用于制備糖-蛋白質糖綴合物的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于還原胺化多糖的還原端處的羰基的方法，其中所述還原胺化在pH4至5之間進行。本發(fā)明還提供了用于制備多糖和載體分子的綴合物的方法，其包括步驟：(a)使多糖與連接體偶聯，以形成多糖-連接體化合物，其中連接體的游離端是酯基；和(b)使酯基與載體分子中的伯氨基反應，以形成多糖-連接體-載體分子綴合物，其中所述連接體通過酰胺鍵與載體分子偶聯。本發(fā)明還提供了減少未反應的連接體污染多糖-連接體化合物的方法，其包括在小于pH5的含水條件下沉淀未反應的連接體的步驟。本發(fā)明還提供了通過這些方法獲得的或者可獲得的多糖-連接體-載體分子綴合物和中間化合物。
【專利說明】用于制備糖-蛋白質糖綴合物的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及綴合的糖領域，特別是來自革蘭氏陰性菌的脂多糖的核心結構域，以及用于形成復合糖的載體。可將復合糖用于免疫接種。
[0002]發(fā)明背景
[0003]已經將來自細菌的糖用于疫苗多年。然后，由于糖是非T細胞依賴性抗原，所以它們免疫原性差。與載體綴合可以將非T細胞依賴性抗原轉變成T細胞依賴性抗原，從而增強記憶應答，并允許產生保護性免疫。因此，最有效的糖疫苗是基于復合糖的，并且原型結合疫苗(prototype conjugatevaccine)是針對流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzae) b型(‘Hib’ )的[例如參見參考文獻64的第14章]。
[0004]革蘭氏陰性菌由含脂多糖的外膜圍繞。脂多糖是作為內毒素并在哺乳動物中誘發(fā)強免疫應答的一組分子。每一脂多糖包含三個部分:0-抗原(也稱為O-特異多糖或O-多糖)、核心結構域和脂質A結構域。針對來自特定革蘭氏陰性菌的O-抗原的抗體可以賦予針對該細菌感染的保護。因此，已經設想了含有與載體蛋白綴合的O-抗原的疫苗。例如，基于O-抗原的結合疫苗已經建議用于多種沙門氏菌(Salmonellae)(例如，參考文獻I和2中的腸沙門氏菌(Salmonella enterica)中的血清型鼠傷寒桿菌(Salmonella Typhimurium)和甲型副傷寒沙門 氏菌(SalmonellaParatyphi A));志賀氏桿菌屬(Shigella)[參考文獻
3、4、5、6、7、8和9];以及大腸桿菌(Escherichia coli)[參考文獻10和11]。在這些疫苗中，O-抗原與來自全長脂多糖的核心結構域連接(即綴合的多糖是沒有其脂質A結構域的脂多糖)。多糖通過其核心結構域與載體綴合。該核心結構域自身可以誘導保護性抗體，因此設想結合疫苗含有不與O-抗原連接的核心結構域[參考文獻12]。
[0005]已知將含核心結構域的多糖與載體蛋白綴合的多種方法。一些方法涉及通過連接體綴合之前，多糖鏈的隨機活化(例如使用溴化氰(CNBr)或1-氰-4-二甲基氨吡啶四氟硼酸酯(CDAP))(參見例如，參考文獻I和2)。其他方法是更有選擇性的，涉及該鏈的特異性殘基(例如核心結構域的2-酮-3-脫氧辛酸(KDO)端)。例如，參考文獻13的方法涉及KDO端中的羰基與己二酸二酰肼(ADH)連接體之間的還原胺化。涉及還原胺化的反應通常非常慢，例如參考文獻13中需要7天的步驟。另一選擇性方法描述于參考文獻9中，這次涉及通過KDO中的羧基，使用1-乙基-3 - (3- 二甲基氨丙基)碳二亞胺(EDAC)和ADH的偶聯。在這些非選擇性和選擇性方法中，通常使用EDAC進行與載體的后續(xù)反應，EDAC活化蛋白質中的用于與連接體反應的羧基。該EDAC活化可以引起KDO亞基中羧基的活化，導致不想要的副反應。EDAC活化還可以引起載體蛋白的交聯，因為蛋白質中活化的羧基可以與蛋白質中的而非連接體中的伯胺基反應。
[0006]因此，仍存在制備綴合物，特別是來自革蘭氏陰性菌的脂多糖的核心結構域的其他以及更好的方法的需求。
[0007]發(fā)明公開
[0008]本發(fā)明基于綴合方法，其可以用于取代現有技術的綴合方法。這些方法可以比現有技術方法，特別是涉及還原胺化的那些方法更快地施行。該方法還不需要使用EDAC，這避免了不想要的副反應。在研發(fā)這些方法期間，發(fā)明人發(fā)現了不需要使用毒性化合物來純化中間化合物的方法。因此，本方法可以更安全地實施。與現有技術的綴合物相比，得到的綴合物具有不同的，優(yōu)選地改進的免疫學特性。
[0009]因此，本發(fā)明提供了用于將多糖與載體蛋白綴合的備選或改進方法，以及通過這些方法獲得或者可獲得的綴合物。本發(fā)明還提供了用于本發(fā)明方法的中間化合物，以及用于制備這些中間化合物的方法。
[0010]本發(fā)明的第一方面
[0011]在第一個方面，本發(fā)明提供了用于制備多糖和載體分子的綴合物的方法，其包括以下步驟:(a)使多糖與連接體偶聯，以形成多糖-連接體中間產物，其中連接體的游離端是酯基；和(b)使酯基與載體分子中的伯胺基反應，以形成多糖-連接體-載體分子綴合物，其中連接體通過酰胺鍵與載體分子偶聯。不同于參考文獻1、2和13中所使用的綴合方法，本發(fā)明不需要使用EDAC活化載體分子，從而避免了不想要的副反應。本發(fā)明還提供了該方法的各個步驟(a)和(b);通過該方法獲得的或者可獲得的綴合物；以及通過該方法的步驟(a)獲得的或者可獲得的多糖-連接體中間產物。[0012]本發(fā)明第一方面的步驟(a)
[0013]在本發(fā)明第一方面的步驟(a)中，將多糖與連接體偶聯，以形成多糖-連接體中間產物，其中連接體的游離端是酯基。因此，連接體是這樣的連接體，其中至少一個末端是酯基。如下所述，連接體的其他末端是選擇性的，以使其可以與多糖反應以形成多糖-連接體中間產物。
[0014]在本發(fā)明的一些實施方案中，直接發(fā)生步驟(a)中的偶聯。在這些實施方案中，通常使用多糖中的伯胺基將多糖與連接體偶聯。在這些實施方案中，連接體通常在兩個末端均具有酯基。這允許酯基中的一個通過親核?；〈c多糖中的伯胺基反應來發(fā)生偶聯。該反應產生了多糖-連接體中間產物，其中多糖通過酰胺鍵與連接體偶聯。因此在這些實施方案中，連接體是雙功能連接體，其提供用于與多糖中伯胺基反應的第一酯基以及用于與載體分子中伯胺基反應的第二酯基。例如，可以使用通式X1-L-X2的雙功能連接體，其中X1是可以與多糖中的伯胺基反應的酯基；X2是可以與載體分子中的伯胺基反應的酯基；并且L是連接體中的連接部分。一般的L基團是具有1-10個碳原子的直鏈烷基(例如C1X2'C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C1(I)，特別地-(CH2) 4_。通式X-L-X的同型雙功能連接體是特別合適的，其中兩個X基團是一模一樣的，并且能與兩個伯胺基反應；并且其中L是連接體中的連接部分。一般的X基團是N-氧丁二酰亞胺。L通常具有通式-L’-L2-L’-，其中L’是羰基。一般的L2基團是具有1-10個碳原子的直鏈烷基(例如Cp C2、C3> C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10)，特別地-(CH2)4-。因此，一般的連接體是己二酸N-羥基琥珀酰亞胺二酯(adipic acid Nhydroxysuccinimide diester) (SIDEA),并且發(fā)明人發(fā)現該化合物特別適合作為本發(fā)明的
連接體:
[0015]
【權利要求】
1.用于還原胺化多糖的還原端處的羰基的方法，其中所述還原胺化在pH4至PH5之間進行。
2.權利要求1的方法，其中所述羰基在所述多糖的還原端處的KDO亞基內。
3.權利要求1或權利要求2的方法，其中所述多糖包含來自革蘭氏陰性菌脂多糖的核心結構域。
4.權利要求3的方法，其中所述多糖包含與所述核心結構域連接的來自革蘭氏陰性菌的脂多糖的O-抗原。
5.權利要求3或權利要求4的方法，其中所述脂多糖來自沙門氏菌屬(Salmonella)細菌。
6.權利要求5的方法，其中所述脂多糖來自甲型副傷寒桿菌(S.Paratyphi A)、鼠傷寒桿菌(S.Typhimurium)或腸炎沙門菌(S.Enteritidis)。
7.權利要求1的方法，其中所述多糖是細菌莢膜多糖。
8.權利要求7的方法，其中所述細菌莢膜多糖來自腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)血清組 X。
9.權利要求1至8中任一項的方法，其中所述還原胺化包括所述羰基與通式為Y1-L-Y2的雙功能連接體中的Y1反應，以形成多糖-雙功能連接體化合物，其中所述多糖通過C-N鍵與所述雙功能連接體偶聯，其中:所述Y1包含可與所述多糖中的羰基反應的伯胺基；所述Y2包含第二反應基團例如伯胺基或-SH基團；并且L是連接部分。
10.權利要求9的方法，其中所述Y1和Y2均是-NHNH2基團。
11.權利要求10的方法，其中所述L具有通式-L’-L2-L’-，其中所述L’是羰基，并且所述L2是具有1至10個碳原子的直鏈烷基。
12.權利要求11的方法，其中所述L2是-(CH2)4_。
13.權利要求10的方法，其中所述L是羰基。
14.通過權利要求9至13中任一項的方法獲得的多糖-雙功能連接體化合物。
15.用于制備多糖和載體分子的綴合物的方法，其包括步驟:(a)將所述多糖與連接體偶聯，以形成多糖-連接體化合物，其中所述連接體的游離端是酯基；和(b)使所述酯基與所述載體分子中的伯胺基反應，以形成多糖-連接體-載體分子綴合物，其中所述連接體通過酰胺鍵與所述載體分子偶聯，特別地，其中所述多糖包含(i)來自革蘭氏陰性菌的脂多糖的核心結構域或(ii)來自腦膜炎奈瑟氏球菌血清組X的莢膜多糖。
16.權利要求15的方法，其中所述多糖包含來自革蘭氏陰性菌的脂多糖的核心結構域，所述連接體在兩個末端均具有酯基，并且所述多糖通過以下方式與所述連接體偶聯，以形成多糖-連接體化合物:所述酯基中的一個通過親核?；〈c所述核心結構域中的伯氨基反應，其中所述多糖通過酰胺鍵與所述連接體偶聯。
17.權利要求16的方法，其中所述連接體具有通式X1-L-X2，其中所述X1是可以與所述核心結構域中的伯氨基反應的酯基；所述X2是酯基；并且所述L是連接部分。
18.權利要求17的方法，其中所述L是具有1至10個碳原子的直鏈烷基。
19.權利要求18的方法，其中所述L是-(CH2)4_。
20.權利要求17至19中任一項的方法，其中所述X1-L-X2是己二酸N-羥基琥珀酰亞胺二酯。
21.權利要求16至20中任一項的方法，其中所述多糖是如權利要求4至6中任一項限定的多糖。
22.權利要求17至21中任一項的方法，其中所述脂多糖來自甲型副傷寒桿菌、鼠傷寒桿菌或腸炎沙門菌，并且所述伯氨基在焦磷酸乙醇胺基團內。
23.權利要求15的方法，其中使用其他連接體進行所述步驟(a)，所述其他連接體在與所述連接體偶聯之前用于衍生所述多糖。
24.權利要求23的方法，其中所述其他連接體在兩個末端均具有伯氨基，并且所述多糖通過以下方法使用所述多糖的還原端處的羰基與所述其他連接體偶聯，所述方法包括兩步:(&1)所述羰基通過還原胺化與所述其他連接體中的伯氨基中的一個反應，以形成多糖-其他連接體化合物，其中所述多糖通過C-N鍵與所述其他連接體偶聯；和(a2)使所述其他連接體的游離端與所述連接體反應。
25.權利要求24的方法，其中所述還原胺化根據權利要求1的方法進行。
26.權利要求23的方法，其中所述其他連接體在兩個末端均具有伯氨基，并且所述多糖通過以下方法使用所述多糖中的羧基與所述其他連接體偶聯，所述方法包括兩步:(?)所述羧基通過EDAC活化與所述其他連接體中的伯氨基中的一個反應，以形成多糖-其他連接體化合物，其中所述多糖通過酰胺鍵與所述其他連接體偶聯；和(a2)使所述其他連接體的游離端與所述連接體反應。
27.權利要求23至26中任一項的方法，其中所述其他連接體是權利要求9至13中任一項定義的雙功能連接體。
28.權利要求24至27中任一項的方法，其中所述連接體在兩個末端均具有酯基，并且所述步驟(a2)包括所述酯基中的一個通過親核?；〈c所述其他連接體的游離端處的伯氨基反應，以形成多糖-連接體化合物，其中所述多糖通過所述其他連接體與所述連接體偶聯，其中所述其他連接體通過酰胺鍵與所述連接體偶聯。
29.權利要求15和權利要求23至28中任一項的方法，其中所述連接體是權利要求16至20中任一項定義的連接體。
30.權利要求15和權利要求23至29中任一項的方法，其中所述多糖是如權利要求2至8中任一項限定的多糖。
31.權利要求15至30中任一項的方法，其中所述載體分子是白喉毒素、破傷風毒素、類毒素或其突變體。
32.權利要求31的方法，其中所述載體分子是CRM197白喉毒素突變體。
33.通過權利要求15至32中任一項的方法獲得的多糖-連接體-載體分子綴合物。
34.在權利要求15至30中任一項的方法中獲得的多糖-連接體化合物。
35.在權利要求24至30中任一項的方法中獲得的多糖-其他連接體化合物。
36.用于減少未反應的連接體污染根據權利要求34的多糖-連接體化合物的方法，其包括在小于PH5的含水條件下沉淀未反應的連接體的步驟。
37.權利要求36的方法，其中所述沉淀在pH2至5之間，特別地在pH4至5之間進行。
38.權利要求36或權利要求37的方法，其中所述pH通過添加含水緩沖液，特別地檸檬酸緩沖液獲得。
39.權利要求36或權利要求37的方法，其中所述pH通過添加HCl獲得。
40.權利要求36至38中任一項的方法，其中所述沉淀在具有>60%含水量(體積/體積)的水溶液中進行。
41.權利要求36至39中任一項的方法，其中所述沉淀通過離心去除。
42.權利要求36至41中任一項的方法，其中所述多糖-連接體化合物通過使用醇沉淀從溶液中回收。
43.權利要求42的方法，其中所述醇是乙醇或2-丙醇。
44.權利要求43的方法，其中將所述醇加入到含所述多糖-連接體化合物的溶液中，以產生80%至95%之間的乙醇或2-丙醇(體積/體積)的終濃度。
45.權利要求44的方法，其中沉淀的所述多糖-連接體化合物通過離心回收。
46.根據權利要求36至45中任一項的方法，其中所述方法在權利要求15至32中任一項的步驟(a)和(b)之間 進行。
【文檔編號】C08B37/00GK103917245SQ201280054487
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2012年9月14日 優(yōu)先權日:2011年9月14日
【發(fā)明者】A·索爾, F·米科利 申請人:諾華股份有限公司