37℃、含5％CO2的潮濕空氣中培養(yǎng)。熒光團標記His6-(ZEGFR：942)2、His6-(ZEGFR：948)2和His6-(ZEGFR：955)2多肽結合物用Oregon488馬來酰亞胺(MolecularProbes)直接標記導入的半胱氨酸(在C末端)。大約1mgHis6-(ZEGFR)2多肽結合物重懸于PBS中并使用20mMDTT在37℃還原45分鐘。多余的DTT通過用PBS平衡的NAPTM-5大小排阻柱子(AmershamBiosciences)去除。加入20倍摩爾過量的10mMOregon488馬來酰亞胺溶液，室溫避光連續(xù)搖動2小時。對PBS進行廣泛透析以去除多余的熒光團。依據(jù)廠商方案使用280和496nm吸光度測量值計算試驗下熒光團標記的多肽結合物的濃度和標記性能。使用Phast系統(tǒng)(AmershamBiosciences)在SDS-PAGEPhastgelTMHomogenous20％凝膠上分析標記的多肽結合物。FACS在FACSVantageSEstream-in-air流式細胞儀(BDBiosciences，SanJose，CA，USA)上進行流式細胞術分析。使用用于488nm的流式細胞儀校正珠(MolecularProbes，Leiden，TheNetherlands)校正激光。樣品用空氣冷卻氬激光(488nm)照射。以大約300次事件/秒的速度檢測10000個細胞的熒光，前向和側向散射光。用CellQuest軟件(BDBiosciences)分析流式細胞術數(shù)據(jù)。在流式細胞術分析之前，實驗前～3天，種植在培養(yǎng)皿中的細胞被胰蛋白酶消化(0.25％胰蛋白酶，37℃，10分鐘)。離心(582g，3分鐘)細胞，沉淀重懸于PBS+1％BSA中，96孔培養(yǎng)板內(nèi)每孔有等份的～300000個細胞。細胞與10μg/ml熒光團標記的His6-(ZEGFR)2多肽結合物在冰上保溫～30分鐘。離心并用PBS+1％BSA洗后，細胞沉淀重懸于300μlPBS+1％BSA并進行流式細胞術分析。與EGFR無結合能力的相似多肽(His6-標記的二聚化構建體)用作陰性對照。這些研究結果在圖5中顯示。特別地，圖5顯示的流式細胞術分析結果證明3個候選結合物(His6-(ZEGFR：942)2、His6-(ZEGFR：948)2、His6-(ZEGFR：955)2)對于A431細胞上天然EGFR的親和力的排列。用作陰性對照(白色)的不相關的Z變體分子位于柱狀圖最左邊。然后，3個ZEGFR結合物以如下順序排列：His6-(ZEGFR：942)2(淺灰)＜His6-(ZEGFR：948)2(灰色)＜His6-(ZEGFR：955)2(黑色)。這些數(shù)據(jù)建議ZEGFR：955可能是3個中最好的候選，盡管在BIAcore中它具有較低的親和力，因為該測定是基于與細胞上天然EGFR的結合。共焦顯微術在實驗前一天，每30mm培養(yǎng)皿中接種大約300000A431細胞。將測試的His6-(ZEGFR：942)2、His6-(ZEGFR：948)2和His6-(ZEGFR：955)2多肽結合物于完全EMEM培養(yǎng)基中稀釋到大約10μg/ml，加入到分開的培養(yǎng)皿中并避光保溫2小時，37℃。測試的3個多肽結合物也如上于無血清EMEM培養(yǎng)基中稀釋，加入分開的培養(yǎng)皿中并在冰上避光保溫1小時。保溫之后，細胞以正常培養(yǎng)基洗一次并加入一些培養(yǎng)基以用于共焦顯微鏡(LSM5Pascal；Zeiss)成像分析。進行連續(xù)掃描以覆蓋細胞厚度并選擇代表細胞中間的掃描。以同樣方法分析作為陰性對照的、與EGFR沒有親和力的相似多肽。共焦顯微術的結果示于圖6。特別地，圖6顯示A431細胞的共焦顯微術圖像，該細胞暴露于OregonGreen標記的His6-ZEGFR多肽A)冰上1小時及B)37℃，2小時。從左到右，可見His6-(ZEGFR：942)2、His6-(ZEGFR：948)2和His6-(ZEFGR：955)2在(A)中結合的和在(B)中內(nèi)在化的細胞膜。結果證明3個EFGR-結合多肽看上去，正如所預測的，結合細胞膜，并在37℃保溫時似乎發(fā)生內(nèi)在化。細胞培養(yǎng)對于如下的放射性標記、特異性和飽和研究，細胞培養(yǎng)于75cm2培養(yǎng)瓶和24孔平板(Nunclonsurface，Denmark)。對于標記方法，使用125I(AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden)、乙酸(MerckDarmstadt，Germany)、氯胺-T(Sigma，USA)、焦亞硫酸鈉(Aldrich，USA)和N-琥珀酰亞胺-4-[3-三甲基甲錫烷基]苯甲酸鹽(本實驗室合成)。NAP-5柱(SephadexG-25，AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden)應用于凝膠過濾。使用胰蛋白酶-EDTA(0.25/0.02％)(BiochromKg)分離細胞并使用細胞計數(shù)器計數(shù)(BeckmanCoulterZ2，F(xiàn)ullerton，CA，USA)。使用gamma計數(shù)器(1480Wizard，WallacOy，Turku，F(xiàn)inland)測量放射性。使用富含EGFR的鱗狀細胞癌細胞系A431(ATCC，CLR1555，Rocksville，MD，USA)。細胞培養(yǎng)于添加了L-谷氨酰胺(2mMBiochromKg，Berlin，Germany)、PEST(青霉素100IU/ml和鏈霉素100μg/ml)和10％胎牛血清(BiochromKg)的Ham′sF-10培養(yǎng)基中(″完全培養(yǎng)基″)。細胞生長于37℃、具有5％CO2平衡的潮濕空氣的培養(yǎng)箱中。放射性標記多肽結合物ZEGFR：942、ZEGFR：948和ZEFGR：955的二聚體通過N-琥珀酰亞胺基團用125I間接標記。將乙酸(2μl，0.1％乙酸于milli-Q中)和N-琥珀酰亞胺-4-[3-三甲基甲錫烷基]苯甲酸鹽(5μl，5％乙酸于甲醇中)加入125I(15MBq)。通過加入10μl氯胺-T將碘偶聯(lián)到N-琥珀酰亞胺-4-[3-三甲基甲錫烷基]苯甲酸鹽上。然后將溶液重懸30秒并進一步在室溫保溫5分鐘。加入15μl焦亞硫酸鈉終止反應。于硼酸鹽緩沖液中稀釋多肽結合物并加入到碘溶液中，并添加額外的硼酸鹽緩沖液使總體積達到150μl，于是溶液保溫30分鐘。為從低分子量化合物中分離標記的多肽結合物，使用PBS平衡的NAP-5柱。特異性測試A431細胞培養(yǎng)于24孔板并使用無血清Ham′sF-10培養(yǎng)基洗一次。3個二聚體化的被檢測的多肽結合物被125I標記并加入細胞，相對于可獲得的受體數(shù)量其摩爾過量大約10∶1，并在37℃保溫4小時。在一些孔中，未標記的多肽結合物(摩爾過量大約500∶1)和[125I]多肽結合物一起加入以確定非特異性結合。以同樣方法使用EGF(摩爾過量大約200∶1)和cetuximab(摩爾過量大約500∶1)，但是觀察是否多肽結合物具有與EGF和cetuximab相同的結合位點。然后，用無血清Ham′sF-10培養(yǎng)基洗細胞6次并加入0.5ml胰蛋白酶-EDTA分離細胞并在37℃保溫30分鐘或直到細胞被分開為止。加入1mlHam′sF-10完全培養(yǎng)基并且重懸細胞。在一些孔中，0.5ml懸液用于計數(shù)細胞。用gamma計數(shù)器檢測放射性(分別取1.5ml和1ml細胞用于計數(shù))。結果在圖7顯示。特別地，在圖7中，顯示[125I](Z00942)2(42*)、[125I](Z00948)2(48*)和[125I](Z00955)2(55*)的細胞結合。數(shù)據(jù)支持先前的FACS-排列的結合物的未預料的結果，其指示ZEFGR：955似乎是細胞上天然EGFR最好的結合物，其次是ZEGFR：948和ZEGFR：942，盡管事實是在BIAcore分析中，(ZEGFR：942)2顯示出最高的親和力。另外，3個EFGR-結合多肽構建體似乎結合重疊表位。而且，它們似乎都與天然配體EGF和單克隆抗體cetuximab競爭相同的結合位點。飽和分析測定多肽結合物結合飽和以確定親和力常數(shù)。富含EGFR的細胞系A431培養(yǎng)于24孔平板。細胞置于冰上并在冷的無血清Ham′sF-10培養(yǎng)基中洗一次。制備一系列稀釋度的125I標記的多肽二聚化結合物并以摩爾過量大約10∶1加入細胞中。細胞在冰上置于如下的環(huán)境中保溫4小時，期間緩慢搖動：來自孵箱的空氣被限制在放有細胞平板的塑料袋中。對于每一個濃度，也存在含有未標記多肽結合物的封閉對照，其摩爾過量大約300∶1以評價非特異性結合。然后，以冷的Ham′sF10無血清培養(yǎng)基洗細胞6次并且加入0.5ml胰蛋白酶-EDTA分離細胞和37℃保溫30分鐘或直到細胞被分離。加入1mlHam′sF-10完全培養(yǎng)基并重懸細胞。在一些孔中，取0.5ml懸液用于計數(shù)細胞。用gamma計算器檢測放射性。用GraphPadPrism4分析數(shù)據(jù)。結果顯示在圖8中。特別地，在圖8中，顯示[125I]Z00942(A)、[125I]Z00948(B)和[125I]Z00955(C)的飽和研究結果。顯示從3個數(shù)值得出的均值和標準差。實施例2本發(fā)明EGFR-結合多肽的第二次選擇材料和方法菌株和載體琥珀抑制基因大腸桿菌菌株RRIΔM15(，U.(1982)NucleicAcidsRes.10，5765-72)用于文庫構建，其作為細菌宿主用于噬菌體生產(chǎn)和克隆程序。噬菌粒載體pAffil用于文庫構建并在別處描述(GronwallC，JonssonA，LindstromS，GunneriussonE，StahlS，HemeN：″SelectionandcharacterizationofAffibodyligandsbindingtoAlzheimeramyloidbetapeptides″，J.Biotechnol.(2006)inpress，Epub27Sep2006)。選擇的克隆的噬菌粒插入物被亞克隆到表達載體pAY442中，其含有T7啟動子(Studieretal.，(1990)MethodsEnzymol.185，60-89)、編碼6組氨酸(HiS6)標記和多克隆位點的DNA片段以及卡那霉素抗性基因。大腸桿菌菌株BL21(DE3)(Novagen，Madison，WI)用于從表達載體制備蛋白質。二級噬菌粒文庫的構建基于從EGFR-結合分子(實施例1，圖2)第一輪選擇出的4個序列的排列決定親和力成熟策略。從編碼蛋白質Z的螺旋1和2的、具有某些簡并密碼子的一條129個核苷酸的模板寡核苷酸(5′ctcgaggtagacaacaaattcaacaaagaannknnknnkgcgnnknnkgagatcmrymryttacctaacttaaacggttggcaaatgaccgccttcatcgcgagtttakytgatgacccaagccaaagc3′)通過PCR擴增產(chǎn)生二級文庫。使用正向引物5′-cccccccccctcgaggtagacaacaaattcaa-3′(XhoI位點，下劃線)和反向引物5′-cccccctgctagcaagttagcgctttggcttgggtcatc-3’(NheI位點，下劃線)以及用于每95個平行反應使用1pmol模板寡核苷酸擴增基因片段。使用AmpliTaqGold聚合酶(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA)擴增15個循環(huán)(96℃15秒，60℃15秒和72℃1分鐘)完成擴增，合并產(chǎn)物，使用QIAquickPCR純化試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)純化，XhoI/NheI消化和連接到XhoI/NheI消化的噬菌粒載體pAffil上，該載體編碼蛋白質Z的第三個nonvariegatedα螺旋。連接的文庫載體經(jīng)fenol∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶21v/v)(Invitrogen)抽提。在ECM630裝置(BTX，Genetronics)上以2500V、125Ω和50μF使用0.2-cm空隙的樣品池，用30等份的連接材料轉化電感受態(tài)大腸桿菌RRIΔM15細胞。細胞在SOC培養(yǎng)基(胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)+酵母提取物(YE)，添加1％葡萄糖，10mmol/1MgCl2，10mmol/1MgSO4，10mmol/1NaCl和2.5mmol/1KCl)中在37℃生長～1小時并轉移到6個錐形瓶中，每個錐形瓶含有1升TSB，并添加2％葡萄糖和25μg/ml羧芐青霉素并在37℃生長過夜。6000g(15min，4℃)離心細胞，隨后重懸于PBS/終濃度大約為20％甘油的甘油溶液，分裝并儲存在-80℃。噬菌體選擇步驟在選擇中使用～100kDa的EGFR重組胞外結構域(命名為EGFR-ECD)作為靶蛋白(1095-ER；R&DSystems)。EGFR-ECD在體外使用EZ-LinkTM-Sulfo-NHS-LC-LC-生物素(Pierce，Rockford，IL，USA)生物素化，20倍摩爾過量的生物素加入于磷酸鹽緩沖液(PBS；10mM磷酸鹽，137mMNaCl，pH7.2)中的EGFR-ECD中，混合物在室溫(RT)保溫1小時，然后在4℃以PBS廣泛透析過夜(ON)以去除多余的生物素。使用輔助噬菌體M13K07(NewEnglandBiolabs，Beverly，MA，USA)依據(jù)先前描述的程序(Nord，Ketal.，(1997)Nat.Biotechnol.，15，772-777；Hanssonetal.，(1999)Immunotechnology，4，237-252)進行文庫和選擇之間的噬菌體原液的制備。PEG/NaCl沉淀產(chǎn)生噬菌體滴度為大約1013噬菌體形成單位(pfu)/ml。在溶液中進行選擇并將結合的噬菌體捕獲到鏈霉抗生物素蛋白包被的順磁珠上(DynabeadsM-280Streptavidin；Dynal，Oslo，Norway)。為避免非特異性結合，所有試管用添加5％牛血清白蛋白(PBST-5％BSA)的PBST(0.1％Tween-20于PBS中)預處理。為進一步避免與存在于鏈霉抗生物素蛋白包被的順磁珠上的鏈霉抗生物素蛋白結合，在前兩輪選擇中～1ml于PBST-3％BSA中的噬菌體原液用0.2mg珠預保溫(30分鐘，顛倒旋轉)。如下進行開始于100nM靶濃度的四輪生物淘選。在第1輪，含有大約1012pfu的等份文庫在于PBST-3％BSA中的1ml100nM生物素化EGFR-ECD中在室溫保溫1小時，連續(xù)旋轉，隨后在4℃～72小時。第2輪和第3輪于1mlPBST-3％BSA中的、分別為50nM和1nM生物素化EGFR-ECD與前一輪的部分噬菌體原液保溫(1小時，室溫，連續(xù)顛倒旋轉)。通過與鏈霉抗生物素蛋白包被的M-280Dynabeads保溫15分鐘(室溫，連續(xù)顛倒旋轉)捕獲結合的噬菌體。正如前面SDS-PAGE分析所確定(結果未顯示)，加入的珠量可以固定每mg珠～2μg靶蛋白。第4輪，如下表2中描述，進行6種稍有不同的選擇方案。在方案4-A和4-B中，0.01nM和0.1nM生物素化EGFR-ECD分別與前一輪的部分噬菌體原液在室溫保溫2小時，隨后與100倍過量的EGFR-ECD在室溫保溫1小時，通過與鏈霉抗生物素蛋白包被的珠保溫15分鐘捕獲結合的噬菌體，洗18次，與100倍過量的第一代EGFR結合物Z00942、Z00948和Z00955(實施例1)在室溫保溫1小時，最終洗2次。在方案4-C中，0.5nM生物素化EGFR-ECD與前一輪的部分噬菌體原液在室溫保溫2小時，隨后通過與鏈霉抗生物素蛋白包被的珠保溫15分鐘捕獲結合的噬菌體，洗18次，與100倍過量的第一代EGFR結合物在室溫保溫1小時，最終洗2次。在方案4-D和4-E中，0.1和0.5nM生物素化EGFR-ECD分別與前一輪的部分噬菌體原液在37℃保溫2小時，隨后與100倍過量的EGFR-ECD在37℃保溫1小時，通過與鏈霉抗生物素蛋白包被的珠保溫15分鐘捕獲結合的噬菌體，洗18次，與100倍過量的第一代EGFR結合物在37℃保溫1小時，最終洗2次。在方案4-F中，0.1nM生物素化EGFR-ECD與前一輪的部分噬菌體原液在室溫保溫2小時，隨后通過與鏈霉抗生物素蛋白包被的珠保溫15分鐘捕獲結合的噬菌體并洗20次。在選擇程序中，清洗步驟的次數(shù)保持恒定在20次，并在所有清洗步驟中均在PBST-3％BSA中進行，除了最后一次清洗使用PBST。噬菌體用500μl50mM甘氨酸-HCl(pH2.1)洗脫10分鐘，隨后加入50μl1MTris-HCl，pH8.0和450μlPBS立即中和。洗脫的噬菌體用于在37℃感染對數(shù)期的RRIΔM15細胞30分鐘。感染的細胞懸液涂布在添加2％葡萄糖和100mg/1氨芐青霉素的TYE瓊脂板上(15g/1瓊脂，3g/1NaCl，10g/1胰蛋白胨和5g/1酵母提取物)，37℃保溫過夜。通過在添加5g/1酵母提取物、2％葡萄糖和100mg/1氨芐青霉素的胰蛋白酶大豆肉湯中(TSB，30g/1；Merck，Darmstadt，Germany)重懸來收集生長的菌落。級分(與洗脫后的噬菌體滴度比較～500倍過量的細胞)用于接種，產(chǎn)生下一代噬菌體原液。使用輔助噬菌體M13K07從感染細胞中獲得噬菌粒顆粒，使用PEG沉淀純化并濃縮。在每個選擇之前和洗脫之后滴定噬菌體原液監(jiān)測選擇過程。一系列稀釋的噬菌體用于在室溫感染對數(shù)期RRIΔM15細胞5分鐘，隨后鋪板在添加2％葡萄糖和100mg/1氨芐青霉素的TYE瓊脂板上，37℃ON。表2第4輪選擇方案4-A4-B4-C4-D4-E4-F用bio-EGFR保溫2h，RT2h，RT2h，RT2h，37℃2h，37℃2h，RT用EGFR保溫(100倍過量)1h，RT1h，RT-1h，37℃1h，37℃-在鏈霉抗生物素蛋白包被的珠上15分鐘15分鐘15分鐘15分鐘15分鐘15分鐘捕獲結合的噬菌體洗滌1-181-181-181-181-181-20用第一代結合物保溫(100倍過量)1h，RT1h，RT1h，RT1h，37℃1h，37℃-洗滌19-2019-2019-2019-2019-20-基于ELISA的第二代結合物的排列單個克隆接種于添加100μmol/1異丙基-L-硫代-β-D-半乳糖吡喃糖苷(IPTG)和100μg/ml氨芐青霉素的1mlTSB-YE培養(yǎng)基的深孔板中(Nunc，Roskilde，Denmark)，并在37℃生長過夜。以3000g離心10分鐘沉淀細胞。于300μlPBST中重懸沉淀并在-80℃凍存過夜。樣品解凍并以3500g離心20分鐘。含有ABD-標記的Z變體分子的上清液(100μl)加入微量滴定孔中，其已被于15mmol/1Na2CO3和35mmol/1NaHCO3(pH9.6)中的6μg/mlHAS(A-3782；Sigma)在4℃預先包被ON并用于PBST中的2％脫脂奶粉在室溫封閉1小時(連續(xù)搖動)。用PBST洗平板4次，之后每孔加入50μl8.4μg/ml生物素化EGFR-ECD并且保溫1.5小時。用PBST洗孔4次之后，每孔加入50μl鏈霉抗生物素蛋白-辣根過氧化物酶(1∶5000，DAKOCytomation，Denmark)并保溫1小時。洗孔4次并每孔加入50μl顯色溶液ImmunoPureTMB底物試劑盒(Pierce)。30分鐘后，每孔加入100μl終止溶液(2MH2SO4)。用TecanSunrise分光光度計測量450nm吸光度。DNA測序和序列聚類對第四輪淘選獲得的187個EGFR-結合克隆進行嗜菌粒(pAffil)插入物的DNA測序。使用特異引物和BigDye終止物(AmershamBiosciences，Uppsala，Sweden)，在DNA序列儀ABI3100GeneticAnalyzer(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity，CA，USA)上分析Sanger片段。同樣程序驗證亞克隆的DNA片段。使用Orlovaetal.(CancerRes.66，4339-48(2006))詳細描述的所謂平均-連接等級聚類方法(average-linkhierarchicalclusteringmethod)對EGFR-結合多肽的序列分類。在前部分描述的ELISA篩選中顯示結合EGFR的候選多肽的推測的氨基酸序列是本發(fā)明EGFR-結合多肽的實例。它們在圖1中顯示和在SEQIDNO：174-309中列出序列。每個這樣結合多肽的相應EGFR-結合基序的序列在圖1中顯示和在SEQIDNO：11-146中列出序列。用Biacore篩選EGFR-結合多肽制備用于ELISA的噬菌體pAffi-載體生成的含有ABD-標記的Z變體的細胞上清也進行生物傳感器分析。在2000儀器上用實時生物特異性相互作用分析ELISA證明具有良好結合的54個克隆的上清。依據(jù)廠商說明書，通過胺偶聯(lián)將靶蛋白EGFR-ECD(于10mMNaAc，pH4.5中稀釋)固定(～1200RU)在一個CM5傳感器芯片(Biacore)流動池表面的羧基葡聚糖層上。另一個流動池表面被激活和滅活以用作參照表面并且HSA被固定在CM5傳感器芯片上分開的流動池表面，用作表達的ABD-標記的Z變體量的對照。實施例1的第一代EGFR結合物(Z00955)2也被用作對照。DNA構建體編碼第二代EGFR-結合Z變體(ZEGFR)的不同變體的DNA片段被亞克隆到表達載體pAY442中。用在3′和5′端導入AccI突出端的特異引物從pAffil載體擴增片段，并連接到先前用相同酶限制和使用牛小腸堿性磷酸酶(CIAP；Fermentas，Ontario，Canada)去磷酸化的pAY442載體。用QIAquickPCR純化試劑盒(QiagenGmbH，Hilden，Germany)純化擴增的DNA片段并雜交，之后用T4DNA連接酶連接(NewEnglandBiolabs，Ipswich，MA，USA)。連接產(chǎn)生了編碼在T7啟動子的控制下的、與使得可以通過固定金屬離子親和層析(IMAC)純化的N末端His6標記融合的不同Z變體的表達載體。構建來自2種載體的EGFR-結合Z變體的二聚化構建體，其中首位相連導入第二個Z變體基因片段，產(chǎn)生His6-(ZEGFR)2變體。過夜培養(yǎng)轉化的大腸桿菌細胞后，依據(jù)廠商說明書使用QIAprepSpinMiniprepKit(QiagenGmbH)進行所有質粒制備。蛋白表達和純化選擇的EGFR-結合Z變體從大腸桿菌菌株BL21(DE3)的pAY442質粒中表達為His6-標記的融合蛋白。細胞接種于25ml添加5g/1酵母(TSB+YE)和50mg/1卡那霉素的TSB培養(yǎng)基(30g/1胰蛋白酶大豆肉湯)，37℃振蕩培養(yǎng)瓶中生長。含50mg/1卡那霉素的新鮮TSB+YE用預培養(yǎng)物接種至OD600～0.06并在分批發(fā)酵罐中在37℃生長3小時，當添加異丙基-L-硫代-β-D-半乳糖吡喃糖苷(IPTG；ApolloScientificLtd，Bradbury，UK)至終濃度0.5mM時誘導基因表達。培養(yǎng)5小時后，離心收獲細胞(15000g，20分鐘)。細胞沉淀凍存過夜，解凍并重懸于變性緩沖液(7M尿素，100mMNaH2PO4，10mMTris-HCl，pH8.0)。室溫保溫30分鐘后，25000g離心細胞15分鐘并且上清中的變性蛋白質于變性緩沖液(7M尿素，100mMNaH2PO4，10mMTris-HCl，pH6.3)中稀釋并應用于Ni-NTASuperflow柱(Qiagen)。使用尿素緩沖液(8M尿素，100mMNaH2PO4，10mMTris-HCl，pH4.5)洗脫結合的蛋白質。蛋白質應用于PD-10柱(GEHealthcare)并使用PBS(pH7.4)洗脫。此后單體蛋白質命名為ZEGFR：no(pAY442載體)和二聚體蛋白質命名為(ZEGFR：no)2(pAY442載體)。對于每個蛋白質使用適當?shù)南庀禂?shù)，通過280nm檢測的吸光度計算蛋白質濃度。為證實蛋白質的純度和準確的分子量，將其進行SDS-PAGE凝膠電泳(NuPAGE4-12％Bis-TrisGel；Invitrogen)和HPLC-MS(HPLC-MS1100；AgilentTechnologies)。通過CD進一步分析純化的蛋白質，其中使用Jasco-810分光偏振計記錄16個EGFR-結合Z變體的CD光譜。使用PBS將所有構建體稀釋到終濃度0.5mg/ml并將200μl每個樣品置于1mm比色池中并在20℃從195到250nm掃描。應用從20到90℃溫度梯度，在固定波長220nm檢測熱穩(wěn)定性。熔點(定義為50％蛋白質解折疊時的溫度)通過解釋熱解折疊光譜而獲得。通過氨基酸分析(Aminosyraanalyscentralen，Uppsala，Sweden)確定選擇的ZEGFR變體的蛋白質濃度。生物傳感器分析2000儀(BiacoreAB，Uppsala，Sweden)用于選擇的Z變體和靶蛋白質之間的實時生物特異性相互作用分析(BIA)。依據(jù)廠商說明書，EGFR-ECD(于10mMNaAc中稀釋，pH4.5)通過胺偶聯(lián)被固定(～2400RU)在CM5傳感器芯片(Biacore)的一個流動池表面的羧基葡聚糖層上。另一個流動池表面被活化和去活化以用作參照表面以及將HER2-ECD(Horaketal，(2005)CancerBiotherRadiopharm.20，603-13)(由GregAdams，F(xiàn)oxChaseCancerCenter，PA惠贈)和ErbB3/Fc(R&DSystems，348-RB)固定在CM5傳感器芯片分開的流動池表面上作為陰性對照。在25℃進行結合分析之前，所有Z變體樣品于運行緩沖液HBS(10mMHEPES，150mMNaCl，3.4mMEDTA，0.005％表面活性劑P20，pH7.4)中稀釋。在第一個實驗中，500nM每種Z變體(以HBS稀釋)以30μl/min流速被注射布滿所有表面。第一代EGFR-結合分子((ZEGFR：955)2；實施例1)作為對照也被注射。每次注射之后，通過注射10μl的10mMHCl再生流動池。在第二個實驗中，5個選擇的單體ZEGFR變體進行動力學分析，其中濃度范圍從6.25nM到500nM的蛋白質以50μl/min流速注射EGFR-ECD表面。使用BIAevaluation3.2軟件(Biacore)計算解離平衡常數(shù)(KD)、結合速率常數(shù)(ka)和解離速率常數(shù)(kd)。樣品一式二份進行實驗并且每次注射后，通過注射10μl的10mMHCl再生流動池。免疫熒光染色從歐洲細胞培養(yǎng)物保藏中心(www.ecacc.org.uk)獲得的細胞系A431在提供者建議的培養(yǎng)基中在37℃、5％CO2的環(huán)境中生長。培養(yǎng)基含有細胞系提供者(來自Sigma-Aldrich)建議濃度的胎牛血清(FBS)。亞鋪滿細胞使用PBS洗1次，以胰蛋白酶/EDTA溶液(Cambrex)消化并重懸于完全生長培養(yǎng)基。在8孔多孔載玻片(Histolab)的每孔中加入20μl大約10000細胞并保溫過夜。第二天早晨，以新鮮制備的3％甲醛的PBS固定細胞15分鐘并使用PBS洗2次。細胞以20μl/孔的Z變體His6-Z01859、His6-Z01865、His6-Z01864、His6-Z01877、His6-Z01868、His6-Z01913、His6-Z01836、His6-(Z01907)2-Cys和His6-(Z01953)2-Cys(2-10μg/ml)染色1小時，或用1μg/ml小鼠抗-EGFR抗體(Abeam，no.ab30)染色。Z變體染色的載玻片以PBS洗滌，與混有5μg/ml抗-山羊IgGAlexaFluor488(MolecularProbes)的山羊抗Z抗體(內(nèi)部制備)保溫1小時?？贵w染色的載玻片以PBS洗滌并與山羊抗小鼠IgG-AlexaFluor488(MolecularProbes)保溫1小時。在這次第二次保溫步驟之后，載玻片以PBS清洗?？贵w載玻片用20μl的1μg/mlDAPI(MolecularProbes)復染10-20秒并清洗。所有載玻片干燥并加入抗褪色試劑(VectorLaboratories)并且使用裝備LeicaDC相機(LeicaMicrosystems)的DM-LA顯微鏡分析膜熒光。使用IM1000軟件(LeicaMicrosystems)獲得圖像。免疫組織化學染色A431異種移植組織得自如下描述的生物分配研究。腫瘤在液氮中急凍并使用LjungCM3000自動化恒冷切片機(LeicaMicrosystems)將腫瘤切為6μm厚的冷凍切片。使用新鮮配制的3％甲醛的PBS固定切片15分鐘并以PBS洗2次。切片用濃度為5μg/ml的His6-(Z01864)2-Cys或His6-Z01877、用1/40稀釋的大約6μg/ml的His6-(Z01907)2-HRP或His6-(Z01853)2-HR染色1小時。用山羊抗Z抗體(內(nèi)部制備)、之后是5μg/ml兔抗山羊HR檢測His6-(Z01864)2-Cys和His6-Z01877。作為陽性對照，一個載玻片用3μg/ml抗EGFR抗體(Abeam，no.ab2430)染色，洗滌并用兔EnvisionHRP(Dako，no.K4002)檢測。HR染色的樣品以PBS洗1次，之后用DAB色原底物(DakoCytomation)保溫7分鐘，之后以PBS洗并以MayersHTX(Histolab)復染20秒。使用Mount-quick(Histolab)封片。使用裝備LeicaDC相機(LeicaMicrosystems)的DMLA顯微鏡分析載玻片。使用IM1000軟件(LeicaMicrosystems)獲得和保存圖像。111In標記的EGFR-結合Z變體的結合特異性和生物分布放射性測量使用具有3英寸NaI(Tl)探測器的自動gamma計數(shù)器(1480WIZARD，WallacOy，Turku，F(xiàn)inland)檢測放射性。在CycloneTMStoragePhosphorSystem上測量沿ITLC帶的放射性分布并使用OptiQuantTM圖像分析軟件分析。p-SCN-苯甲基-DTPA與Z變體的偶聯(lián)和111In綴合物的標記使用螯合劑與蛋白質摩爾比例1∶1，依據(jù)Mirzadeh等(BioconjugChem.1990；1：59-65)描述方法進行異硫氰酸-苯甲基-DTPA與ZEGFR變體的綴合。簡言之，300μl的Z變體PBS溶液與溶于0.07M硼酸鈉緩沖液pH9.2的43μl新鮮制備的異硫氰酸-苯甲基-DTPA溶液(1mg/ml)混合。用0.07M硼酸鈉緩沖液(pH8.5-9.0)調節(jié)總體積為500μl，之后混合物渦旋大約30秒并在37℃保溫過夜。保溫后，依據(jù)廠商說明書將反應混合物在用0.2M醋酸鹽緩沖液pH5.3預平衡的NAP-5大小排阻柱純化(高分子量級分是0.9ml)。洗脫液渦旋，之后取出含有50μgZ變體綴合物的級分用于進一步標記而剩余溶液凍存。用于標記，50μg綴合物與預先定量的111In(18MBq)混合并在室溫保溫60分鐘。向異硫氰酸-苯甲基-DTPA綴合物中加入37μl醋酸鹽緩沖液以平衡這個Z變體的高濃度。用于標記的質量控制，使用用0.2M檸檬酸洗脫的ITLC。在這個系統(tǒng)中，放射標記的Z變體保持原貌，游離銦遷移在溶劑前方，并且111In-異硫氰酸-DTPA復合物具有0.4的Rf。標記的綴合物在NAP-5柱(高分子級分是0.9ml)上純化并在ITLC上檢測產(chǎn)物純度。111In標記的綴合物與表達EGFR的A431細胞的結合特異性將標記的綴合物以計算的比例為1個標記的綴合物/1個EGFR受體(1.5×106受體/A431細胞)加入2組培養(yǎng)皿(每組3個培養(yǎng)皿)。一組培養(yǎng)皿在加入標記的綴合物之前用100倍過量的非標記Z變體預飽和10分鐘。細胞在37℃保溫1小時并收集保溫培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)皿以冷的無血清培養(yǎng)基洗6次并用0.5ml胰蛋白酶-EDTA在37℃處理10分鐘。當細胞解離時，每個皿中加入0.5ml完全培養(yǎng)基并重懸細胞。收集細胞懸液進行放射性測量。在自動gamma計數(shù)器上測量細胞相關放射性(C)，以1ml相應保溫培養(yǎng)基(M)作平行。與細胞結合的加入級分放射性計算為％結合放射性＝Cx100％/(C+M)。動物腫瘤模型動物研究經(jīng)當?shù)貏游镅芯總惱砦瘑T會同意。雌性遠交Balb/cnu/nu小鼠(到達時10-12周齡)用于體內(nèi)實驗。在腫瘤植入前，動物在Rudbeck實驗動物設備中采用標準飲食，墊料和環(huán)境適應一個星期。小鼠自由取食和飲水。通過在右后腿皮下(s.c)注射～107細胞移植A431腫瘤。異種移植生長2周。生物分布研究在攜帶A431腫瘤的Balb/c(nu/nu)小鼠品系中在銦-111標記的EGFRZ變體綴合物(s.c.)注射后4小時評估EGFR結合多肽的生物分布。在所有生物分布實驗中注射后(pi)4小時通過腹膜內(nèi)注射鹽酸克他命(Ketalar，Pfizer)和鹽酸甲苯噻嗪(Rompun；Bayer)混合物(20μl溶液/克體重；克他命-10mg/ml，Rompun-1mg/ml)麻醉小鼠。其后，用使用稀釋的肝素(5000IE/ml，來自LeoPharma，Copenhagen，Denmark)沖洗的1ml注射器通過心臟穿刺對小鼠實施安樂死。收集血液、肺、肝、脾、結腸、腎、子宮、唾液腺、肌肉、皮膚、骨和腫瘤的器官樣品，稱重并用gamma計數(shù)器測量放射性。腸(有內(nèi)容物)作為整個器官進行測量并不稱重。器官吸收值計算為注射的放射性/克組織的百分比(％IA/g)。在所有實驗中，小鼠隨機分組，每組4只動物。結果第一代EGFR結合Z變體的親和力成熟設計并構建親和力成熟文庫，其基于一組初級EGFR結合分子(實施例1)。實施例1中3個最佳結合物的序列和來自進一步序列分析的第四個序列進行對比。固定5個位置(24，25，27，28和32)并允許在第17和18位對于N和R以及在第35為對于S和V(圖2D)具有某些偏好被認為是合理的。因此，使用簡并密碼子NNG/T(圖2D)，第9、10、11、13和14位被隨機靶定。由于蛋白質Z小，有可能使用具有簡并密碼子的、編碼Z結構域的螺旋1和2的單一129個核苷酸的寡核苷酸產(chǎn)生二級文庫。PCR擴增寡核苷酸并隨后連接到編碼蛋白質Z的第三個α-螺旋的質粒載體上。產(chǎn)生的文庫由～1×109成員組成，其將包括大部分理論變體?；景匆陨厦枋鲋苽涫删w原液和進行選擇，使用遞減濃度的靶蛋白質并充分沖洗，同時用過量的非生物素化靶蛋白封閉具有快解離速率的結合物的重結合和用產(chǎn)生的第二代結合物與第一代結合物(實施例1)競爭以在文庫中選擇最強的EGFR結合變體。四輪選擇后獲得的克隆培養(yǎng)在96孔培養(yǎng)板，凍融以釋放周質內(nèi)容物，并進行ELISA篩選EGFR結合活性。當372個隨機挑選的克隆用于ELISA篩選，大部分克隆證明有高吸收值，表明與靶蛋白質的良好結合。在具有最高吸收值的克隆中，186個克隆進行DNA測序并根據(jù)測序克隆的聚類觀察選擇的克隆之間的關系。而且，對54個克隆上含有ABD標記的Z變體的周質內(nèi)容物進行生物傳感器分析篩選以選擇具有與EGFR最佳結合和最慢解離速率的克隆(數(shù)據(jù)未顯示)。基于ELISA篩選的數(shù)值，得自DNA測序的聚類結果和生物傳感器分析篩選，選擇16個克隆進一步定性，即Z01836，Z01848，Z01853，Z01859，Z01864，Z01865，Z01868，Z01877，Z01887，Z01888，Z01905，Z01907，Z01908，Z01913，Z01917和Z01960(見圖1和序列表)。實際上，所有結合物在濃度≥1.0mg/ml時顯示是可溶的并在遠UV光譜區(qū)(190-250nm)顯示特征性的α-螺旋形CD光譜，在207和220nm有最大吸收。熔點通過解釋熱解折疊光譜獲得并且實際上對于所有結合物確定為50℃或更高。熱變性后記錄的光譜顯示完全重新折疊為α-螺旋結構。生物傳感器篩選為獲得最初的結合親和力排列，表達16個選擇的Z變體以及單體和二聚體ZEGFR：955(實施例1)并使用Biacore儀器分析其EGFR結合。不同的ZEGFR變體分別注射在傳感器芯片流動池表面，其分別含有固定的靶蛋白EGFR-ECD和對照蛋白質HER2-ECD和Fc融合的HER3。對于所有16個結合物觀察到在低的納摩爾范圍的結合親和力(數(shù)據(jù)未顯示)。大多數(shù)結合物未顯示與HER2-ECD和Fc-融合的HER3的任何非特異性結合。選擇具有最佳親和力和生物傳感器分析范圍之外的5個結合物以進一步定性，即Z01853，Z01868，Z01877，Z01907和Z01908。體外比較第一代和第二代結合物使用Biacore分析比較親和力成熟的Z01853，Z01868，Z01877，Z01907和Z01908(KD～10nM)與Z00955的單體(KD～185nM)和二聚體(KD～50nM)形式(圖9)。親和力成熟的Z變體的結合速率與第一代結合物單體和二聚體大約相同。然而，解離速率改良～20倍。熒光和免疫組化分析結果顯示在圖10中。圖10A顯示用特異于EGFR的下列Z變體染色的A431；a)His6-Z01859，b)His6-Z01865，c)His6-Z01864，d)His6-Z01913，e)His6-Z01877，f)His6-Z01868，g)HiS6-Z01836，h)His6-(Z01853)2-cys和i)His6-(Z01907)2-cys。使用山羊抗Z抗體、隨后用Alexa488綴合的抗山羊抗體檢測Z變體單體。用OregonGreen標記二聚化Z變體。作為陽性對照，用抗EGFR抗體染色A431(j)。圖10B顯示用如下染色的A431異種移植物的冷凍切片：a)His6-(Z01864)2-Cys，b)His6-Z01877，c)His6-(Z01853)2-Cys和d)His6-(Z01907)2-Cys。His6-(Z01864)2-Cys和His6-Z01877(a和b)用山羊抗Z抗體、隨后用HRP綴合的抗山羊抗體檢測。His6-(Z01853)2-Cys(c)和His6-(Z01907)2-Cys(d)分子直接綴合到HPR。作為陽性對照，用抗EGFR抗體染色A431(e)。111In-標記的EGFR結合Z變體的特異性和生物分布所有Z變體綴合物用indium-111成功標記，標記產(chǎn)量超過90％，并經(jīng)NAP-5純化后，所有綴合物純度超過95％。在表達EGFR的鱗狀細胞癌細胞系A431中評估標記的綴合物的結合特異性。結果顯示在圖11。圖中所有數(shù)據(jù)點是三次測量的平均值，誤差條代表SEM。發(fā)現(xiàn)所有綴合物的結合是EGFR特異的(見圖11)，因此有可能通過添加100倍過量的非標記ZEGFR阻止吸收(p＜0.0001)。在攜帶A431腫瘤的小鼠中注射4小時后銦-111標記的Z變體綴合物的生物分布結果總結于圖12。圖中，每個數(shù)據(jù)點代表4個動物平均值±標準偏差，并表示為每克器官或組織中注射的放射性的百分比。通過ErikaNordberg(BiomedicalradiationSciences，UppsalaUniversity)與AffibodyAB(VINNOVA)聯(lián)合獲得111In-CHX-DTPA-(ZEGFR：955)2數(shù)據(jù)并包括在本發(fā)明中用于比較。使用4-6％IA/g水平的所有5種新Z變體在體內(nèi)成功靶定腫瘤，但是與非成熟的二聚體(4％IA/g)比較未見改良。第一代二聚體(Z00955)2和所有成熟單體之間的主要差別可見于血液清除、肝臟吸收和腎臟積累：在成熟實驗中選擇的新單體與(Z00955)2比較，血液放射性濃度更高，肝臟吸收更低并且腎臟吸收更高。很可能，這些觀察是相關的：肝臟中新單體與EGFR受體具有較弱的結合是由于與鼠受體具有更低的交叉反應性和/或由于與受體的單價結合，其不引發(fā)內(nèi)在化和結合是可逆的。實施例3本發(fā)明EGFR結合多肽的第三次選擇基于實施例2選擇結果的統(tǒng)計學分析，基本上如上所述制備推定的EGFR結合多肽的第三個文庫。在使用EGFR作為靶的噬菌體展示選擇和ELISA篩選選擇的變體后，鑒定了EGFR結合Z變體的17個額外序列。它們的氨基酸序列在圖1以及序列表SEQIDNO：310-326中顯示。這些EGFR結合Z變體的推測的EGFR結合基序示于圖1以及序列表SEQIDNO：147-163。