本發(fā)明涉及木質(zhì)纖維素酶解技術領域，特別是涉及利用ph響應型木質(zhì)素兩性表面活性劑促進木質(zhì)纖維素酶解和回收纖維素酶的方法。

背景技術：

木質(zhì)纖維素生物煉制燃料乙醇是替代汽油有效可行的技術之一。在這一煉制過程中，纖維素酶能否高效水解木質(zhì)纖維素底物是關鍵的技術瓶頸。同時，纖維素酶因其具有活力低、耗量大和價格貴等特點，直接阻礙了纖維素乙醇的工業(yè)化。實現(xiàn)纖維素酶的高效回收利用是降低生物乙醇成本的重要途徑。目前，纖維素酶回收利用技術主要有超濾膜回收、纖維素酶的固定化回收和新鮮底物重吸附法回收。

超濾膜回收可以同時回收纖維素酶中的內(nèi)切酶，外切酶和β-葡萄糖苷酶，且可以得到較高纖維素酶回收效率，但是超濾膜回收存在著設備貴、超濾膜易堵塞、操作費時、成本高等問題。纖維素酶的固定化可以保持纖維素酶的穩(wěn)定且利于纖維素酶的回收利用，但是固定化酶與纖維素固體顆粒之間存在很大的傳質(zhì)障礙，且固定化過程會嚴重影響酶活，因此在木質(zhì)纖維素酶解體系中目前僅限于纖維二糖酶的固定化回收再用。纖維素酶具有高穩(wěn)定性和對纖維素的強吸附的特性，使得酶通過新鮮底物吸附回收成為降低纖維素酶成本比例的潛在途徑，但是添加新鮮底物回收纖維素酶效率較低，同時也會造成酶解體系中木質(zhì)素富集，對纖維素的酶解糖化起到消極作用，且該方法無法回收纖維二糖酶。

木質(zhì)素是自然界中在數(shù)量上僅次于纖維素的第二大天然高分子材料，制漿造紙工業(yè)每年都會得到5000萬噸左右的木質(zhì)素副產(chǎn)品，但超過95％的木質(zhì)素仍然主要作為工業(yè)制漿的廢棄物，造紙黑液的排放不僅造成資源的浪費，同時又污染環(huán)境，對其進行綜合開發(fā)利用對經(jīng)濟的發(fā)展和環(huán)境保護都具有現(xiàn)實意義。纖維素乙醇工業(yè)本身也會產(chǎn)生大量的酶解木質(zhì)素，若能將其應用于降低生物乙醇的生產(chǎn)成本方面將會有巨大的意義。

lou等發(fā)現(xiàn)低分子量高磺化度的木質(zhì)素可以有效地促進純纖維素的酶解，高分子量低磺化度的木質(zhì)素會抑制纖維素的酶解。提出了木質(zhì)素磺酸鹽可以與纖維素酶形成復合物來穩(wěn)定纖維素酶，并通過改變纖維素的酶解條件得到了驗證(cellulose,2014.21:1351-1359.)。

wang等發(fā)現(xiàn)纖維素酶與磺化木質(zhì)素結合后，纖維素酶與木質(zhì)纖維素底物中的木質(zhì)素之間的靜電排斥作用增加了，纖維素酶在木質(zhì)素上的無效吸附減小了，更多的纖維素酶可以參與到纖維素的水解中，實驗觀察到添加磺化木質(zhì)素可使預處理后的白楊樹和美國黑松的葡萄糖產(chǎn)率分別提高了25.9％和31.8％(biotechnologyforbiofuels,2013.6:1-10.)。

lin等將一種由酶解木質(zhì)素和聚乙二醇通過環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)合成的水溶性的木質(zhì)素聚氧乙烯醚(ehl-peg)用于促進玉米秸稈的酶解糖化。在ehl-peg作用下，玉米秸稈的72h酶解效率從16.7％提高到70.1％，而peg4600為52.3％。當木質(zhì)纖維素中木質(zhì)素含量越高，ehl-peg強化酶解的效果比peg4600越顯著(bioresourcetechnology,2015,185:165-170.)。

但是這些研究只是將木質(zhì)素改性后應用于促進木質(zhì)纖維素的酶解，并沒有在酶解結束后將仍然具有活性的纖維素酶加以回收利用。

技術實現(xiàn)要素：

為了克服木質(zhì)纖維素酶解工藝現(xiàn)有技術所存在的酶解效率低和纖維素酶用量大等缺點和不足，本發(fā)明的目的在于提供一種不僅可以有效地提高木質(zhì)纖維素的酶解效率，回收纖維素酶，而且擴大了工業(yè)木質(zhì)素的應用，不需要額外的設備，操作簡單，綠色環(huán)保的利用ph響應型木質(zhì)素兩性表面活性劑促進木質(zhì)纖維素酶解并回收纖維素酶的方法。

本發(fā)明方法首次提出了利用ph響應型木質(zhì)素兩性表面活性劑促進木質(zhì)纖維素的酶解并通過簡單的調(diào)節(jié)ph回收纖維素酶的方法。本發(fā)明以制漿造紙副產(chǎn)物木質(zhì)素或酶解木質(zhì)素為原料，經(jīng)過化學反應改性成ph響應型木質(zhì)素兩性表面活性劑，將其用于強化木質(zhì)纖維素的酶解和纖維素酶的回收。本發(fā)明木質(zhì)素兩性表面活性劑不僅能回收纖維素酶，而且其自身也可以回收后循環(huán)利用。

本發(fā)明的目的通過下述方案實現(xiàn)：

利用ph響應型木質(zhì)素兩性表面活性劑促進木質(zhì)纖維素酶解和回收纖維素酶的方法，包括以下步驟：將木質(zhì)纖維素加入緩沖溶液中，再加入ph響應型木質(zhì)素兩性表面活性劑和纖維素酶，控制混合溶液的ph為4.0～6.2，加熱至40～60℃溫度下反應24～96h，得到木質(zhì)纖維素的糖化水解液，通過固液分離后得到酶解液體，再調(diào)節(jié)酶解液體ph使ph響應型木質(zhì)素兩性表面活性劑和纖維素酶沉淀出來，循環(huán)利用。

為進一步實現(xiàn)本發(fā)明目的，優(yōu)選地，所述ph響應型木質(zhì)素兩性表面活性劑為工業(yè)木質(zhì)素或木質(zhì)素的衍生物為原料經(jīng)過化學反應引入陽離子基團和/或陰離子基團得到的具有ph響應的木質(zhì)素兩性表面活性劑，其中陰離子基團為羧基、磺酸基或磷酸基；所述陽離子基團為季銨基或胺基。

優(yōu)選地，所述工業(yè)木質(zhì)素為堿木質(zhì)素、有機溶劑木質(zhì)素或生物質(zhì)煉制木質(zhì)素，木質(zhì)素的衍生物為木質(zhì)素磺酸鹽、木質(zhì)素羧酸鹽、木質(zhì)素磷酸鹽、木質(zhì)素季銨鹽或木質(zhì)素胺鹽。

優(yōu)選地，所述ph響應型木質(zhì)素兩性表面活性劑為磺化季銨化木質(zhì)素、磺化胺化木質(zhì)素、硫酸化季銨化木質(zhì)素、硫酸化胺化木質(zhì)素、磷酸化季銨化木質(zhì)素、磷酸化胺化木質(zhì)素、羧化季銨化木質(zhì)素或羧化胺化木質(zhì)素。

優(yōu)選地，所述ph響應型木質(zhì)素兩性表面活性劑中陰離子或陽離子基團的含量均大于0.3mmol/g木質(zhì)素。ph響應型木質(zhì)素兩性表面活性劑中不同陰陽離子基團的含量為0.3～3mmol/g木質(zhì)素可保證木質(zhì)素兩性表面活性劑ph響應的靈敏性。

優(yōu)選地，所述再調(diào)節(jié)酶解液體ph使ph響應型木質(zhì)素兩性表面活性劑和纖維素酶沉淀出來的ph值取值為2.5-10.0。

優(yōu)選地，酶解結束后通過固液分離得到酶解液體的方法為自然沉降法、傾析法、過濾法、其特征在于，所述離心法或這些方法的聯(lián)合使用。

優(yōu)選地，所述木質(zhì)纖維素為松木、桉木、楊木、水曲柳、沙棘、伯樹、杉木、樺木、玉米芯、玉米秸稈、麥稈、甘蔗渣、稻草、稻殼、食用菌基質(zhì)和花生殼中的至少一種。

優(yōu)選地，所述緩沖液的量為木質(zhì)纖維素質(zhì)量的5～50倍，ph響應型兩性表面活性劑與木質(zhì)纖維素的質(zhì)量比為2～40：100。本發(fā)明緩沖溶液為常規(guī)纖維素酶適用緩沖溶液系統(tǒng)即可，如ph＝4.5～6.2，離子強度為5～200mmol/l的緩沖液。優(yōu)選為醋酸-醋酸鈉緩沖液、檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液或磷酸鹽緩沖液。

優(yōu)選地，所述纖維素酶的用量以木質(zhì)纖維素中的葡聚糖含量計為3～30fpu/g。

本發(fā)明ph響應型木質(zhì)素兩性表面活性劑在酶解的ph范圍內(nèi)(4.0～6.2)完全溶解在緩沖液中，酶解結束后，通過調(diào)高或調(diào)低酶解液體的ph(ph>6.2或ph<4.0)可以方便地從溶液中沉淀出來。調(diào)節(jié)酶解液體的ph值最低不超過2.5，最高不超過10.0。過高和過低的ph值都會導致纖維素酶的失活。所述的調(diào)節(jié)酶解液體中可能用到的酸為有機酸或無機酸(如鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸、醋酸、乙酸、甲酸、馬來酸等)；可能用到的堿為常規(guī)的堿(如氫氧化鈉，氫氧化鉀，氧化鈣，氫氧化鈣等)。

本發(fā)明的機理為：由于ph響應型木質(zhì)素兩性表面活性劑的溶解度可以隨ph調(diào)節(jié)，當ph在4.0～6.2時，ph響應型木質(zhì)素兩性表面活性劑完全溶解于緩沖液中，減少纖維素酶在木質(zhì)素上的無效吸附，促進木質(zhì)纖維素的酶解；當ph>6.2或ph<4.0時，ph響應型木質(zhì)素兩性表面活性劑析出，由于其與纖維素酶存在一定的相互作用(靜電作用、疏水作用、氫鍵作用)，所以在ph響應型兩性表面活性劑析出時會將溶液中的纖維素酶一起沉淀下來。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術，具有如下的優(yōu)點及有益效果：

(1)本發(fā)明以ph響應型木質(zhì)素兩性表面活性劑作為酶解助劑，對純纖維素的酶解沒有抑制作用，可使木質(zhì)纖維素的酶解糖化得率提高16.9～78.7％。

(2)本發(fā)明中回收纖維素酶的操作簡單、耗時短、不需要額外的設備，只需要簡單的調(diào)節(jié)ph就可以快速地回收纖維素酶。

(3)本發(fā)明以工業(yè)木質(zhì)素和木質(zhì)素衍生物為原料，將其應用于強化木質(zhì)纖維素酶解和纖維素酶的回收，避免了環(huán)境污染，有利于生物質(zhì)資源的綜合利用。

(4)本發(fā)明與目前普遍研究的將纖維素酶固定在溫度響應或ph響應聚合物上來回收纖維素酶相比可以避免纖維素酶在固定反應過程中的失活。

附圖說明

圖1是tcsl-n28在純水中的ph響應性情況圖；

圖2是ph響應型木質(zhì)素兩性表面活性劑促進木質(zhì)纖維素酶解和回收纖維素酶工藝流程圖。

具體實施方式

為更好地理解本發(fā)明，下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。下列實施例中所用試劑均可從市場購買得到。實施例中的微晶纖維素型號為ph101(購自西格瑪奧德里奇)，纖維素酶是目前被廣泛使用的cellicctec2，底物包含有稀酸預處理的桉木(桉木-da)和酸性亞硫酸法處理過的松木(松木-sporl)。實施例水解液中葡萄糖濃度是通過生物傳感分析儀(sba-40e，山東省生物科學研究院)測定的。

實施例涉及到三種ph響應型木質(zhì)素兩性表面活性劑，一種是由磺化木質(zhì)素(tcsl，湖南通道神華林木有限公司生產(chǎn))季銨化得到，等電點小于4.0；一種是由堿木質(zhì)素(kl，湖南湘江紙業(yè)有限公司生產(chǎn))季銨化得到，等電點大于7.0。一種是由木質(zhì)素磺酸鈉(sl，來源于楊木酸性亞硫酸鈉造紙廢液，由吉林石峴紙業(yè)有限責任公司生產(chǎn))胺化得到，等電點小于4.0。三種ph響應型木質(zhì)素兩性表面活性劑的具體合成方法如下：

季銨化磺化木質(zhì)素(tcsl-nx)：配制ph＝12的350gtcsl水溶液(tcsl占溶液質(zhì)量分數(shù)為20％)，倒入500ml的三口燒瓶，用水浴鍋將溫度升到80℃后，用蠕動泵將1.0769xg質(zhì)量分數(shù)為65wt％(3-氯-2-羥丙基)三甲基氯化銨溶液往燒瓶中緩慢滴加，控制滴加速度為1ml/min，滴加5min時加入0.3721xg質(zhì)量分數(shù)為20％的naoh水溶液，再繼續(xù)滴加完(3-氯-2-羥丙基)三甲基氯化銨溶液后，在80℃下反應3個小時，將得到的反應液用純水稀釋50倍后調(diào)節(jié)到ph＝3，使產(chǎn)品析出；x為(3-氯-2-羥丙基)三甲基氯化銨占tcsl的質(zhì)量分數(shù)，x的取值范圍為10～80。

季銨化堿木質(zhì)素(kl-n40)：配制ph＝12的350gkl水溶液(kl占溶液質(zhì)量分數(shù)為20％)，倒入500ml的三口燒瓶，用水浴鍋將溫度升到80℃后，用蠕動泵將43.08g質(zhì)量分數(shù)為65wt％(3-氯-2-羥丙基)三甲基氯化銨溶液往燒瓶中緩慢滴加，控制滴加速度為1ml/min，滴加5min時加入22.91g質(zhì)量分數(shù)為20％的naoh水溶液，再繼續(xù)滴加完(3-氯-2-羥丙基)三甲基氯化銨溶液后，在80℃下反應3個小時，將得到的反應液用純水稀釋50倍后調(diào)節(jié)到ph＝7，使產(chǎn)品析出。

胺化木質(zhì)素磺酸鈉(asl)：配制ph＝12的50gsl水溶液(sl占溶液質(zhì)量分數(shù)為20％)，倒入100ml的三口燒瓶，控制攪拌速度為350rpm，設定水浴鍋的溫度為80℃，當溫度升到50℃-55℃，加入1.5g甲醛溶液(甲醛沸點低，溫度低加入)，待溫度上升到80℃后，加入對應的3.657g二乙胺，在80℃下反應4h，將得到的反應液用純水稀釋50倍后調(diào)節(jié)到ph＝3，使產(chǎn)品析出。

實施例1

取100質(zhì)量份微晶纖維素，加入到5000質(zhì)量份ph為4.8，離子強度為50mmol/l的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，加入5質(zhì)量份tcsl-n25，再加入10fpu/g以微晶纖維素質(zhì)量計的纖維素酶，在50℃溫度下反應24h，反應結束后，離心分離獲得酶解液，將酶解液體的ph調(diào)至2.8，溶液出現(xiàn)大量沉淀后進行離心分離，再將得到的固體加入到與初始酶解條件(底物和緩沖液)相同的樣品中再次酶解24h(不補充纖維素酶和木質(zhì)素兩性表面活性劑)，通過生物傳感分析儀測定兩次酶解的葡萄糖含量，統(tǒng)計結果如表1所示。

實施例2

取100質(zhì)量份桉木-da，加入到5000質(zhì)量份ph為4.8，離子強度為25mmol/l的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中，加入25質(zhì)量份tcsl-n28，再加入20fpu/g以底物中葡聚糖計的纖維素酶，在50℃溫度下反應48h，反應結束后，離心分離獲得酶解液體，將酶解液體的ph調(diào)至3.0，溶液出現(xiàn)大量沉淀后進行離心分離，再將得到的固體加入到與初始酶解條件(底物和緩沖液)相同的樣品中再次酶解48h(不補充纖維素酶和木質(zhì)素兩性表面活性劑)，通過生物傳感分析儀測定兩次酶解的葡萄糖含量，統(tǒng)計結果如表1所示。

實施例3

取500質(zhì)量份松木-sporl，加入到5000質(zhì)量份ph為5.5，離子強度為5mmol/l的磷酸鹽緩沖溶液中，加入10質(zhì)量份tcsl-n30，再加入10fpu/g以底物中葡聚糖計的纖維素酶，在50℃溫度下反應72h，反應結束后，離心分離獲得酶解液體，將酶解液體的ph調(diào)至3.0，溶液出現(xiàn)大量沉淀后進行離心分離,再將得到的固體加入到與初始酶解條件(底物和緩沖液)相同的樣品中再次酶解72h(不補充纖維素酶和木質(zhì)素兩性表面活性劑)，通過生物傳感分析儀測定兩次酶解的葡萄糖含量，統(tǒng)計結果如表1所示。

實施例4

取100質(zhì)量份桉木-da，加入到5000質(zhì)量份ph為4.0，離子強度為5mmol/l的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，加入10質(zhì)量份kl-n40，再加入10fpu/g以底物中葡聚糖計的纖維素酶，在50℃溫度下反應48h，反應結束后，離心分離獲得酶解液體，將酶解液體的ph調(diào)至7.0，溶液出現(xiàn)大量沉淀后進行離心分離，再將得到的固體加入到與初始酶解條件(底物和緩沖液)相同的樣品中再次酶解48h(不補充纖維素酶和木質(zhì)素兩性表面活性劑)，通過生物傳感分析儀測定兩次酶解的葡萄糖含量，統(tǒng)計結果如表1所示。

實施例5

取100質(zhì)量份微晶纖維素，加入到5000質(zhì)量份ph為4.8，離子強度為5mmol/l的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中，加入25質(zhì)量份tcsl-n28，再加入20fpu/g以微晶纖維素質(zhì)量計的纖維素酶，在50℃溫度下反應24h，反應結束后，離心分離獲得酶解液體，將酶解液體的ph調(diào)至3.0，溶液出現(xiàn)大量沉淀后進行離心分離,再將得到的固體加入到與初始酶解條件(底物和緩沖液)相同的樣品中再次酶解48h(不補充纖維素酶和木質(zhì)素兩性表面活性劑)，通過生物傳感分析儀測定兩次酶解的葡萄糖含量，統(tǒng)計結果如表1所示。

實施例6

取250質(zhì)量份桉木-da，加入到5000質(zhì)量份ph為6.0，離子強度為5mmol/l的磷酸鹽緩沖溶液中，加入15質(zhì)量份asl，再加入20fpu/g以底物中葡聚糖計的纖維素酶，在50℃溫度下反應48h，反應結束后，離心分離獲得酶解液體，將酶解液體的ph調(diào)至3.2，溶液出現(xiàn)大量沉淀后進行離心分離，再將得到的固體加入到與初始酶解條件(底物和緩沖液)相同的樣品中再次酶解48h(不補充纖維素酶和木質(zhì)素兩性表面活性劑)，通過生物傳感分析儀測定兩次酶解的葡萄糖含量，統(tǒng)計結果如表1所示。

表1木質(zhì)素兩性表面活性劑促進木質(zhì)纖維素酶解和回收纖維素酶的情況

根據(jù)表1中可以看出，木質(zhì)素兩性表面活性劑可以有效地促進木質(zhì)纖維素的酶解，并且可以回收一定的纖維素酶，同時木質(zhì)素兩性表面活性劑也可以在過程中得到循環(huán)利用。

圖1是tcsl-n28在純水中的ph響應性情況圖，說明了tcsl-n28具有靈敏的ph響應性，在ph>4.0時溶解，在ph<4.0時沉淀。

圖2是木質(zhì)素兩性表面活性劑促進木質(zhì)纖維素酶解和通過調(diào)節(jié)ph來回收纖維素酶的工藝流程圖，過程中沒有涉及到復雜的工藝，不需要額外的設備，能耗低，綠色環(huán)保。

需要說明的是，本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。