專利名稱：抗綠膿桿菌卵黃免疫球蛋白的產(chǎn)品及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有抗體活性的卵黃免疫球蛋白產(chǎn)品及其應(yīng)用，特別是一種抗綠膿桿菌的抗體產(chǎn)品及應(yīng)用。
綠膿桿菌屬假單胞菌屬，可引起全身各部位的感染，繼發(fā)性感染尤為常見，是一種對人體健康危害較大的菌類。當(dāng)人體因各種原因造成免疫系統(tǒng)機(jī)能下降時，綠膿桿菌易侵入人體，引起多種疾病或加重病人原有病癥。當(dāng)前雖然有某些抗生素對其有一定作用，但該菌易產(chǎn)生耐藥性而使其失效。
本發(fā)明的目的在于提供一種具有抗體活性的抗綠膿桿菌卵黃免疫球蛋白(抗-PA IgY)的產(chǎn)品，并應(yīng)用它們配制保健品和生物制劑，用于防治綠膿桿菌原發(fā)病和繼發(fā)性感染以及用于綠膿桿菌檢測診斷試劑。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的具有抗體活性的抗綠膿桿菌卵黃免疫球蛋白(抗-PA IgY)的產(chǎn)品。該產(chǎn)品可以從以下步驟所獲得制備綠膿桿菌抗原，將綠膿桿菌抗原免疫母家禽，然后收集其所產(chǎn)禽卵，再從禽卵中提取卵黃免疫球蛋白。
在選擇母家禽品種時可選母雞，母雞喂養(yǎng)方便且飼養(yǎng)成本較低。
為有效制備綠膿桿菌抗原可采用下述步驟先從病人病灶中分離得到綠膿桿菌，繼而先將其接種于普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基小管內(nèi)，再分別接種于大豆酶解液培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃，收集培養(yǎng)液即得抗原。
從卵黃中提取卵黃免疫球蛋白，采用水稀釋法較優(yōu)越。此法不采用有機(jī)浸提劑，成本低，是一種無污染的提取方法。其步驟為從禽蛋中收集蛋黃，以蒸餾水稀釋，靜置過夜，離心取上清液，濃縮，冷凍干燥，得到卵黃免疫球蛋白。
本發(fā)明所提供的抗-PA IgY產(chǎn)品是由綠膿桿菌抗原免疫產(chǎn)卵家禽而得的，具有很強(qiáng)的特異性，對防治綠膿桿菌引起的原發(fā)病和繼發(fā)病有良好的效果，而且免疫球蛋白類制品能增強(qiáng)人體免疫機(jī)能，與此相對比，綠膿桿菌易產(chǎn)生耐藥性而使得抗生素失效。本發(fā)明采用家禽所產(chǎn)禽卵為載體，安全而無毒。家禽特別是母雞易飼養(yǎng)和管理，便于產(chǎn)業(yè)化。
下面結(jié)合實(shí)施例詳細(xì)說明本發(fā)明。
實(shí)施例1具有抗體活性的抗綠膿桿菌卵黃免疫球蛋白(抗-PA IgY)的產(chǎn)品，可以從以下步驟所獲得制備綠膿桿菌抗原，將綠膿桿菌抗原免疫母家禽，然后收集其所產(chǎn)禽卵，再從禽卵中提取卵黃免疫球蛋白。
實(shí)施例2用綠膿桿菌抗原免疫母雞，其余步驟采用實(shí)施例1的方法。
實(shí)施例3從病人病灶中分離得到綠膿桿菌，繼而先將其接種于普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基小管內(nèi)，再分別接種于大豆酶解液培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃，收集培養(yǎng)液即得綠膿桿菌抗原。
實(shí)施例4從綠膿桿菌抗原免疫后的家禽所產(chǎn)的禽蛋中收集蛋黃，以蒸餾水稀釋，靜置過夜，離心取上清液，濃縮、冷凍干燥，得到卵黃免疫球蛋白(抗-PAIgY)。
實(shí)施例5取實(shí)施例1-4提供的任何一種抗-PA IgY產(chǎn)品，將其稀釋，分別進(jìn)行間接血凝試驗(yàn)，單、雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)間接血凝試驗(yàn)將抗-PA IgY稀釋液加入間凝板小孔中，再加入0.5％綠膿桿菌致敏鞣酸血球一滴，然后置板于血凝微量振蕩器，振搖五分鐘，37℃、30分鐘?？梢娍字谐示磉厾畛恋?，即強(qiáng)陽性結(jié)果。
單向瓊脂擴(kuò)散取抗-PA IgY稀釋液注入培養(yǎng)器，再向其中加入2％進(jìn)口瓊脂液9ml，充分混勻，冷卻后打孔，加入煮沸失活綠膿桿菌液，37℃、24小時后觀察結(jié)果。結(jié)果可見各孔周圍均形成沉淀圈。
雙向瓊脂擴(kuò)散在1.5％進(jìn)口瓊脂板上打梅花形孔。中間孔滴加抗-PA IgY稀釋液，周邊孔分別加入不同濃度的煮沸失活綠膿桿菌液，以及大腸桿菌滅活菌液，金黃色葡萄球菌滅活菌液，37℃、48小時后觀察結(jié)果。結(jié)果可見抗-PA IgY孔與綠膿桿菌孔之間形成清晰沉淀線；而大腸桿菌孔，金黃色葡萄球菌孔與抗-PA IgY孔之間沒有沉淀線。
以上結(jié)果表明了抗-PA IgY具有特異性抗綠膿桿菌作用和較高的抗體活性。同時也表明抗-PA IgY可作為綠膿桿菌的檢測診斷試劑。實(shí)施例6由于抗-PA IgY對綠膿桿菌的特異性作用和較高的抗體活性，它可用于防治綠膿桿菌原發(fā)病和繼發(fā)病，將實(shí)施例1-4所提供的任何一種抗-PA IgY產(chǎn)品用于防治綠膿桿菌引起的呼吸道感染，肺炎，中耳炎，角膜炎，尿道炎，心內(nèi)膜炎，胃腸炎，敗血癥以及燒傷和創(chuàng)傷的綠膿桿菌繼發(fā)性感染。實(shí)施例7由抗-PA IgY產(chǎn)品組成的用于防治綠膿桿菌原發(fā)病和繼發(fā)性感染的保健品和生物制劑。實(shí)施例8含有抗-PA IgY的產(chǎn)品用于防治綠膿桿菌原發(fā)病和繼發(fā)性感染的保健品和生物制劑。實(shí)施例9應(yīng)用抗-PA IgY產(chǎn)品制備防治綠膿桿菌原發(fā)病和繼發(fā)性感染的保健品和生物制劑。實(shí)施例10將抗-PA IgY用于防治門脈高壓所致的腸道細(xì)菌易位，增強(qiáng)人體免疫機(jī)能。
肝硬變患者易于發(fā)生主要由腸道細(xì)菌引起的自發(fā)性菌血癥和腹膜炎，門脈高壓導(dǎo)致腸壁充血，水腫和腸內(nèi)細(xì)菌過度增殖，促使腸腔內(nèi)細(xì)菌向區(qū)域淋巴結(jié)或全身循環(huán)播散，即細(xì)菌易位。實(shí)驗(yàn)表明，腸道細(xì)菌易位是肝硬變自發(fā)性腹膜炎的一個重要早期過程。
以SD大鼠為研究對象，隨機(jī)分為以下三組門脈高壓防治組實(shí)驗(yàn)前胃內(nèi)灌注所配抗-PA IgY2ml，每日一次，連續(xù)三天；形成門脈高壓模型前24小時經(jīng)胃灌入綠膿桿菌活菌液108/kg；完成模型8小時后再經(jīng)胃灌入抗-PA IgY2ml；48小時后1％戊巴比妥麻醉，無菌操作取所需標(biāo)本備檢。
門脈高壓組實(shí)驗(yàn)前不作特殊處理，于形成模型前24小時經(jīng)胃灌入綠膿桿菌活菌液108/kg；完成模型48小時后，1％戊巴比妥麻醉，無菌操作取所需標(biāo)本備檢。
對照組經(jīng)胃灌入綠膿桿菌活菌液108/kg,24小時后，分離門靜脈但不縮窄，標(biāo)本采集同門脈高壓防治組。
以上三組SD大鼠分別于術(shù)后兩天取腸系膜淋巴結(jié)、門靜脈血和心血作細(xì)菌培養(yǎng)，對腸道細(xì)菌定量培養(yǎng)，光鏡下觀察肝、回腸病理改變。結(jié)果表明門脈高壓組腸系膜淋巴結(jié)和門脈血細(xì)菌檢出率明顯升高，但外周血培養(yǎng)為陰性；門脈血內(nèi)毒素水平顯著升高且門體循環(huán)內(nèi)毒素有顯著差異，腸內(nèi)容物內(nèi)毒素水平明顯升高；腸道菌量明顯增高；肉眼觀察，肝臟表面光滑，色澤紅潤，質(zhì)軟，回腸擴(kuò)張，平滑肌松馳，腔內(nèi)充滿液體和氣體，腸壁淤血，還可見面部腸粘膜糜爛，出血，光鏡下，肝臟輕度浮腫，灶性淋巴細(xì)胞浸潤，肝小葉結(jié)構(gòu)及肝細(xì)胞形態(tài)基本完整；回腸病理改變顯著，腸上皮細(xì)胞壞死脫落，少量炎性細(xì)胞浸潤，粘膜輕度淤血，出血。門脈高壓防治組其腸系膜淋巴結(jié)、門脈血細(xì)菌檢出率明顯降低，血及腸內(nèi)容物內(nèi)毒素水平顯著下降，腸道細(xì)菌過度增殖明顯受抑，肝、回腸病理改變顯著減輕。
由以上試驗(yàn)可見，門脈高壓促使腸道細(xì)菌和內(nèi)毒素易位，門脈高壓所致腸粘膜屏障功能受損，腸道微生態(tài)平衡的破壞和腸源性內(nèi)毒素血癥是細(xì)菌易位的重要促發(fā)因素，抗-PA IgY能夠減輕腸粘膜損傷，維護(hù)腸道微生態(tài)平衡和降低內(nèi)毒素水平，具有防治腸道細(xì)菌、內(nèi)毒素易位的作用。實(shí)施例11采用燒傷大鼠綠膿桿菌腸源性感染動物模型，用給燒傷大鼠口服特異性抗-PA IgY的方法，考察其對嚴(yán)重?zé)齻笫竽c源性感染的影響。
將健康SD大鼠隨機(jī)分為對照用的正常組，對照用的燒傷組及抗-PA IgY預(yù)防組大鼠禁食8小時后，胃管內(nèi)注入1.5％ NaHCO31ml，待一分鐘后注入108CFU/ml的綠膿桿菌的菌懸液(1ml/100g)，自由進(jìn)食。給菌后8小時，氯胺酮肌肉注射(30mg/kg)麻醉下，背部10％ Na2S脫毛。正常組不作任何處理。燒傷組及IgY預(yù)防組用100℃不銹鋼塊接觸脫毛區(qū)20秒，造成25％TBSA三度燒傷。傷后立即腹腔注射生理鹽水(3ml/100g)抗休克，創(chuàng)面立即涂布磺胺嘧啶銀霜劑，每24小時一次。IgY組燒傷后立即管飼抗-PA IgY2ml，每12小時重復(fù)一次，直到動物處死。燒傷組則管飼等容量生理鹽水。動物單籠管理，自由飲水，24小時后自由進(jìn)食。三組動物均于致傷后24小時及48小時活殺，解剖，進(jìn)行各項(xiàng)試驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果表明，燒傷后應(yīng)用抗-PA IgY預(yù)防使門脈血內(nèi)毒素含量顯著下降。燒傷后24小時，48小時兩個時相點(diǎn)均可反映出燒傷組門脈血內(nèi)毒素含量顯著高于正常組( P＜0.01)；IgY組門脈血內(nèi)毒素含量顯著低于燒傷組(P＜0.01)；IgY組門脈血內(nèi)毒素含量與正常組內(nèi)毒素含量無差異(P＞0.05)。另外，腸系膜淋巴結(jié)細(xì)菌培養(yǎng)正常組均為陰性，燒傷組燒傷后24小時，48小時腸系膜淋巴結(jié)細(xì)菌易位發(fā)生率分別為85.7％，80％，與IgY組相比0％,20％,P＜0.01燒傷組與IgY組燒傷后血培養(yǎng)結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計分析P＜0.01。
結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察，表明腸源性感染的嚴(yán)重程度與腸粘膜病理改變基本一致。血中細(xì)菌培養(yǎng)陽性表明嚴(yán)重?zé)齻罂蓪?dǎo)致膿毒癥。由此，試驗(yàn)證明在此動物模型上，使用抗-PA IgY后血漿內(nèi)毒素明顯下降，腸粘膜淋巴結(jié)細(xì)菌培養(yǎng)陽性率降低，腸道物理屏障得到保護(hù)，從而減少了腸源性感染的發(fā)生?？?PA IgY使用方便，可加入患者飲用水中服用，這是其它腸源性感染防治手段不可比擬的。
權(quán)利要求
1.一種抗綠膿桿菌卵黃免疫球蛋白(抗-PA IgY)產(chǎn)品，該產(chǎn)品可以從以下步驟所獲得制備綠膿桿菌抗原，將綠膿桿菌抗原免疫母家禽，然后收集其所產(chǎn)禽卵，再從禽卵中提取卵黃免疫球蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗-PA IgY產(chǎn)品，其特征在于被免疫的家禽是母雞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的抗-PA IgY產(chǎn)品，其特征在于為有效制備綠膿桿菌抗原，可采用下述步驟首先從病人病灶中分離得到綠膿桿菌，繼而先將其接種于普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基小管內(nèi)，再分別接種于大豆酶解液培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37℃，收集培養(yǎng)液即得抗原。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗-PA IgY產(chǎn)品，其特征在于采用水稀釋法提取卵黃免疫球蛋白，其步驟為從禽蛋中收集蛋黃，以蒸餾水稀釋，靜置過夜；離心取上清液，濃縮，冷凍干燥，得到卵黃免疫球蛋白。
5.由權(quán)利要求1-4項(xiàng)中任何一項(xiàng)所述的抗-PA IgY產(chǎn)品組成的用于防治綠膿桿菌引起的原發(fā)病的保健品和生物制劑。
6.含有權(quán)利要求1-4項(xiàng)中任何一項(xiàng)所述的抗-PA IgY產(chǎn)品，用于防治綠膿桿菌引起的原發(fā)病的保健品和生物制劑。
7.應(yīng)用權(quán)利要求1-4項(xiàng)中任何一項(xiàng)所述的抗-PA IgY產(chǎn)品制備防治綠膿桿菌引起的原發(fā)病的保健品和生物制劑。
8.由權(quán)利要求1-4項(xiàng)中任何一項(xiàng)所述的抗-PA IgY產(chǎn)品組成的用于防治綠膿桿菌繼發(fā)性感染的保健品和生物制劑。
9．含有權(quán)利要求1-4項(xiàng)中任何一項(xiàng)所述的抗-PA IgY產(chǎn)品用于防治綠膿桿菌繼發(fā)性感染的保健品和生物制劑。
10.應(yīng)用權(quán)利要求1-4項(xiàng)中任何一項(xiàng)所述的抗-PA IgY制備防治綠膿桿菌繼發(fā)性感染的保健品和生物制劑。
11.根據(jù)權(quán)利要求5-10項(xiàng)中任何一項(xiàng)所述的抗-PA IgY保健品和生物制劑防治的綠膿桿菌原發(fā)病和繼發(fā)病是下列疾病呼吸道感染，肺炎，中耳炎，角膜炎，尿道炎，心內(nèi)膜炎，胃腸炎，敗血癥，以及燒傷、創(chuàng)傷發(fā)生綠膿桿菌感染。
12.由權(quán)利要求1-4項(xiàng)中任何一項(xiàng)所述的抗-PA IgY產(chǎn)品用作綠膿桿菌的檢測診斷試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗綠膿桿菌的卵黃免疫球蛋白產(chǎn)品,綠膿桿菌抗原免疫產(chǎn)卵家禽,再從禽卵中提取提純后可得該產(chǎn)品。本發(fā)明的產(chǎn)品可制成保健品和生物制劑,可用于防治綠膿桿菌引起的原發(fā)病和繼發(fā)感染。本產(chǎn)品具有良好的活性和特異性。
文檔編號C07K16/02GK1208732SQ9811644
公開日1999年2月24日 申請日期1998年7月29日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月29日
發(fā)明者楊榮鑒, 曹勇, 陳紅兵, 熊勇華, 鐘青萍, 楊寧生 申請人:中德聯(lián)合研究院