一種肝素鈉的精制方法
【專利摘要】本發(fā)明為一種肝素鈉的精制方法，屬于生化行業(yè)領(lǐng)域。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種吸附除雜與添加酶激活劑進(jìn)行酶解的聯(lián)合精制肝素鈉的方法，該方法能解決單純的吸附與酶解難以徹底除雜的問題，且通過酶激活劑的使用，大大縮短了酶解時(shí)間，提高了生產(chǎn)效率。
【專利說明】一種肝素鈉的精制方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生化行業(yè)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種肝素鈉的精制方法。
【背景技術(shù)】
[0002]肝素鈉是肝素的鈉鹽形式產(chǎn)物，是一種含有硫酸基的酸性粘多糖類天然抗凝血物質(zhì)?？蓮V泛用于防治各種心腦血管疾病，在臨床應(yīng)用中廣受青睞。
[0003]肝素鈉廣泛存在于哺乳動(dòng)物的腸粘膜、肺、肝中，特別是豬小腸粘膜中含量最高。目前我國(guó)生產(chǎn)的肝素鈉主要以豬小腸粘膜為原料進(jìn)行提取，由于肝素鈉在動(dòng)物體內(nèi)多以肝素鈉-蛋白質(zhì)復(fù)合物的形式存在，故使得粗品中會(huì)殘留一定量的蛋白質(zhì)，影響了產(chǎn)品的品質(zhì)。
[0004]目前，我國(guó)肝素鈉的精制主要采用酶解、鹽解、吸附的一種或多種生產(chǎn)工藝。申請(qǐng)?zhí)枮?01210161795.5和申請(qǐng)?zhí)枮?01110067346.X的專利采用樹脂吸附的方法來精制肝素鈉，申請(qǐng)?zhí)枮?01110169065.5的專利采用酶解法進(jìn)行精制，專利號(hào)為201210095896.7采用鹽解、酶解與吸附相結(jié)合的方式進(jìn)行精制，由于采用單一的吸附或酶解法進(jìn)行精制很難得到效價(jià)高的肝素鈉，而酶解反應(yīng)由于反應(yīng)速度較慢，酶用量大，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，且純化時(shí)采用多次溶解再沉淀的方法，酒精用量大，并且產(chǎn)品收率低，大大影響了生產(chǎn)效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種吸附除雜與添加酶激活劑進(jìn)行酶解的聯(lián)合精制肝素鈉的方法，該方法能解決單純的吸附與酶解難以徹底除雜的問題，且通過酶激活劑的使用，大大縮短 了酶解時(shí)間，提高了生產(chǎn)效率。
[0006]本發(fā)明的解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:一種肝素鈉的精制方法，包括下述步驟:
(1)預(yù)處理:將粗品肝素鈉進(jìn)行粉碎、過篩；
(2)溶解:按照粗品肝素鈉:水的重量比為1:5~20進(jìn)行溶解；
(3)酶解:在步驟2所制成的肝素鈉溶液中加入胰酶和酶激活劑，在pH6、、45飛(TC下酶解2~6小時(shí)；
(4)升溫至7(T90°C，過濾取濾液；
(5)將步驟4所得的濾液經(jīng)氧化、吸附、過濾、超濾濃縮、沉淀、脫水后制得肝素鈉。
[0007]優(yōu)化地，所述步驟(1)中肝素鈉粗品經(jīng)粉碎過篩后所得為直徑小于30目的粉末。
[0008]優(yōu)化地，所述步驟(3)中加入胰酶的量為溶液質(zhì)量的2%_8%。
[0009]優(yōu)化地，所述步驟(3)中所用酶激活劑為氯化鈣、醋酸鈣的一種或兩種，所用量為溶液質(zhì)量的0.05%-0.15%。
[0010]優(yōu)化地，所述步驟(5)中氧化為在步驟(4)所得濾液中加入雙氧水，對(duì)濾液進(jìn)行氧化處理,加入量為濾液質(zhì)量的0.1%-1%。對(duì)濾液進(jìn)行氧化處理。
[0011]優(yōu)化地，所述步驟(5)中吸附為向氧化后的濾液中加入占濾液質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%-2%的Ca3 (PO4) 2以除去濾液中的雜質(zhì)。
[0012] 優(yōu)化地，所述步驟(5)中過濾為采用板框過濾，采用0.22微米的醋酸纖維素濾膜。
[0013]優(yōu)化地，所述步驟(5)中超濾濃縮為選用截留分子量為3000的醋酸纖維素濾膜。
[0014]優(yōu)化地，所述步驟(5)中沉淀為將超濾濃縮后的溶液中用鹽酸調(diào)節(jié)pH至5.0-6.0，邊攪動(dòng)邊加入乙醇，使乙醇度數(shù)在38~45度，靜置10-12小時(shí)沉淀。
[0015]優(yōu)化地，所述步驟(5)中脫水用無水乙醇脫水，離心后真空干燥。
[0016]本發(fā)明的有益效果為利用吸附除雜和酶解的方法聯(lián)合精制肝素鈉除雜較徹底，得到的產(chǎn)品效價(jià)高，收率高，且通過添加酶激活劑使酶解速率大大提高，減少了酶的用量，縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本，利于工業(yè)化生產(chǎn)。
【具體實(shí)施方式】
[0017]實(shí)施例1
本發(fā)明的具體步驟為實(shí)驗(yàn)前先對(duì)所用器具、試劑、耗材進(jìn)行高壓滅菌。具體步驟如下:
1、將粗品肝素鈉用粉碎機(jī)粉碎、過篩，得到直徑小于30目的粉末；
2、按照粗品肝素鈉:水的重量比為1:5進(jìn)行溶解；
3、在步驟2所制成的肝素鈉溶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的胰酶和0.05%的氯化鈣，在pH6、45°C下酶解2小時(shí)；
4、升溫至70°C，過濾取濾液；
5、在濾液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的雙氧水和0.2%Ca3 (PO4)2,選用0.22微米的醋酸纖維素濾膜進(jìn)行半框過濾，選用可截留分子量3000的醋酸纖維素濾膜進(jìn)行超濾濃縮，將濾液用鹽酸調(diào)pH為5.0，邊攪邊加乙醇，度數(shù)為38度，沉淀10小時(shí)，脫水干燥用無水乙醇脫水，
離心后真空干燥。
[0018]將實(shí)驗(yàn)過程及產(chǎn)品各數(shù)據(jù)記錄于表1。
實(shí)施例2
實(shí)驗(yàn)前先對(duì)所用器具、試劑、耗材進(jìn)行高壓滅菌。具體步驟如下:
1、將粗品肝素鈉用粉碎機(jī)粉碎、過篩，得到直徑小于30目的粉末；
2、按照粗品肝素鈉:水的重量比為1:12進(jìn)行溶解；
3、在步驟2所制成的肝素鈉溶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%胰酶和0.1%醋酸鈣，在pH7.5、55°C下酶解4小時(shí)；
4、升溫至80°C，過濾取濾液；
5、在濾液中加入1%的雙氧水和2%的Ca3(PO4)2,板框過濾選用0.22微米的醋酸纖維素濾膜，選用可截留分子量為3000的醋酸纖維素濾膜進(jìn)行超濾濃縮，將濾液用鹽酸調(diào)pH為5.5，邊攪邊加乙醇，度數(shù)為41度，沉淀11小時(shí)，脫水干燥用無水乙醇脫水，離心后真空干燥。
[0019]將實(shí)驗(yàn)過程及產(chǎn)品各數(shù)據(jù)記錄于表1。
[0020]實(shí)施例3
實(shí)驗(yàn)前先對(duì)所用器具、試劑、耗材進(jìn)行高壓滅菌。具體步驟如下:
1、將粗品肝素鈉用粉碎機(jī)粉碎、過篩，得到直徑小于30目的粉末；
2、按照粗品肝素鈉:水的重量比為1:20進(jìn)行溶解；3、在步驟2所制成的肝素鈉溶液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%胰酶和0.15%氯化鈣，在pH9、60°C下酶解6小時(shí)；
4、升溫至90°C，過濾取濾液；
5、在濾液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的雙氧水和1%的Ca3(PO4)2,選用;0.22微米的醋酸纖維素濾膜進(jìn)行板框過濾，選用可截留分子量3000的醋酸纖維素濾膜進(jìn)行超濾濃縮，將濾液用鹽酸調(diào)pH為6.0，邊攪邊加乙醇，度數(shù)為45度，沉淀12小時(shí)，脫水干燥用無水乙醇脫水，離心后真空干燥。
[0021]將實(shí)驗(yàn)過程及產(chǎn)品各數(shù)據(jù)記錄于表1。
[0022]對(duì)比例I
本對(duì)比例僅采用吸附法對(duì)肝素鈉進(jìn)行精制，即方法與實(shí)施例1相比去除步驟3和4，其他步驟完全相同。
[0023]將實(shí)驗(yàn)過程及產(chǎn)品各數(shù)據(jù)記錄于表1。
[0024]對(duì)比例2
本對(duì)比例僅采用酶解方法且不使用酶激活劑對(duì)肝素鈉進(jìn)行精制，即方法與實(shí)施例1相比去除了步驟5中添加Ca3 (PO4) 2與步驟3中添加酶激活劑這兩個(gè)過程，其他步驟完全相同。
[0025]將實(shí)驗(yàn)過程及產(chǎn)品各數(shù)據(jù)記錄于表1。
[0026]對(duì)比例3
本對(duì)比例采用的方法為吸附與酶解相結(jié)合的方法，但不添加酶激活劑，即方法與實(shí)施例I相比去除步驟3中添加酶激活劑這一過程，其他步驟完全相同。
[0027]將實(shí)驗(yàn)過程及產(chǎn)品各數(shù)據(jù)記錄于表1。
[0028]對(duì)比例4
實(shí)驗(yàn)前先對(duì)所用器具、試劑、耗材進(jìn)行高壓滅菌。具體步驟如下:
1、將粗品肝素鈉用粉碎機(jī)粉碎、過篩，得到直徑小于30目的粉末；
2、按照粗品肝素鈉:水的重量比為1:1進(jìn)行溶解；
3、在步驟2所制成的肝素鈉溶液中加入胰酶和酶激活劑1%的胰酶，0.04%氯化鈣，在pH5、40°C下酶解I小時(shí);
4、升溫至60°C，過濾取濾液；
5、在濾液中加入0.05%的雙氧水和0.1%的Ca3 (PO4) 2，選用0.22微米的醋酸纖維素濾膜進(jìn)行板框過濾，選用可截留分子量3000的醋酸纖維素濾膜進(jìn)行超濾濃縮，將濾液用鹽酸調(diào)pH為4.5，邊攪邊加乙醇，度數(shù)為35度，沉淀8小時(shí)，脫水干燥用無水乙醇脫水，離心后真
空干燥。
[0029]將實(shí)驗(yàn)過程及產(chǎn)品各數(shù)據(jù)記錄于表1。
[0030]對(duì)比例5
實(shí)驗(yàn)前先對(duì)所用器具、試劑、耗材進(jìn)行高壓滅菌。具體步驟如下:
1、將粗品肝素鈉用粉碎機(jī)粉碎、過篩，得到直徑大于30目小于50目的粉末；
2、按照粗品肝素鈉:水的重量比為1:30進(jìn)行溶解；
3、在步驟2所制成的肝素鈉溶液中加入10%的胰酶，0.2%氯化鈣，在pH10、65°C下酶解8小時(shí)；
4、升溫至95°C，過濾取濾液；5、在濾液中加入2%的雙氧水和5%的Ca3(PO4)2，選用0.22微米的醋酸纖維素濾膜進(jìn)行板框過濾，選用可截留分子量3000的醋酸纖維素濾膜進(jìn)行超濾濃縮，將濾液用鹽酸調(diào)pH為7.0，邊攪邊加乙醇，度數(shù)為50度，沉淀15小時(shí)，脫水干燥用無水乙醇脫水，離心后真空干燥。
[0031]將實(shí)驗(yàn)過程及產(chǎn)品各數(shù)據(jù)記錄于表1。
[0032]表1
【權(quán)利要求】
1.一種肝素鈉的精制方法，包括下述步驟: (1)預(yù)處理:將粗品肝素鈉進(jìn)行粉碎、過篩； (2)溶解:按照粗品肝素鈉:水的重量比為1:5~20進(jìn)行溶解； (3)酶解:在步驟2所制成的肝素鈉溶液中加入胰酶和酶激活劑，在pH6、、45飛(TC下酶解2~6小時(shí)； (4)升溫至7(T90°C，過濾取濾液； (5)將步驟4所得的濾液經(jīng)氧化、吸附、過濾、超濾濃縮、沉淀、脫水后制得肝素鈉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肝素鈉的精制方法，所述步驟(1)中肝素鈉粗品經(jīng)粉碎過篩后所得為直徑小于30目的粉末。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肝素鈉的精制方法，所述步驟(3)中加入胰酶的量為溶液質(zhì)量的2%_8%。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肝素鈉的精制方法，所述步驟(3)中所用酶激活劑為氯化鈣、醋酸鈣的一種或兩種，所用量為溶液質(zhì)量的0.05%-0.15%。
5.根據(jù)權(quán)利要 求1所述的一種肝素鈉的精制方法，所述步驟(5)中氧化為在步驟(4)所得濾液中加入雙氧水，對(duì)濾液進(jìn)行氧化處理，加入量為濾液質(zhì)量的0.1%-1%，對(duì)濾液進(jìn)行氧化處理。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肝素鈉的精制方法，所述步驟(5)中吸附為向氧化后的濾液中加入占濾液質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%-2%的Ca3(PO4)2以除去濾液中的雜質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肝素鈉的精制方法，所述步驟(5)中過濾為采用板框過濾，采用0.22微米的醋酸纖維素濾膜。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肝素鈉的精制方法，所述步驟(5)中超濾濃縮為選用截留分子量為3000的醋酸纖維素濾膜。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肝素鈉的精制方法，所述步驟(5)中沉淀為將超濾濃縮后的溶液中用鹽酸調(diào)節(jié)PH至5.0-6.0，邊攪動(dòng)邊加入乙醇，使乙醇度數(shù)在38~45度，靜置10-12小時(shí)沉淀。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肝素鈉的精制方法，所述步驟(5)中脫水用無水乙醇脫水，離心后真空干燥。
【文檔編號(hào)】C08B37/10GK103923230SQ201310009732
【公開日】2014年7月16日 申請(qǐng)日期:2013年1月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月11日
【發(fā)明者】張永勤, 李萍, 曲輝, 張濤 申請(qǐng)人:青島亞博生物科技有限公司