專利名稱：軟骨素的生物技術(shù)制備的制作方法
軟骨素的生物技術(shù)制備發(fā)明目的本發(fā)明涉及一種產(chǎn)生軟骨素的新的重組微生物以及軟骨素的生物技術(shù)制備方法。在本發(fā)明中，術(shù)語軟骨素指定義為線性糖胺聚糖的線性多糖，其由通過β 1-3 (GlcUA — GalNAc)鍵和 β 1-4 (GalNAc — GlcUA)鍵連接的 D-糖醛酸(GlcUA)和 N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNAc)的交替殘基構(gòu)成。
背景技術(shù)：
硫酸軟骨素為糖胺聚糖，其中糖醛酸(GlcUA)和N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNAc)經(jīng)β 1-3鍵和β 1-4鍵分別地線性和交替連接，來自在其GalNAc殘基中進行不同程度的硫酸化的線性多糖鏈。其存在于動物中，在軟骨和結(jié)締組織中，在細胞黏著、組織再生、神經(jīng)延伸等中起到重要作用。從非動物源制備軟骨素是通向非動物來源的硫酸軟骨素制備的重要且期望的步驟。已有的專利文獻 描述了幾種制備非動物來源的軟骨素的方法。此外，已經(jīng)克隆并測序了來自動物和微生物的幾種軟骨素合酶基因。已經(jīng)提供了使用導入來自多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida)的軟骨素合酶基因的重組革蘭氏陽性芽孢桿菌制備軟骨素的方法(US2007/0281342A1)。另一發(fā)明描述了通過將來自大腸桿菌05:K4:H4(Escherichia coli05:K4:H4A)的kfoC和kfoA基因?qū)氘a(chǎn)生UDP-糖醛酸的細菌中制備軟骨素的方法(W02008/133350)。另一發(fā)明描述了包括大腸桿菌05:K4:H4軟骨素合酶和前體反應的酶體系中的體外軟骨素合成(US2009/0263867A1)。已知大腸桿菌05:K4:H4能夠產(chǎn)生與軟骨素具有相同主鏈結(jié)構(gòu)的莢膜多糖(K4多糖)，果糖殘基連接于其上的GlcUA殘基(參見，例如N.Volpi，Glycoconj.J.(2008)25:451-457) ο因此，K4多糖由重復的三糖單元組成，所述三糖單元包括經(jīng)β 1-3 (GlcUA — GalNAc)連接的D-糖醛酸(GlcUA)部分和N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNAc)部分以及結(jié)合于所述GlcUA殘基的C3-羥基的果糖殘基。因此，果糖殘基構(gòu)成所得線性多糖的分支。通過酸性條件中的水解處理已經(jīng)實現(xiàn)果糖殘基的去除(N.Volpi,Electrophoresis25,692-696(2004))。盡管已經(jīng)廣泛研究了大腸桿菌05:K4:H4莢膜抗原基因簇以及產(chǎn)生組成K4線性多糖的糖的代謝途徑，迄今為止，還沒有發(fā)現(xiàn)負責將果糖部分加至線性多糖得到K4多糖的糖基轉(zhuǎn)移酶活性。本發(fā)明的新特征為通過失活基因獲得的重組微生物直接制備高分子量軟骨素，所述基因編碼負責將果糖殘基加至軟骨素主鏈的酶，從而消除了將K4多糖進行結(jié)合于GlcUA部分的果糖殘基的水解去除來獲得軟骨素的需要。發(fā)明詳述
本發(fā)明的目的為提供產(chǎn)生軟骨素的重組微生物，所述軟骨素定義為分別由通過β 1-3鍵和β 1-4鍵連接的D-糖醛酸(GlcUA)和N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNAc)的交替殘基組成的線性糖胺聚糖，其特征在于，在所述微生物中編碼負責將果糖殘基加至軟骨素主鏈的酶的基因被失活。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供一種產(chǎn)生軟骨素的重組微生物，其特征在于，所述微生物通過將原始存在于其中的基因進行失活而獲得，所述基因編碼負責將果糖殘基加至線性軟骨素主鏈的蛋白質(zhì)，所述失活包括全部或部分缺失或取代所述基因或通過插入另外的核苷酸序列進行干擾。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，通過失活編碼具有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的基因獲得的本發(fā)明的重組微生物來自屬于大腸桿菌種的細菌、優(yōu)選地屬于包括公知的血清型如Κ1、Κ5、Κ7、Κ12的2類K抗原。盡管根據(jù)本發(fā)明的代表性實施方案，具有產(chǎn)生軟骨素能力的重組微生物來自大腸桿菌05:Κ4:Η4，可以使用任何屬于K抗原類的微生物，不管其與大腸桿菌05:Κ4:Η4是否共享任何基因同源性。所述微生物的實例包括屬于嗜血桿菌屬的細菌，如流感嗜血桿菌(H.1nfluenzae)(Branefors-Helander P.,Carbohydr.Res., 1981, Janl5,88)，彎曲桿菌屬的細菌，如空腸彎曲桿菌(C.jejuni) (McNally DJ, Jarrell HC, Li J, Khieu NH,Vinogradov E, Szymanski CM, Brisson JR., FEBS J.2005Sep; 272),粘球藻屬的細菌，如膠質(zhì)粘球藻(G.Gelatinosa) (Raungsomboon S, Chidthaisong A, Bunnag B, InthornD, Harvey NW., Water Res.2006Dec ；40)和弧菌屬的細菌，如霍亂弧菌(V.cholerae)(Knirel YA, Widmalm G,Senchenkova SN,Jansson PE,Weintraub A-Eur J Biochem,1997,Jull, 247)。更優(yōu)選地，產(chǎn)生軟骨素的本發(fā)明的重組微生物所來自的細菌為大腸桿菌血清型05:K4:H4，其含有編碼具有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的kfoE基因。

已知kfoE位于大腸桿菌(E.coli) K4抗原基因簇(GenBankAB079602)內(nèi)，該基因簇含有本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的基因，與來自其它微生物的、可能參與細菌莢膜產(chǎn)生的基因具有顯著同源性(T.Ninomiya, N.Sugiura, A.Tawada, K.Sugimoto, H.Watanabe andK.Kimata-JBC, 2002，vol.277，June14, N。24，21567-75)。最優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的重組微生物的細菌為大腸桿菌05:K4:H4菌株U1-41可由ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas-Virginia，US)獲得，保藏號ATCC23502。根據(jù)本發(fā)明的代表性實施方案，所述重組微生物為產(chǎn)生軟骨素的微生物，其中進行失活的基因為編碼選自以下(A)、(B)、(C)的蛋白質(zhì)的基因:(A)包含SEQ ID N。2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)(B)包含經(jīng)缺失、取代或插入一個或多個氨基酸修飾的SEQ ID N0 2的氨基酸序列且具有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。(C)包含與SEQ ID N。2的氨基酸序列具有至少50%同源性的氨基酸序列且具有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的微生物為其中失活的基因為kfoE基因或選自以下(a)、(b)、(C)的DNA的微生物:(a)包含SEQ ID N。I的核苷酸序列的DNA
(b)與包含互補于SEQ ID N° I的核苷酸序列的DNA雜交且編碼具有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。(c)包含與SEQ ID N0 I的核苷酸序列具有至少50%同源性的核苷酸序列且編碼具有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。本發(fā)明的一個目的為一種產(chǎn)生軟骨素的微生物，其中通過修飾kfoE的核苷酸序列獲得kfoE失活，例如，通過全部或部分缺失或取代以上(a)、(b)或(C)所述的核苷酸序列。本發(fā)明的另一目的為一種微生物，其中通過將一個或多個核苷酸插入以上(a)、(b)或(C)所述的核苷酸序列獲得kfoE失活。根據(jù)本發(fā)明最優(yōu)選的方面，通過核苷酸缺失來失活編碼假定的果糖基轉(zhuǎn)移酶的kfoE基因，獲得大腸桿菌05:K4:H4菌株U1-41 (從此稱為大腸桿菌K4)的重組衍生物。本發(fā)明公開kfoE基因的破壞如何導致直接產(chǎn)生缺少果糖殘基的K4多糖，即軟骨素。根據(jù)本發(fā)明另一優(yōu)選的方面，通過使用破壞染色體基因的方法來獲得本發(fā)明的重組大腸桿菌K4,在所述方法中PCR引物提供與祀向基因的同源性(Datsenko and Wanner,PNAS2000N0 12vol.97，6640-6645)。首先以外源卡那霉素抗性基因取代kfoE基因的核苷酸序列的大部分(“第一遺傳修飾”)、然后使用FLP重組·酶表達載體去除插入的基因(“第二遺傳修飾”)，已將本發(fā)明的重組大腸桿菌K4菌株進行染色體kfoE基因的失活。在所述第一遺傳修飾后獲得的稱為大腸桿菌K4(AkfoE/kanK)的重組大腸桿菌K4菌株已根據(jù)布達佩斯條約于2010年4月30日保藏于德意志微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse7B,38124Braunschweig, Germany)，保藏號 DSM23578。在所述第二遺傳修飾后獲得的稱為大腸桿菌K4(AkfoE)的重組大腸桿菌K4菌株已根據(jù)布達佩斯條約于2010年5月26日保藏于德意志微生物菌種保藏中心(DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstrasse7B, 38124Braunschweig, Germany)，保藏號為 DSM23644。kfoE基因的失活通過3個連續(xù)的細菌轉(zhuǎn)化實現(xiàn):第一，以Red重組酶表達質(zhì)粒(pKD46)進行轉(zhuǎn)化；第二，以來自適宜地修飾以提供與kfoE基因的同源性的模板質(zhì)粒(pDK4)的DNA片段進行轉(zhuǎn)化；第三，以表達酶FLP重組酶的輔助質(zhì)粒(pCP20)進行轉(zhuǎn)化。為了獲得大腸桿菌K4的第一遺傳修飾，使用了 pKD46質(zhì)粒(GenBank: AY048746)和線性DNA片段。在大腸桿菌K4轉(zhuǎn)化的第一步驟中使用的PKD46質(zhì)粒由來自噬菌體λ的2154個核苷酸和編碼氨芐青霉素抗性的基因組成。當使用線性DNA片段時，該質(zhì)粒促進提高速率的重組。通過使用幾對引物的PCR獲得了在大腸桿菌Κ4的后續(xù)轉(zhuǎn)化中所用的線性DNA片段，所述引物包含對于kfoE基因和攜帶卡那霉素抗性盒(GenBank:AY048743)的模板質(zhì)粒PDK4的同源延伸。該過程能夠產(chǎn)生攜帶卡那霉素抗性盒的線性DNA片段，在其末端具有kfoE5’和3’同源末端。在本發(fā)明的一個實施方案中，通過電穿孔實現(xiàn)細菌轉(zhuǎn)化，選擇電穿孔是由于其容易地產(chǎn)生雙轉(zhuǎn)化體的能力，所述雙轉(zhuǎn)化體可以從含有氨芐青霉素和卡那霉素的平板上回收。然而，盡管電穿孔為優(yōu)選的技術(shù)，該結(jié)果可以通過任何已知的轉(zhuǎn)化方法實現(xiàn)，例如，氯化鈣轉(zhuǎn)化或葡聚糖-DEAE轉(zhuǎn)化。旨在證實大腸桿菌K4轉(zhuǎn)化體(AkfoE/kanK)中以卡那霉素抗性盒取代原始DNA序列的正確位置，使用兩個臨近的位點特異性引物對進行了數(shù)個PCR擴增:第一引物對能夠證明kfoE剩余5’末端與插入的kan基因之間新的連接的形成,而第二引物對能夠證明插入的kan基因與kfoE剩余3’末端之間新的連接的形成。用于除去卡那霉素抗性盒(“第二遺傳修飾”)的輔助質(zhì)粒為攜帶酵母FLP重組酶基因和氨芐青霉素抗性基因的質(zhì)粒PCP20。pKD46和pCP20質(zhì)粒均為溫度敏感性載體，其在43°C生長后在后續(xù)從大腸桿菌K4的轉(zhuǎn)化體菌株除去。對大腸桿菌K4 ( Δ kfoE/kanR)進行測序分析，以證實卡那霉素抗性盒對kfoE基因的全部或部分取代。類似地，對大腸桿菌M(AkfoE)進行了測序分析，以證實卡那霉素抗性盒的后續(xù)缺失，導致最終產(chǎn)生kfoE-破壞型菌株。用于成功構(gòu)建能夠產(chǎn)生天然糖胺聚糖的非糖基化變體的重組大腸桿菌K4的方法應用廣泛，可有利地應用于需要防止所述糖基化的其它糖基化產(chǎn)品?？傊_發(fā)了一種獲得能夠產(chǎn)生天然糖胺聚糖的非糖基化`變體的微生物的一般性方法。本發(fā)明的另一目的為提供用于軟骨素的生物技術(shù)制備的方法，其包括以下步驟:(I)在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組微生物,和(2)從其肉湯培養(yǎng)物回收產(chǎn)生的軟骨素。在培養(yǎng)步驟中可以使用能夠產(chǎn)生根據(jù)上述失活編碼負責將果糖殘基加至軟骨素的酶的基因的方法獲得的軟骨素的任何重組微生物。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，從大腸桿菌K4獲得的重組細菌例如大腸桿菌DSM23644用作具有直接產(chǎn)生軟骨素的能力的重組微生物。用于培養(yǎng)細菌大腸桿菌DSM23644的方法是可用于培養(yǎng)埃希氏菌屬成員的一般性方法。所述方法基于優(yōu)選地但不專一地使用含有以下(每升)的培養(yǎng)基:K2HP043H209.7g、KH2P048g、檸檬酸鈉 5H200.5g、MgCl27H200.2g、酪蛋白氨基酸 20g、(NH4) 2S0420g、葡萄糖 2g、酵母提取物10g。高水平的軟骨素制備可以通過適當調(diào)整基礎培養(yǎng)基的組成和/或通過底物飼喂向所述培養(yǎng)物提供進一步的營養(yǎng)物實現(xiàn)。設置培養(yǎng)條件，以使細菌生長和軟骨素制備最大化。一般地，在25°C至40°C之間的溫度進行培養(yǎng)8h至72h。優(yōu)選地，通過離心收集上清液并用于后續(xù)的純化以及制備的軟骨素的定性。根據(jù)米用Rodriguez 和 Jann (Eur.J.Biochem.117,117-124, FEBS1988)所述的方法實現(xiàn)軟骨素純化。簡言之，用于純化軟骨素的方法是基于沉淀的幾個步驟，始于培養(yǎng)物上清液，最后在真空下干燥?；厥债a(chǎn)物的同一性可以通過很多方法證實，優(yōu)選通過提供多糖鏈結(jié)構(gòu)證據(jù)和不存在果糖殘基的證據(jù)的方法的組合進行證實。純化樣品不存在果糖可以有利地通過在已知從天然K4多糖釋放果糖的條件下對產(chǎn)物進行酸水解、然后對任何釋放的果糖進行特定測定來進行驗證。該測試恒定地顯示從細菌大腸桿菌DSM23644的培養(yǎng)物回收的多糖不含果糖，與從大腸桿菌05:K4:H4菌株U1-41獲得的天然K4多糖相反，所述大腸桿菌05:K4:H4菌株U1-41恒定地產(chǎn)生多糖，所述多糖含有從K4多糖的結(jié)構(gòu)式預計的量的果糖。進一步的證實從細菌大腸桿菌DSM23644的培養(yǎng)物回收的產(chǎn)物的同一性通過將產(chǎn)物以酶軟骨素酶ABC消化而獲得，已知軟骨素酶ABC將無果糖軟骨素多糖而不是天然K4多糖完全降解為二糖。換言之，軟骨素酶ABC不能消化天然K4多糖。從細菌大腸桿菌DSM23644的培養(yǎng)物回收的產(chǎn)物的軟骨素酶ABC消化實驗產(chǎn)生從完全消化所預計的二糖產(chǎn)物的量，從而證實了多糖主鏈的性質(zhì)、特別是不存在果糖殘基。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，為了證實kfoE的功能為編碼K4糖基轉(zhuǎn)移酶活性的基因，構(gòu)建了攜帶野生型kfoE核苷酸序列的重組質(zhì)粒，并將其導入大腸桿菌K4菌株(Δ kfoE)，以介導喪失功能的互補。簡言之，擴增kfoE基因并在NcoI和BamHI限制性位點內(nèi)克隆到pTrcHis質(zhì)粒(Invitrogen Corporation, 5791Van Allen Way PO B ox6482Carlsbad, California)。使用構(gòu)建體pTrcHis-kfoE通過電穿孔轉(zhuǎn)化重組大腸桿菌(AkfoE),在含有100 μ g/mL氨節(jié)青霉素的平板上于37°C選擇轉(zhuǎn)化體。根據(jù)Rodriguez 和 Jann (Eur.J.Biochem.117,117-124, FEBS1988)培養(yǎng)攜帶構(gòu)建體pTrcHis-kfoE的大腸桿菌(AkfoE)轉(zhuǎn)化體并純化K4多糖，為了量化回收的產(chǎn)物中存在的多糖，在于99°C以0.2M三氟乙酸水解Ih之前及其后測定游離果糖。在水解前后測定的游離果糖已作為結(jié)合于 起始K4分子的果糖。從以pTrcHis-kfoE轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DSM23644的培養(yǎng)物回收的產(chǎn)物顯示存在結(jié)合的果糖，證實該菌株中缺失的果糖基轉(zhuǎn)移酶活性由質(zhì)粒互補。


圖1示意性地顯示對大腸桿菌05:K4:H4菌株U1-41進行遺傳修飾，從而構(gòu)建大腸桿菌 K4 ( Δ kfoE/kanR)和大腸桿菌 K4 ( Δ kfoE):a)攜帶卡那霉素抗性盒(卡那霉素)的DNA片段被兩個FRT (翻轉(zhuǎn)酶識別靶)重組序列側(cè)接；卡那霉素抗性基因通過使用Pl和P2引發(fā)位點來自PKD4質(zhì)粒模板。b)大腸桿菌05:K4:H4菌株U1-41的K抗原基因簇的詳細結(jié)構(gòu)，其中kfoD和kfoFSkfoE的側(cè)翼基因。c)大腸桿菌K4 ( Δ kfoE/kanR)染色體DNA顯示通過以卡那霉素抗性基因(卡那霉素)取代原始DNA的片段而破壞kfoE基因。d)大腸桿菌K4 ( Δ kfoE)染色體DNA顯示最終缺失kfoE基因的大部分。圖2顯示在3個大腸桿菌K4(AkfoE/kanK)轉(zhuǎn)化體上進行PCR擴增的結(jié)果，以證實3，和5，kfoE剩余側(cè)翼區(qū)的序列:泳道I和10顯示分子量標記(IKb梯度)；
泳道2-4:3個轉(zhuǎn)化體的剩余kfoE3’末端的PCR產(chǎn)物；泳道6-8:3個轉(zhuǎn)化體的剩余kfoE5’末端的PCR產(chǎn)物；泳道5和9:分別使用3’和5’引物對獲得的大腸桿菌05:K4:H4菌株U1-41的PCR產(chǎn)物。圖3顯示大腸桿菌DSM23644產(chǎn)生的多糖的層析譜，在用軟骨素酶ABC消化后通過毛細管電泳進行分析，其中顯示典型的以軟骨素酶ABC進行軟骨素消化的不飽和△ - 二糖(Δ d1-OS)(峰 8)。圖4顯示根據(jù)實施例3獲得的大腸桿菌DSM23644產(chǎn)生的軟骨素的13C-NMR譜。實施例實施例1:構(gòu)建大腸桿菌K4(AkfoE/kanK)菌株攜帶kanK基因和kfoE同源末端的線性DNA片段(圖1a)的構(gòu)建通過PCR實現(xiàn)，所述PCR使用pKD4載體作為模板和以下PCR引物:0L151:atgcttctaataatgtctggttcctatgttcaacaagaatgtgtaggctggagctgcttc(SEQ ID N° 3)0L152:tcatactgcagcctccttaaaaatttcatataatctaaatgcacatatgaatatcctcctta(SEQ ID N。 4)在各寡核苷酸 序列中，起始40個核苷酸提供kfoE基因同源性，而剩余20個核苷酸提供PKD4模板質(zhì)粒同源性(Pl和P2引發(fā)位點)。根據(jù)以下條件，對120ng模板DNA進行PCR:94 °C x3min, (94 °C xlmin, 40 °C xlmin, 68 °C x2min) x5 循環(huán)，(94°C xlmin, 59°C xlmin, 68°C x2min)x30 循環(huán),68。。xlOmin, 4°C xl0mino凝膠純化PCR產(chǎn)物并轉(zhuǎn)化細菌。根據(jù)Datsenko 和 Wanner (PNAS, June2000, vol97, N。12,6640-6645)制備大腸桿菌05:K4:H4菌株Ul-41(Fig.1b)并通過電穿孔以pKD46轉(zhuǎn)化，然后鋪板到含有氨芐青霉素
的培養(yǎng)基上。識別并分離氨芐青霉素抗性轉(zhuǎn)化體。通過質(zhì)粒提取以及使用以下引物和條件的PCR驗證兩個轉(zhuǎn)化體:0L149:ccactcataaatcctcatagag(SEQ ID N。 5)0L150:ccaacttacttctgacaacgat(SEQ ID N。 6)以 94 °C x3min, (94 °C xlmin, 43 °C xlmin, 68 °C x2.5min) x30 循環(huán)，68°C xlOmin,4°C xlOmin通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，鑒別大小為1799堿基對的產(chǎn)物，完全符合預計的產(chǎn)物大小。兩個pKD46轉(zhuǎn)化體之一進行后續(xù)的電穿孔，使用攜帶卡那霉素抗性盒和kfoE同源末端的DNA片段進行。使用含有氨芐青霉素和卡那霉素的培養(yǎng)基上的平板篩選來分離攜帶以卡那霉素抗性基因取代kfoE核苷酸序列的大部分的重組體。
通過使用合適的以下引物，PCR擴增kfoE3’和5’側(cè)翼區(qū)證實了 3個雙轉(zhuǎn)化體:0L153:aatccgacggggactgtagatt(SEQ ID N。 7)0L142:aactgttcgccaggctcaag(SEQ ID N。 8)0L143:gcgttttcccttgtccagat(SEQ ID N。 9)0L154:gctaatgtatatgattgccaggt(SEQ ID N。 10)以 95 °C x5min, (94 °C xlmin, 47 °C xlmin, 68 °C x2min)x30 循環(huán),68°C xlOmin, 4°C xlOmin通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物，分別鑒定了 kfoE基因的3’末端擴增大小為1773堿基對和kfoE基因的5’末端擴增大小為769堿基對的兩個產(chǎn)物，與預計的產(chǎn)物大小完全相符(圖2)。 為了驗證卡那霉素抗性基因的方向并確保基因轉(zhuǎn)錄的正確方向，通過使用以下寡核苷酸、通過大腸桿菌K4(AkfoE/kanK)的序列分析(圖1c)進行轉(zhuǎn)化體的進一步分析:0L153:aatccgacggggactgtagatt(SEQ ID N。 7)0L154:gctaatgtatatgattgccaggt(SEQ ID N。 10)所得到的核苷酸序列鑒定為SEQ ID N。14。實施例2:構(gòu)建大腸桿菌K4 ( Δ kfoE)菌株為了獲得缺乏卡那霉素抗性盒并攜帶kfoE基因的大部分缺失附帶喪失功能的大腸桿菌K4菌株(Λ kfoE)，以pCP20質(zhì)粒進行進一步的大腸桿菌K4菌株(Λ kfoE/kanR)的轉(zhuǎn)化。電穿孔步驟后，于30°C在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化體，然后純化集落。于43°C在非選擇性平板上培養(yǎng)假定的轉(zhuǎn)化體，然后測試所有抗生素抗性的喪失。使用以下寡核苷酸，通過測序kf oE側(cè)翼3’和5’剩余末端(圖1d)證實大腸桿菌K4菌株(Δ kfoE)轉(zhuǎn)化體:0L169:tgaggtgattgttggtaaaccttggtg(SEQ ID N。11)0L166:tactgtttctgcttgcccccgagtt(SEQ ID N。12)所得到的核苷酸序列鑒定為SEQ ID N。13實施例3: 大腸桿菌DSM23644的培養(yǎng)和軟骨素分析根據(jù)Rodriguez 和 Jann (Eur.J.Biochem.117,117-124,FEBS1988)進行大腸桿菌DSM23644的培養(yǎng)。簡言之，實現(xiàn)培養(yǎng)物的營養(yǎng)階段，始于0.5ml解凍的培養(yǎng)物儲液,溫育含有20ml由以下(每升)組成的肉湯培養(yǎng)物的瓶:9.7g K2HP043H20、8g ΚΗ2Ρ04、0.5g檸檬酸鈉5H20、MgCl27H200.2g、酪蛋白氨基酸20g、硫酸銨20g、葡萄糖2g、酵母提取物10g，于37°C溫育16h，伴隨180rpm和2.5cm位移的震蕩。后續(xù)的培養(yǎng)階段在肉湯培養(yǎng)物中進行，其在含有85ml如上所述的肉湯培養(yǎng)物的500ml-帶平板的瓶中，以0.05%如上制備的營養(yǎng)培養(yǎng)物溫育，并于37°C溫育48h，伴隨180rpm和25cm位移的震蕩。在溫育的最后，通過離心收集培養(yǎng)物并將上清液純化，以分離和定性制備的軟骨素。根據(jù)采用Rodriguez 和 Jann (Eur.J.Biochem.117，117-124，F(xiàn)EBS1988)所述的方法實現(xiàn)軟骨素純化。簡言之，通過Cetavlon(烷基一三甲基溴化銨，CAS N。7192_88_3)從培養(yǎng)物上清液沉淀多糖，于3°C以NaOH0.5M提取，中和并隨后通過3輪以80%乙醇沉淀進行純化。純化的最后步驟以90%冷苯酚pH6.8進行，以沉淀污染性蛋白質(zhì)，從而通過離心回收水相。通過以80%乙醇沉淀和真空干燥從水相回收純化的軟骨素。使用幾種分析方法來確定制備的軟骨素的性質(zhì)。第一種方法是基于在以0.2M三氟乙酸于99°C水解Ih后在從培養(yǎng)物回收的產(chǎn)物中存在或不存在果糖。為了量化回收產(chǎn)物中存在的果糖，在水解前及其后測定游離果糖。使用B10C0NTR0L(BioControl Systems Inc.12822SE32nd Street Bellevue, WA98005,UnitedStates)供應的 EnzyPlus Sucrose/D-Glucose/D-Fructose 試劑盒,酶學測定果糖。水解后存在的游離果糖與水解前存在的游離果糖的差作為結(jié)合于起始K4分子的果糖。從大腸桿菌DSM23644的培養(yǎng)物回收的產(chǎn)物顯示不存在結(jié)合的果糖，證實該菌株產(chǎn)生無果糖的多糖。通過以軟骨素酶ABC的酶解證實從如上所述的大腸桿菌DSM23644的培養(yǎng)物回收的多糖不存在結(jié)合的果糖。進一步表明當以軟骨素酶ABC消化時，純化的軟骨素產(chǎn)生軟骨素消化典型的不飽和Λ-二糖(Λ d1-OS)，如使用膠囊電動層析(MECK)技術(shù)的毛細管電泳(CE)所證實(圖3)。通過使用合適的Λ -二糖參照標準(相當?shù)碾娪鞠疵?獲得Λ d1-OS結(jié)構(gòu)的證實。通過外部校準曲線實現(xiàn)獲得的Ad1-OS的定量測定。最后，通過C13NMR定性由大腸桿菌DSM23644產(chǎn)生的純化的軟骨素多糖(圖4)。該技術(shù)表明目標產(chǎn)物與通過酸水解從天然K4多糖除去果糖后獲得的產(chǎn)物驚人地相同。實施例4:kfoE功能的質(zhì)粒介導的互補為了證實kfoE作為編碼K4果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的基因的功能，構(gòu)建攜帶野生型kfoE核苷酸序列的重組質(zhì)粒并導入大腸桿菌K4菌株(AkfoE),以介導喪失功能的互補。使用以下寡核苷酸擴增kfoE基因:0L172:acaacatgttactaataatgtctggttcctatgttc(SEQ ID N。 15)0L173:actggatccttatcatactgcagcctcctta(SEQ ID N。 16)使用pTrcHis 質(zhì)粒(44OObp-1nvitrogen Corporation, 5791Van Allen Way POBox6482Carlsbad, California)將擴增并凝膠純化的kfoE基因(1569bp)導入合適的克隆位點。于25°C對70ng經(jīng)NcoI和BamHI限制性酶 消化的pTrcHis載體和75ng具有相容性Pcil/BamHI消化末端的kfoE基因進行連接反應15min。然后以5yL連接混合物對50yL大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞(InvitrogenCorporation, 5791Van Allen Way PO Box6482Carlsbad, California)進行電穿孔，在含有100 μ g/mL氨芐青霉素的平板上于37°C篩選5個轉(zhuǎn)化體。純化集落后，提取構(gòu)建的質(zhì)粒pTrcHis-kfoE并通過Mfe I限制性酶消化，該酶能夠切除插入的kfoE序列內(nèi)的DNA構(gòu)建體。通過凝膠電泳分析,在Mfe I消化后,5個轉(zhuǎn)化體中的3個顯示預計的長度5887bp,且序列分析證實正確插入kfoE基因。經(jīng)證實的pTrcHis-kfoE構(gòu)建體用于通過電穿孔轉(zhuǎn)化重組大腸桿菌DSM23644,并在含有100 μ g/mL氨芐青霉素的平板上篩選轉(zhuǎn)化體。根據(jù)實施例3描述的條件培養(yǎng)篩選的轉(zhuǎn)化體，并根據(jù)Rodriguez和Jann(Eur.J.Biochem.117，117-124，F(xiàn)EBS1988)純化 K4 多糖。為了量化回收產(chǎn)物中存在的果糖，在于99°C以0.2M三氟乙酸水解Ih之前及其后測定游離果糖。使用EnzyPlus Sucrose/D-Glucose/D-Fructose試劑盒酶法測定果糖。水解后存在的游離果糖與水解前存在的游離果糖的差作為結(jié)合于起始K4分子的果糖。從以pTrcHis-kfoE轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DSM23644的培養(yǎng)物回收的產(chǎn)物顯示存在結(jié)合的果糖， 證實該菌株中缺失的糖基轉(zhuǎn)移酶活性由質(zhì)?；パa。
權(quán)利要求
1.產(chǎn)生軟骨素的重組微生物，所述軟骨素定義為由經(jīng)β1-3 (GlcUA —GalNAc)鍵和β 1-4 (GalNAc — GlcUA)鍵連接的D-糖醛酸(GlcUA)和N-乙酰-D-半乳糖胺(GalNAc)的交替殘基組成的線性糖胺聚糖，其特征在于，在所述微生物中編碼負責將果糖殘基加至線性軟骨素主鏈的酶的基因被失活。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的產(chǎn)生軟骨素的重組微生物，其中編碼負責將果糖殘基加至線性軟骨素主鏈的蛋白質(zhì)的原始存在的基因被失活，所述失活通過全部或部分缺失或取代所述基因或者通過插入另外的核苷酸序列的干擾進行。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2任一項的重組微生物，其中被失活的基因為編碼負責將果糖殘基加至線性軟骨素主鏈的蛋白質(zhì)的基因，所述蛋白質(zhì)選自: (A)包含SEQID N0 2的氨基酸序列的蛋白質(zhì)； (B)包含經(jīng)缺失、取代或插入一個或多個氨基酸修飾的SEQID N0 2的氨基酸序列且具有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)；和 (C)包含與SEQID N0 2的氨基酸序列具有至少50%同源性的氨基酸序列且具有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的重組微生物，其中被失活的基因為kfoE基因或選自以下的 DNA: (a)包含SEQID N0 I的核苷酸序列的DNA ； (b)與包含互補于SEQID N0 I的核苷酸序列的DNA雜交且編碼具有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的DNA ;和 (c)包含與SEQID N0 I的核苷酸具有至少50%同源性的核苷酸序列且編碼具有果糖基轉(zhuǎn)移酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。
5.根據(jù)權(quán)利要求3和4任一項的重組微生物，其中所述基因通過全部或部分缺失或取代其核苷酸序列，或者向其核苷酸序列插入一個或多個核苷酸而被失活。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的重組微生物，其中被失活的基因為kfoE基因。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的重組微生物，其中kfoE基因通過以卡那霉素抗性盒對其進行全部或部分取代及其后續(xù)去除、得到全部或部分缺失kfoE基因而被失活。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項的重組微生物，其來自屬于選自埃希式菌屬、嗜血桿菌屬、彎曲桿菌屬、粘球藻屬和弧菌屬的屬的細菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項的重組微生物，其中所述微生物來自屬于大腸桿菌種的細菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的重組微生物，其來自屬于2類K抗原的大腸桿菌種的血清型。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的重組微生物， 其來自大腸桿菌05:K4:H4U1-41菌株。
12.根據(jù)權(quán)利要求1-11任一項的重組微生物，其為大腸桿菌DSM23644。
13.生物技術(shù)制備軟骨素的方法，其包括以下步驟: a.在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求1一 12任一項的重組細菌 b.回收并純化微生物培養(yǎng)物中存在的軟骨素。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的生物技術(shù)制備軟骨素的方法，其中所述重組微生物為大腸桿菌DSM23644。
15.生物技術(shù)制備的軟骨素，其可通過權(quán)利要求13的方法獲得。
16.可通過權(quán)利要求13的方法獲得的權(quán)利要求15的生物技術(shù)制備的軟骨素，其中所述重組微生物為大腸桿 菌DSM23644。
全文摘要
通過培養(yǎng)重組微生物制備軟骨素，所述重組微生物通過使產(chǎn)生軟骨素的果糖基化衍生物的微生物中編碼負責將果糖殘基加至線性軟骨素多糖的酶的基因失活而獲得。
文檔編號C08B37/08GK103228781SQ201180033969
公開日2013年7月31日 申請日期2011年6月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月9日
發(fā)明者A·特里利, I·布瀉洛, S·戴利, F·巴加廷 申請人:靈知股份公司