本發(fā)明涉及植物蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，特別是涉及一個(gè)來源于棉花的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(IPT2)蛋白及其編碼基因，以及其在培育抗旱性提高的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
非生物脅迫，如干旱、鹽漬、極端溫度、化學(xué)污染和氧損傷等能夠?qū)χ参锏纳L發(fā)育造成嚴(yán)重的危害，對(duì)作物產(chǎn)量造成極大損失。其中干旱對(duì)作物產(chǎn)量的影響，在諸多自然逆境中占首位，其危害相當(dāng)于其它災(zāi)害之和，是許多地區(qū)是農(nóng)業(yè)發(fā)展的瓶頸。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界干旱、半干旱地區(qū)占陸地面積的34％；我國干旱、半干旱地區(qū)約占國土面積的52％，年受旱面積達(dá)200-270萬公頃，全國灌溉區(qū)每年缺水約30億立方米，因缺水而少收糧食350-400億公斤；特別是我國主要產(chǎn)糧區(qū)如華北、東北和西北，是我國缺水最嚴(yán)重的地區(qū)，春旱頻繁達(dá)到十年九遇。由于植物的耐脅迫性大多屬于數(shù)量性狀，現(xiàn)有可利用的種質(zhì)資源匱乏，采用常規(guī)育種技術(shù)改良植物脅迫耐性的難度相當(dāng)大，培育出真正的耐脅迫品種就尤為困難。近年來，隨著對(duì)植物抗逆分子機(jī)理研究的不斷深入和分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展，抗逆研究已經(jīng)從生理水平深入到分子水平，促進(jìn)了植物抗逆基因工程的發(fā)展。當(dāng)植物在受到脅迫時(shí)會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)答反應(yīng)，來降低或消除給植株帶來的危害。植物的這種應(yīng)答反應(yīng)是一個(gè)涉及多基因、多信號(hào)途徑、多基因產(chǎn)物的復(fù)雜過程。這些基因及其表達(dá)產(chǎn)物可以分為3類：(1)參與信號(hào)級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)和轉(zhuǎn)錄控制的基因及產(chǎn)物；(2)直接對(duì)保護(hù)生物膜和蛋白質(zhì)起作用的基因及其表達(dá)產(chǎn)物；(3)與水和離子的攝入和轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的蛋白質(zhì)。近年來，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高植物對(duì)脅迫耐受能力的研究，以及對(duì)脅迫具有耐受能力的農(nóng)作物、旱生植物和鹽生植物的研究都取得了顯著的成果，對(duì)脅迫相關(guān)基因和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)也有了更進(jìn)一步的了解(LiuQ.1998.Twotranscriptionfactors，DREB1andDREB2，withanEREBP/AP2DNAbindingdomain，separatetwocellularsignaltransductionpathwaysindrought-andlowtemperature-responsivegeneexpression，respectively，inArabidopsis.PlantCell，10：1391-1406；KANGJY.2002.Arabidopsisbasicleucinezipperproteinsthatmediatestress-responsiveabscisicacidsignaling.PlantCell，14：343-357；ABEH.2003.ArabidopsisAtMYC2(bHLH)andAtMYB2(MYB)functionastranscriptionalactivatorsinabscisicacidsignaling.PlantCell，15：63-78.)。但就目前的研究狀況而言，由于其機(jī)制十分復(fù)雜，許多植物對(duì)逆境下的生物化學(xué)和生理學(xué)上的響應(yīng)機(jī)制仍有待深入研究。在抗逆應(yīng)答基因的功能及表達(dá)調(diào)控方面的研究將對(duì)植物抗逆相關(guān)的信號(hào)傳遞途徑及信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)的研究提供重要的基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明人利用SSH(抑制差減雜交)與RACE(cDNA末端快速擴(kuò)增)相結(jié)合的方法克隆出了棉花的一個(gè)異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(本文命名為IPT2)的編碼基因，并測定了其DNA序列。并且發(fā)現(xiàn)通過轉(zhuǎn)基因?qū)⑵鋵?dǎo)入植株后，可明顯改善轉(zhuǎn)基因植株的抗旱性，而且這些性狀可穩(wěn)定遺傳。本發(fā)明第一方面提供棉花的一個(gè)異戊烯基轉(zhuǎn)移酶IPT2的編碼基因(本文命名為GhIPT2)，其序列為SEQIDNO：2。本發(fā)明第二方面提供一種重組表達(dá)載體，其含有本發(fā)明第一方面所述的基因并且所述基因的核苷酸序列與所述表達(dá)載體的表達(dá)控制序列可操作地連接；優(yōu)選地，所述載體為附圖2所示的rd29A-GhIPT2-2300載體。本發(fā)明第三方面提供一種重組細(xì)胞，其含有本發(fā)明第一方面所述的基因或者本發(fā)明第二方面所述的重組表達(dá)載體；優(yōu)選地，所述重組細(xì)胞為重組農(nóng)桿菌細(xì)胞。本發(fā)明第四方面提供一種改善植物抗旱性的方法，包括：將本發(fā)明第一方面所述基因或者本發(fā)明第二方面所述的重組表達(dá)載體導(dǎo)入植物或植物組織并使所述基因表達(dá)；優(yōu)選地，所述植物是煙草。本發(fā)明第五方面提供一種制備轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括：在有效產(chǎn)生植物的條件下培養(yǎng)含有本發(fā)明第一方面所述基因或者本發(fā)明第二方面所述的重組表達(dá)載體的植物或植物組織；優(yōu)選地，所述植物是煙草。本發(fā)明第六方面提供本發(fā)明第一方面所述的基因、本發(fā)明第二方面所述的重組表達(dá)載體或者本發(fā)明第三方面所述的重組細(xì)胞用于改善植物抗旱性以及用于植物育種的用途；優(yōu)選地，所述植物是煙草。本發(fā)明第七方面提供本發(fā)明第一方面所述的基因編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。附圖說明圖1是GhIPT2的植物表達(dá)載體(rd29A-GhIPT2-2300)的構(gòu)建流程。圖2是GhIPT2的植物表達(dá)載體(rd29A-GhIPT2-2300)的質(zhì)粒圖。圖3是對(duì)照煙草和轉(zhuǎn)基因煙草的抗旱性生長情況(圖3a為干旱前，圖3b為干旱后)；CK(左)：對(duì)照煙草；T1Q4(右)：轉(zhuǎn)基因煙草株系。圖4是耐干旱T1代轉(zhuǎn)基因煙草植株和不耐干旱對(duì)照煙草植株在轉(zhuǎn)錄水平上的驗(yàn)證結(jié)果。M為Marker(DL2000)，1-8為耐干旱T1代轉(zhuǎn)基因煙草植株，9為質(zhì)粒PCR陽性對(duì)照，10-13為不耐干旱對(duì)照煙草植株。具體實(shí)施方式提供以下實(shí)施例，以方便本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明。所述實(shí)施例僅出于示例性目的，并非意在限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1.干旱脅迫下棉花SSH文庫構(gòu)建：具體方法為：利用Clontech公司的PCR-selectTMcDNASubtractionKit所示的方法通過抑制差減雜交方法構(gòu)建差減文庫。在實(shí)驗(yàn)過程中以干旱處理的棉花幼苗的葉片中提取的mRNA作為樣本(tester)，以未處理的棉花幼苗的葉片中提取的mRNA作為對(duì)照(driver)。具體步驟簡述如下：(1)供試材料：非洲棉(國家棉花中期庫，獲取單位中國棉花研究所，統(tǒng)一編號(hào)：ZM-06838)播種到滅過菌的蛭石上，在25℃、光周期16h光照/8h黑暗(光強(qiáng)2000-3000Lx)條件下培養(yǎng)，每周澆1/2MS培養(yǎng)基(含有9.39mMKNO3，0.625mMKH2PO4，10.3mMNH4NO3，0.75mMMgSO4，1.5mMCaCl2，50μMKI，100μMH3BO3，100μMMnSO4，30μMZnSO4，1μMNa2MoO4，0.1μMCoCl2，100μMNa2EDTA，100μMFeSO4)一次。當(dāng)苗株高達(dá)25-30cm時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。(2)材料處理：將供試幼苗分為2組，每組4盆，每盆1株。第一組為對(duì)照組，在25℃、光周期16h光照/8h黑暗(光強(qiáng)2000-3000Lx)培養(yǎng)，正常澆灌。第二組為干旱處理組，25℃、光周期16h光照/8h黑暗(光強(qiáng)2000-3000Lx)條件下培養(yǎng)，停止?jié)补?，處?0天，處理完畢后及時(shí)剪取兩組幼苗頂端1/3的葉片，用液氮迅速冷凍后，于-70℃冰箱中保存。(3)總RNA提?。悍謩e取對(duì)照組和干旱處理組的棉花葉片0.5g，用植物RNA提取試劑盒(購自invitrogen)提取棉花葉片的總RNA。用HITACHI公司的紫外分光光度計(jì)U-2001測定總RNA在260nm和280nm的吸光度值，OD260/OD280比值為1.8-2.0，表明總RNA純度較高，用1.0％的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，28S條帶的亮度約為18S條帶的2倍，表明RNA的完整性良好。使用Qiagen公司的OligotexmRNA純化試劑盒(purificationofpolyA+RNAfromtotalRNA)分離mRNA。(4)抑制差減雜交：按Clontech公司的PCR-selectTMcDNASubtractionKit試劑盒所示的方法進(jìn)行抑制差減雜交。先將DrivermRNA和TestermRNA分別反轉(zhuǎn)錄，得到雙鏈cDNA，再以2μgTestercDNA和2μgDrivercDNA作為起始材料進(jìn)行差減雜交。在37℃水浴下分別將TestercDNA和DrivercDNA用RsaI酶切1.5h，然后將酶切后的TestercDNA分成兩等份，連接上不同的接頭，而DrivercDNA不連接頭。兩種連有不同接頭的TestercDNA分別與過量的Driver混合，進(jìn)行第一次正向差減雜交。將兩種第一次正向差減雜交的產(chǎn)物混合，再與新變性的DrivercDNA進(jìn)行第二次正向差減雜交，通過兩次抑制性PCR擴(kuò)增差異表達(dá)的片段，使其得到富集。(5)cDNA差減文庫的構(gòu)建與初步篩選、克隆、鑒定依照pGEM-TEasy試劑盒的程序，將所述第二次正向差減雜交cDNA片段的第二次抑制性PCR產(chǎn)物(使用QIAquickPCRPurificationKit純化，購自Qiagen)與pGEM-TEasy(購自Promega試劑盒)載體連接，其具體步驟如下：用200μlPCR管依次加入下列成分：純化的正向差減雜交cDNA片段的第二次PCR產(chǎn)物3μl，2×T4連接酶緩沖液5μl，pGEM-TEasy載體1μl，T4DNA連接酶1μl，于4℃連接過夜。取10μl連接反應(yīng)產(chǎn)物，加入到100μl感受態(tài)大腸桿菌JM109(購自TAKARA)中，冰浴30min、熱休克60秒、冰浴2min，另加250μlLB培養(yǎng)液(含有1％Tryptone(購自O(shè)XOID)，0.5％YeastExtract(購自O(shè)XOID)，1％NaCl(購自國藥))置37℃水浴中，以225rpm振蕩培養(yǎng)30min，取200μl菌液接種于含50μg/ml氨芐青霉素的LB(同上)/X-gal/IPTG(X-gal/IPTG購自TAKARA)培養(yǎng)板上，37℃培育18h。計(jì)數(shù)培養(yǎng)板中直徑＞1mm的...