專利名稱：一種普魯蘭多糖的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種利用Savage法、分級(jí)醇沉和凝膠層析純化普魯蘭多糖的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
普魯蘭多糖是短梗霉多糖(pullulan)的中文譯名，是通過(guò)黑酵母菌的ー種出芽短梗霉發(fā)酵所產(chǎn)生的胞外多糖，是無(wú)味無(wú)嗅的白色粉末。其化學(xué)組成主要是由a-I. 4葡萄糖苷鍵連接的聚麥芽三糖，分子結(jié)構(gòu)中含1/3的a -I. 6葡萄糖苷鍵，2/3的a -I. 4葡萄糖苷鍵，受不同發(fā)酵培養(yǎng)條件的影響，分子量一般在5. OX 104-5. OX IO6道爾頓之間。該多糖易溶于水，安全無(wú)毒、可食用、低熱值、耐酸堿、可塑性好、成膜性好、薄膜隔氣性佳。因其在自然界可被微生物降解利用，不會(huì)引起環(huán)境污染，故被譽(yù)為無(wú)公害塑料。1938年R. Bauer從微生物的培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)普魯蘭多糖的產(chǎn)生菌，而普魯蘭多糖的研究工作則起始于西德，英國(guó)人在理論方面也作了不少工作，日本進(jìn)行了比較系統(tǒng)尤其是生產(chǎn)エ藝和產(chǎn)品應(yīng)用的研究，并取得了大量專利。1976年至1980年是普魯蘭多糖的第一個(gè)研究高峰，主要是對(duì)其性質(zhì)和發(fā)酵方法的研究，1984年至1996年是第二個(gè)研究高峰，主要集中在對(duì)其產(chǎn)生機(jī)理和應(yīng)用方面的研究。我國(guó)在80年代初期開(kāi)始進(jìn)行相關(guān)研究，雖然在菌種和エ藝方面取得了一定成績(jī)，但生產(chǎn)廠商較少。普魯蘭多糖的純化工藝一般采用氯仿/ 丁醇混合溶液除去蛋白質(zhì)后透析，后用溶液洗滌、干燥，經(jīng)DEAE-纖維素柱層析，收集多糖峰，減壓濃縮、透析、冷凍干燥。反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，多次用到透析，對(duì)溶劑消耗量較大，且所得到的普魯蘭多糖純度多在90% -95%之間。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種不同于傳統(tǒng)的普魯蘭多糖的純化方法，采用發(fā)明所述的エ藝方法，制得普魯蘭多糖的含糖量在99%以上，產(chǎn)品得率高。本發(fā)明提供的普魯蘭多糖的純化工藝是以普魯蘭多糖粗品為原料(含糖量20%左右——硫酸苯酚法測(cè)定(中國(guó)藥學(xué)雜質(zhì)，1996，31 (9) :550)，分子量為5000-15000道爾頓)，對(duì)其進(jìn)行純化，使之達(dá)到多糖純度在99%以上，其具體包括以下步驟(a)將粗品普魯蘭多糖加蒸餾水稀釋成普魯蘭多糖水溶液，加入氯仿/正丁醇或氯仿/戊醇混合液，充分震蕩，離心，除去沉淀，將上清液再用此方法重復(fù)處理，最后得到脫去蛋白的上清液，減壓蒸餾除去有機(jī)溶液，凍干，得到粗普魯蘭多糖。(b)將一定量的粗普魯蘭多糖溶解在蒸餾水中，加入こ醇，醇析，離心，沉淀為普魯蘭多糖，然后繼續(xù)向上清液中加入こ醇，至不同梯度的こ醇濃度，毎次操作如上所述。(c)將分級(jí)醇沉淀得到的粗普魯蘭多糖用Sepharose 6fast flow (2. 6 X 60cm)凝膠層析住分離，分部收集器分管收集減壓旋蒸含有活性物質(zhì)的洗脫液，得到普魯蘭多糖，再用冷凍こ酸こ酯沖洗，凍干，既得普魯蘭多糖純品。本發(fā)明所提供的方法，相對(duì)于現(xiàn)有普魯蘭多糖純化方法，具有以下優(yōu)勢(shì)
(I)傳統(tǒng)方法在除去普魯蘭多糖粗品的小分子時(shí)采用的是透析方法，所用時(shí)間較長(zhǎng)，一般一次透析在8小時(shí)以上，且整個(gè)純化工藝中至少要使用3次透析；本發(fā)明所采用方法采用分級(jí)醇沉方法除去小分子，只需一次分級(jí)醇沉，所用時(shí)間在2-8小吋，大大節(jié)省了純化時(shí)間；(2)傳統(tǒng)方法制得的普魯蘭多糖的多糖純度在90% _95%，而采用本發(fā)明所提供方法，普魯蘭多糖的多糖純度能達(dá)到99%以上，收率(以多糖含量計(jì)算，下同)在58%以上。具體實(shí)施案例 下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)ー步說(shuō)明，下述實(shí)施例是說(shuō)明性的，不是限定性的，所用術(shù)語(yǔ)從事生物技術(shù)行業(yè)的技術(shù)人員均能讀懂。實(shí)施例I(a)將粗品普魯蘭多糖IOOg加蒸餾水稀釋成I. 5%的普魯蘭多糖水溶液，加入氯仿/正丁醇(y氯仿:Vietii= 4 I)混合液,充分震蕩，以2000r/min離心15min,除去沉淀，將上清液再用此方法重復(fù)處理8次，最后得到脫去蛋白的上清液，減壓蒸餾除去有機(jī)溶液，凍干，得到粗普魯蘭多糖。(b)將粗普魯蘭多糖溶解在蒸餾水中，加入95%こ醇至濃度為20% (體積濃度，下同)，4°C醇析8小吋，以15000r/min離心lOmin，沉淀為普魯蘭多糖，然后繼續(xù)向上清液中繼續(xù)加入こ醇，至終濃度分別為30 %、40 %、50 %、60 %、70 %，每次操作同前所述。(c)將分級(jí)醇沉淀得到的粗普魯蘭多糖用Sepharose 6fast flow (2. 6 X 60cm)凝膠層析住分離，用蒸餾水洗脫，流速2. OmL/min，分部收集器分管收集，收集活性片段減壓旋蒸含有活性物質(zhì)的洗脫液，得到普魯蘭多糖，再用冷凍こ酸こ酯沖洗，凍干，既得普魯蘭多糖純品16. 2g。用硫酸苯酚法測(cè)定多糖純度為99. 2%，收率81 %。實(shí)施例2(a)將粗品普魯蘭多糖500g加蒸餾水稀釋成2 %的普魯蘭多糖水溶液，加入氯仿/戊醇(V氣仿V戊醇=4 I)混合液，充分震蕩，以3000r/min離心30min，除去沉淀，將上清液再用此方法重復(fù)處理5次，最后得到脫去蛋白的上清液，減壓蒸餾除去有機(jī)溶液，凍干，得到粗普魯蘭多糖。(b)將粗普魯蘭多糖溶解在蒸餾水中，加入98%こ醇至濃度為15% (體積濃度，下同)，4°C醇析5小吋，以25000r/min離心lOmin，沉淀為普魯蘭多糖，然后繼續(xù)向上清液中繼續(xù)加入こ醇，至終濃度分別為30 %、45 %、60 %、75 %，每次操作同前所述。(c)將分級(jí)醇沉淀得到的粗普魯蘭多糖用Sepharose 6fast flow (2. 6 X 60cm)凝膠層析住分離，用蒸餾水洗脫，流速3. OmL/min,分部收集器分管收集，收集活性片段，減壓旋蒸含有活性物質(zhì)的洗脫液，得到普魯蘭多糖，再用冷凍こ酸こ酯沖洗，凍干，既得普魯蘭多糖純品76g。用硫酸苯酚法測(cè)定多糖純度為99. 4%，收率76%。實(shí)施例3(a)將粗品普魯蘭多糖200g加蒸餾水稀釋成10 %的普魯蘭多糖水溶液，加入氯仿/戍醇(Viw V^e= 6 I)混合液,充分震蕩，以4000r/min離心30min,除去沉淀,將上清液再用此方法重復(fù)處理6次，最后得到脫去蛋白的上清液，減壓蒸餾除去有機(jī)溶液，凍干，得到粗普魯蘭多糖。
(b)將粗普魯蘭多糖溶解在蒸餾水中，加入98%こ醇至濃度為15% (體積濃度，下同)，4°C醇析10小吋，以20000r/min離心20min，沉淀為普魯蘭多糖，然后繼續(xù)向上清液中繼續(xù)加入こ醇，至終濃度分別為30 %、45 %、60 %、75 %，每次操作同前所述。(c)將分級(jí)醇沉淀得到的粗普魯蘭多糖用Sepharose 6fast flow (2. 6 X 60cm)凝膠層析住分離，用蒸餾水洗脫，流速5. OmL/min,分部收集器分管收集，收集活性片段，減壓旋蒸含有活性物質(zhì)的洗脫液，得到普魯蘭多糖，再用冷凍こ酸こ酯沖洗，凍干，既得普魯蘭 多糖純品24g。用硫酸苯酚法測(cè)定多糖純度為99. 5%，收率為60%。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明是采用Savage法、分級(jí)醇沉和凝膠層析的方法純化粗品普魯蘭多糖，得到99%以上的普魯蘭多糖。
2.權(quán)利要求I中所述的Savage法指的是用蒸餾水稀釋粗品普魯蘭多糖，加入氯仿/正丁醇或氯仿/戊醇混合液，離心，將上清液再用此方法重復(fù)處理，最后得到脫去蛋白的上清液，減壓蒸餾除去有機(jī)溶液，凍干，得到粗普魯蘭多糖。
3.權(quán)利要求I中所述的分級(jí)醇沉指的是將權(quán)利要求2所得的粗普魯蘭多糖溶解在蒸餾水中，加入こ醇，醇析，離心，沉淀為普魯蘭多糖，然后繼續(xù)向上清液中加入こ醇，至不同梯度的こ醇濃度，每次操作同上述。
4.權(quán)利要求I中所述的凝膠層析指的是將分級(jí)醇沉淀得到的粗普魯蘭多糖用Sepharose 6fast flow(2. 6X60cm)凝膠層析住分離,分部收集器分管收集,減壓旋蒸含有活性物質(zhì)的洗脫液，得到普魯蘭多糖，再用冷凍こ酸こ酯沖洗，凍干，既得普魯蘭多糖純品，純度在99%以上。
5.權(quán)利要求2中所述的普魯蘭多糖水溶液的濃度為0.5% 10% ;氯仿/正丁醇和氯仿/戍醇的比例為Vit仿V戊醇或正丁醇=6 I : I ;離心的速率在1500r/min 4000r/min,離心時(shí)間為IOmin 30min ；Savage法重復(fù)次數(shù)為4 20次。
6.權(quán)利要求3中所述的こ醇選用95%或98%こ醇，こ醇濃度梯度為5% 20%，こ醇的始濃度為10% 20%，終濃度為70% 80%;醇析時(shí)間為4 20小吋，醇析溫度為0°C 60C ;離心速率為 10000r/min 40000r/min,時(shí)間為 10 60min。
7.權(quán)利要求4中所述的凝膠柱層析洗脫液為蒸懼水,流速為I.OmL/min 5. OmL/min。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種普魯蘭多糖的純化方法。其中主要包括以下步驟用Savage法除去蛋白質(zhì)，反復(fù)4～20次，再用95％或98％的乙醇配制成不同濃度梯度的溶液，進(jìn)行醇沉，除去小分子物質(zhì)，最后用蒸餾水為洗脫溶劑，進(jìn)行凝膠層析，最終得到純化普魯蘭多糖，純度在99％以上，收率在58％以上(以多糖含量計(jì)算)。本發(fā)明用時(shí)間短、收率高、方法簡(jiǎn)單，所得的普魯蘭多糖的多糖純度高等優(yōu)點(diǎn)，適合于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C08B37/00GK102617748SQ20121009873
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月6日
發(fā)明者王秀云, 肖佳普 申請(qǐng)人:華遠(yuǎn)醫(yī)藥研究院有限公司