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從成人外周血中自動化分離免疫細胞并提取PRP的方法與流程

文檔序號:11293721閱讀:來源:國知局
從成人外周血中自動化分離免疫細胞并提取PRP的方法與流程

技術(shù)特征:
1.從成人外周血中自動化分離免疫細胞并提取PRP的方法,該方法包括以下步驟:(a)全血樣本預(yù)處理:將采集的成人外周血血樣,以1000rpm離心10min;吸取上清血漿用于提取富血小板血漿;剩余的下層轉(zhuǎn)移至AXP處理袋中,加入羥乙基淀粉溶液放置在搖床上充分混勻,其中血樣與羥乙基淀粉溶液的混合體積比為3~5:1,所述羥乙基淀粉溶液中羥乙基淀粉的濃度為5-7%,該羥乙基淀粉溶液是將羥乙基淀粉添加到0.9%氯化鈉溶液中配制得到的,該羥乙基淀粉溶液中還包含麥芽糖,麥芽糖的濃度為0.5~1%;(b)自動分離:將AXP處理袋放入AXP全自動細胞分離設(shè)備后,進行自動分離;(c)單個核細胞收集:由AXP全自動細胞分離設(shè)備自動分離得到的免疫細胞自動收集于AXP全自動細胞分離設(shè)備內(nèi)所附的凍存袋中;(d)針對步驟(c)所得免疫細胞,檢測以下項目的至少一項:單個核細胞總數(shù)、單個核細胞活率、細胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型;(e)單個核細胞凍存:向步驟(c)提取的免疫細胞中加入凍存液,重懸免疫細胞,將免疫細胞加入凍存容器,程序降溫,然后再將凍存容器置于液氮罐中長期儲存;所述凍存液中含有50重量份的X-VIVO無血清培養(yǎng)基、40重量份的人血清白蛋白和10重量份的DMSO;(f)建立包含步驟以上信息的免疫細胞的數(shù)據(jù)庫,并使該數(shù)據(jù)庫與步驟(e)的凍存免疫細胞進行關(guān)聯(lián);(g)細胞復(fù)蘇:將步驟(e)凍存的凍存容器從液氮罐中取出,水浴,清洗凍存容器表面后轉(zhuǎn)移至生物安全柜中,將免疫細胞轉(zhuǎn)移至裝有培養(yǎng)基的離心容器中,重懸,混勻,補加培養(yǎng)基,離心洗滌;(h)針對步驟(g)所得復(fù)蘇的免疫細胞,檢測以下項目的至少一項:單個核細胞總數(shù)、單個核細胞活率及復(fù)蘇率、細胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型;任選的(i)對復(fù)蘇的免疫細胞進行擴增:用含有培養(yǎng)基和血清的細胞培養(yǎng)液對復(fù)蘇后的單個核細胞進行重懸培養(yǎng),吸出細胞培養(yǎng)液,轉(zhuǎn)移至離心容器,反復(fù)吹洗貼壁細胞,直至貼壁細胞完全不被吹洗下來,獲得未成熟樹突狀細胞即iDC細胞,添加培養(yǎng)基重懸未成熟樹突狀細胞,將離心容器中的細胞培養(yǎng)液進行離心處理,獲得的細胞沉淀為細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞即CIK細胞,針對iDC細胞和CIK細胞進行細胞計數(shù),再分別針對iDC細胞及CIK細胞進行培養(yǎng)。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,所述羥乙基淀粉溶液中羥乙基淀粉的濃度為6%。3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,步驟(b)中在AXP全自動細胞分離設(shè)備中進行自動分離時,執(zhí)行兩次離心處理,第一次離心條件為:1430rcf、20min、15℃,第二次離心條件為:80rcf、10min、15℃。4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,步驟(a)中,轉(zhuǎn)移至AXP處理袋中的血液留取5ml血樣于15ml離心容器中,用于血型檢測。5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,步驟(d)所述的檢測單個核細胞總數(shù)和單個核細胞活率是向步驟(c)收集的細胞沉淀中加入10-30ml生理鹽水,用10ml移液管反復(fù)吹吸細胞,充分混勻,吸取20μl細胞,加入180μl臺盼藍染液,充分混勻后加入計數(shù)板計算細胞總數(shù)與活率,記錄結(jié)果。6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,步驟(e)所述的重懸免疫細胞是將步驟(c)獲得的細胞沉淀按照2×105-2×109/ml的密度用凍存液充分混勻。7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,步驟(e)所述的程序降溫是將凍存容器放入程序降溫裝置中,放入0-7℃冰箱中備用,轉(zhuǎn)移至-100℃至-40℃的冰箱中儲存20-36小時,再將凍存容器從程序降溫裝置中取出。8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,步驟(g)所述離心洗滌是設(shè)置水平離心機升速為9,降速為9,轉(zhuǎn)速為1000-3000rpm,離心時間為5-20min,離心溫度為15-30℃。9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,步驟(h)所述的檢測單個核細胞總數(shù)和單個核細胞活率及復(fù)蘇率是向步驟(g)收集的細胞沉淀中加入10-30ml生理鹽水,用10ml移液管反復(fù)吹吸細胞,充分混勻,吸取20μl細胞,加入180μl臺盼藍染液,充分混勻后加入計數(shù)板計算細胞總數(shù)、活率及復(fù)蘇率,記錄結(jié)果。10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法,步驟(i)所述細胞培養(yǎng)液為含有X-VIVO無血清培養(yǎng)基及...
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