專利名稱：一種分子印跡聚合物的制備方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于中藥活性成分的制備領(lǐng)域，特別涉及一種制備分子印跡聚合物的方法，及其該聚合物在精制丹參酮IIA中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
丹參具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩的功效，是治療心腦血管疾病的傳統(tǒng)中藥。丹參的化學(xué)成分主要分為脂溶性成分及水溶性成分兩大類，脂溶性成分主要為二萜類化合物，如丹參酮IIA、隱丹參酮、丹參酮I等。丹參酮類化合物為脂溶性主要成分，在生物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物表現(xiàn)出多種藥理作用，對心腦血管疾病、肝炎、白血病等具有潛在的治療作用。有關(guān)丹參酮的精制工藝文獻(xiàn)報(bào)道很多，主要有乙醇回流或者滲漉法和超臨界CO2 萃取法等。以上方法從提取原理上，都是利用相似相溶的原理，反復(fù)進(jìn)行溶解、結(jié)晶、沉淀等步驟最終達(dá)到純化的效果。由于以上方法選擇性不強(qiáng)，而丹參中丹參酮等一類脂溶性的成分都具有相似的物化性質(zhì)，結(jié)構(gòu)類似物的雜質(zhì)偏高，丹參酮IIA的含量相對來說偏低。加之需經(jīng)過多步操作，耗時(shí)耗力，因此不是足夠理想的方法。分子印跡技術(shù)是一種新型的技術(shù)，應(yīng)用此技術(shù)可以有針對性地采用不同模板合成針對不同化合物的分子印跡聚合物。由于在合成過程中加入模板分子，和功能單體形成相互作用的復(fù)合物，然后再加入交聯(lián)劑在引發(fā)劑的作用下引發(fā)聚合反應(yīng)，形成高分子的聚合物，之后通過研磨，洗脫等工序除去模板分子，得到具有模板分子三維空穴的聚合物，這種聚合物因此對模板分子具有特異性的識別能力。因其制備簡單，性質(zhì)穩(wěn)定，耐高溫，耐酸堿， 耐有機(jī)溶劑等優(yōu)點(diǎn)使其在色譜分離以及固相萃取等領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用。近年來，已經(jīng)開始用于中藥活性成分的分離。分子印跡技術(shù)在丹參分離上的應(yīng)用，有報(bào)道的是樂康等人利用丹參酮IIA為模板，甲基丙烯酸為單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)為交聯(lián)劑，比例為1 4 M熱聚合合成了分子印跡聚合物(華西藥學(xué)雜志，2009，M (5) :443 445)。但是該實(shí)驗(yàn)中所述的吸附等溫線測定所使用的模板分子的溶液濃度明顯過大，我們經(jīng)測試實(shí)驗(yàn)無法重復(fù)，故對其結(jié)果的可信性表示審慎的懷疑。另有中國發(fā)明專利申請201010167614.0提出一種芯-殼結(jié)構(gòu)復(fù)合納米表面分子印跡聚合物的制備方法，該方法制備過程復(fù)雜，成本高，不利于大規(guī)模制備和應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種分子印跡聚合物的精制方法，以丹參酮IIA為模板，制備方法主要包括下列步驟(1)將丹參酮IIA、一種或幾種功能單體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑、致孔劑按一定配比混合制成均相體系，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，于聚合4- 小時(shí)。(2)將步驟(1)制備的材料磨成粉末，過篩后先用醇類溶劑浸泡、清洗，然后用醇與有機(jī)酸的混合溶液進(jìn)行洗脫，直至紫外檢查洗脫液中不含丹參酮IIA分子，得到所述目標(biāo)分子印跡聚合物。其中，所述單體有多種選擇，包括丙烯酸類(例如甲基丙烯酸、甲基丙烯酸酯類、 丙烯酸或丙烯酸酯類)、吡啶類、酰胺類和其他類單體等。優(yōu)選的是酰胺類和吡啶類，更優(yōu)選的是丙烯酰胺(AM)、2-乙烯基吡啶Q-VP)和甲基丙烯酸(MAA)。常用的交聯(lián)劑，包括三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)、二乙烯基苯(DVB)、3，5-二(丙烯酰胺)苯甲酸等；優(yōu)選的是乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)和三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)。本發(fā)明中所述的致孔劑可采用二氯甲烷、氯仿、乙腈、乙酸乙酯、乙醇或甲醇；優(yōu)選的是二氯甲烷和乙腈。本發(fā)明中所用的引發(fā)劑一般為有機(jī)過氧化物或偶氮化合物；優(yōu)選為偶氮二異丁腈 (AIBN)。步驟(1)中功能單體與丹參酮IIA的物質(zhì)的量比為3-8 1 ；交聯(lián)劑與參酮IIA 的物質(zhì)的量比為12-30 1;交聯(lián)劑與功能單體的物質(zhì)的量比為2-5 1;致孔劑用量為 6-15mL/mmol丹參酮IIA ；引發(fā)劑用量為60-200mg/mmol丹參酮IIA。本發(fā)明步驟(1)采用熱引發(fā)聚合，反應(yīng)方式將反應(yīng)物用超聲混合均勻后，加入到容器中，通入3-5分鐘的氮?dú)夂竺荛]聚合。反應(yīng)條件為于55-75°C聚合4- 小時(shí)。聚合反應(yīng)完成后，所得到的聚合物中含有模板分子，需要經(jīng)過清洗除去模板分子才可以使用。步驟( 中所述醇類溶劑為甲醇或乙醇溶劑；所述有機(jī)酸為乙酸或甲酸；所述醇與有機(jī)酸的混合溶液中醇與有機(jī)酸的體積比為20-5 1 ；所述洗脫方法為索式提取或者浸泡抽濾。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述方法獲得的分子印跡聚合物在精制丹參酮IIA 中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的分子印跡聚合物可以作為固相萃取材料來分離純化丹參乙醇粗提物中的丹參酮IIA。該方法通過以下步驟實(shí)現(xiàn)將所述的分子印跡聚合物裝柱，然后將樣品溶液過柱，用醇類溶劑清洗去雜質(zhì)后洗脫、收集精制的丹參酮IIA。本發(fā)明所述樣品溶液為丹參藥材提取液或丹參粗提物的溶液或含有丹參酮IIA的其他溶液。其中，去雜質(zhì)所用洗脫劑為體積比為10-0. 5 1的乙醇或甲醇與水的混合溶液； 洗脫、收集丹參酮IIA所用洗脫劑為體積比為100-50 5-50 1的乙醇或甲醇與水、乙酸的混合溶液。本發(fā)明以丹參酮IIA為模板分子，制備的分子印跡聚合物在含水流動(dòng)相中對丹參酮IIA表現(xiàn)出了很好的親和性和選擇性，使其作為一種使其作為一種特異性的分離材料在對中藥中丹參酮IIA的分離、富集和提純方面有著廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明采用分子印跡技術(shù)，制備出一種新型的對丹參酮IIA具有特異選擇性的分離介質(zhì)，從而達(dá)到選擇性分離的效果。本發(fā)明雖然使用的也是熱聚合的引發(fā)方式，但是本發(fā)明合成時(shí)只需一步混合，較此文獻(xiàn)報(bào)道的方法在制備過程上明顯簡化，大大的節(jié)省了所需時(shí)間，并且所用單體也不相同， 對聚合物的應(yīng)用本發(fā)明嘗試了多種條件，確定采用了水相洗脫系統(tǒng)，使其實(shí)際應(yīng)用范圍明顯擴(kuò)大，效果也明顯優(yōu)于以上文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果。


附圖1是實(shí)施實(shí)例8的上樣液的HPLC譜圖。附圖2是實(shí)施實(shí)例8的萃取之后的萃余液的HPLC譜圖。附圖3是實(shí)施實(shí)例8的60%除雜的除雜液的HPLC譜圖。附圖4是實(shí)施實(shí)例8的95%除雜的除雜液的HPLC譜圖。附圖5是實(shí)施實(shí)例8的洗脫液的HPLC譜圖。附圖6是實(shí)施實(shí)例8的模板分子對照品的HPLC譜圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明結(jié)合附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例1稱取0. 5mmol模板分子丹參酮IIA、2. 5mmol功能單體甲基丙烯酸(MAA) UOmmol 交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)、0.05g引發(fā)劑偶氮二異丁腈(AIBN)、5mL致孔劑氯仿，置于50mL磨口圓底燒瓶中，超聲IOmin至混合均勻。冰浴中通氮?dú)釯Omin后密封；置 60°C恒溫水浴箱中聚合Mh，得到紅色棒狀聚合物。將聚合物取出，用甲醇浸泡后干燥，過篩。先用2X IOOmL甲醇超聲洗滌，抽濾，再用5X IOOmLl甲醇乙酸(V V = 9 1)的混合溶液超聲清洗，離心，棄去上層洗滌液，再用4X IOOmL甲醇超聲洗滌，抽濾，反復(fù)洗至紫外270nm下無模板分子檢出為止，置真空干燥箱中干燥至恒重，得到丹參酮IIA分子印跡聚合物，MIPl。實(shí)施例2稱取0. 5mmol模板分子丹參酮IIA、2. 5mmol功能單體2-乙烯基吡啶Q-VP)、 IOmmol交聯(lián)劑三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)、0. 05g引發(fā)劑偶氮二異丁腈(AIBN)、 5mL致孔劑二氯甲烷，置于50mL磨口圓底燒瓶中，超聲IOmin至混合均勻。冰浴中通氮?dú)?IOmin后密封；置65°C恒溫水浴箱中聚合他，得到紅色棒狀聚合物。將聚合物取出，用甲醇浸泡后干燥，過篩。先用2 X IOOmL甲醇超聲洗滌，抽濾，再用6 X IOOmL甲醇乙酸(V V =9 1)的混合溶液超聲清洗，離心，棄去上層洗滌液，再用5X100mL甲醇超聲洗滌，抽濾，反復(fù)洗至紫外270nm下無模板分子檢出為止，置真空干燥箱中干燥至恒重，得到丹參酮 IIA分子印跡聚合物，MIP2。實(shí)施例3稱取0. 5mmol模板分子丹參酮IIA、2. 5mmol功能單體丙烯酰胺(AM)、IOmmol交聯(lián)劑三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)、0. 05g引發(fā)劑偶氮二異丁腈(AIBN)、5mL致孔劑乙腈，置于50mL磨口圓底燒瓶中，超聲IOmin至混合均勻。冰浴中通氮?dú)釯Omin后密封；置 60°C恒溫水浴箱中聚合12h，得到紅色棒狀聚合物。將聚合物取出，用甲醇浸泡后干燥，過篩。先用2X IOOmL甲醇超聲洗滌，抽濾，再用6X IOOmL甲醇乙酸(V V = 8. 5 1. 5) 的混合溶液超聲清洗，離心，棄去上層洗滌液，再用5X100mL甲醇超聲洗滌，抽濾，反復(fù)洗至紫外270nm下無模板分子檢出為止，置真空干燥箱中干燥至恒重，得到丹參酮IIA分子印跡聚合物，MIP3。實(shí)施例4稱取0. 5mmol模板分子丹參酮IIA、4mmol功能單體甲基丙烯酸(MAA)、20mmol交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)、0.04g引發(fā)劑偶氮二異丁腈(AIBN)、6mL致孔劑氯仿， 置于50mL磨口圓底燒瓶中，超聲IOmin至混合均勻。冰浴中通氮?dú)釯Omin后密封；置55°C 恒溫水浴箱中聚合Mh，得到紅色棒狀聚合物。將聚合物取出，用甲醇浸泡后干燥，過篩。先用3 X IOOmL甲醇超聲洗滌，抽濾，再用7 X IOOmL甲醇乙酸(V V = 8. 5 1. 5)的混合溶液超聲清洗，離心，棄去上層洗滌液，再用5X100mL甲醇超聲洗滌，抽濾，反復(fù)洗至紫外 270nm下無模板分子檢出為止，置真空干燥箱中干燥至恒重，得到丹參酮IIA分子印跡聚合物，MIP4。實(shí)施例5稱取0. 5mmol模板分子丹參酮IIA、4mmol功能單體2_乙烯基吡啶O-VP)、20mmol 交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)、0.04g引發(fā)劑偶氮二異丁腈(AIBN)、6mL致孔劑氯仿，置于50mL磨口圓底燒瓶中，超聲IOmin至混合均勻。冰浴中通氮?dú)釯Omin后密封；置 55°C恒溫水浴箱中聚合Mh，得到紅色棒狀聚合物。將聚合物取出，用甲醇浸泡后干燥，過篩。先用3X IOOmL甲醇超聲洗滌，抽濾，再用7 X IOOmL甲醇乙酸(V V = 8. 5 1. 5) 的混合溶液超聲清洗，離心，棄去上層洗滌液，再用5X100mL甲醇超聲洗滌，抽濾，反復(fù)洗至紫外270nm下無模板分子檢出為止，置真空干燥箱中干燥至恒重，得到丹參酮IIA分子印跡聚合物，MIP5。實(shí)施例6稱取0. 5mmol模板分子丹參酮IIA、3mmol功能單體2_乙烯基吡啶O-VP)、15mmol 交聯(lián)劑三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)、0.08g引發(fā)劑偶氮二異丁腈(AIBN)、5mL致孔劑二氯甲烷，置于50mL磨口圓底燒瓶中，超聲IOmin至混合均勻。冰浴中通氮?dú)釯Omin 后密封；置55°C恒溫水浴箱中聚合Mh，得到紅色棒狀聚合物。將聚合物取出，用甲醇浸泡后干燥，過篩。先用4X IOOmL甲醇超聲洗滌，抽濾，再用SXlOOmL甲醇乙酸(V V = 8.5 1. 的混合溶液超聲清洗，離心，棄去上層洗滌液，再用5 X IOOmL甲醇超聲洗滌，抽濾，反復(fù)洗至紫外270nm下無模板分子檢出為止，置真空干燥箱中干燥至恒重，得到丹參酮 IIA分子印跡聚合物，MIP6。實(shí)施例7使用一種以上混合功能單體合成MIP稱取0. 5mmol模板分子丹參酮IIA、2mmol功能單體2-乙烯基吡啶Q-VP)和2mmol 功能單體甲基丙烯酸(MAA)、20mmol交聯(lián)劑乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)、0. 06g引發(fā)劑偶氮二異丁腈(AIBN)、6mL致孔劑氯仿，置于50ml磨口圓底燒瓶中，超聲IOmin至混合均勻。 冰浴中通氮?dú)釯Omin后密封；置55°C恒溫水浴箱中聚合Mh，得到紅色棒狀聚合物。將聚合物取出，用甲醇浸泡后干燥，過篩。先用3 X IOOmL甲醇超聲洗滌，抽濾，再用8 X IOOmL甲醇乙酸(V V = 8.5 1.5)的混合溶液超聲清洗，離心，棄去上層洗滌液，再用5 X IOOml 甲醇超聲洗滌，抽濾，反復(fù)洗至紫外270nm下無模板分子檢出為止，置真空干燥箱中干燥至恒重，得到丹參酮IIA分子印跡聚合物，MIP7。實(shí)施例8以上分子印跡聚合物(MIP)對目標(biāo)分子的吸附性能考察將0.03g本發(fā)明分子印跡聚合物以及其空白對照聚合物浸泡在5mL濃度為 0. 5mmol/L的丹參酮IIA甲醇溶液中，室溫下振蕩12h，使其達(dá)到吸附平衡。HPLC檢測吸附后溶液中的丹參酮IIA的濃度，計(jì)算吸附量。結(jié)果列于表1。結(jié)果表明，本發(fā)明分子印跡聚合物對于目標(biāo)分子具有較大的吸附量。而空白聚合物(即除了不加入模板分子，其余條件相同合成的聚合物)則吸附量較小。由此可見，此分子印跡聚合物對模板分子具有高選擇性。表1.實(shí)施實(shí)例1-6中不同分子印跡聚合物(MIP)對目標(biāo)分子的吸附性能考察結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種丹參酮IIA的分子印跡聚合物的精制方法，其特征在于，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)將丹參酮IIA、一種或幾種功能單體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑、致孔劑混合制成均相體系， 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，于55-75°C聚合4-M小時(shí)，所述功能單體與丹參酮IIA的物質(zhì)的量比為 3-8 1;所述交聯(lián)劑與丹參酮IIA的物質(zhì)的量比為12-30 1 ；交聯(lián)劑與功能單體的物質(zhì)的量比為2-5 1 ；致孔劑用量為6-15mL/mmol丹參酮IIA ；引發(fā)劑用量為60-200mg/mmol 丹參酮IIA。(2)將步驟(1)制備的材料磨成粉末，過篩，先用醇類溶劑浸泡、清洗，然后用醇與有機(jī)酸的混合溶液進(jìn)行洗脫，直至紫外檢查洗脫液中不含丹參酮IIA，得到分子印跡聚合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種丹參酮IIA的分子印跡聚合物的精制方法，其特征在于 步驟⑴所述功能單體為甲基丙烯酸、2-乙烯基吡唆、甲基丙烯酸二乙胺乙基酯、丙烯酰胺或4-乙烯基吡啶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種丹參酮IIA的分子印跡聚合物的精制方法，其特征在于 步驟(1)所述交聯(lián)劑為三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯或3，5-二(丙烯酰胺)苯甲酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種丹參酮IIA的分子印跡聚合物的精制方法，其特征在于 步驟(1)所述致孔劑為二氯甲烷、氯仿、乙腈、乙酸乙酯、乙醇或甲醇。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種丹參酮IIA的分子印跡聚合物的精制方法，其特征在于 步驟(1)所述引發(fā)劑為有機(jī)過氧化物或偶氮化合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種丹參酮IIA的分子印跡聚合物的精制方法，其特征在于 步驟(1)采用熱引發(fā)聚合，將反應(yīng)物用超聲混合均勻后，加入到容器中，通入3-5分鐘的氮?dú)夂竺荛]聚合，反應(yīng)條件為于55-75°C聚合4- 小時(shí)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種丹參酮IIA的分子印跡聚合物的精制方法，其特征在于 步驟( 所述醇類溶劑為甲醇或乙醇溶劑；所述有機(jī)酸為乙酸或甲酸；所述醇與有機(jī)酸的混合溶液中醇與有機(jī)酸的體積比為20-8 1 ；所述洗脫方法為索式提取或者浸泡抽濾。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法獲得的分子印跡聚合物在精制丹參酮IIA中的應(yīng)用，其特征在于，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)將所述的分子印跡聚合物裝柱，然后將樣品溶液過柱，去雜質(zhì)后洗脫、收集精制的丹參酮IIA。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于去除雜質(zhì)所用洗脫劑的體積比為10-0.5 1的乙醇或甲醇與水的混合溶液；洗脫、收集所用洗脫劑為體積比為 100-50 5-50 1的乙醇或甲醇與水、乙酸的混合溶液。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述樣品溶液為丹參藥材提取液或丹參粗提物的溶液或含有丹參酮IIA的其他溶液。
全文摘要
本發(fā)明提供一種分子印跡聚合物的精制方法，以丹參酮IIA為模板，與功能單體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑、致孔劑混合制成均相體系，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下聚合，然后將制備的材料磨成粉末過篩，用醇類溶劑浸泡、清洗、洗脫，獲得。本發(fā)明制備的分子印跡聚合物在含水流動(dòng)相中對丹參酮IIA表現(xiàn)出很好的親和性和選擇性，使其作為一種使其作為一種特異性的分離材料在對中藥中丹參酮IIA的分離、富集和提純方面有著廣闊的應(yīng)用前景。本發(fā)明合成時(shí)只需一步混合，制備過程明顯簡化，節(jié)省時(shí)間，采用水相洗脫系統(tǒng)，使應(yīng)用范圍擴(kuò)大，洗脫效果明顯。本發(fā)明提供的分子印跡聚合物可以作為固相萃取材料來分離純化丹參乙醇粗提物中的丹參酮IIA。
文檔編號C08F226/06GK102167777SQ20101061325
公開日2011年8月31日 申請日期2010年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月22日
發(fā)明者周長新, 王真真, 甘禮社 申請人:浙江大學(xué)