本發(fā)明涉及一種半抗原及其制備方法和應(yīng)用，具體涉及磺胺類藥物半抗原及其制備方法和應(yīng)用。技術(shù)背景磺胺類藥物(Sulfonamides，SAs)是一類具有對氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)、用于預(yù)防和治療細(xì)菌感染性疾病的化學(xué)治療藥物。因具有廣譜、穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)、易用以及聯(lián)合抗菌增效劑效果可提高數(shù)十倍的特點(diǎn)，常以亞治療濃度的藥物做為飼料添加劑來預(yù)防疾病的發(fā)生，提高飼料的轉(zhuǎn)化率和促進(jìn)動(dòng)物生長，其中常用的SAs就有十幾種。但該類藥物存在嚴(yán)重副作用，人體中長期存在會(huì)導(dǎo)致許多細(xì)菌對磺胺類藥物產(chǎn)生耐藥性，且有潛在的致癌性，因此已引起了國內(nèi)外的高度重視。我國以及美國、歐盟等國家規(guī)定了動(dòng)物性食品中總磺胺以及單個(gè)磺胺的最高殘留限量(MRLs)為0.1mg/kg，其中磺胺二甲基嘧啶(SM2)的MRLs為0.025μg/ml。目前，磺胺類藥物殘留的檢測方法主要有微生物學(xué)法、理化分析方法和免疫法等。微生物學(xué)法簡便、費(fèi)用低，但操作費(fèi)時(shí)且敏感性、特異性都較差，在定性定量上都存在困難，不能滿足現(xiàn)代殘留檢測的需要，甚至有些檢測結(jié)果還達(dá)不到最高殘留限量的要求；理化法常作為確證方法用于測定動(dòng)物組織中的藥物殘留，如氣相色譜(GC)、高效液相色譜(HPLC)、氣-質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)、液-質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS)等，這些方法靈敏、準(zhǔn)確，特異性強(qiáng)、分離度好，可以同時(shí)測定多種藥物，但需要昂貴的儀器、樣品的前處理復(fù)雜、繁瑣費(fèi)時(shí)、檢測的成本較高，不能現(xiàn)場操作，而且需專業(yè)人員操作，所以限制了其應(yīng)用；與之相比，酶聯(lián)免疫方法具有特異性好、靈敏度高、操作簡便、檢測成本低、適合于批量樣品的篩選檢測等優(yōu)點(diǎn)，而且所需設(shè)備少，操作簡單易學(xué)，成本低廉，能夠更好地滿足我國畜禽養(yǎng)殖戶、屠宰場、食品企業(yè)、政府職能監(jiān)管部門等開展檢測工作。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種磺胺類藥物半抗原及其制備方法。本發(fā)明提供的磺胺類藥物半抗原，分子結(jié)構(gòu)式為：本發(fā)明提供的磺胺類藥物半抗原的制備方法，包括如下步驟：a)于25ml單口瓶中加入6-氨基煙酸、乙醇和12mol/L鹽酸，加熱回流，反應(yīng)8h，TLC監(jiān)測，反應(yīng)完畢，減壓除去溶劑，溶于飽和NaHCO3水溶液，乙酸乙酯萃取，無水Na2SO4干燥，柱層析(乙酸乙酯/石油醚，2/1，v/v)純化；b)于25ml單口瓶中加入a)所得產(chǎn)物、三乙胺(Et3N)和CH2Cl2，攪拌溶解后，加入催化劑4-二甲氨基吡啶(DMAP)。緩慢滴入4-乙酰氨基苯磺酰氯的二氯甲烷溶液，TLC監(jiān)測，5h，反應(yīng)完畢后處理，干燥，柱層析純化(乙酸乙酯/石油醚，1/10，v/v)；c)于25ml單口瓶中加入b)所得產(chǎn)物和2mol/LNaOH水溶液，加熱回流，TLC監(jiān)測，反應(yīng)10h，完畢，調(diào)節(jié)pH4～5，有固體析出，即為磺胺類藥物半抗原。本發(fā)明的另一個(gè)目的是上述磺胺類藥物半抗原在免疫檢測中的應(yīng)用，具體包括由所述磺胺類藥物半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到的磺胺類藥物抗原，及由所得磺胺類藥物抗原免疫動(dòng)物制備得到的磺胺類藥物抗體。其中所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、人血清蛋白、卵清蛋白、血藍(lán)蛋白或纖維蛋白原，所述抗體為磺胺類藥物單克隆抗體。本發(fā)明還提供由上述磺胺類藥物抗體制備的酶聯(lián)免疫試劑盒，及其在檢測動(dòng)物源性樣本中磺胺類藥物殘留的應(yīng)用。本發(fā)明提供的磺胺類藥物半抗原既最大程度地保留了磺胺母核的化學(xué)結(jié)構(gòu)，又通過化學(xué)合成改造引入了可以與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的—COOH，合成方法簡單，純度、產(chǎn)率較高；用該半抗原作為原料，制備適于動(dòng)物免疫的抗原體系免疫動(dòng)物，所得抗體的效價(jià)、特異性、親和力都比較好；所得的抗體用于酶聯(lián)免疫試劑盒，可以同時(shí)檢測磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲基異噁唑、磺胺噻唑、酞酰磺噻唑、磺胺甲噻二唑、磺胺吡啶七種藥物，使用方便、檢測成本低、檢測方法高效、準(zhǔn)確、快速、可同時(shí)檢測大批量的樣本，適于動(dòng)物源性樣本中磺胺類藥物殘留的現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本的篩查。本發(fā)明的磺胺類藥物半抗原在磺胺類藥物的檢測中發(fā)揮重要作用。附圖說明圖1：磺胺類藥物半抗原合成路線圖圖2：磺胺類藥物半抗原核磁共振氫譜圖圖3：磺胺類藥物酶聯(lián)免疫試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體的實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1磺胺類藥物半抗原的合成和鑒定一、磺胺類藥物半抗原的合成(合成路線如圖1)a)于25ml單口瓶中加入6-氨基煙酸0.87g，乙醇20ml，12mol/L鹽酸3.7ml，加熱回流，反應(yīng)8h，TLC監(jiān)測，反應(yīng)完畢，減壓除去溶劑，溶于飽和NaHCO3水溶液，乙酸乙酯萃取，無水Na2SO4干燥，柱層析(乙酸乙酯/石油醚，2/1，v/v)純化；b)于25ml單口瓶中加入a)所得產(chǎn)物0.89g，三乙胺(Et3N)1.6ml，CH2Cl210ml，攪拌溶解后，加入催化劑4-二甲氨基吡啶(DMAP)。緩慢滴入4-乙酰氨基苯磺酰氯的2ml二氯甲烷溶液，TLC監(jiān)測，5h，反應(yīng)完畢后處理，干燥，柱層析純化(乙酸乙酯/石油醚，1/10，v/v)；c)于25ml單口瓶中加入b)所得產(chǎn)物1g，2mol/LNaOH水溶液120ml，加熱回流，TLC監(jiān)測，反應(yīng)10h，完畢，調(diào)節(jié)pH4～5，有固體析出，即為磺胺類藥物半抗原。二、磺胺類藥物半抗原的鑒定取合成的磺胺類藥物半抗原經(jīng)核磁共振氫譜測定，如圖2所示，圖譜中6.7～8.2ppm左右的三個(gè)峰為吡啶環(huán)上的H信號峰，11ppm左右的單峰為磺胺鍵上的N—H峰，13.1ppm左右的單峰為羧基峰，說明半抗原合成成功。實(shí)施例2磺胺類藥物抗原將磺胺類藥物半抗原與載體蛋白進(jìn)行偶聯(lián)得到磺胺類藥物抗原。一、免疫原的制備——磺胺類藥物半抗原-牛血清白蛋白偶聯(lián)物合成取12mg磺胺類藥物半抗原，溶解于1mlN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，得到溶液I；取15mg碳化二亞胺(EDC)用0.2ml水充分溶解后于加入I中，室溫下攪拌24h，得到溶液Ⅱ；稱取牛血清白蛋白(BSA)40mg，使之充分溶解在3mlPBS(pH7.2)中，將溶液Ⅱ逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h；用0.01mol/LPBS4℃透析3天，每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)，即得到磺胺類藥物免疫原；分裝，于-20℃保存?zhèn)溆?。二、包被原的制備——磺胺類藥物半抗?卵清蛋白偶聯(lián)物合成取15mg磺胺類藥物半抗原用0.8mlDMF溶解，冷卻至10℃，得到溶液I；取氯甲酸異丁酯10μl加入I中，10℃攪拌反應(yīng)30min；取30mg卵清蛋白用2.2ml50mmol/LNa2CO3溶解，10℃反應(yīng)4h，然后4℃過夜；用0.01mol/LPBS4℃透析3天，每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)，即得到磺胺類藥物包被原；分裝，于-20℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?、磺胺類藥物抗原的鑒定將載體蛋白、磺胺類藥物半抗原、磺胺類藥物半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物用pH7.4的PBS配成0.5mg/ml的溶液，以0.01mol/LpH7.4PBS調(diào)零，用紫外分光光度計(jì)在波長200～800nm范圍內(nèi)掃描，得到載體蛋白、磺胺類藥物半抗原、磺胺類藥物半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的吸收曲線，并計(jì)算其結(jié)合比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三者出現(xiàn)不同的吸收曲線，表明磺胺類藥物半抗原與載體蛋白偶聯(lián)成功，半抗原與牛血清白蛋白的結(jié)合比為(18～22):1，與卵清蛋白的結(jié)合比為(16～21):1。實(shí)施例3磺胺類藥物單克隆抗體一、磺胺類藥物單克隆抗體的制備動(dòng)物免疫：將免疫原注入到Balb/c小鼠體內(nèi)，免疫劑量為150μg/只，使其產(chǎn)生多克隆抗體血清。細(xì)胞融合和克隆化：小鼠血清測定結(jié)果較高后，取其脾細(xì)胞，按8:1比例與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，采用間接競爭ELISA測定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進(jìn)行克隆化，直到得到分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。細(xì)胞凍存和復(fù)蘇：將磺胺類藥物的單克隆雜交瘤細(xì)胞株用凍存液制成1×109個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，在液氮中長期保存。復(fù)蘇時(shí)取出凍存管，立即放入37℃水浴中速融，離心去除凍存液后，移入培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)。單克隆抗體的生產(chǎn)與純化：將Balb/c小鼠腹腔注入滅菌石蠟油0.5ml/只，7天后腹腔注射磺胺類藥物的單克隆雜交瘤細(xì)胞株6×105個(gè)/只，7天后采集腹水。用辛酸-飽和硫酸銨法進(jìn)行腹水純化，-20℃保存。二、單克隆抗體效價(jià)的測定用間接競爭ELISA法測定抗體的效價(jià)為1:(50000～100000)。間接競爭ELISA方法：用磺胺類藥物半抗原-卵清蛋白偶聯(lián)物包被酶標(biāo)板，加入磺胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品溶液、酶標(biāo)二抗和單克隆抗體工作液，25℃反應(yīng)30min，倒出孔內(nèi)液體，用PBST洗滌液洗滌3～5次，用吸水紙拍干；加入底物顯色液，25℃反應(yīng)15min后，加入終止液終止反應(yīng)；設(shè)定酶標(biāo)儀于波長450nm處測定每孔吸光度值。三、單克隆抗體的特異性抗體特異性是指它同特異性抗原結(jié)合的能力與同該類抗原類似物結(jié)合能力的比較，常用交叉反應(yīng)率作為評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。交叉反應(yīng)越小，抗體的特異性則越高。本實(shí)驗(yàn)將磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲基異噁唑、磺胺噻唑、酞酰磺噻唑、磺胺甲噻二唑、磺胺吡啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲基嘧啶11種磺胺類藥物做系列稀釋，分別與單克隆抗體進(jìn)行間接競爭ELISA，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，分析得到IC50，然后按下式計(jì)算交叉反應(yīng)率：結(jié)果顯示各磺胺類藥物的交叉反應(yīng)率為：磺胺嘧啶100.0％、磺胺間甲氧嘧啶97.6％、磺胺甲基異噁唑169.0％、磺胺噻唑188.0％、酞?；青邕?2.8％、磺胺甲噻二唑103％、磺胺吡啶51.9％、磺胺二甲基嘧啶＜1％、磺胺二甲氧嘧啶＜1％、磺胺喹噁啉＜1％、磺胺甲基嘧啶＜1％。本發(fā)明抗體可以同時(shí)檢測磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲基異噁唑、磺胺噻唑、酞?；青邕颉⒒前芳奏缍?、磺胺吡啶7種磺胺類藥物。實(shí)施例4由磺胺類藥物單克隆抗體制備的酶聯(lián)免疫試劑盒一、酶聯(lián)免疫試劑盒的組成(1)包被磺胺類藥物半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物的酶標(biāo)板；(2)用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體；(3)磺胺類藥物單克隆抗體工作液；(4)磺胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為0μg/L、0.5μg/L、1.5μg/L、4.5μg/L、13.5μg/L、40.5μg/L；(5)底物顯色液由A液和B液組成，A液為過氧化脲，B液為四甲基聯(lián)苯胺；(6)終止液為2mol/L硫酸；(7)濃縮洗滌液為pH7.2，含0.8％～1.2％吐溫-20、0.01‰～0.03‰硫柳汞防腐劑、0.1～0.3mol/L的碳酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比；(8)濃縮復(fù)溶液為pH7.6，含8％～12％酪蛋白、0.1～0.3mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。本試劑盒的主要試劑以工作液的形式提供，檢驗(yàn)方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確度高、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，同時(shí)采用一步法，節(jié)省了檢測時(shí)間。二、酶聯(lián)免疫試劑盒檢測實(shí)際樣本的應(yīng)用1.樣品前處理(1)鮮牛奶前處理方法取50μl鮮牛奶樣本，加入450μl復(fù)溶工作液中，混勻；取50μl用于分析(2)組織(雞肉、豬肉、魚、蝦)前處理方法用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本后，稱取2.0±0.05g均質(zhì)物至50ml聚苯乙烯離心管中，加入4mlpH＝6的磷酸鹽緩沖液渦動(dòng)成糊狀，再加入6ml乙酸乙酯，振蕩1min，4000rpm室溫(20-25℃/68-77℉)離心5min；取3ml上清液至10ml干凈玻璃試管中，于50～60℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈桑患尤?ml正己烷，用渦旋儀渦動(dòng)30s，再加入1ml復(fù)溶工作液，渦動(dòng)10s，4000rpm室溫(20-25℃/68-77℉)離心5min；除去上層正己烷相，取下層水相50μl用于分析。(3)蜂蜜前處理方法稱取1.0±0.05g蜂蜜樣本至50ml聚苯乙烯離心管中；加入1ml1mol/L鹽酸溶液，用振蕩器振蕩至蜂蜜全部溶解；放入37℃培養(yǎng)箱中孵育30min；取出，加入1ml1mol/L氫氧化鈉溶液和1mlpH＝6的磷酸鹽緩沖液，再分別加入2ml乙腈和6ml乙酸乙酯，用振蕩器振蕩1min，4000rpm室溫(20-25℃/68-77℉)離心10min；取4ml上層有機(jī)相至10ml干凈玻璃試管中，于50～60℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈桑患?.5ml復(fù)溶工作液溶解；取50μl用于分析。(4)尿液前處理方法取50μl尿液樣本，加入150μl洗滌工作液中，混勻；取50μl用于分析。2.用試劑盒檢測向包被有磺胺類藥物包被抗原的酶標(biāo)板微孔中加入磺胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液50μl，隨即加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠抗抗體50μl/孔，再加入磺胺類藥物單克隆抗體工作液50μl/孔，用蓋板膜蓋板后，置25℃恒溫箱中避光反應(yīng)30min，倒出孔內(nèi)液體，每孔加入250μl洗滌液，30s后倒出孔內(nèi)液體，如此重復(fù)操作洗板5次，用吸水紙拍干；每孔加入底物顯色液A液過氧化脲50μl，底物顯色液B液四甲基聯(lián)苯胺(TMB)50μl，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃恒溫箱中避光顯色15min，每孔加入終止液2mol/L硫酸50μl，輕輕振蕩混勻，用酶標(biāo)儀波長設(shè)定在450nm處，測定每孔吸光度值(OD值)。3.檢測結(jié)果分析用所獲得的每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(B0)再乘以100％，得到百分吸光度值。以磺胺嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/L)的對數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，如圖3所示。用同樣的辦法計(jì)算樣品溶液的百分吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，再乘以每種藥物對應(yīng)的交叉反應(yīng)率，即為樣本中磺胺類藥物的實(shí)際濃度。三、酶聯(lián)免疫試劑盒技術(shù)參數(shù)的確定最低檢測限：對20份空白樣本進(jìn)行檢測，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對應(yīng)于各百分吸光度值的濃度，以20份樣本磺胺類藥物濃度的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差表示檢測限，結(jié)果得該方法對牛奶樣本的最低檢測限為5μg/L，對動(dòng)物組織、蜂蜜樣本的最低檢測限為0.5μg/kg，對尿液樣本的最低檢測限為2μg/L。準(zhǔn)確度和精密度：ELISA測定的準(zhǔn)確度以回收率表示，精密度以變異系數(shù)表示。取空白樣本，以50、100、200μg/kg三個(gè)濃度的磺胺類藥物對其進(jìn)行添加回收試驗(yàn)(添加濃度超出曲線測量范圍，需要把樣本酌情稀釋后再進(jìn)行檢測，)，結(jié)果得該方法對牛奶樣本的回收率為85％±15％，對動(dòng)物組織樣本的回收率為75％±10％，對蜂蜜樣本的回收率為90％±10％，對尿液樣本的回收率為95％±15％，批內(nèi)變異系數(shù)＜15％，批間變異系數(shù)＜25％。經(jīng)測定本發(fā)明試劑盒在2～8℃至少可以保存12個(gè)月。