本發(fā)明涉及從血液特別是外周血中自動(dòng)分離免疫細(xì)胞并同時(shí)提取富血小板血漿(PRP)的方法及其在治療疾病中的應(yīng)用，具體涉及從健康人體的血液中特別是外周血中自動(dòng)分離免疫細(xì)胞并凍存，以及在出現(xiàn)免疫低下或發(fā)生疾病癥狀時(shí)，將免疫細(xì)胞進(jìn)行體外擴(kuò)增并施用于患者進(jìn)行免疫細(xì)胞治療的方法。

背景技術(shù)：
免疫細(xì)胞(immunecell)是白細(xì)胞的俗稱，包括淋巴細(xì)胞和各種吞噬細(xì)胞，也特指能識(shí)別抗原、產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答的淋巴細(xì)胞。淋巴細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的基本成分，在體內(nèi)分布很廣泛。研究發(fā)現(xiàn)血液中蘊(yùn)含豐富的淋巴細(xì)胞，由于這類細(xì)胞具有免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點(diǎn)，所以一直受到人們的關(guān)注。淋巴細(xì)胞具有自然殺傷和自我保護(hù)的特性，針對(duì)病毒、細(xì)菌、真菌感染的治療均起到關(guān)鍵的作用，在癌癥的治療中具有很大的臨床應(yīng)用價(jià)值。免疫細(xì)胞在健康人體的血液中蘊(yùn)含豐富，但由于年齡老化、亞健康、罹患疾病等原因，血液中的免疫細(xì)胞數(shù)目會(huì)顯著降低，增殖分化能力亦大幅度衰退；而其他健康人的免疫細(xì)胞移植給患者則可能引起免疫排斥反應(yīng)；提取免疫細(xì)胞過程對(duì)患者的損傷性和在采集時(shí)遇到的其他問題，都直接影響了免疫細(xì)胞的臨床應(yīng)用，使得尋找一種穩(wěn)定可靠的免疫細(xì)胞獲取來(lái)源成為一個(gè)重要的問題。研究顯示，健康人的新鮮血液中含有大量有效的免疫細(xì)胞并且能有效分離，這種組織來(lái)源的免疫細(xì)胞不僅保持了免疫細(xì)胞的特異性免疫應(yīng)答的生物學(xué)特性，而且分離出來(lái)的免疫細(xì)胞具有原始的、強(qiáng)勁的增殖能力，同時(shí)還易于冷凍保存和復(fù)蘇。由于免疫細(xì)胞起源于自身，大大減低了觸發(fā)免疫反應(yīng)及引起移植物抗宿主病的風(fēng)險(xiǎn)。潛伏性病毒和微生物的感染及傳播幾率比較低。采集過程簡(jiǎn)單，對(duì)健康的被采集者無(wú)任何危害及損傷。以上原因足以令從血液中分離免疫細(xì)胞成為獲得免疫細(xì)胞的有效途徑。但是，目前關(guān)于血液免疫細(xì)胞的分離和擴(kuò)增方法不一，且大多步驟復(fù)雜，獲得較多數(shù)量血液免疫細(xì)胞也存在一定困難，同時(shí)患者在罹患疾病時(shí)采集血液存在一定風(fēng)險(xiǎn)。因此，本領(lǐng)域需要有從血液中分離、保存和擴(kuò)增免疫細(xì)胞的簡(jiǎn)單、有效的方法，以滿足醫(yī)藥、科研、臨床應(yīng)用等領(lǐng)域的需求。富含血小板的血漿，在本發(fā)明中可稱為富血小板血漿(PlateletRichPlasma，PRP)，其是是通過離心血液而得到的含高濃度的血小板血漿。人體的血小板除了可以在止血的時(shí)候提供凝聚作用外，血小板中還含有很多與創(chuàng)傷愈合和骨頭再生有關(guān)的多種生長(zhǎng)因子。如血小板衍生生長(zhǎng)因子(PlateletDerivedGrowthFactor，PDGF)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TransformingGrowthFactor，TGF)，胰島素樣生長(zhǎng)因子(Insulin-likeGrowthFactor，IGF)，表皮生長(zhǎng)因子(EpidermalGrowthFactor，EGF)以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF)等等，血小板來(lái)源的生長(zhǎng)因子，對(duì)細(xì)胞的分化和增殖起著促進(jìn)作用，這些生長(zhǎng)因子相互之間具有協(xié)同響應(yīng)，與其他促進(jìn)細(xì)胞活性的因子相互作用和影響，共同維持著組織環(huán)境的平衡，對(duì)傷口愈合、修復(fù)和再生有著重要的作用。另外，由于PRP可以從患者自身血液中提取，經(jīng)提取富集處理后，可用于相關(guān)疾病的治療，因而來(lái)源豐富，取材方便，制備方法簡(jiǎn)單而且可以讓身體吸收。自身PRP使用能避免病毒傳播和免疫排斥的問題出現(xiàn)。因此PRP被廣泛應(yīng)用到不同的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中。如骨科、口腔科、頜面外科、運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)以及美容醫(yī)學(xué)。PRP在目前為止還沒有一個(gè)統(tǒng)一的制備方法，PRP的制備原理主要是利用血液中各種成分沉降速度不同，通過離心將血液分層。從而獲取含血小板的血漿，并利用離心原理進(jìn)一步的濃縮以獲得高濃度的血小板血漿。人體全血中血小板的濃度一般為1～3×105/ml。研究認(rèn)為濃縮后的PRP血小板濃度應(yīng)為全血血小板濃度的3-4倍。研究也發(fā)現(xiàn)PRP中血小板濃度的提高能有效提高干細(xì)胞的增殖和分化能力以及能夠顯著增加成纖維細(xì)胞的增殖和I型膠原蛋白的表達(dá)。因此有效的分離和提高PRP中血小板的濃度成為了整個(gè)PRP治療方案的關(guān)鍵。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)提取、凍存、復(fù)蘇血液免疫細(xì)胞方法的缺陷，提供一種簡(jiǎn)單有效的血液免疫細(xì)胞的提取方法，以及相配套使用的凍存和復(fù)蘇的方法，以及復(fù)蘇后免疫細(xì)胞擴(kuò)增的方法。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)使用特定操作步驟的提取、凍存、復(fù)蘇以及擴(kuò)增，可以有效地獲得免疫細(xì)胞。本發(fā)明基于此發(fā)現(xiàn)而得以完成。本發(fā)明方法中使用到一種稱為AXP(AutoXpressPlatform)的全自動(dòng)細(xì)胞分離設(shè)備，其是美國(guó)TG公司(ThermoGenesis)制造的，TG公司是全球范圍內(nèi)專業(yè)從事干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)相關(guān)醫(yī)療設(shè)備與技術(shù)開發(fā)的國(guó)際領(lǐng)導(dǎo)型企業(yè)。公司研發(fā)的AXP、BioArchive等干細(xì)胞全自動(dòng)化技術(shù)設(shè)備，獲得國(guó)際干細(xì)胞行業(yè)的廣泛認(rèn)可，并已得到美國(guó)食品藥品管理局(FDA)和美國(guó)血庫(kù)協(xié)會(huì)(AABB)等行業(yè)管理機(jī)構(gòu)與協(xié)會(huì)的認(rèn)同。目前，世界最大的CBR私人血庫(kù)，紐約NYBC公共血庫(kù)以及臺(tái)灣、香港等地區(qū)的170多家血庫(kù)都紛紛引進(jìn)他們的設(shè)備，全面實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞技術(shù)自動(dòng)化。AXP全自動(dòng)干細(xì)胞分離設(shè)備根據(jù)國(guó)際干細(xì)胞、血庫(kù)的行業(yè)技術(shù)要求設(shè)計(jì)發(fā)明的，不僅能全密閉式分離干細(xì)胞，將污染程度降到最低點(diǎn)，還能將干細(xì)胞的質(zhì)量從手工采集的70％提升到98.7％。自動(dòng)化將是國(guó)內(nèi)干細(xì)胞產(chǎn)業(yè)技術(shù)的一個(gè)里程碑。本發(fā)明第一方面提供了從健康哺乳動(dòng)物的新鮮血液中獲取免疫細(xì)胞的方法，具體提供了從成人外周血中自動(dòng)化分離免疫細(xì)胞并提取PRP的方法，該方法包括以下步驟：(a)全血樣本預(yù)處理：將采集的成人外周血血樣，以1000rpm離心10min；吸取上清血漿用于提取富血小板血漿；剩余的下層轉(zhuǎn)移至AXP處理袋中，加入羥乙基淀粉溶液放置在搖床上充分混勻(其中血樣與羥乙基淀粉溶液的混合體積比為2～6：1，例如3～5：1，例如4：1)；(b)自動(dòng)分離：將AXP處理袋放入AXP全自動(dòng)細(xì)胞分離設(shè)備后，進(jìn)行自動(dòng)分離；(c)單個(gè)核細(xì)胞(在本文中可用縮寫MNC表示)收集：由AXP全自動(dòng)細(xì)胞分離設(shè)備自動(dòng)分離得到的免疫細(xì)胞自動(dòng)收集于AXP全自動(dòng)細(xì)胞分離設(shè)備內(nèi)所附的凍存袋中；以及任選的下列步驟：(d)針對(duì)步驟(c)所得免疫細(xì)胞，檢測(cè)以下項(xiàng)目的至少一項(xiàng)：?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞總數(shù)、單個(gè)核細(xì)胞活率、細(xì)胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，該方法還包括以下對(duì)提取的免疫細(xì)胞進(jìn)行凍存的步驟：(e)單個(gè)核細(xì)胞凍存：向步驟(c)提取的免疫細(xì)胞中加入凍存液，重懸免疫細(xì)胞，將免疫細(xì)胞加入凍存容器，程序降溫，然后再將凍存容器置于液氮罐中長(zhǎng)期儲(chǔ)存；以及任選的下列步驟：(f)建立包含步驟以上信息的免疫細(xì)胞的數(shù)據(jù)庫(kù)，并使該數(shù)據(jù)庫(kù)與步驟(e)的凍存免疫細(xì)胞進(jìn)行關(guān)聯(lián)。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，該方法還包括以下對(duì)凍存的免疫細(xì)胞進(jìn)行復(fù)蘇的步驟：(g)細(xì)胞復(fù)蘇：將步驟(e)凍存的凍存容器從液氮罐中取出，水浴，清洗凍存容器表面后轉(zhuǎn)移至生物安全柜中，將免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)移至裝有培養(yǎng)基的離心容器中，重懸，混勻，補(bǔ)加培養(yǎng)基，離心洗滌；以及任選的下列步驟：(h)針對(duì)步驟(g)所得復(fù)蘇的免疫細(xì)胞，檢測(cè)以下項(xiàng)目的至少一項(xiàng)：?jiǎn)蝹€(gè)核細(xì)胞總數(shù)、單個(gè)核細(xì)胞活率及復(fù)蘇率、細(xì)胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，該方法還包括以下對(duì)復(fù)蘇的免疫細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增的步驟：(i)細(xì)胞擴(kuò)增：用含有培養(yǎng)基和血清的細(xì)胞培養(yǎng)液對(duì)復(fù)蘇后的單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行重懸培養(yǎng)，吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)移至離心容器，反復(fù)吹洗貼壁細(xì)胞，直至貼壁細(xì)胞完全不被吹洗下來(lái)，獲得未成熟樹突狀細(xì)胞(iDC)，添加培養(yǎng)基重懸未成熟樹突狀細(xì)胞(iDC)，將離心容器中的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行離心處理，獲得的細(xì)胞沉淀為細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(CIK)，針對(duì)iDC細(xì)胞和CIK細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，再分別針對(duì)iDC細(xì)胞及CIK細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，所述哺乳動(dòng)物是人。例如是成年人。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，所述新鮮血液是外周血。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，所述羥乙基淀粉溶液中羥乙基淀粉的濃度為4-8％，例如5-7％，例如6％。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，所述羥乙基淀粉溶液是將羥乙基淀粉添加到0.9％氯化鈉溶液中配制得到的。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，所述羥乙基淀粉溶液中還包含麥芽糖。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，所述羥乙基淀粉溶液中還包含麥芽糖，麥芽糖的濃度為0.2～2％，特別是0.25～1.5％，特別是0.5～1％。已經(jīng)出人意料地發(fā)現(xiàn)，在用AXP全自動(dòng)細(xì)胞分離設(shè)備進(jìn)行從外周血中自動(dòng)分離免疫細(xì)胞時(shí)，使用添加了適量麥芽糖的羥乙基淀粉溶液稀釋血樣后，免疫細(xì)胞的收率至少可以提高15％，這具有極其重大的臨床意義。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(b)中在AXP全自動(dòng)細(xì)胞分離設(shè)備中進(jìn)行自動(dòng)分離時(shí)，執(zhí)行兩次離心處理，第一次離心條件為：1430rcf、20min、15℃，第二次離心條件為：80rcf、10min、15℃。眾所周知，rcf(relativecentrifugalforce)系指相對(duì)離心力。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(a)中，轉(zhuǎn)移至AXP處理袋中的血液留取5ml血樣于15ml離心容器中，用于血型檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(d)所述的檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)和單個(gè)核細(xì)胞活率是向步驟(c)收集的細(xì)胞沉淀中加入10-30ml生理鹽水，優(yōu)選20ml，用10ml移液管反復(fù)吹吸細(xì)胞，充分混勻，吸取20μl細(xì)胞，加入180μl臺(tái)盼藍(lán)染液，充分混勻后加入計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞總數(shù)與活率，記錄結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(e)所述的凍存液是按照20-60重量份的X-VIVO無(wú)血清培養(yǎng)基、10-50重量份的人血清白蛋白和5-15重量份的DMSO的配方配制而成的，優(yōu)選X-VIVO無(wú)血清培養(yǎng)基的配方量為30重量份、40重量份或50重量份，優(yōu)選人血清白蛋白的配方量為20重量份、30重量份或40重量份，優(yōu)選DMSO的配方量為8重量份、10重量份或12重量份。在一個(gè)實(shí)施方案中，凍存液中含有約50重量份的X-VIVO無(wú)血清培養(yǎng)基、約40重量份的人血清白蛋白和約10重量份的DMSO的凍存液。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，含有約50重量份的X-VIVO無(wú)血清培養(yǎng)基、約40重量份的人血清白蛋白和約10重量份的DMSO的凍存液是特別優(yōu)選的，比之于使該凍存液的任一成分含量變化10％以上的配方在提高冷凍效果、保護(hù)冷凍細(xì)胞等效果方面具有顯著優(yōu)勢(shì)。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(e)所述的凍存液配置10-20ml，優(yōu)選15ml，放置于0-7℃冰箱中備存，優(yōu)選4℃。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(e)所述的重懸免疫細(xì)胞是將步驟(c)獲得的細(xì)胞沉淀按照2×105-2×109/ml的密度用凍存液充分混勻，優(yōu)選2×107/ml的密度。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述的凍存容器為凍存管，優(yōu)選2ml的凍存管。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(e)所述的將免疫細(xì)胞加入凍存容器后，將凍存容器用封口膜封口，并標(biāo)示免疫細(xì)胞的相關(guān)信息，優(yōu)選標(biāo)示免疫細(xì)胞來(lái)源的標(biāo)簽。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(e)所述的程序降溫是將凍存容器放入程序降溫裝置(優(yōu)選程序降溫盒)中，放入0-7℃(優(yōu)選4℃)冰箱中備用，轉(zhuǎn)移至-100℃至-40℃(優(yōu)選-80℃)的冰箱中儲(chǔ)存20-36小時(shí)(優(yōu)選24小時(shí))，再將凍存容器從程序降溫裝置中取出。在一個(gè)實(shí)施方案中，凍存容器取出后，程序降溫裝置放入4℃冰箱以備下一次使用。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(e)所述凍存容器置于液氮罐中長(zhǎng)期儲(chǔ)存，同時(shí)記錄樣本儲(chǔ)存的位置。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(g)所述水浴是將從液氮中取出的凍存容器迅速放入水浴裝置(優(yōu)選水浴鍋)中實(shí)施的。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述水浴裝置的溫度在體溫附近，優(yōu)選37℃。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，所述凍存容器在水浴裝置中反復(fù)震蕩5-15次，優(yōu)選8-10次，震蕩時(shí)間控制在5min以內(nèi)，優(yōu)選控制在2min以內(nèi)。在一個(gè)具體實(shí)施方式中，直至看到凍存容器中只剩下一團(tuán)冰晶后從水浴裝置中取出凍存容器。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(g)所述清洗凍存容器表面是用蘸有75％酒精的無(wú)塵布將凍存容器表面水滴擦拭。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(g)所述將免疫細(xì)胞轉(zhuǎn)移至裝有培養(yǎng)基的離心容器中、重懸和混勻的步驟是用1ml移液槍將凍存容器中復(fù)蘇后的免疫細(xì)胞迅速吸出轉(zhuǎn)移至裝有2-10ml(優(yōu)選5ml)X-VIVO無(wú)血清培養(yǎng)基的10-20ml(優(yōu)選15ml)離心容器中重懸，并用槍頭反復(fù)吹洗混勻2-8次(優(yōu)選3-5次)。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(g)所述補(bǔ)加培養(yǎng)基是補(bǔ)加X-VIVO無(wú)血清培養(yǎng)基至5-15ml(優(yōu)選10ml)。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(g)所述離心洗滌是設(shè)置水平離心機(jī)升速為9，降速為9，轉(zhuǎn)速為1000-3000rpm，離心時(shí)間為5-20min，離心溫度為15-30℃，優(yōu)選轉(zhuǎn)速為1500-2500rpm，優(yōu)選轉(zhuǎn)速為1800rpm，優(yōu)選離心時(shí)間為10min，優(yōu)選離心溫度為20℃。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(h)所述的檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)和單個(gè)核細(xì)胞活率及復(fù)蘇率是向步驟(g)收集的細(xì)胞沉淀中加入10-30ml生理鹽水，優(yōu)選20ml，用10ml移液管反復(fù)吹吸細(xì)胞，充分混勻，吸取20μl細(xì)胞，加入180μl臺(tái)盼藍(lán)染液，充分混勻后加入計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞總數(shù)、活率及復(fù)蘇率，記錄結(jié)果。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中步驟(i)所述細(xì)胞培養(yǎng)液為含有X-VIVO無(wú)血清培...