專利名稱：分子印跡聚合物色譜柱及其制備方法與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種分子印跡聚合物色譜柱及其制備方法與應用。
背景技術：
如何從植物中快速大量分離出高活性的化合物一直是一個難題，到目前為止，只有不到10%的植物經過了系統(tǒng)的植化研究和藥理學研究(Xie JC, Chen LR, Li CX, XuXJ Selective extraction of functional components derived from herb in plasma by using amolecularly imprinted polymer based on 2,2-bis(hydroxymethyl)butanol trimethacrylate. JChromatogr B 2003,788(2) :233-242. ；Xu X:New concepts and approaches for drugdiscovery based on traditional Chinese medicine. Drug Discov Today 2006,3(3) J47-253.)。而傳統(tǒng)的植化分離方法費時費力，分離一個化合物常需數月之久。而分子印跡聚合物作為吸附劑在活性化合物分離方面表現(xiàn)出很好的前景。分子印跡聚合物是為模板分子(欲分離的化合物)量身定做的吸附材料 (AlexanderC,Andersson HSiAndersson LIiAnsell RJiKirsch N,Nicholls IA,Or Mahony J，WhitcombeMJ :Molecular imprinting science and technology :a survey of the literature for the years upto and including 2003.J Mol Recognit 2006,19(2) 106-180.)。在制備分子印跡聚合物時，首先由功能單體與模板分子通過共價或非共價的方式形成復合物，然后加入交聯(lián)劑，引發(fā)聚合形成高分子吸附劑。這種吸附劑能夠特異性的吸附模板分子及其類似物，而不管基質成分如何復雜(Xu XJ, Zhu LL, Chen LR Reparation and screening ofcompounds of biological origin using molecularly imprinted polymers. J Chromatogr B2004,804(1) :61-69.)。分子印跡聚合物吸附劑具有識別特異性、構效預定性、物理化學性能穩(wěn)定、使用壽命長等優(yōu)點，且制備簡單，成本較低(Hall A. J. , Emgenbroich Μ. , Sellergren B. Imprinted polymers. Top. Curr. Chem. ,2005,249, 317-349)。分子印跡聚合物用于復雜體系的化合物分離已經取得了很大的成績，但是傳統(tǒng)的制備方法具有以下的缺點模板分子消耗量大且回收率較低，制備過程較復雜且重復性不好，制備周期較長，傳質速度慢，吸附量小等缺點；極大的限制了 MIP在分離科學中的應用， 特別是對于一些很難得到或者量很少的天然產物分離方面應用較少，目前還沒有能夠將分子印跡聚合物用于制備規(guī)模的活性化合物分離方面的報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種分子印跡聚合物色譜柱及其制備方法與應用。本發(fā)明提供的制備分子印跡聚合物的方法，包括如下步驟1)將二氧化硅顆粒與鹽酸進行反應，反應完畢干燥，得到活化后的二氧化硅顆粒；2)將模板分子和功能單體于溶劑中混勻進行反應，反應完畢后再加入步驟1)所得活化后的二氧化硅顆粒、交聯(lián)劑和引發(fā)劑混勻進行聚合反應，反應完畢得到所述分子印跡聚合物。上述方法的所述步驟1)中，所述二氧化硅顆粒的粒徑為5-300微米，優(yōu)選60-105 微米；所述鹽酸的濃度為l-3mol/L，優(yōu)選2mol/L ；所述二氧化硅顆粒與所述鹽酸的用量比為50g 300mL;所述反應步驟中，溫度為60°C，時間為12小時；所述干燥步驟中，溫度為 120°C，時間為24小時；所述步驟2)中，所述模板分子為大黃素(也即1' 3' 8-三羥基-6-甲基蒽醌)，所述功能單體為3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTQ，所述溶劑選自四氫呋喃、甲醇和二氯甲烷中的至少一種，優(yōu)選四氫呋喃；所述交聯(lián)劑為四乙氧基硅烷(TEOS)，所述引發(fā)劑為乙酸水溶液，所述引發(fā)劑(乙酸水溶液)的濃度為0.5-2mol/L，優(yōu)選l.Omol/ L ；所述模板分子、功能單體、溶劑、步驟1)所得活化后的二氧化硅顆粒、交聯(lián)劑和引發(fā)劑的用量比為 50-500mg 5-IOmL 15_30mL 15_25g 15_20mL l_5mL，優(yōu)選 200mg 8mL 20mL 20g 16mL 2mL ；所述反應步驟中，時間為1-3小時，優(yōu)選2小時，溫度為15-30°C，優(yōu)選25°C ；所述聚合反應步驟中，時間為20-30小時，優(yōu)選M小時，溫度為 15-30°C，優(yōu)選 25°C。所述制備分子印跡聚合物的方法，還包括如下步驟在所述步驟1)反應步驟之后，所述干燥步驟之前，還對反應產物進行如下處理將所述反應產物用水洗滌至中性后， 再用無水乙醇洗滌。按照上述方法制備得到的分子印跡聚合物，也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明提供的用于制備分子印跡聚合物色譜柱的填料，是將所述分子印跡聚合物與溶劑混合得到的懸濁液。上述填料中，所述溶劑選自甲醇、水、乙醇和丙酮中的至少一種，優(yōu)選甲醇；所述分子印跡聚合物與溶劑的用量比為15-20g 20-30mL，優(yōu)選15g 25mL。本發(fā)明提供的制備分子印跡聚合物色譜柱的方法，包括如下步驟將所述填料裝填于色譜柱中，得到所述分子印跡聚合物色譜柱。所述填料中，所述分子印跡聚合物按照如下方法得到將權利要求4所述分子印跡聚合物過篩，洗滌，得到所述填料中的分子印跡聚合物；所述過篩步驟中，篩子的篩孔為300-800目，優(yōu)選500目；所述洗滌步驟中，洗滌液為由體積比為10 1的甲醇和乙酸組成的混合液，洗滌次數為5-10次，優(yōu)選5次，每次用量為50-150mL，優(yōu)選IOOmL,每次洗滌時間為1_3小時，優(yōu)選1小時；所述制備分子印跡聚合物色譜柱的方法，還包括如下步驟在所述裝填于色譜柱中步驟之后，將所得分子印跡聚合物色譜柱依次用體積比為10 1的甲醇和乙酸組成的混合液和體積比為10000 1的由甲醇和乙酸組成的混合液沖洗所述色譜柱至基線。按照上述方法制備得到的分子印跡聚合物、所述填料、所述分子印跡聚合物色譜柱在化合物的分離、提純或檢測中的應用，也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述化合物優(yōu)選大黃素；所述分離或提純大黃素的步驟中，優(yōu)選如下洗脫條件流動相為由體積比為10000 1 的由甲醇和乙酸組成的混合液，流速為1. 5mL/min，檢測波長254nm。本發(fā)明提供的制備分子印跡聚合物色譜柱的方法，可用于在制備規(guī)模分離提取植物中的有效活性成分。制備所得MIP柱能特異性的分離模板分子，且受基質成分影響不大，穩(wěn)定性很好，可連續(xù)使用較長時間。


圖1為MIP柱對大黃素及其他雜質的分離效果。圖2為MIP柱分離大黃提取液中的大黃素。圖3為MIP柱分離的大黃素粗品的HPLC檢測結果。圖4為MIP柱分離的大黃素粗品的質譜圖。圖5為大黃提取液的質譜圖。 圖6為大黃素紫外吸收與其濃度的校準曲線。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。下述方法如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所述原料如無特別說明，均為從公開商業(yè)途徑購買得到。下述實施例中所用實驗材料的購買出處大黃素(純度98%)，購于南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司；大黃購于北京同仁堂； 二氧化硅顆粒(60-105 μ m)、3-氨丙基三乙氧基硅烷、交聯(lián)劑TEOS均購于Alfa Asear (天津)有限公司；鹽酸以及冰醋酸均購于北京化工廠；甲醇、乙醇及四氫呋喃均為分析純。 C18(4. 6mm I. D. X 200mm)色譜柱購于北京迪馬科技有限公司，以及一臺Gilson分析-半制備液相色譜儀(322Pump和UV/Visl52)，色譜柱(13mm I. D. X 200mm，帶篩板)購于北京欣維爾玻璃儀器有限公司。紫外檢測儀(HD-21-B)及信號采集器(HD-A)均購于上海冀輝科學分析儀器有限公司。質譜檢測在Mariner ESI-TOF質譜儀上進行，紫外吸收檢測在722 型分光光度計上進行。實施例1l)50g粒徑為60-105 μ m的二氧化硅顆粒和300mL濃度為2mol/L的鹽酸加入到 500mL圓底燒瓶中，在60°C油浴中反應12小時，用去離子水洗滌至中性，再用無水乙醇洗滌兩次，在120°C干燥M小時，得到活化后的二氧化硅顆粒，放入保干器中備用；2)在200mL圓底燒瓶中，200mg模板分子大黃素溶于20mL四氫呋喃中，加入8mL 功能單體APTS，室溫攪拌反應池反應完畢，再向該圓底燒瓶中加入20g步驟1)所得活化的二氧化硅顆粒(60-105 μ m)，繼續(xù)攪拌濁，再加入16mL交聯(lián)劑TE0S，攪拌lh，最后加入2mL 濃度為1. Omol/L的引發(fā)劑HAc水溶液(乙酸水溶液)，于室溫攪拌聚合反應18h，反應完畢后減壓過濾，甲醇洗滌三次，過濾后晾干，得到分子印跡聚合物；3)將步驟2、所得的分子印跡聚合物用500目篩子過篩除去粒徑過小的顆粒后， 再裝入250mL圓底燒瓶中，加入IOOmL體積比為9 1的由甲醇和乙酸組成的混合液進行洗滌，每次洗滌液用量為IOOmL,每次均在室溫攪拌洗滌lh，重復五次以盡可能除去模板分子，完成后過濾，晾干，再取15g所得分子印跡聚合物在25mL甲醇中配成懸濁液，灌入色譜柱(13mm I. D. X20cm)中，依次用體積比為9 1的由甲醇和乙酸組成的混合液和體積比為10000 1的由甲醇和乙酸組成的混合液沖洗至基線，得到本發(fā)明提供的分子印跡聚合物色譜柱，該柱子平衡后即可上樣。
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色譜柱將400g大黃用體積百分比為85%的乙醇水溶液浸泡10天，過濾，濾液旋干后用50mL甲醇溶出，得到大黃提取液。將該實施例制備所得分子印跡聚合物色譜柱與紫外檢測儀相連，紫外檢測儀通過信號采集器連接到計算機后，利用該分子印跡聚合物色譜柱及HPLC色譜柱進行上述大黃提取液中大黃素的分離、鑒定及純度檢測，具體步驟如下1)將上述大黃提取液與大黃素標準品的甲醇溶液混合于該實施例制備所得分子印跡聚合物色譜柱中上樣，上樣量為0. lmL，流動相為由體積比為10000 1的由甲醇和乙酸組成的混合液，流速1. 5mL/min，檢測波長254nm，紫外檢測儀靈敏度設為0. 1。所得結果如圖1所示，在保留時間為15min時出現(xiàn)峰a，在保留時間為47min時出峰b。2)按照與上完全相同的洗脫條件，僅將所用大黃提取液單獨上樣，上樣量由原 0. ImL改為1. OmL，紫外檢測儀靈敏度由原0. 1改為2. O。所得結果如圖2所示，在保留時間為15min時出現(xiàn)峰a'，在保留時間為47min時出現(xiàn)峰b'，收集保留時間為47min的流出物380mg，備用。3)取步驟2)所得保留時間為47min的流出物適量進行HPLC和電噴霧質譜檢測，以確定該流出物中的主要成分；其中，HPLC檢測條件如下色譜柱為C18(I. D. 4. 6mmX 250mm)色譜柱，流速1. OmL/min,檢測波長254nm，流動相為甲醇-乙酸 (10000 1，ν/ν)，在 2. Omin 時開始進樣；質譜檢測條件如下噴霧電壓4800V，噴嘴溫度和離子傳輸管溫度都是140°C。所得HPLC檢測結果如圖3所示，圖3中，峰a"的保留時間為4. 9min，所得質譜檢測結果如圖4所示，m/z為沈9. 7629化合物為大黃素，由上可知，步驟1)和步驟2)中保留時間均為47min的峰a和峰a'的流出物及該步驟幻中峰a"的流出物中均含有大黃素化合物。另按照與上完全相同的質譜檢測方法對所用大黃提取液進行質譜檢測，所得結果如圖5所示。4)取步驟2)所得保留時間為47min的流出物2. 6mg溶于25mL甲醇中，稀釋五倍后用722型紫外分光光度計測量，檢測波長420nm，光程1cm，每個濃度測量三次。按照與上完全相同的檢測方法將大黃素標準品溶于甲醇中進行紫外檢測，得到圖 6所示校準曲線，該校準曲線為y = 0. 003+7. 729*x，R = O. 9999。檢測可知該流出物的紫外吸收峰強度為0.570士0.001，將其與所得標準曲線比較可知，該步驟幻所得保留時間為47min的流出物的甲醇溶液中，大黃素的濃度為 0. 0734mmol/L,即含有大黃素2. 48mg,可知步驟2)所得保留時間為47min的流出物中，大黃素的純度為95%。對照圖5所示大黃提取液的質譜圖及圖1可知，利用本發(fā)明提供的分子印跡聚合物色譜柱對大黃提取液中的大黃素及其他雜質具有非常好的分離效果，除掉了大黃提取液中的絕大部分雜質，且所得大黃素流出物的純度很高，可達95%。
權利要求
1.一種制備分子印跡聚合物的方法，包括如下步驟1)將二氧化硅顆粒與鹽酸進行反應，反應完畢干燥，得到活化后的二氧化硅顆粒；2)將模板分子和功能單體于溶劑中混勻進行反應，反應完畢后再加入步驟1)所得活化后的二氧化硅顆粒、交聯(lián)劑和引發(fā)劑混勻進行聚合反應，反應完畢得到所述分子印跡聚合物。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于所述步驟1)中，所述二氧化硅顆粒的粒徑為5-300微米，優(yōu)選60-105微米；所述鹽酸的濃度為l-3mol/L，優(yōu)選2mol/L ；所述二氧化硅顆粒與所述鹽酸的用量比為50g 300mL ；所述步驟幻中，所述模板分子為大黃素，所述功能單體為3-氨丙基三乙氧基硅烷， 所述溶劑選自四氫呋喃、甲醇和二氯甲烷中的至少一種，優(yōu)選四氫呋喃；所述交聯(lián)劑為四乙氧基硅烷，所述引發(fā)劑為乙酸水溶液，所述引發(fā)劑的濃度為0. 5-2mol/L,優(yōu)選1. Omol/ L ；所述模板分子、功能單體、溶劑、步驟1)所得活化后的二氧化硅顆粒、交聯(lián)劑和引發(fā)劑的用量比為 50-500mg 5-IOmL 15_30mL 15_25g 15_20mL l_5mL，優(yōu)選 200mg 8mL 20mL 20g 16mL 2mL ；所述反應步驟中，時間為1-3小時，優(yōu)選2小時，溫度為15-30°C，優(yōu)選25°C ；所述聚合反應步驟中，時間為20-30小時，優(yōu)選M小時，溫度為 15-30°C，優(yōu)選 25°C。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述制備分子印跡聚合物的方法，還包括如下步驟在所述步驟1)反應步驟之后，所述干燥步驟之前，還對反應產物進行如下處理將所述反應產物用水洗滌至中性后，再用無水乙醇洗滌。
4.權利要求1-3任一所述方法制備得到的分子印跡聚合物。
5.一種用于制備分子印跡聚合物色譜柱的填料，是將權利要求4所述分子印跡聚合物與溶劑混合得到的懸濁液。
6.根據權利要求5所述的填料，其特征在于所述溶劑選自甲醇、水、乙醇和丙酮中的至少一種，優(yōu)選甲醇；所述分子印跡聚合物與溶劑的用量比為15-20g 20-30mL，優(yōu)選 15g 25mL。
7.一種制備分子印跡聚合物色譜柱的方法，包括如下步驟將權利要求4或5所述填料裝填于色譜柱中，得到所述分子印跡聚合物色譜柱。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述填料中，所述分子印跡聚合物按照如下方法得到將權利要求4所述分子印跡聚合物過篩，洗滌，得到所述填料中的分子印跡聚合物；所述過篩步驟中，篩子的篩孔為300-800目，優(yōu)選500目；所述洗滌步驟中，洗滌液為由體積比為10 1的甲醇和乙酸組成的混合液，洗滌次數為5-10次，優(yōu)選5次，每次用量為 50-150mL，優(yōu)選1 OOmL，每次洗滌時間為1-3小時，優(yōu)選1小時;所述制備分子印跡聚合物色譜柱的方法，還包括如下步驟在所述裝填于色譜柱中步驟之后，將所得分子印跡聚合物色譜柱依次用體積比為10 1的甲醇和乙酸組成的混合液和體積比為10000 1的由甲醇和乙酸組成的混合液沖洗所述色譜柱至基線。
9.權利要求7-8任一所述方法制備得到的分子印跡聚合物色譜柱。
10.權利要求4所述分子印跡聚合物、權利要求5或6所述填料或權利要求9所述分子印跡聚合物色譜柱在化合物的分離、提純或檢測中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種分子印跡聚合物色譜柱及其制備方法與應用。該方法，包括如下步驟1)將二氧化硅顆粒與鹽酸進行反應，反應完畢干燥，得到活化后的二氧化硅顆粒；2)將模板分子和功能單體于溶劑中混勻進行反應，反應完畢后再加入步驟1)所得活化后的二氧化硅顆粒、交聯(lián)劑和引發(fā)劑混勻進行聚合反應，反應完畢得到分子印跡聚合物；3)將步驟2)所得分子印跡聚合物與溶劑混合得到懸濁液，裝填于色譜柱中，得到所述分子印跡聚合物色譜柱(簡稱MIP柱)。該方法，可用于在制備規(guī)模分離提取植物中的有效活性成分。制備的MIP柱能特異性的分離模板分子，且受基質成分影響不大，穩(wěn)定性很好，可連續(xù)使用較長時間。
文檔編號C08J9/26GK102344568SQ20111015542
公開日2012年2月8日 申請日期2011年6月10日 優(yōu)先權日2011年6月10日
發(fā)明者古江勇, 徐筱杰, 陳麗蓉 申請人:北京大學