專利名稱：纖維素衍生物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及特定結(jié)構(gòu)的纖維素衍生物、含有特定結(jié)構(gòu)的纖維素衍生物和磷脂的組合物、它們的制備方法、以及含有該衍生物或該組合物的防粘連材料。

背景技術(shù)：
生物體組織的粘連是由于受到損傷的器官表面再生時與其它的組織結(jié)合而產(chǎn)生的。因此，為了防止手術(shù)后的粘連，提出了使用生物相容性的材料即纖維素等多糖類的各種防粘連材料。
例如，提出了利用羧甲基纖維素的水溶液的防粘連材料(Am J Surg.，169，154-159(1995))。但是，該防粘連材料在體內(nèi)的滯留性低，不能充分發(fā)揮防止的粘連效果。因此，進(jìn)行了用各種方法修飾多糖類或使其不溶于水的嘗試。
例如，提出了用碳化二亞胺修飾透明質(zhì)酸和羧甲基纖維素的防粘連材料(國際公開WO92/000105號小冊子、國際公開WO92/020349號小冊子)。此外，提出了將用特定的取代基取代纖維素的氫原子而成的纖維素衍生物作為主要成分的防粘連材料(日本特開平1-301624號公報)。進(jìn)一步地，提出了含有用磷脂酰乙醇胺修飾的透明質(zhì)酸化合物的防粘連材料(日本特開2006-296916號公報) 此外，美國專利第5064817號說明書中記載了使低分子量的羧甲基纖維素與磷脂酰乙醇胺在水溶劑中反應(yīng)得到磷脂酶A2抑制劑組合物的反應(yīng)。不過由后述的比較例5所示可知，該反應(yīng)條件下未生成目標(biāo)化合物。
國際公開WO2001/046265號小冊子中記載了包括使聚陰離子性多糖類與活性劑在含有水相溶性有機溶劑的水溶液中反應(yīng)而成的水不溶性的生物相容性凝膠，作為聚陰離子性多糖類，可以舉出羧甲基纖維素。
但是，任意一種提案都存在對防粘連效果、操作性、安全性進(jìn)行進(jìn)一步研究的余地。如上所述，雖然暗示將磷脂導(dǎo)入到纖維素，但是對于具有防粘連效果、易操作的水凝膠未有任何研究。
此外，日本特開平9-296005號公報中記載了若將含有疏水性基團(tuán)的修飾基團(tuán)導(dǎo)入到多糖類中，則不會使多糖類凝膠化，而可以實現(xiàn)粘度的增大以及生物體內(nèi)穩(wěn)定性的提高。但是，關(guān)于對得到本發(fā)明的防粘連效果有用的纖維素衍生物或含有其的組合物未有記載或暗示。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供可以作為醫(yī)用材料的纖維素衍生物或含有該衍生物的組合物。特別是提供在形成水凝膠時，具有適當(dāng)?shù)膹椥阅Ａ亢驼硰椥?，可以作為防粘連材料的纖維素衍生物或含有該衍生物的組合物，特別是提供體內(nèi)的滯留性優(yōu)異的凝膠狀的防粘連材料。進(jìn)一步地，本發(fā)明的目的是提供該纖維素衍生物或含有該衍生物的組合物的制備方法。
本發(fā)明人對用安全性優(yōu)異的材料修飾纖維素，增大粘彈性，提高生物體內(nèi)的滯留性，具有適當(dāng)?shù)恼硰椥?，提高防粘連效果的組成進(jìn)行了深入研究。結(jié)果本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，若用來源于生物體的物質(zhì)磷脂酰乙醇胺取代羧甲基纖維素側(cè)鏈上的一部分氫原子，則得到可以形成具有適當(dāng)?shù)恼硰椥裕梢杂米鞣勒尺B材料，且可以通過注射器注入的水凝膠的新型纖維素衍生物。本發(fā)明人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，通過使該纖維素衍生物與特定量的磷脂共存，也得到具有適當(dāng)?shù)恼硰椥?，可以用作防粘連材料的纖維素衍生物組合物。
即，本發(fā)明是含有下式所示的重復(fù)單元的纖維素衍生物。

式中，R1、R2和R3各自獨立地選自下式(a)、(b)、(c)和(d)中， -H(a) -CH2-COOH (b) -CH2-COOX (c)
式(c)中，X為堿金屬或堿土金屬， 式(d)中，R4和R5各自獨立地是碳原子數(shù)為9～27的烷基或烯基， (b)和(c)的總?cè)〈葹?.3～2.0， (d)的取代度為0.001～0.05。
其中，本說明書中的取代度指的是(a)、(b)、(c)和(d)的總當(dāng)量為3時各取代基的數(shù)目。
此外，本發(fā)明為含有上述纖維素衍生物和下式所示的磷脂，纖維素衍生物的重復(fù)單元的摩爾當(dāng)量與磷脂的摩爾當(dāng)量之比為1∶0.05～1∶1的纖維素衍生物組合物。

式中，R6和R7各自獨立地是碳原子數(shù)為9～27的烷基或烯基，R8為-NH3+或-N(CH3)3+。
此外，本發(fā)明是本發(fā)明的纖維素衍生物的制備方法，該方法包括將含有下式所示的重復(fù)單元、分子量為5×103～5×106的羧甲基纖維素
與下式所示的磷脂酰乙醇胺，
以相對于羧甲基纖維素的羧基100當(dāng)量，磷脂酰乙醇胺為0.1～100當(dāng)量的比率，溶解由水和與水相溶的有機溶劑構(gòu)成、水含量為20～70容量％的混合溶劑中，使它們在縮合劑的存在下反應(yīng)的步驟。
其中，R1、R2和R3各自獨立地選自下式(a)、(b)和(c)中， -H (a) -CH2-COOH(b) -CH2-COOX(c) 式(c)中，X為堿金屬或堿土金屬， 式(b)和(c)的總?cè)〈葹?.3～2.0， R4和R5各自獨立地是碳原子數(shù)為9～27的烷基或烯基。
此外，本發(fā)明為上述纖維素衍生物組合物的制備方法，該方法包括使用含有水和與水相溶的有機溶劑的混合溶劑，將通過上述制備方法得到的纖維素衍生物與下式所示的磷脂混合，然后除去溶劑的步驟。

式中，R6和R7各自獨立地是碳原子數(shù)為9～27的烷基或烯基，R8為-NH3+或-N(CH3)3+。
進(jìn)一步地，本發(fā)明是含有上述纖維素衍生物或纖維素衍生物組合物的防粘連材料。
進(jìn)一步地，本發(fā)明是相對于水100重量份，含有上述纖維素衍生物0.1～1.5重量份的可以注入的水凝膠。
進(jìn)一步地，本發(fā)明為相對于水100重量份，含有上述纖維素衍生物組合物0.1～5.0重量份的可以注入的水凝膠。
本發(fā)明的纖維素衍生物形成具有適當(dāng)?shù)膹椥阅Ａ亢驼硰椥缘乃z，無色透明，即使?jié)舛鹊鸵簿哂行纬赡z所需的充分的粘彈性，可以使用注射器等具有細(xì)管的器具注入。通過本發(fā)明的制備方法，可以有效地制備上述纖維素衍生物。
本發(fā)明的纖維素衍生物組合物，若溶解在水中則形成具有適當(dāng)?shù)膹椥阅Ａ亢驼硰椥缘乃z，可以用作醫(yī)療用的可注入凝膠或防粘連材料。本發(fā)明的纖維素衍生物組合物由于含有來源于生物體的物質(zhì)即磷脂酰乙醇胺類或磷脂酰膽堿類，因此是安全的。本發(fā)明的纖維素衍生物組合物，通過向用磷脂酰乙醇胺取代的纖維素衍生物中添加游離的磷脂酰乙醇胺類或磷脂酰膽堿類，可以形成具有適當(dāng)?shù)膹椥阅Ａ亢驼硰椥缘乃z。通過本發(fā)明的制備方法，可以有效地制備上述纖維素衍生物組合物。
本發(fā)明的防粘連材料在體內(nèi)的滯留性優(yōu)異，防粘連效果優(yōu)異。此外，本發(fā)明的凝膠狀防粘連材料具有充分的柔軟性和粘彈性，操作性優(yōu)異，可以適用于形狀復(fù)雜的部位，也可以適用于使用內(nèi)窺鏡的手術(shù)中。



圖1是表示纖連蛋白和水凝膠+纖連蛋白的滴以及纖連蛋白覆蓋整個培養(yǎng)皿的簡圖。

具體實施例方式 <纖維素衍生物> 本發(fā)明是含有下式所示的重復(fù)單元的纖維素衍生物。

式中，R1、R2和R3各自獨立地選自下式(a)、(b)、(c)和(d)中， -H (a) -CH2-COOH(b) -CH2-COOX(c)
(對(d)中的不對稱碳原子的立體異構(gòu)不特別限定)。
式(c)中，X為堿金屬或堿土金屬， 式(d)中，R4和R5各自獨立地是碳原子數(shù)為9～27的烷基或烯基， (b)和(c)的總?cè)〈葹?.3～2.0， (d)的取代度為0.001～0.05。
作為上述X的堿金屬，優(yōu)選為鈉、鉀、鋰等，作為堿土金屬，優(yōu)選為鎂、鈣等。
優(yōu)選式(d)中的R4和R5都是碳原子數(shù)為9～19的烯基。其中，優(yōu)選R4CO-和/或R5CO-為油酰基，特別優(yōu)選R4CO-和R5CO-為油?；?br> (b)和(c)的總?cè)〈葹?.3～2.0，優(yōu)選為0.5～1.8，更優(yōu)選為0.6～1.5。對(b)和(c)的比率不特別限定，從在水中的溶解性方面考慮，優(yōu)選存在的(c)比(b)多。
(d)的取代度為0.001～0.05，優(yōu)選為0.005～0.03。
通過將(d)的取代度控制在該范圍內(nèi)，可以得到具有適當(dāng)?shù)恼硰椥?、可以使用注射器等具有?xì)管的器具注入的凝膠。(d)的取代度通過利用元素分析進(jìn)行的磷的定量分析求得。磷的元素分析中，將纖維素衍生物用適當(dāng)?shù)乃嵝运芤核夂?，對于游離的磷離子可以利用通過磷-鉬法等的顯色進(jìn)行的吸光分光或IPC等發(fā)光分析。
此外，本發(fā)明纖維素衍生物的優(yōu)選重均分子量為5×103～5×106，更優(yōu)選為5×104～5×106，進(jìn)一步優(yōu)選為5×104～1×106。纖維素衍生物的重均分子量由于通過式(d)所示的基團(tuán)的導(dǎo)入而增大，可以通過適當(dāng)選擇作為原料的羧甲基纖維素的分子量來得到具有目標(biāo)分子量的纖維素衍生物。
<纖維素衍生物組合物> 本發(fā)明是含有上述纖維素衍生物和下式所示的磷脂，纖維素衍生物的重復(fù)單元的摩爾當(dāng)量與磷脂的摩爾當(dāng)量之比為1∶0.05～1∶1的纖維素衍生物組合物。

式中，R6和R7各自獨立地是碳原子數(shù)為9～27的烷基或烯基，R8為-NH3+或-N(CH3)3+。
對于作為上述本發(fā)明纖維素衍生物組合物的構(gòu)成成分的纖維素衍生物，適合使用作為上述本發(fā)明的纖維素衍生物優(yōu)選的例子舉出的物質(zhì)。
即，作為X的堿金屬，優(yōu)選為鈉、鉀、鋰等，作為堿土金屬，優(yōu)選為鎂、鈣等。優(yōu)選式(d)中的R4和R5都是碳原子數(shù)為9～19的烯基，其中，優(yōu)選R4CO-和/或R5CO-為油酰基，特別優(yōu)選R4CO-和R5CO-為油?；?。
作為上式所示的磷脂中的R6和R7，優(yōu)選都是碳原子數(shù)為9～19的烯基，其中，優(yōu)選R6CO-和/或R7CO-為油?；?，特別優(yōu)選R6CO-和R7CO-為油?；?。
此外，作為R8，優(yōu)選為-NH3+。
此外，作為本發(fā)明的纖維素衍生物組合物，優(yōu)選R4、R5、R6和R7都相同，其中，優(yōu)選R4CO-、R5CO-、R6CO-和R7CO-都為油?；顑?yōu)選同時R8為-NH3+。
<纖維素衍生物的制備方法> 上述本發(fā)明的纖維素衍生物可以通過下述方法制備，該方法包括將含有下式所示的重復(fù)單元、分子量為5×103～5×106的羧甲基纖維素
與下式所示的磷脂酰乙醇胺，
以相對于羧甲基纖維素的羧基(即，(b)+(c)的總?cè)〈?100當(dāng)量，磷脂酰乙醇胺為0.1～100當(dāng)量的比率，溶解由水和與水相溶的有機溶劑構(gòu)成、并且水含量為20～70容量％的混合溶劑中，使它們在縮合劑的存在下反應(yīng)的步驟。
其中，R1、R2和R3各自獨立地選自下式(a)、(b)和(c)中， -H (a) -CH2-COOH(b) -CH2-COOX(c) 式(c)中，X為堿金屬或堿土金屬， 式(b)和(c)的總?cè)〈葹?.3～2.0， R4和R5各自獨立地是碳原子數(shù)為9～27的烷基或烯基。
作為上述原料的羧甲基纖維素，優(yōu)選分子量為5×103～5×106，更優(yōu)選為5×104～5×106，進(jìn)一步優(yōu)選為5×104～1×106。
作為上述原料的羧甲基纖維素，例如可以將紙漿(pulp)用氫氧化鈉溶液溶解，用單氯乙酸或其鈉鹽醚化，并進(jìn)行純化來制備。
作為上式(c)中的X的堿金屬，優(yōu)選為鈉、鉀、鋰等，作為堿土金屬，優(yōu)選為鎂、鈣等。
(b)和(c)的總?cè)〈葹?.3～2.0，優(yōu)選為0.5～1.8，更優(yōu)選為0.6～1.5。對(b)和(c)的比率不特別限定，但是從在水中的溶解性方面考慮，優(yōu)選存在的(c)比(b)多。
作為原料優(yōu)選的羧甲基纖維素的具體結(jié)構(gòu)式如下式所示。纖維素骨架中的羧甲基的取代位置優(yōu)選為C-6位。

本發(fā)明的纖維素衍生物的制備方法中使用的上式所示的磷脂酰乙醇胺中，R4和R5各自獨立地是碳原子數(shù)為9～27的烷基或烯基。作為R4和R5，優(yōu)選都是碳原子數(shù)為9～27的烯基，其中，優(yōu)選R4CO-和/或R5CO-為油?；貏e優(yōu)選R4CO-和R5CO-為油?；?br> 作為上述原料的磷脂酰乙醇胺，可以使用從動物組織提取的磷脂酰乙醇胺或合成制備的磷脂酰乙醇胺中的任意一種。作為磷脂酰乙醇胺，可以舉出例如，二月桂?；字Ｒ掖及?、二肉豆蔻?；字Ｒ掖及贰⒍貦磅；字Ｒ掖及贰⒍仓；字Ｒ掖及贰⒍ㄉ；字Ｒ掖及?diarachidoyl phosphatidylethanolamine)、二(二十二烷?；?磷脂酰乙醇胺(dibehenoyl phosphatidylethanolamine)、二(二十四烷酰基)磷脂酰乙醇胺(dilignoceroyl phosphatidylethanolamine)、二(二十六烷?；?磷脂酰乙醇胺(dicerotoyl phosphatidylethanolamine)、二(二十八烷?；?磷脂酰乙醇胺(dimontanoyl phosphatidylethanolamine)、月桂油?；字Ｒ掖及?lauroleoyl phosphatidylethanolamine)、肉豆蔻油?；字Ｒ掖及?myristoleoyl phosphatidylethanolamine)、棕櫚油酰基磷脂酰乙醇胺(palmitoleoyl phosphatidylethanolamine)、二油?；字Ｒ掖及?、二(二十四烷?；?磷脂酰乙醇胺(dinervonoyl phosphatidylethanolamine)、二亞油?；字Ｒ掖及?dilinoleoyl phosphatidylethanolamine)、二亞麻?；字Ｒ掖及?dilinolenoyl phosphatidylethanolamine)、二(三磷酰基)磷脂酰乙醇胺(dihiragonoyl phosphatidylethanolamine)、二花生四烯?；字Ｒ掖及?diarachidonoyl phosphatidylethanolamine)、二(二十二碳六烯?；?磷脂酰乙醇胺(didocosahexaenoyl phosphatidylethanolamine)。其中，從在合成時使用的有機溶劑中的溶解性方面考慮，優(yōu)選為二(油?；?磷脂酰乙醇胺。
認(rèn)為磷脂酰乙醇胺是來源于生物體的安全物質(zhì)，在本發(fā)明的纖維素衍生物中，提高纖維素衍生物分子間的疏水性相互作用，結(jié)果是，本發(fā)明的纖維素衍生物由于這些疏水性相互作用形成水凝膠。
作為本發(fā)明纖維素衍生物的原料的羧甲基纖維素與磷脂酰乙醇胺，以相對于羧甲基纖維素的羧基100當(dāng)量、磷脂酰乙醇胺為0.1～100當(dāng)量、優(yōu)選0.2～50當(dāng)量、更優(yōu)選0.3～40當(dāng)量的比率反應(yīng)。若少于0.1當(dāng)量則生成的纖維素衍生物不形成水凝膠。此外，若多余100當(dāng)量則生成的纖維素的疏水性增大，易產(chǎn)生不溶物，所以不優(yōu)選。羧甲基纖維素與磷脂酰乙醇胺的縮合反應(yīng)，由于有可能因縮合中使用的催化劑的反應(yīng)性或反應(yīng)條件而導(dǎo)致反應(yīng)效果變差，因此磷脂酰乙醇胺優(yōu)選與目標(biāo)取代度的計算值相比過量使用。
將羧甲基纖維素與磷脂酰乙醇胺溶解在由水和與水相溶的有機溶劑(A)構(gòu)成、水為20～70容量％的混合溶劑中。若水的含量少于20容量％則難以溶解羧甲基纖維素，此外，若多于70容量％則由于難以溶解磷脂酰乙醇胺而不能進(jìn)行反應(yīng)。水的含量優(yōu)選為30～60容量％ 作為與水相溶的有機溶劑(A)，具體地說，可以舉出四氫呋喃、1，4-二噁烷、1，3-二噁烷、1，3-二氧戊環(huán)、嗎啉等具有環(huán)狀醚鍵的有機溶劑，二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮等具有酰胺鍵的有機溶劑，吡啶、哌啶、哌嗪等胺類，二甲基亞砜等亞砜類。其中，優(yōu)選為環(huán)狀醚類或亞砜類，其中，更優(yōu)選為四氫呋喃、二噁烷、二甲基亞砜。
作為反應(yīng)中使用的縮合劑，優(yōu)選為羧基活化劑或縮合劑(狹義)。作為羧基活化劑，可以舉出N-羥基琥珀酰亞胺、對硝基苯酚、N-羥基苯并三唑、N-羥基哌啶、N-羥基琥珀酰胺、2，4，5-三氯苯酚、N，N-二甲基氨基吡啶等。作為縮合劑(狹義)，可以舉出1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)-碳二亞胺或其鹽酸鹽、二異丙基碳二亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺或N-羥基-5-降冰片烯-2，3-二碳二亞胺等。其中，作為羧基活化劑，優(yōu)選使用N-羥基苯并三唑，作為縮合劑(狹義)，優(yōu)選使用1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)-碳二亞胺鹽酸鹽。
反應(yīng)溫度優(yōu)選為0～60℃。為了抑制副產(chǎn)物的產(chǎn)生，反應(yīng)更優(yōu)選在0～10℃下進(jìn)行。反應(yīng)環(huán)境優(yōu)選為弱酸性，進(jìn)一步優(yōu)選為pH＝6～7。
<纖維素衍生物的純化方法> 本發(fā)明的纖維素衍生物的制備方法可以包括將所得到的纖維素衍生物用實質(zhì)上不溶解羧甲基纖維素而與水相溶的有機溶劑(B)進(jìn)行純化的步驟。
其中，實質(zhì)上不溶解羧甲基纖維素指的是對于可以以粉末狀或冷凍干燥狀態(tài)得到的羧甲基纖維素鈉鹽或羧甲基纖維素(COOH型)，在不存在水的條件下，調(diào)查羧甲基纖維素在有機溶劑中的溶解性時，幾乎不溶解的有機溶劑。具體地說，是溶解度為3％以下的有機溶劑?？梢耘e出例如，甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇、叔丁醇等醇類，乙二醇、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、甘油等多元醇類，丙酮等酮類，苯酚等芳族醇類。其中，優(yōu)選為沸點低于100℃的有機溶劑，更優(yōu)選沸點為73.8℃以下的有機溶劑。可以舉出例如甲醇、乙醇、異丙醇，但是若考慮到在生物體內(nèi)使用，優(yōu)選為乙醇。
使用這些組的有機溶劑(B)進(jìn)行純化時，可以使用在纖維素衍生物存在于水或有機溶劑(A)的混合液中的狀態(tài)下加入有機溶劑(B)形成沉淀，然后取出纖維素衍生物的方法。此外，可以使用向通過上述得到的沉淀、或處于干燥狀態(tài)下的粉末、或通過冷凍干燥得到的海綿等成型體中，添加有機溶劑(B)進(jìn)行洗滌的方法。通過這些純化方法，可以除去反應(yīng)中使用的縮合劑或羧基活化劑等催化劑類、未反應(yīng)而殘留在體系中的未反應(yīng)的磷脂等。為了得到懸浮在有機溶劑(B)中的目的物，利用離心分離、過濾等方法。此外，為了用有機溶劑(B)進(jìn)行洗滌，也可以利用索氏萃取。
<纖維素衍生物組合物的制備方法> 本發(fā)明的纖維素衍生物組合物可以通過下述方法制備，該方法包括使用由水和與水相溶的有機溶劑構(gòu)成的混合溶劑，將通過上述制備方法得到的纖維素衍生物與下式所示的磷脂混合，然后除去溶劑的步驟。

式中，R6和R7各自獨立地是碳原子數(shù)為9～27的烷基或烯基，R8為-NH3+或-N(CH3)3+。
即，該步驟中使用的磷脂是磷脂酰乙醇胺類或磷脂酰膽堿類。式中，R6和R7各自獨立地是碳原子數(shù)為9～27的烷基或烯基。R6和R7優(yōu)選都是碳原子數(shù)為9～19的烯基，其中，優(yōu)選R6CO-和/或R7CO-為油?；貏e優(yōu)選R6CO-和R7CO-為油?；?br> 上述磷脂，可以使用由動物組織萃取的磷脂或合成制備的磷脂中的任意一種。作為磷脂酰乙醇胺，可以舉出例如，二月桂?；字Ｒ掖及贰⒍舛罐Ⅴ；字Ｒ掖及贰⒍貦磅；字Ｒ掖及?、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二花生?；字Ｒ掖及?、二(二十二烷酰基)磷脂酰乙醇胺、二(二十四烷?；?磷脂酰乙醇胺、二(二十六烷?；?磷脂酰乙醇胺、二(二十八烷?；?磷脂酰乙醇胺、月桂油?；字Ｒ掖及?、肉豆蔻油?；字Ｒ掖及贰⒆貦坝王；字Ｒ掖及?、二油酰基磷脂酰乙醇胺、二(二十四烷?；?磷脂酰乙醇胺、二亞油?；字Ｒ掖及?、二亞麻酰基磷脂酰乙醇胺、二(三烯?；?磷脂酰乙醇胺、二花生四烯?；字Ｒ掖及贰⒍?二十二碳六烯?；?磷脂酰乙醇胺。
作為磷脂酰膽堿，可以舉出例如，二月桂?；字Ｄ憠A、二肉豆蔻?；字Ｄ憠A、二棕櫚?；字Ｄ憠A、二硬脂酰基磷脂酰膽堿、二花生?；字Ｄ憠A、二(二十二烷?；?磷脂酰膽堿、二(二十四烷?；?磷脂酰膽堿、二(二十六烷?；?磷脂酰膽堿、二(二十八烷?；?磷脂酰膽堿、月桂油酰基磷脂酰膽堿、肉豆蔻油?；字Ｄ憠A、棕櫚油?；字Ｄ憠A、二油?；字Ｄ憠A、二(二十四烷?；?磷脂酰膽堿、二亞油?；字Ｄ憠A、二亞麻?；字Ｄ憠A、二(三烯?；?磷脂酰膽堿、二花生四烯?；字Ｄ憠A、二(二十二碳六烯?；?磷脂酰膽堿。
其中，特別優(yōu)選為二油酰基磷脂酰乙醇胺、二油?；字Ｄ憠A。
上述纖維素衍生物和磷脂的混合在水和與水相溶的有機溶劑(A)的混合溶劑中混合。此時，使用水含量為20～70容量％的混合溶劑、優(yōu)選水含量為30～60容量％的混合溶劑。
作為有機溶劑(A)，具體地說，可以利用上述有機溶劑。其中優(yōu)選為環(huán)狀醚類或亞砜類，其中，更優(yōu)選為四氫呋喃、二噁烷、二甲基亞砜。
本發(fā)明的纖維素衍生物組合物中，通過在纖維素衍生物中混合磷脂，可以提高得到的組合物的粘彈性以及加入水得到的其水凝膠的粘彈性。此時，纖維素衍生物與磷脂的混合比是，纖維素衍生物的重復(fù)單元摩爾當(dāng)量與磷脂的摩爾當(dāng)量比為1∶0.05～1∶1，優(yōu)選為1∶0.1～1∶0.8，更優(yōu)選為1∶0.15～1∶0.6。若磷脂的摩爾當(dāng)量比小于0.05則得不到粘彈性的改善效果，此外即使超過1，僅僅是使磷脂過量存在，難于觀察到粘彈性的改善效果。
作為在纖維素衍生物中混合磷脂時的條件，溫度可以為0～30℃，優(yōu)選為10～25℃。此外，對溶劑中的聚合物和磷脂的含量不特別限定，但是優(yōu)選總計為3重量％以下。
在纖維素衍生物中混合磷脂后，經(jīng)過除去有機溶劑(A)的步驟，得到目標(biāo)組合物。作為除去有機溶劑(A)的方法，不特別限定，可以利用通過減壓濃縮、冷凍干燥、水中的透析除去有機溶劑的方法，噴霧干燥，電噴霧沉積、風(fēng)干、添加溶解性低的溶劑使目的物沉淀的方法等，其中，優(yōu)選為通過水中的透析除去有機溶劑的方法，優(yōu)選為通過冷凍干燥來將所得到的透析物干燥的方法。對透析膜不特別限定，優(yōu)選利用市售的visking管(再生纖維素膜)。
<纖維素衍生物的水凝膠> 本發(fā)明的防粘連材料是含有本發(fā)明的纖維素衍生物的水凝膠，其中，相對于水100重量份，含有本發(fā)明的纖維素衍生物0.1～5.0重量份、優(yōu)選0.2～2.0重量份、進(jìn)一步優(yōu)選0.3～1.0重量份。
這些水凝膠優(yōu)選具有即使將加入有凝膠的容器傾倒也不會流落的程度的粘彈性，若與刮勺(spatel)等金屬抹刀接觸則可以容易地變形，為容易涂布到患部的狀態(tài)，此外，可以用注射器等具有細(xì)管的器具注入。
作為上述凝膠的優(yōu)選的復(fù)數(shù)彈性模量，在水中的聚合物濃度為1重量％、溫度為37℃的條件下，使用動態(tài)粘彈性測定裝置，以角速度10rad/sec測定時，優(yōu)選為50～900N/m2，進(jìn)一步優(yōu)選為100～700N/m2。這是由于在該范圍時，作為注入型的凝膠最易操作。
此外，本發(fā)明的水凝膠為無色透明，制備過程中混入灰塵等異物時，可以檢出該異物，具有工業(yè)生產(chǎn)上的優(yōu)點。
此外，作為水凝膠中含有的水以外的其它成分，認(rèn)為有作為催化劑使用的縮合劑類、通過縮合劑經(jīng)過規(guī)定的化學(xué)反應(yīng)生成的脲等副產(chǎn)物類、羧基活化劑、未反應(yīng)的磷脂酰乙醇胺類、有可能在反應(yīng)的各階段中混入的異物、用于調(diào)整pH的離子類等，但是這些成分通過使用上述有機溶劑(B)進(jìn)行的純化或洗滌來除去，優(yōu)選這些化合物都抑制在加入到生物體內(nèi)時未發(fā)現(xiàn)異物反應(yīng)的程度的低水平。
<纖維素衍生物組合物的水凝膠> 本發(fā)明的纖維素衍生物組合物可以形成水凝膠。此時，通過相對于水100重量份，含有纖維素衍生物組合物0.1～5.0重量份、優(yōu)選0.2～2.0重量份、進(jìn)一步優(yōu)選0.3～1.0重量份，由此可以得到具有適當(dāng)粘彈性的水凝膠。
這些水凝膠優(yōu)選具有即使將加入有水凝膠的容器傾倒也不會流落的程度的粘彈性，若與刮勺等金屬抹刀接觸則可以容易地變形，為容易涂布到患部的狀態(tài)，此外，可以用注射器等具有細(xì)管的器具注入。
作為上述凝膠的優(yōu)選的復(fù)數(shù)彈性模量，在水中的聚合物濃度為1重量％、溫度為37℃的條件下，使用動態(tài)粘彈性測定裝置，以角速度10rad/sec測定時，優(yōu)選為50～900N/m2，進(jìn)一步優(yōu)選為100～700N/m2。這是在由于該范圍時，作為注入型的凝膠最易操作。
此外，作為水凝膠中含有的水、纖維素衍生物和磷脂以外的其它成分，認(rèn)為有作為催化劑使用的縮合劑類、通過縮合劑經(jīng)過規(guī)定的化學(xué)反應(yīng)生成的脲等副產(chǎn)物類、羧基活化劑、有可能在反應(yīng)的各階段中混入的異物、用于調(diào)整pH的離子類等。優(yōu)選這些化合物都抑制在加入到生物體內(nèi)時未發(fā)現(xiàn)異物反應(yīng)的程度的低水平。
<用途> 作為本發(fā)明的纖維素衍生物、纖維素衍生物組合物和它們的水凝膠的用途，可以用于包括醫(yī)用材料的醫(yī)療用途、頭發(fā)護(hù)理產(chǎn)品或肌膚的保濕劑等日用品用途、化妝品用途等中。本凝膠由于可以通過注射器注入，其中特別是可以用于低侵襲醫(yī)療用途中，可以優(yōu)選用作用于再生醫(yī)療的細(xì)胞載體，保持、緩釋生長因子等液性因子的載體，保持、緩釋可以用作藥物的低分子化合物的載體，防粘連材料或密封劑等醫(yī)用材料，特別是注入型的防粘連材料。
實施例 通過以下的實施例對本發(fā)明進(jìn)行具體的說明，但是本發(fā)明不被這些實施例所限定。
(1)實施例中使用的材料如下所述。
(i)CMCNa羧甲基纖維素鈉(日本制紙Chemical(株)制、取代度0.69) (ii)四氫呋喃(和光純藥工業(yè)(株)制)、 (iii)0.1M HCl(和光純藥工業(yè)(株)制)、 (iv)0.1M NaOH(和光純藥工業(yè)(株)制)、 (v)EDC1-乙基-3-[3-(二甲基氨基)丙基]-碳二亞胺·HCl((株)大阪合成有機化學(xué)研究所制)、 (vi)HOBt-H2O1-羥基苯并三唑，一水合物((株)大阪合成有機化學(xué)研究所制)、 (vii)L-α-二油?；字Ｒ掖及?COATSOME ME-8181、日本油脂(株)制)、 (viii)L-α-二月桂?；字Ｒ掖及?COATSOME ME-2020、日本油脂(株)制)、 (ix)L-α-二油?；字Ｄ憠A(COATSOME MC-8181、日本油脂(株)制)、 (x)L-α-二月桂?；字Ｄ憠A(COATSOME MC-2020、日本油脂(株)制)、 (xi)L-α-二肉豆蔻?；字Ｄ憠A(COATSOME MC-4040、日本油脂(株)制)、 (xii)L-α-二棕櫚?；字Ｄ憠A(COATSOME MC-6060、日本油脂(株)制)、 (xiii)L-α-二硬脂酰基磷脂酰膽堿(COATSOME MC-8080、日本油脂(株)制)、 (xiv)纖連蛋白(日本Becton Dickinson(株)制)、 (xv)硝酸纖維素(Schleicher&Schuell公司制) (xvi)小鼠NIH/3T3成纖維細(xì)胞(通過American Type CultureCollection分售) (xvii)PBS(Invitrogen公司制) (xviii)DMEM(Invitrogen公司制) (xix)Antibiotics Antimycotics(Invitrogen公司制) (xx)FBS(HYCLONE公司制) (xxi)胰蛋白酶-EDTA0.25％胰蛋白酶、1mM EDTA·4Na(Invitrogen公司制) (xxii)甲醇(和光純藥工業(yè)(株)制)、 (xxiii)消毒用乙醇(和光純藥工業(yè)(株)制)、 (xxiv)戊巴比妥鈉(Nembutal注射液、大日本住友制藥制)、 (xxv)Isodine消毒液(明治制菓(株)制) (xxvi)注射用蒸餾水(大塚制藥(株)制) (2)纖維素衍生物中的磷脂含量的測定 纖維素衍生物中的磷脂的比率通過利用鉬釩酸吸光光度法(vanadomolybdate absorption spectrometry)進(jìn)行的總磷含量的分析來求得。
(3)水凝膠的復(fù)數(shù)彈性模量的測定 水凝膠的復(fù)數(shù)彈性模量，使用動態(tài)粘彈性測定裝置RheometerRFIII(TA Instrument)，在37℃、角速度10rad/sec下測定。復(fù)數(shù)彈性模量是表示彈性體的應(yīng)力與變形之比的常數(shù)。
[實施例1] <纖維素衍生物> 將平均分子量為230萬的CMCNa 200mg溶解在水40ml中，進(jìn)一步加入四氫呋喃40ml。將L-α-二油?；字Ｒ掖及?69.7mg(0.000228mol)(相對于CMCNa的羧基100當(dāng)量為40當(dāng)量)、EDC48mg(0.000251mol)、HOBt·H2O 38.4mg(0.000251mol)溶解在10ml的四氫呋喃/水＝1/1中并添加到反應(yīng)體系中后，攪拌整夜。攪拌后，除去四氫呋喃，以某種程度蒸發(fā)水后，加入到乙醇中，進(jìn)行沉淀。通過過濾，除去乙醇，再次用乙醇洗滌，真空干燥濾物，由此得到纖維素衍生物，測定該磷脂含量。反應(yīng)前的羧甲基纖維素鈉的取代度為0.69，假設(shè)所有羧甲基被鈉化，使用磷脂含量進(jìn)行計算，由此求得式(d)的取代度。式(d)的取代度為0.007。
<纖維素衍生物組合物> 將上述中得到的纖維素衍生物100mg(0.45mmol)溶解在20ml的四氫呋喃/水＝1/1中，添加L-α-二油?；字Ｒ掖及?0.6mg(0.028mmol)使纖維素衍生物中的重復(fù)單元的摩爾當(dāng)量與L-α-二油?；字Ｒ掖及返哪柈?dāng)量的比為1∶0.062，攪拌20小時。攪拌后，通過透析進(jìn)行純化，進(jìn)一步進(jìn)行冷凍干燥得到纖維素衍生物組合物。
<纖維素衍生物水凝膠> 將冷凍干燥的纖維素衍生物10mg溶解在離子交換水990mg中，制備濃度為1重量％的水凝膠。得到的水凝膠為無色透明，即使將容器傾斜也不會流動，可以簡單地插入刮勺等金屬抹刀，可以通過25G的注射針容易地擠出。此外，測定所得到的水凝膠的復(fù)數(shù)彈性模量，結(jié)果為188.2N/m2。
<纖維素衍生物組合物水凝膠> 將冷凍干燥的纖維素衍生物組合物10mg溶解在離子交換水990mg中，制備濃度為1重量％的水凝膠。測定所得到的水凝膠的復(fù)數(shù)彈性模量，結(jié)果為188.3N/m2。
[實施例2] 除了添加L-α-二油?；字Ｒ掖及?3.8mg(0.059mmol)使纖維素衍生物中的重復(fù)單元的摩爾當(dāng)量與L-α-二油?；字Ｒ掖及返哪柈?dāng)量的比為1∶0.13之外，進(jìn)行與實施例1同樣的操作，得到纖維素衍生物組合物后，制備水凝膠。測定所得到的水凝膠的復(fù)數(shù)彈性模量，結(jié)果為287.3N/m2。
[實施例3] 除了添加L-α-二油?；字Ｒ掖及?9.6mg(0.12mmol)使纖維素衍生物中的重復(fù)單元的摩爾當(dāng)量與L-α-二油酰基磷脂酰乙醇胺的摩爾當(dāng)量的比為1∶0.26之外，進(jìn)行與實施例1同樣的操作，得到纖維素衍生物組合物后，制備水凝膠。測定所得到的水凝膠的復(fù)數(shù)彈性模量，結(jié)果為291.9N/m2。
[實施例4] 除了添加L-α-二油?；字Ｒ掖及?35.6mg(0.18mmol)使纖維素衍生物中的重復(fù)單元的摩爾當(dāng)量與L-α-二油?；字Ｒ掖及返哪柈?dāng)量的比為1∶0.40之外，進(jìn)行與實施例1同樣的操作，得到纖維素衍生物組合物后，制備水凝膠。測定所得到的水凝膠的復(fù)數(shù)彈性模量，結(jié)果為308.9N/m2。
[實施例5] 除了添加L-α-二油?；字Ｒ掖及?31mg(0.31mmol)使纖維素衍生物中的重復(fù)單元的摩爾當(dāng)量與L-α-二油?；字Ｒ掖及返哪柈?dāng)量的比為1∶0.69之外，進(jìn)行與實施例1同樣的操作，得到纖維素衍生物組合物后，制備水凝膠。測定所得到的水凝膠的復(fù)數(shù)彈性模量，結(jié)果為294.2N/m2。
[實施例6] 除了添加L-α-二油酰基磷脂酰膽堿28.6mg(0.036mmol)使纖維素衍生物中的重復(fù)單元的摩爾當(dāng)量與L-α-二油?；字Ｄ憠A的摩爾當(dāng)量的比為1∶0.26之外，進(jìn)行與實施例1同樣的操作，得到纖維素衍生物組合物后，制備水凝膠。測定所得到的水凝膠的復(fù)數(shù)彈性模量，結(jié)果為174.9N/m2。
[實施例7] 除了添加L-α-二月桂?；字Ｄ憠A22.5mg(0.036mmol)使纖維素衍生物中的重復(fù)單元的摩爾當(dāng)量與L-α-二月桂酰基磷脂酰膽堿的摩爾當(dāng)量的比為1∶0.27之外，進(jìn)行與實施例6同樣的操作，得到纖維素衍生物組合物后，制備水凝膠。測定所得到的水凝膠的復(fù)數(shù)彈性模量，結(jié)果為249.1N/m2。
[實施例8] 除了添加L-α-二肉豆蔻酰基磷脂酰膽堿24.6mg(0.036mmol)使纖維素衍生物中的重復(fù)單元的摩爾當(dāng)量與L-α-二肉豆蔻?；字Ｄ憠A的摩爾當(dāng)量的比為1∶0.27之外，進(jìn)行與實施例6同樣的操作，得到纖維素衍生物組合物后，制備水凝膠。測定所得到的水凝膠的復(fù)數(shù)彈性模量，結(jié)果為398.4N/m2。
[實施例9] 除了添加L-α-二棕櫚?；字Ｄ憠A26.7mg(0.036mmol)使纖維素衍生物中的重復(fù)單元的摩爾當(dāng)量與L-α-二棕櫚?；字Ｄ憠A的摩爾當(dāng)量的比為1∶0.27之外，進(jìn)行與實施例6同樣的操作，得到纖維素衍生物組合物后，制備水凝膠。測定所得到的水凝膠的復(fù)數(shù)彈性模量，結(jié)果為244.8N/m2。
[實施例10] 除了添加L-α-二硬脂?；字Ｄ憠A28.8mg(0.036mmol)使纖維素衍生物中的重復(fù)單元的摩爾當(dāng)量與L-α-二硬脂?；字Ｄ憠A的摩爾當(dāng)量的比為1∶0.27之外，進(jìn)行與實施例6同樣的操作，得到纖維素衍生物組合物后，制備水凝膠。測定所得到的水凝膠的復(fù)數(shù)彈性模量，結(jié)果為261.2N/m2。
[實施例11] 除了添加L-α-二月桂?；字Ｒ掖及?0.9mg(0.036mmol)使纖維素衍生物中的重復(fù)單元的摩爾當(dāng)量與L-α-二月桂?；字Ｒ掖及返哪柈?dāng)量的比為1∶0.27之外，進(jìn)行與實施例6同樣的操作，得到纖維素衍生物組合物后，制備水凝膠。測定所得到的水凝膠的復(fù)數(shù)彈性模量，結(jié)果為212.7N/m2。
[實施例12] <小鼠NIH/3T3成纖維細(xì)胞的制備> 在含有10％FBS和1％ Antibiotics Antimycotics的DMEM中，在5％CO2存在下培養(yǎng)小鼠NIH/3T3成纖維細(xì)胞。在體外評價細(xì)胞對水凝膠的粘接和浸潤時，用0.05％胰蛋白酶-EDTA將小鼠NIH/3T3成纖維細(xì)胞從組織培養(yǎng)用的培養(yǎng)皿(Petri dish)分離，在900rpm、室溫下進(jìn)行5分鐘離心分離。除去上清，懸浮在含有10％FBS和1％ AntibioticsAntimycotics的DMEM中，制備0.4×105個/ml的細(xì)胞懸浮液中。
<細(xì)胞對纖維素衍生物組合物水凝膠的粘接和浸潤的評價> 手術(shù)后的粘連是由于受到損傷的器官表面再生時與其它的組織結(jié)合而產(chǎn)生的，所以作為其防止方法之一，有抑制細(xì)胞向損傷組織浸潤。因此，使用對Snow等人的方法進(jìn)行一部分改變的方法，評價細(xì)胞對纖維素衍生物組合物水凝膠的粘接和浸潤[Snow DM，emmon V，CarrinoDA，Caplan Al，Sivler J.Exp.Neurol；109(1)111-330.1990]。即，在甲醇6ml中溶解5cm2的硝酸纖維素，用該溶液0.5ml覆蓋組織培養(yǎng)用的直徑60mm的培養(yǎng)皿后，風(fēng)干2小時。將實施例1的纖維素衍生物組合物水凝膠滴加到用硝酸纖維素覆蓋的培養(yǎng)皿中后，風(fēng)干6小時。然后用30μg/ml的纖連蛋白3ml覆蓋培養(yǎng)皿后，用PBS洗滌培養(yǎng)皿(圖1)。最后，將0.4×105個/ml的小鼠NIH/3T3成纖維細(xì)胞懸浮液5ml接種到整個培養(yǎng)皿上(2×105個/培養(yǎng)皿。使用相位差顯微鏡觀察7天細(xì)胞對水凝膠滴的粘接和浸潤。結(jié)果，未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞對滴加的纖維素衍生物組合物水凝膠的粘接和浸潤。
[實施例13] 除了使用實施例2的水凝膠來替代實施例1的纖維素衍生物組合物水凝膠之外，進(jìn)行與實施例12同樣的操作，評價細(xì)胞對水凝膠的粘接和浸潤。其結(jié)果與實施例12大致相同。
[實施例14] 除了使用實施例3的水凝膠來替代實施例1的纖維素衍生物組合物水凝膠之外，進(jìn)行與實施例12同樣的操作，評價細(xì)胞對水凝膠的粘接和浸潤。其結(jié)果與實施例12大致相同。
[實施例15] 除了使用實施例5的水凝膠來替代實施例1的纖維素衍生物組合物水凝膠之外，進(jìn)行與實施例12同樣的操作，評價細(xì)胞對水凝膠的粘接和浸潤。其結(jié)果與實施例12大致相同。
[比較例1] 除了使用30μg/ml的纖連蛋白來替代實施例1的纖維素衍生物組合物水凝膠之外，進(jìn)行與實施例12同樣的操作，評價細(xì)胞對纖連蛋白的粘接和浸潤。觀察到細(xì)胞擴展到全部纖連蛋白中。
其結(jié)果，到第7天為止，比較例1中，小鼠NIH/3T3成纖維細(xì)胞發(fā)生粘接和浸潤，而實施例12、13、14和15中，幾乎未觀察到小鼠NIH/3T3成纖維細(xì)胞對本發(fā)明的水凝膠的粘接和浸潤，細(xì)胞選擇性地與未覆蓋水凝膠的纖連蛋白的區(qū)域粘接。
由上確認(rèn)，實施例12、13、14和15中評價的水凝膠具有抑制細(xì)胞粘接和浸潤的效果。
[實施例16] <腹腔內(nèi)粘連試驗> 使用Sprague-Dawley(SD)系大鼠(日本Charles River)10只(7周齡、雄性)，根據(jù)Buckenmaier CC 3rd等人的方法制造腹腔內(nèi)粘連模型[Buckenmaier CC 3rd，Pusateri AE，Harris RA，Hetz SPAm Surg，65(3)274-82，1999]。即，將大鼠在戊巴比妥鈉的腹腔內(nèi)給藥麻醉下仰面固定，對腹部進(jìn)行剃毛后，用消毒乙醇消毒。進(jìn)一步用Isodine消毒液將手術(shù)區(qū)域消毒后，沿著腹部正中線切開3～4cm露出盲腸。對于露出的盲腸的一定面積(1～2cm2)，使用滅菌紗布摩擦直至產(chǎn)生點狀出血。將盲腸放回原處，進(jìn)一步地對相對的腹壁制造缺損(8mm×1.6mm)。然后，在腹壁的缺損部位涂布實施例1的纖維素衍生物水凝膠(1ml)，連續(xù)縫合切口部的肌肉層后，對皮膚縫合4～5針。創(chuàng)傷部用isodine消毒液消毒后，放回籠中。制造模型4周后，在戊巴比妥鈉麻醉下對動物進(jìn)行剖腹，肉眼觀察腹腔內(nèi)粘連的程度。根據(jù)以下所示的基準(zhǔn)進(jìn)行評分。將未涂布纖維素衍生物水凝膠的情況作為對照。
(評分分類) 評分0未發(fā)現(xiàn)粘連的狀態(tài) 評分1存在輕度牽引就斷開的程度的弱粘連的狀態(tài) 評分2存在耐輕度牽引的中等程度的粘連的狀態(tài) 評分3存在相當(dāng)牢固的粘連的狀態(tài) 顯著性差異用Wilcoxon的方法檢驗。
結(jié)果是，在對照中，4周后發(fā)現(xiàn)腹壁與盲腸之間形成牢固的粘連。另一方面，涂布了實施例1的水凝膠的組中，4周后腹壁與盲腸之間的粘連的程度與對照相比顯著降低。具體地說，對照為2.3±1.2(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)，而涂布了實施例1的水凝膠的組中，為0.8±1.2(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)，在統(tǒng)計學(xué)上存在顯著性差異(P＜0.014，Wilcoxon’s檢驗)。
進(jìn)一步地，發(fā)現(xiàn)粘連時，在盲腸上用縫合線縫上曲別針，將其用Metric Gauges(EW-93953-05、Cole-Parmer公司制)拉伸，測定盲腸從腹壁分離的最大強度(克)，將該值作為粘連的強度進(jìn)行評價。無粘連時，作為0克處理。顯著性差異使用Welch’st檢驗。如此評價實施例1的纖維素衍生物水凝膠對粘連的程度、強度的效果。結(jié)果是，對照為338.7±278.4克(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)，而涂布了實施例1的纖維素衍生物水凝膠的組中，為108.1±188.7克(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)，在統(tǒng)計學(xué)上存在顯著性差異(P＜0.044，Student’st檢驗)。
由上確認(rèn)，實施例1的纖維素衍生物水凝膠可以防止粘連。
[實施例17] 除了使用大鼠8只，并使用實施例1的纖維素衍生物組合物水凝膠來替代實施例1的纖維素衍生物水凝膠之外，進(jìn)行與實施例16相同的操作，評價其對粘連的程度、強度的效果。結(jié)果粘連的評分、強度分別為0.1±0.4、18±52克(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)。
[實施例18] 除了使用大鼠9只，使用實施例2的水凝膠來替代實施例1的纖維素衍生物組合物水凝膠之外，進(jìn)行與實施例17相同的操作，評價水凝膠對于粘連的程度、強度的效果。結(jié)果粘連的評分、強度分別為0.2±0.7、7.50±149克(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)。
[實施例19] 除了使用大鼠8只，使用實施例3的水凝膠來替代實施例1的纖維素衍生物組合物水凝膠之外，進(jìn)行與實施例17相同的操作，評價水凝膠對于粘連的程度、強度的效果。結(jié)果粘連的評分、強度分別為0.0±0.0、0±0克(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)，粘連被完全抑制。
[實施例20] 除了使用大鼠9只，使用實施例5的水凝膠來替代實施例1的纖維素衍生物組合物水凝膠之外，進(jìn)行與實施例17相同的操作，評價水凝膠對于粘連的程度、強度的效果。結(jié)果粘連的評分、強度分別為0.6±1.1、89±180克(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)。
[比較例2] 作為對照，不涂布水凝膠，進(jìn)行與實施例17相同的操作，對粘連的程度、強度進(jìn)行評價。結(jié)果粘連的評分、強度分別為2.0±1.3、397±313克(平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差)。
以上，4周后，比較例2中產(chǎn)生牢固的粘連，與此相比，實施例17、18、19和20中，粘連的程度、強度得到顯著抑制。
由上確認(rèn)，實施例1、2、3和5中得到的本發(fā)明的纖維素衍生物組合物水凝膠具有在生物體內(nèi)強力抑制粘連的效果，說明可以有效地防止手術(shù)后的粘連。
實施例17～20和比較例2的結(jié)果如以下表1所示。
表1 [實施例21] 除了改變實施例1的纖維素衍生物水凝膠的濃度和涂布量來使用之外，進(jìn)行與實施例16、17相同的操作，評價水凝膠對于粘連的程度、強度的效果。各組使用9例大鼠。結(jié)果如表2所示。
表2 涂布量為一定(1ml)時，粘連的程度、強度，在0.5重量％以上時，與對照組相比顯著降低。此外，濃度為一定(1重量％)時，即使為0.25ml，與對照組相比，粘連的程度、強度也顯著降低。因此確認(rèn)，若為這些涂布量、濃度，則在生物體內(nèi)表現(xiàn)出所期望的效果。
[實施例22] 除了使用分子量為97萬的CMCNa之外，與實施例1同樣地制備纖維素衍生物(取代度0.001、記為“CMC-PE”)，測定將該CMC-PE溶解在氯化鈉水溶液中形成凝膠而成的物質(zhì)的粘度(Eta(P)、10rad/sec下的值)。結(jié)果如表3所示。聚合物的濃度為1重量％，“CMC-Na”表示原料使用的分子量為97萬的羧甲基纖維素鈉鹽，PBS表示磷酸緩沖生理食鹽水(0.9％NaCl)。
表3
由此可知，本發(fā)明的纖維素衍生物水凝膠，通過共存少量的氯化鈉，其粘度令人吃驚地急劇增大。通過利用該特性，使用方法可以如下例如在注射本發(fā)明的水凝膠時不加入氯化鈉，形成低粘度的狀態(tài)，由此容易地進(jìn)行注射，但在給藥部位與生物體組織接觸，氯化鈉濃度升高，由此粘度增大，例如易發(fā)揮防粘連劑等的所需功能。
[比較例3] 本發(fā)明人不限于本發(fā)明的纖維素衍生物水凝膠或纖維素衍生物組合物水凝膠，對通過用具有伯氨基的疏水基修飾其它的多糖類來增大粘彈性的效果進(jìn)行了研究。例如，對于透明質(zhì)酸，使用亮氨酸甲酯、酪氨酸乙酯、苯丙氨酸甲酯、維生素K5、卡巴膽堿(氯化氨甲酰膽堿)、乙基胺、煙酰胺修飾多糖類的羧基制成的水凝膠中，幾乎未發(fā)現(xiàn)粘彈性的升高，與此相對地，用乙基脲修飾的物質(zhì)發(fā)現(xiàn)明顯的粘彈性的升高。因此，通過用疏水基修飾多糖類，有可能發(fā)現(xiàn)其水凝膠的粘彈性升高，但是可知難以預(yù)測具體地怎樣組合時發(fā)現(xiàn)粘彈性的升高。
[比較例4] 進(jìn)一步地，還對通過用疏水基修飾多糖類得到的水凝膠的粘彈性與使用該水凝膠時的防粘連效果的關(guān)系進(jìn)行了研究。除了使用平均分子量為230萬的CMCNa，相對于CMCNa的羧基100當(dāng)量使用40當(dāng)量的油胺來替代磷脂酰乙醇胺之外，用實施例1記載的方法制備CMC-油胺衍生物。該衍生物的復(fù)數(shù)彈性模量為87.4N/m2。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過用烷基胺、具體地說用油胺修飾羧甲基纖維素，也得到高粘彈性的纖維素衍生物的水凝膠。但是對其進(jìn)行實施例12記載的細(xì)胞對水凝膠的粘接和浸潤的評價后可知，CMC-烷基胺水凝膠抑制細(xì)胞粘接和浸潤的效果低，水凝膠的高粘彈性未必帶來良好的防粘連效果。
[比較例5] 使用CMCNa(日本制紙Chemical(株)制、F15MHC、取代度0.77)，磷脂使用二月桂?；字Ｒ掖及?COATSOME ME-2020、日本油脂(株)制)。其它的試劑使用與實施例1記載的試劑相同的試劑。
將1g的CMCNa溶解在50ml的水中，向該溶液中添加二月桂?；字Ｒ掖及?00mg，室溫下攪拌1小時。向該溶液中添加500mg的EDC，室溫下攪拌一晚。將得到的溶液用去離子水透析，進(jìn)行冷凍干燥。將得到的冷凍干燥物與水混合使聚合物濃度為1重量％。測定粘彈性。
結(jié)果是，反應(yīng)前的CMCNa的復(fù)數(shù)彈性模量為0.4N/m2，而得到的冷凍干燥品的復(fù)數(shù)彈性模量為0.4N/m2，反應(yīng)前后聚合物溶液的物性未發(fā)現(xiàn)變化。得到的纖維素衍生物與水的混合物，仍然為若將容器傾倒則流落的流體，未表現(xiàn)出凝膠的性狀。
工業(yè)實用性 本發(fā)明的纖維素衍生物組合物可以作為醫(yī)療用水凝膠、特別是可注入的防粘連材料。防粘連材料可以用于在對于脊椎、關(guān)節(jié)、腱、神經(jīng)等進(jìn)行手術(shù)時，防止受到損傷的生物體組織表面粘連。進(jìn)一步地，具體地說，在脊椎手術(shù)時，例如為了隔離硬膜和神經(jīng)根周圍而涂布本發(fā)明的防粘連材料，由此可以防止粘連。
產(chǎn)生粘連時，有必要為了除痛、確保可動區(qū)域而進(jìn)行粘連剝離。通過涂布本發(fā)明的防粘連材料，可以防止粘連?？梢员苊庠俅问中g(shù)，提高醫(yī)療經(jīng)濟性，進(jìn)一步提高患者的生活質(zhì)量。
此外，在婦科手術(shù)中，可以用于剖腹術(shù)或通過腹腔鏡進(jìn)行的子宮肌瘤摘除術(shù)時等。通過在手術(shù)后的創(chuàng)傷部位涂布本發(fā)明的防粘連材料，可以防止粘連。
本發(fā)明的防粘連材料在體內(nèi)具有優(yōu)異的滯留性，作為防粘連材料是有用的。特別是防粘連材料為凝膠時，可以適用于形狀復(fù)雜的部位，可以容易地適用于使用內(nèi)窺鏡的手術(shù)中。
權(quán)利要求
1.纖維素衍生物，含有下式所示的重復(fù)單元，
式中，R1、R2和R3各自獨立地選自下式(a)、(b)、(c)和(d)中，
-H (a)
-CH2-COOH(b)
-CH2-COOX(c)
式(c)中，X為堿金屬或堿土金屬，
式(d)中，R4和R5各自獨立地是碳原子數(shù)為9～27的烷基或烯基，
(b)和(c)的總?cè)〈葹?.3～2.0，
(d)的取代度為0.001～0.05。
2.如權(quán)利要求1所述的纖維素衍生物，其中，對于1重量％水溶液，用動態(tài)粘彈性測定裝置，以10rad/sec的角速度求得的復(fù)數(shù)彈性模量為50～900N/m2。
3.如權(quán)利要求1或2所述的纖維素衍生物，其中，R4和R5是碳原子數(shù)為9～19的烯基。
4.如權(quán)利要求3所述的纖維素衍生物，其中，R4CO-和/或R5CO-為油酰基。
5.如權(quán)利要求3所述的纖維素衍生物，其中，R4CO-和R5CO-為油?；?。
6.纖維素衍生物組合物，含有權(quán)利要求1所述的纖維素衍生物和下式所示的磷脂，纖維素衍生物的重復(fù)單元的摩爾當(dāng)量與磷脂的摩爾當(dāng)量的比為1∶0.05～1∶1，
式中，R6和R7各自獨立地是碳原子數(shù)為9～27的烷基或烯基，R8為-NH3+或-N(CH3)3+。
7.如權(quán)利要求6所述的纖維素衍生物組合物，其中，對于1重量％水溶液，用動態(tài)粘彈性測定裝置，以10rad/sec的角速度求得的復(fù)數(shù)彈性模量為50～900N/m2。
8.如權(quán)利要求6所述的纖維素衍生物組合物，其中，R8為-NH3+。
9.如權(quán)利要求6所述的纖維素衍生物組合物，其中，R8為-N(CH3)3+。
10.如權(quán)利要求6～9中任意一項所述的纖維素衍生物組合物，其中，R4、R5、R6和R7全部相同。
11.如權(quán)利要求6～9中任意一項所述的纖維素衍生物組合物，其中，R6和R7是碳原子數(shù)為9～19的烯基。
12.如權(quán)利要求11所述的纖維素衍生物組合物，其中，R6CO-和/或R7CO-為油?；?br> 13.如權(quán)利要求11所述的纖維素衍生物組合物，其中，R6CO-和R7CO-為油?；?。
14.如權(quán)利要求6～9中任意一項所述的纖維素衍生物組合物，其中，R4和R5是碳原子數(shù)為9～19的烯基。
15.如權(quán)利要求14所述的纖維素衍生物組合物，其中，R4CO-和/或R5CO-為油?；?。
16.如權(quán)利要求14所述的纖維素衍生物組合物，其中，R4CO-和R5CO-為油酰基。
17.如權(quán)利要求8所述的纖維素衍生物組合物，其中，R4CO-、R5CO-、R6CO-和R7CO-都為油?；?。
18.權(quán)利要求1～5中任意一項所述的纖維素衍生物的制備方法，該方法包括將含有下式所示的重復(fù)單元、分子量為5×103～5×106的羧甲基纖維素
與下式所示的磷脂酰乙醇胺，
以相對于羧甲基纖維素的羧基100當(dāng)量，磷脂酰乙醇胺為0.1～100當(dāng)量的比率，溶解由水和與水相溶的有機溶劑構(gòu)成、并且水含量為20～70容量％的混合溶劑中，使它們在縮合劑的存在下反應(yīng)的步驟，
其中，R1、R2和R3各自獨立地選自下式(a)、(b)和(c)中，
-H (a)
-CH2-COOH (b)
-CH2-COOX (c)
式(c)中，X為堿金屬或堿土金屬，
式(b)和(c)的總?cè)〈葹?.3～2.0，
R4和R5各自獨立地是碳原子數(shù)為9～27的烷基或烯基。
19.如權(quán)利要求18所述的制備方法，其中，反應(yīng)步驟后，進(jìn)一步包括使用羧甲基纖維素的溶解度小于3％、與水相溶的沸點低于100℃的有機溶劑進(jìn)行純化的步驟。
20.如權(quán)利要求19所述的制備方法，其中，羧甲基纖維素的溶解度小于3％、與水相溶的沸點低于100℃的有機溶劑為乙醇。
21.如權(quán)利要求18～20中任意一項所述的制備方法，其中，反應(yīng)步驟中使用的與水相溶的有機溶劑是選自四氫呋喃、二噁烷和二甲基亞砜中的至少一種。
22.權(quán)利要求6～9、17中任意一項所述的纖維素衍生物組合物的制備方法，該方法包括使用含有水和與水相溶的有機溶劑的混合溶劑，將通過權(quán)利要求18～21中任意一項所述的制備方法得到的纖維素衍生物與下式所示的磷脂混合，然后除去溶劑的步驟，
式中，R6和R7各自獨立地是碳原子數(shù)為9～27的烷基或烯基，R8為-NH3+或-N(CH3)3+。
23.如權(quán)利要求22所述的制備方法，其中，除去溶劑的步驟是用水進(jìn)行的透析處理。
24.防粘連材料，其含有權(quán)利要求1～5中任意一項所述的纖維素衍生物。
25.防粘連材料，其含有權(quán)利要求6～9、17中任意一項所述的纖維素衍生物組合物。
26.可注入的水凝膠，其中相對于水100重量份，含有權(quán)利要求1～5中任意一項所述的纖維素衍生物0.1～1.5重量份。
27.可注入的水凝膠，其中相對于水100重量份，含有權(quán)利要求6～9、17中任意一項所述的纖維素衍生物組合物0.1～5.0重量份。
全文摘要
本發(fā)明提供含有下式所示的重復(fù)單元的纖維素衍生物、含有該纖維素衍生物和磷脂的組合物、它們的制備方法以及含有該衍生物或該組合物的防粘連材料。R1、R2、R3為-H、-CH2-COOH、-CH2-COOX或-CH2CO-磷脂酰乙醇胺，X為堿金屬或堿土金屬，-CH2-COOH和-CH2-COOX的總?cè)〈葹?.3～2.0，-CH2CO-磷脂酰乙醇胺的取代度為0.001～0.05。
文檔編號C08B11/14GK101605817SQ20088000428
公開日2009年12月16日 申請日期2008年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月6日
發(fā)明者伊東雅彌, 兼子博章, 福平由佳子, 遠(yuǎn)藤信幸 申請人:帝人株式會社