專利名稱：：Hiv多包膜蛋白疫苗的重組痘苗載體混合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及人免疫缺損病毒(HIV)多包膜蛋白疫苗，此疫苗包括至少4-40且高達(dá)10,000種表達(dá)不同HIV包膜蛋白變異體的重組痘苗病毒混合物。此疫苗適用于接種包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物，從而可對HIV感染產(chǎn)生出乎意料增強(qiáng)的細(xì)胞和/或體液免疫反應(yīng)。另外，本發(fā)明還涉及制備和應(yīng)用這些重組痘苗病毒和多包膜蛋白疫苗的方法。
背景技術(shù)：
：到2000年，艾滋病很可能要吞噬幾千萬人的生命，是國際上最優(yōu)先關(guān)注的健康問題之一。〔見Devita等，獲得性免疫缺損綜合征(AIDS)，病原學(xué)，診斷，治療和預(yù)防，第三版，J.B.LippincottCo.Philadelphia,PA(1992)；Wong-Staal，病毒學(xué)，pp1529-1543；及Hirsch等，病毒學(xué)，pp1545-1570〕。設(shè)計(jì)有效的HIV疫苗對免疫學(xué)家尤其是一個(gè)挑戰(zhàn)，因?yàn)閰⑴cHIV復(fù)制的反轉(zhuǎn)錄酶具高出錯(cuò)率。這將導(dǎo)致許多HIV突變株的外殼或包膜蛋白有變異的蛋白序列。這些變異的外膜蛋白常被哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)認(rèn)為是不同的抗原，單為對抗外來抗原，哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)每天產(chǎn)生109個(gè)以上新的淋巴細(xì)胞。B細(xì)胞和T細(xì)胞分別是體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)的組成部分。這種免疫反應(yīng)定性威力的良好實(shí)例反映于HIV感染的病人和SIV感染的恒河猴。在每一種情況下，發(fā)生連續(xù)幾輪的感染，免疫和變異株HIVs或SIVs的建立?！瞁rin等，獲得性免疫缺損綜合征雜志7:211-219(1994)；BurnsandDesrosiers，微生物學(xué)與免疫學(xué)當(dāng)前論題。188:185-219(1994)〕。隨著每一輪循環(huán)，HIV抗原決定簇(及相應(yīng)的免疫反應(yīng))多樣性增加，以致于這些免疫反應(yīng)中和大范圍的SIV或HIV變異株，超感染大大地受抑制。然而，AIDS病人出現(xiàn)受損的免疫反應(yīng)不足以抵御HIV病毒感染克服病人的免疫系統(tǒng)。這可能部分緣于HIV變異株的建立，其包膜變異蛋白不被病人的免疫系統(tǒng)識別而得以逃避毀滅〔科學(xué)的美國人1995年8月pp〕。在這些情況下，免疫系統(tǒng)即使能抵御從頭感染(例如病毒特別隱蔽位點(diǎn)的持續(xù)突變)，HIV感染最終可能會(huì)克服病人的免疫反應(yīng)〔Pantaleo等，自然362:355-358(1993)；Embretson等，自然362:359-362(1993)〕。HIV蛋白的B細(xì)胞和T細(xì)胞抗原決定簇的鑒定還不完全。HIV包膜蛋白被分為變異區(qū)(V1-V5)和保守區(qū)(C1-C5)。盡管包膜蛋白的其他區(qū)域也參與引發(fā)免疫反應(yīng)，但V3區(qū)一段典型肽段被稱為主要中和決定簇(PND)〔Javaherian等，美國國家科學(xué)院院報(bào)86:6768-6772(1989)〕。HIV全長包膜蛋白包含約850-900個(gè)氨基酸，其長度差異緣于超突變。〔Starcich等，細(xì)胞45:637(1986)〕。在臨床試驗(yàn)中評價(jià)的最初抗HIV疫苗被設(shè)計(jì)成將單個(gè)包膜蛋白或其部分呈遞于免疫系統(tǒng)。然而，對單個(gè)或幾個(gè)包膜蛋白的中和反應(yīng)不能識別HIV的多種分離物，因而個(gè)體不能抵御感染〔Belshe等，美國醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)雜志272:431-431(1994)；美國專利No.5,169,763；PCT公開WO87/06262；Zagury等，自然332:728-731(1988)；Kieny等，艾滋病國際會(huì)議5:541(1989)；Eichberg，艾滋病國際會(huì)議7:88(1991)；Cooney等，美國國家科學(xué)院院報(bào)90:1882-1886(1993)；Graham等，傳染病雜志166:244-252(1992)；傳染病雜志167:533-537(1993)；Keefer等，艾滋病研究與人類逆轉(zhuǎn)錄病毒10(增刊2)S139-143(1994)；Gorse，艾滋病研究與人類逆轉(zhuǎn)錄病毒10(增刊2)S139-143(1994)；Gorse，艾滋病研究與人類逆轉(zhuǎn)錄病毒10(增刊2)141-143(1994)；McElrath等，傳染病雜志169:41-47(1994)；Fauci，科學(xué)264:1072-1073(五月，1994)〕。因而，發(fā)現(xiàn)能夠引發(fā)足以治療或預(yù)防HIV感染免疫反應(yīng)的疫苗和方法是困擾人們已久而且是急需解決的問題。發(fā)明概述本發(fā)明意欲克服相關(guān)領(lǐng)域的一個(gè)或多個(gè)缺陷。特別地，本發(fā)明的多包膜蛋白疫苗有助于引發(fā)更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。本發(fā)明的威力在于它能夠募集B細(xì)胞、輔助T細(xì)胞及細(xì)胞毒性T細(xì)胞的免疫反應(yīng)區(qū)室(compartmentsofimmuneresponse)以用于有效的體液和細(xì)胞免疫。例如，本發(fā)明引發(fā)很廣泛的HIV特異的抗體活性。HIV中和分析表明引發(fā)產(chǎn)生的抗體有很高的質(zhì)量。令人驚奇地是，本發(fā)明對“新的”HIV株也能產(chǎn)生免疫反應(yīng)，新HIV株指的是包膜蛋白不包含于多包膜蛋白雞尾酒中的HIV菌株。為了提供更有效的HIV疫苗，本發(fā)明提供多包膜蛋白疫苗，其中包括至少4種高到10,000種，優(yōu)選地4-約1000種，更優(yōu)選地約10-100種不同的重組病毒的混合物，其中每一種重組病毒表達(dá)不同的包括包膜蛋白保守區(qū)和變異區(qū)的HIV包膜蛋白變異體(EPV)(或其基本部分)。優(yōu)選地，表達(dá)的包膜蛋白變異體中的每一個(gè)都具有與存在于感染細(xì)胞或HIV脂雙層的原初HIV包膜蛋白如寡聚體形式相似的結(jié)構(gòu)和/或免疫原性。本發(fā)明也提供了制備和使用這些重組病毒和多包膜蛋白疫苗的方法。在用作為疫苗時(shí)，每一包膜蛋白變異體優(yōu)選地誘發(fā)不同B和/或T細(xì)胞亞群，每一亞群對不同的包膜蛋白反應(yīng)，且因此，對多種HIV變異體反應(yīng)。這些數(shù)目、型別和/或結(jié)構(gòu)的包膜蛋白混合物是現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)的方法，它可引發(fā)強(qiáng)而持久且具更廣泛中和活性的HIV特異的免疫反應(yīng)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，此重組病毒選自痘苗病毒、金絲雀痘病毒、腺病毒及腺病毒伴隨病毒(AAV)。在下述的一具體實(shí)例中，痘苗病毒用于制備多包膜蛋白疫苗。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的重組痘苗病毒疫苗為皮下方式給藥。本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)在于痘苗病毒的皮下施用不會(huì)導(dǎo)致創(chuàng)傷的形成，因此可避免感染性痘苗病毒的釋放，其中的感染性痘苗病毒對于免疫受損的人是一個(gè)很大的威脅。優(yōu)選地，本發(fā)明的重組病毒多包膜蛋白疫苗包括感染了病毒的培養(yǎng)細(xì)胞的裂解物，例如Vero細(xì)胞裂解物，它包括了表達(dá)的包膜蛋白變異體及感染性病毒。包含能刺激免疫反應(yīng)的包膜蛋白變異體裂解物是本發(fā)明的一個(gè)特別之處，因?yàn)橥ǔＧ闆r下病毒被從培養(yǎng)細(xì)胞裂解物中純化出去。本發(fā)明中的疫苗中，EV核酸可從一地理上隔離區(qū)域中感染了HIV病毒的病人中分離到，也可從不同的進(jìn)化枝(clades)感染了HIV病毒的病人分離到，也可來自HIV的實(shí)驗(yàn)室分離物。本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的多包膜蛋白疫苗可通過表達(dá)和/或呈遞多種包膜蛋白變異體來引發(fā)出乎意料增強(qiáng)的免疫反應(yīng)，每一變異體都包括保守區(qū)和變異區(qū)，優(yōu)選地，具有與原初HIV包膜蛋白基本相似的結(jié)構(gòu)。增強(qiáng)的免疫反應(yīng)也識別多包膜蛋白疫苗提供的能表達(dá)包膜蛋白株之外的HIV株。因此，這樣疫苗的目的是對廣泛的HIV株提供增強(qiáng)的免疫反應(yīng)，此免疫反應(yīng)適于治療或預(yù)防由不同病毒株引起的感染(或由突變引起的連續(xù)感染)。本發(fā)明也提供了編碼(或互補(bǔ)于)包膜蛋白變異體(EPV)的至少一個(gè)抗原決定簇的包膜蛋白變異體(EV)的核酸。如在本發(fā)明中進(jìn)一步提供的多包膜蛋白疫苗，EPV優(yōu)選地由重組病毒編碼。此變異的核酸包括向編碼的EPV提供不同的抗原特性或三維結(jié)構(gòu)的至少一種突變。本發(fā)明也提供了疫苗組合物，它包括本發(fā)明的多包膜蛋白疫苗和藥學(xué)上可以接受的載體或稀釋劑。此疫苗組合物可進(jìn)一步包括佐劑和/或細(xì)胞因子，佐劑和/或細(xì)胞因子在使用了該疫苗組合物的哺乳動(dòng)物體內(nèi)可以增強(qiáng)多包膜蛋白疫苗對于至少一種HIV株的免疫反應(yīng)。本發(fā)明的多包膜蛋白疫苗能夠誘發(fā)包括體液免疫反應(yīng)(如，抗體)和細(xì)胞免疫反應(yīng)(如B細(xì)胞、輔助T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTLS)的活化)中的至少一種。本發(fā)明也提供了在哺乳動(dòng)物中引發(fā)具有預(yù)防HIV感染的針對HIV感染的免疫反應(yīng)的方法。這種方法包括將包含有本發(fā)明的多包膜蛋白疫苗的疫苗組合物施用于哺乳動(dòng)物，它對于由至少一株HIV引起的臨床HIV-相關(guān)病理的哺乳動(dòng)物有保護(hù)作用。本發(fā)明也提供了在哺乳動(dòng)物中引發(fā)具有治療HIV感染的針對HIV感染的免疫反應(yīng)的方法。這種方法包括將包括本發(fā)明的滅活或減毒多包膜蛋白疫苗組合物施用于哺乳動(dòng)物，與對照組相比，在哺乳動(dòng)物中此組合物可引發(fā)增強(qiáng)的免疫反應(yīng)，此免疫反應(yīng)可對抗由至少一株HIV感染引起的臨床病毒病理。在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，引發(fā)抗HIV的免疫反應(yīng)的預(yù)防或治療方法包括施用有效量的另一種(如，第二種)多包膜蛋白疫苗，這些多包膜蛋白疫苗包括至少4～約10,000種不同的重組病毒，其中的重組病毒與前一次用的疫苗中的重組病毒是不同的種類，并且多包膜蛋白中的每種重組病毒包括編碼HIV包膜蛋白不同變異體的核苷酸。由本發(fā)明的多包膜蛋白重組病毒疫苗產(chǎn)生的HIV特異免疫反應(yīng)可由初次或加強(qiáng)的體液或細(xì)胞免疫反應(yīng)或兩者共同進(jìn)一步加強(qiáng)，這可通過有效量的至少一種重組HIV包膜蛋白或DNA疫苗或兩者共同使用來實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選地，重組蛋白或DNA疫苗也是多包膜蛋白疫苗。在此提供的任何疫苗策略可以任意順序使用。例如，對一受試者，可用多包膜蛋白重組病毒疫苗初次免疫，然后用DNA疫苗加強(qiáng)，最后用重組蛋白疫苗加強(qiáng)。優(yōu)選地，重組HIV包膜蛋白是與佐劑形成混合物。在下述的一具體實(shí)施方案中，重組HIV包膜蛋白以肌內(nèi)方法施用。優(yōu)選地，DNA疫苗以基因槍施用。本發(fā)明前述的方法提供了用遺傳工程方法構(gòu)建新質(zhì)粒載體的動(dòng)力。因此，在理論上講，本發(fā)明提供了既可用作DNA疫苗又可用作重組病毒載體的雙功能質(zhì)粒，它包括一個(gè)既在動(dòng)物表達(dá)控制序列又在病毒表達(dá)控制序列下的外源插入位點(diǎn)。優(yōu)選地，動(dòng)物表達(dá)控制序列是巨細(xì)胞病毒立即早期(CMV)啟動(dòng)子，而病毒表達(dá)控制序列是痘苗病毒早期啟動(dòng)子，痘苗病毒晚期啟動(dòng)子或兩者具備。通過下面對于有關(guān)本發(fā)明的詳細(xì)描述及實(shí)施例，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明其他目的、特征、優(yōu)點(diǎn)、用處及實(shí)施方案將顯而易見。附圖簡述圖1HIV-1基因在痘苗病毒基因組中的方向圖解。HIV-1包膜蛋白基因位于胸腺嘧啶核苷激酶座位左右兩片斷之間。HIV-1包膜蛋白基因的C末端有一個(gè)HindⅢ位點(diǎn)。適當(dāng)?shù)牟迦氘a(chǎn)生一個(gè)大約7kb的HindⅢ片段。Southern印跡帶型證實(shí)了HIV-1包膜蛋白基因的位置和正確方向。圖2數(shù)據(jù)圖解表明哺乳動(dòng)物模型中HIV特異抗體反應(yīng)是長期的。ELISA檢測典型的小鼠血清中HIV特異性抗體結(jié)果被顯示。每個(gè)樣品都在HIV-1包被的ELISA板上分析以前以1∶100(實(shí)心柱)、1∶1,000(影線柱)和1∶10,000(空心柱)的稀釋度稀釋。在注射了107噬斑形成單位(pfu)的表達(dá)HIV包膜蛋白的痘苗病毒構(gòu)建體后，對小鼠在不同的時(shí)間取樣(1個(gè)月，4個(gè)月和6個(gè)月)。用對照小鼠以不含包膜蛋白序列的痘苗病毒免疫。標(biāo)準(zhǔn)誤差示于圖上。圖3數(shù)據(jù)圖解表明痘苗病毒劑量如何影響至少免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)，包括HIV特異抗體的產(chǎn)生。在HIV-1包被板上用ELISA檢測典型小鼠血清樣品，血清樣品取自分別注射了105、106、107pfu的表達(dá)HIV-1包膜蛋白的一種痘苗病毒。注射后約三星期檢測血清，每個(gè)樣品都在HIV-1包被的ELISA板上分析以前以1∶100(實(shí)心柱)、1∶1,000(影線柱)和1∶10,000(空心柱)的稀釋度稀釋，標(biāo)準(zhǔn)誤差示于圖上。圖4數(shù)據(jù)圖解表明，痘苗病毒構(gòu)建體的混合不能損害注射的哺乳動(dòng)物中HIV特異的抗體的引發(fā)。注射107pfu的表達(dá)HIV包膜蛋白的痘苗病毒約2個(gè)月后檢測典型小鼠血清。“單個(gè)”代表來自注射單個(gè)痘苗病毒的小鼠樣品?！盎旌稀贝碜⑸浔磉_(dá)五種不同的包膜蛋白的痘苗病毒混合物的小鼠的樣品。每個(gè)樣品都在HIV-1包被的ELISA板上分析以前以1∶100(實(shí)心柱)、1∶1,000(影線柱)和1∶10,000(空心柱)的稀釋度稀釋，標(biāo)準(zhǔn)誤差示于圖上。圖5用PCR產(chǎn)物代替pEvenv4BH10序列產(chǎn)生新的痘苗病毒重組。序列替換的方法被列出。PCR產(chǎn)物在KpnⅠ和BsmⅠ單一酶切位點(diǎn)處替換各自的BH10包膜蛋白序列。質(zhì)粒切割后與PCR產(chǎn)物相連接，新的質(zhì)粒與野生型痘苗病毒(VV)重組產(chǎn)生痘苗病毒表達(dá)載體。圖6免疫后AbbottELISA中的反應(yīng)。來自4只猩猩的血清都用Abbott臨床分析法檢測(見后面的材料與方法)。Y-軸為血清樣品檢測結(jié)果，X-軸為每種檢測日期。用混合的痘苗病毒包膜蛋白疫苗免疫的猩猩中觀察到高的反應(yīng)。圖7既可作為DNA疫苗又可作為痘苗病毒重組載體的雙功能質(zhì)粒圖譜，巨細(xì)胞病毒立即早期(CMV)啟動(dòng)子和痘苗病毒(VV)晚期和早期啟動(dòng)子的存在使外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞或痘苗病毒感染細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。公開內(nèi)容的詳細(xì)描述對混合型HIV多包膜蛋白疫苗出乎意料地增強(qiáng)的免疫反應(yīng)的發(fā)現(xiàn)。提供抗不同HIV株疫苗的先前嘗試集中于gp120或gp160的一個(gè)或多個(gè)變異區(qū)。期望這些提供于疫苗中的變異區(qū)能夠廣泛地抵御HIV感染。然而，這樣的疫苗沒有成功，其中疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)不能識別許多不同的HIV株。所以，提供能引發(fā)針對多種HIV株產(chǎn)生免疫反應(yīng)的疫苗是關(guān)鍵的、必需的，從而該疫苗適用于HIV的治療和/或預(yù)防。本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)使用含有至少4種多至1,000種，甚至10,000種分別編碼不同包膜蛋白變異體(EPV)的重組病毒混合物的多包膜蛋白疫苗可誘導(dǎo)產(chǎn)生對抗幾種或多種不同HIV株的出乎意料增強(qiáng)的初級和次級(加強(qiáng))免疫反應(yīng)。這種疫苗也包括由病毒表達(dá)的包膜蛋白(EPVs)變異體，例如，由產(chǎn)生病毒的宿主細(xì)胞表達(dá)的蛋白。在此應(yīng)用的術(shù)語“初次”或“初級的”和“加強(qiáng)”或“加強(qiáng)的”分別指的是初始的和隨后的免疫，即與免疫學(xué)中用的術(shù)語的定義是一致的。編碼EPV的核酸(包膜蛋白變異體(EV)核酸)能從相同或不同感染了HIV的人群(如地理上的)中分離到。另一種方法是，通過篩選編碼序列的差異或根據(jù)已知方法，在體內(nèi)體外，估計(jì)其引發(fā)的對抗多種HIV株的體液或細(xì)胞免疫反應(yīng)的差異從任何來源篩選得到不同的EV核酸。最初發(fā)現(xiàn)涉及重組痘苗病毒疫苗。然而本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易理解，任何重組病毒都可用于表達(dá)本發(fā)明疫苗的多包膜蛋白抗原。而且，許多病毒疫苗的使用可排除使病毒疫苗加強(qiáng)免疫效力降低(緣于可能的強(qiáng)抗病毒反應(yīng)的加強(qiáng))的抗病毒免疫反應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員任何人很容易理解，本發(fā)明者進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，用重組一種或多種HIV包膜蛋白，優(yōu)選地，多種蛋白進(jìn)行加強(qiáng)免疫，會(huì)進(jìn)一步加強(qiáng)本發(fā)明免疫方法的效果。該一種或多種HIV包膜蛋白可與多包膜蛋白疫苗中表達(dá)的HIV包膜蛋白相一致，它們也可以不同。相似地，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解，本發(fā)明的免疫方法可由于DNA疫苗的使用而加強(qiáng)。DNA疫苗可用于加強(qiáng)免疫，例如，如上有關(guān)重組HIV蛋白的描述。另一種方法是，DNA疫苗可用作初次免疫，一種或多種重組病毒疫苗用于加強(qiáng)抗HIV的免疫反應(yīng)。如同重組包膜蛋白增強(qiáng)疫苗，DNA疫苗可包括一種或多種表達(dá)一種或多種HIV包膜蛋白基因的載體。另外，HIV包膜蛋白基因可與重組病毒疫苗表達(dá)的基因一致也可不同。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，制備載體用于在重組病毒疫苗和轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中于表達(dá)而作為DNA疫苗的一部分。人們發(fā)現(xiàn)免疫反應(yīng)(體液的和/或細(xì)胞的)對傳染性病毒如HIV有更廣泛的毒株范圍，而不局限于由多包膜蛋白疫苗中提供的表達(dá)特定的外膜蛋白變異體(EPVs)的病毒株。本發(fā)明提供了可對多種HIV株產(chǎn)生出乎意料地增強(qiáng)的免疫反應(yīng)的由重組病毒疫苗編碼的多種包膜蛋白變異體(EPVs)。多包膜蛋白癌苗和免疫本發(fā)明一方面提供了使用包括至少4種直至10,000種不同重組痘苗病毒混合物的多包膜蛋白疫苗。其中的每一痘苗病毒都表達(dá)不同的包膜蛋白變異體或其具有抗原性的一部分。本領(lǐng)域任一技術(shù)人員很容易理解，4種至約1000種或優(yōu)選地約10種至100種不同的重組病毒可以被應(yīng)用。本領(lǐng)域的任何普通技術(shù)人員更容易理解其他病毒也可用作疫苗，可用作疫苗的重組病毒主體的合適的病毒的實(shí)例除了痘苗病毒外還包括金絲雀痘病毒、腺病毒和腺病毒伴隨病毒。同時(shí)本發(fā)明也提供了制備和應(yīng)用這種多包膜蛋白疫苗的方法。在使用了這種多包膜蛋白疫苗的哺乳動(dòng)物中，本發(fā)明的多包膜蛋白疫苗可誘發(fā)體液免疫和細(xì)胞免疫中的至少一種，但對此疫苗的反應(yīng)是亞臨床的，或此疫苗加強(qiáng)至少對一株HIV的至少一種免疫反應(yīng)，由此，這種疫苗的使用適合于接種目的。病毒疫苗多種遺傳工程病毒主體(“重組病毒”)可用于制備多包膜蛋白病毒疫苗以用作HIV多包膜蛋白抗原。病毒疫苗特別有優(yōu)勢，因?yàn)椴《靖腥境煞挚纱龠M(jìn)強(qiáng)的引發(fā)B淋巴細(xì)胞，輔助T淋巴細(xì)胞及細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞活化的免疫反應(yīng)。多種病毒可用作本發(fā)明疫苗的病毒主體。優(yōu)選地，用于病毒疫苗的重組病毒是痘苗病毒〔國際專利公開WO87/062621987年10月22日。Moss等；Cooney等美國國家科學(xué)院院報(bào)90:1882-6(1993)；Graham等，傳染病雜志166:244-52(1992),McElrath等，傳染病雜志169:41-7(1994)〕。金絲雀痘病毒可用于另一實(shí)施方案〔Pialoux等，艾滋病研究與人類逆轉(zhuǎn)錄病毒11:373-81(1995)，艾滋病研究與人類逆轉(zhuǎn)錄病毒勘誤11:875(1995)；Andersson等，傳染病雜志，174:977-85(1996)；Fries等，疫苗14:428-34(1996)；Gonczol等，疫苗13:1080-5(1995)〕。另一種選擇是缺陷型腺病毒或腺病毒〔Gilardi-Hebenstreit等，普通病毒學(xué)雜志71:2425-31(1990)；Prevec等，傳染病雜志161:27-30(1990)；Lubeck等，美國國家科學(xué)院院報(bào)86:6763-7(1989)；Xiang等，病毒學(xué)219:220-7(1996)〕。其他合適的病毒載體包括反轉(zhuǎn)錄病毒，它可被包裝入有雙嗜性的宿主細(xì)胞〔見Miller人類基因治療1:5-14(1990)；Ausubel等，當(dāng)前分子生物學(xué)方法，§9〕，和減毒或缺陷型DNA病毒，如但不局限于單純皰疹病毒(HSV)〔見如Kaplitt等，分子細(xì)胞神經(jīng)科學(xué)2:320-330(1991)〕，乳頭瘤病毒、EB病毒(EBV)、腺病毒伴隨病毒(AAV)〔見如Samulski等，病毒學(xué)雜志61:3096-3101(1987)；Samulski等，病毒學(xué)雜志63:3822-3828(1989)〕等。DNA疫苗是傳統(tǒng)疫苗之外的另一種疫苗。它包括抗原和佐劑，可在體內(nèi)直接將編碼抗原的DNA導(dǎo)入受治療者的組織，由受試者組織的細(xì)胞表達(dá)抗原，這樣的疫苗在此稱為“DNA疫苗”或“基于核酸的疫苗”。DNA疫苗在國際專利公開WO95/20660和國際專利公開WO93/19183中有所描述。直接注射的編碼誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)病毒蛋白的DNA的能力已在很多實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中表現(xiàn)出來〔Conry等，癌癥研究54:1164-1168(1994)；Cox等，病毒學(xué)67:5664-5667(1993)；Davis，人類分子遺傳學(xué)，2:1847-1851(1993)；Sedegah等，美國國家科學(xué)院院報(bào)91:9866-9870(1994)；Montgomery等，DNA細(xì)胞生物學(xué)12:777-783(1993)；Ulmer等，科學(xué)，259:1745-1749(1993)；Wang等，美國國家科學(xué)院院報(bào)90:4156-4160(1993)；Xiang等，病毒學(xué)199:132-140(1994)〕。對流感病毒中和分析。此策略的研究既用包被蛋白又用內(nèi)部病毒蛋白以誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生，但特別集中于血凝素蛋白(HA)〔Fynan等，DNA細(xì)胞生物學(xué)，12:785-789(1993A)；Fynan等，美國自然科學(xué)院院報(bào)90:11478-11482(1993B)；Robinson等，疫苗，11:957(1993)；Webster等，疫苗，12:1495-1498(1994)〕。直接將編碼HIV包膜蛋白的DNA導(dǎo)入的接種可引發(fā)產(chǎn)生細(xì)胞介導(dǎo)的和體液兩種保護(hù)性免疫反應(yīng)。這與用活病毒的結(jié)果相類似〔Raz等，美國國家科學(xué)院院報(bào)91:9519-9523(1994)；Ulmer,1993，前述；Wang,1993，前述；Xiang,1994，前述〕。有關(guān)雪貂的研究表明抗流感病毒保守內(nèi)部蛋白與表面糖蛋白的DNA疫苗，在對抗流感病毒的抗原變異體比滅活疫苗和亞病毒疫苗都更為有效〔Donnelly等，NatMedicine6:583-587(1995)〕。實(shí)際上，對編碼核蛋白DNA的重復(fù)出現(xiàn)的免疫反應(yīng)基本上在動(dòng)物的一生中都持續(xù)存在的情況在小鼠中有所報(bào)導(dǎo)〔Yankanckas等，DNA細(xì)胞生物學(xué)12:771-776(1993)〕。本領(lǐng)域中眾所周知，很多因素可影響抗原基因的表達(dá)效率和/或DNA疫苗的免疫原性。這些因素的例子包括接種的可重復(fù)性，質(zhì)粒載體的構(gòu)建，驅(qū)動(dòng)抗原基因表達(dá)的啟動(dòng)子的選擇及質(zhì)粒中插入基因的穩(wěn)定性。依不同來源，啟動(dòng)子在組織特異性和起始mRNA合成的效率方面有差異〔Xiang等，病毒學(xué)，209:564-579(1994)；Chapman等，核酸研究，19:3979-3986(1991)〕。到目前為止，哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中大部分DNA疫苗都依賴于來自巨細(xì)胞病毒(CMV)的病毒啟動(dòng)子。在多種哺乳動(dòng)物中，這些啟動(dòng)子在肌肉和皮膚接種方面有很高的效率。另外一個(gè)影響DNA免疫引發(fā)的免疫反應(yīng)的已知因素是DNA運(yùn)送的方法，非腸道途徑的基因轉(zhuǎn)移效率低并且產(chǎn)生很高的基因表達(dá)的變化性〔Montgomery1993前述〕。用基因槍高速接種質(zhì)粒可增強(qiáng)小鼠的免疫反應(yīng)?！睩ynan,1993B前述；Eisenbraun等，DNA細(xì)胞生物學(xué)，12:791-797(1993)〕，可能是緣于更大的DNA轉(zhuǎn)染效率和樹枝狀細(xì)胞其更有效的抗原呈遞。包含有本發(fā)明的基于核酸的疫苗的載體也可用本領(lǐng)域其他方法導(dǎo)入預(yù)期的宿主細(xì)胞。例如轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)體(溶酶體融合)或用一DNA載體轉(zhuǎn)運(yùn)器〔見例Wu等，生物化學(xué)雜志，267:963-967(1992)；WuandWu，生物化學(xué)雜志263:14621-14624(1988)；Hartmut等，加拿大專利申請No.2.012,311,1990年3月15日提交〕。用于病毒和DNA疫苗的雙功能質(zhì)粒本發(fā)明優(yōu)選的一方面是其設(shè)計(jì)了既能用作DNA疫苗又可做為重組病毒載體的雙功能質(zhì)粒。純化的質(zhì)粒的直接注射，即作為DNA疫苗會(huì)在受試者體內(nèi)引發(fā)針對由此質(zhì)粒表達(dá)的抗原的免疫反應(yīng)。此質(zhì)粒也可做為免疫運(yùn)載體應(yīng)用于活的重組病毒。本發(fā)明的雙功能質(zhì)粒提供可處于兩種不同的表達(dá)控制序列之下的外源基因或外源基因插入位點(diǎn)一為動(dòng)物表達(dá)控制序列，一為病毒的表達(dá)控制序列。術(shù)語“控制之下”使用的為其普遍意義，即可操作地與表達(dá)控制序列相關(guān)如啟動(dòng)子連接，提供外源基因的表達(dá)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，動(dòng)物表達(dá)控制序列是一個(gè)哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子(本發(fā)明也打算用鳥類啟動(dòng)子)，在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期啟動(dòng)子(見圖7)，在進(jìn)一步的一特定實(shí)施方案中，病毒啟動(dòng)子是痘苗病毒早期啟動(dòng)子或痘苗病毒晚期啟動(dòng)子，優(yōu)選地或兩者都包括其中(見圖7)。受試者可接受一個(gè)多層次的治療方案的免疫，其中，雙功能質(zhì)粒以DNA使用，并且在另一時(shí)間可以任何順序，以重組病毒疫苗使用。本發(fā)明打算單次或多次將此雙功能質(zhì)粒作為DNA疫苗或重組病毒疫苗或既作為DNA疫苗又作為重組病毒疫苗使用。此接種方案既可與重組蛋白疫苗(見后述)相補(bǔ)充運(yùn)用，又可與另外的疫苗工具聯(lián)合使用。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員很容易理解本發(fā)明的雙功能質(zhì)?？捎米鞫喟さ鞍滓呙巛d體。因此，通過將至少4至約10,000種，優(yōu)選地4-1,000種，更優(yōu)選地10-100種不同的HIV包膜蛋白基因插入雙功能質(zhì)粒就可制備出一套相應(yīng)的用作多包膜蛋白疫苗的雙功能質(zhì)粒。重組蛋白疫苗根據(jù)本發(fā)明，用一種或多種HIV包膜蛋白接種引發(fā)的活性免疫性能夠引起或加強(qiáng)細(xì)胞或體液免疫反應(yīng)。一種或多種HIV包膜蛋白或其具有抗原性的片段可與一種佐劑相混合制備疫苗。術(shù)語“佐劑”指的是能加強(qiáng)針對抗原的免疫反應(yīng)的化合物或混合物。佐劑可作為一個(gè)組織庫緩慢釋放抗原并且可作為淋巴系統(tǒng)的激活劑能夠非特異性地增強(qiáng)免疫反應(yīng)(Hood等，免疫學(xué)，第二版1984，Benjamin/Cummings:MenloParkCaiifornia.p384)。通常，在缺乏佐劑的情況下，單用抗原的初次激發(fā)是不能引發(fā)體液或細(xì)胞免疫。佐劑包括但不限于完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、皂苷、礦物膠如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、普盧蘭尼克多元醇、聚陰離子(polyanions)、肽、油或烴乳膠、匙孔血藍(lán)蛋白、二硝基苯酚和有效的人用佐劑如BCG(卡介菌)及小棒桿菌。佐劑的選擇依賴于接種的受試者。優(yōu)選地，使用藥物上可接受的佐劑。例如，用于人的疫苗應(yīng)避免用油或烴乳膠佐劑，包括完全和不完全弗氏佐劑。適用于人的佐劑的一個(gè)實(shí)例是明礬(氧化鋁膠)。在下面一特定實(shí)施方案中，重組HIV包膜蛋白與明礬聯(lián)合用于肌內(nèi)用藥。另一種方法是，重組HIV包膜蛋白疫苗可通過皮下、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)或其他可接受的疫苗用藥途徑施用。疫苗的施用根據(jù)本發(fā)明，針對HIV的免疫可單用本發(fā)明的重組病毒疫苗，或與DNA疫苗或重組蛋白疫苗或同時(shí)與兩者聯(lián)合使用。在一特定的實(shí)施方案中，于明礬中的重組HIV包膜蛋白通過肌肉注射加強(qiáng)免疫反應(yīng)。每一劑量的病毒疫苗可含有同樣的4-10,000，優(yōu)選地4-1000，更優(yōu)選地10-100種表達(dá)不同HIV包膜蛋白基因的重組病毒。另一種方法，隨后的疫苗中的病毒可表達(dá)不同HIV包膜蛋白的基因。在另外一個(gè)實(shí)施方案中，隨后多包膜蛋白病毒疫苗可與前面疫苗部分相同，另一部分也可不同。例如，初次疫苗可含有表達(dá)任意標(biāo)號為1-10HIV包膜蛋白的痘苗病毒。第二次(加強(qiáng))疫苗可含有表達(dá)6-15號或11-20號等HIV包膜蛋白的痘苗病毒(或優(yōu)選不同的病毒，如金絲雀痘病毒或腺病毒)。DNA疫苗或重組蛋白疫苗可包括一種或多種HIV包膜蛋白抗原。優(yōu)選地，本發(fā)明使用的DNA或重組蛋白疫苗包括一種以上的HIV包膜蛋白抗原。在后面的病毒疫苗中，HIV包膜蛋白或DNA疫苗中的蛋白或重組蛋白疫苗可與多包膜蛋白病毒疫苗中表達(dá)的HIV包膜蛋白一致，它也可與任一多包膜蛋白不同?？傊?，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案打算在接種方案中提供盡可能多的變化；以使接受者暴露于最大數(shù)量的HIV包膜蛋白且從而提供與新型HIV分離物產(chǎn)生中和交叉反應(yīng)的最大機(jī)會(huì)。包膜蛋白變異體如前所述，用于本發(fā)明疫苗的EPV可以從局限于某一地理區(qū)域的分離物或進(jìn)化枝(clades)或從地理上不同的分離物中得到即不同的進(jìn)化枝。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解，從自然分離物中得到的包膜蛋白核苷酸(即基因)有很多優(yōu)點(diǎn)分離物易于得到，相當(dāng)于理想免疫性的天然蛋白的EVPs和HIV突變可迅速從新的分離物中捕捉到。EPV也包括了具有免疫原性的多肽，EPV氨基酸序列中至少可作為一個(gè)表位或抗原決定簇的氨基酸序列引發(fā)這種免疫原性。此氨基酸序列基本上與已知的HIVEPV的一段至少10-900個(gè)氨基酸片段和/或其共有序列相一致。這樣的EPV與已知的包膜蛋白氨基酸可全部同源或至少有50％相同。如50-99％同源或其中的任何范圍或數(shù)值，同時(shí)可引發(fā)針對至少一株HIV的免疫原反應(yīng)。例如，通過運(yùn)用來自Wisconsin遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)小組(UWGCG)的計(jì)算機(jī)程序GAP,6.0版，通過比較序列信息可以測定同源百分?jǐn)?shù)。GAP程序運(yùn)用了Needleman和Wunsch的序列比較方法〔分子生物學(xué)雜志48:443(1970)〕，此程序由Smith和Waterman修改〔應(yīng)用數(shù)學(xué)進(jìn)展2:482(1981)〕。簡單地說，GAP程序以序列比較符號(即核苷酸或氨基酸)的數(shù)目除以兩個(gè)序列中短序列比較的符號總數(shù)來確定其相似性。GAP程序優(yōu)選缺失參數(shù)包括(1)單一的比較矩陣(1代表相同和0代表不同)和Gribskov和Burgess的加權(quán)比較矩陣核酸研究14:6745(1986),Schwartz和Dayhoff編，“蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖譜”在國家生物醫(yī)學(xué)研究基金會(huì)，WashingtonDC(1979)pp353-358中做過描述。(2)一個(gè)缺口罰3.0并且一個(gè)缺口中的一個(gè)符號罰0.10且(3)末端缺口不罰分。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的EPV是至少一種HIV包膜蛋白的變異形式。優(yōu)選地，EPV包括gp120及gp41的寡聚區(qū)，gp140〔Hallenberge等，病毒學(xué)193:510-514(1993)〕。已知的HIV包膜蛋白包含約750-900個(gè)氨基酸。從商業(yè)和研究性的HIV序列庫中可容易得到這樣的序列的實(shí)例，HIV序列庫如GENBANK或已發(fā)表的匯編物如Myers等編，人類反轉(zhuǎn)錄病毒和艾滋病核酸和氨基酸序列匯編和分析，第1、Ⅱ卷。理論生物學(xué)和生物物理(TheoreticalBiologyandBiophysics)LosAlamosNM(1993)。為了得到其他的由用于本發(fā)明重組病毒或多包膜蛋白疫苗，核酸編碼的EPV的EPV的替換或插入可包括至少一個(gè)氨基酸殘基的替換或插入(例如1-25個(gè)氨基酸)。另一種方法，至少一個(gè)氨基酸(如1-25個(gè)氨基酸)可從EPV序列中被刪除。優(yōu)選地，這些替換、插入或刪除基于包膜蛋白序列的測定加以確定，包膜蛋白序列測定是通過對來自感染了HIV的個(gè)體的一個(gè)以上編碼EPV核酸序列的序列測定而獲得的。非限制性的替換、插入或刪除優(yōu)選通過從感染HIV-1的病人擴(kuò)增包膜蛋白DNA或RNA序列得到。這些替換、插入或刪除可用常規(guī)實(shí)驗(yàn)提供的包膜蛋白或包膜蛋白變異體的修飾后的結(jié)構(gòu)和功能特征來確定。這樣得到的EPVs優(yōu)選地具有與原初EPV不同的抗原特性。這些抗原差異可通過合適的測定方法來測定。如在ELISA測定中，用一組特異的抗HIV包膜蛋白的單克隆抗體來檢測。只要最終的EPV蛋白能引發(fā)可結(jié)合于HIV包膜任何替換、插入或刪除都可應(yīng)用只要得到的EPV蛋白與第二種EPV有不同的引發(fā)方式的結(jié)合HIV包膜蛋白的抗體。上述每一個(gè)替代、插入或刪除也包括修飾或稀有氨基酸，如在37C.F.R.§1.822(p)(2)所提供的。下列表1提供了非限制性的可供選擇的HIV包膜蛋白變異體，它們可由本發(fā)明的重組病毒編碼。<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="985">表1HIV包膜蛋白變異體1020301234567891234567891234567891KEOKTVAHRVKESQMKKQHLWRWGWRWGTEKMKAMGTRRNCPNWLKITKGYITTMIKKSYNCRKGKMI,I,MIRMGGEWRRKITTYKETDWQSSI</table></tables><tablesid="table2"num="002"><tablewidth="993">405060123456789123456789123’45678931MLLGLMICSATEKLWVTVYYGVPVWKEATLIFWIITSLVVSQYASIIEDEAMAIMTPLGAQDAHVIAMLTPCIEDNN’TIANKVA</table></tables><tablesid="table3"num="003"><tablewidth="986">70809012345678912345678912345678961TTLFCASDAKAYDTEVHNVWATH’ACVPTDPPVERRTHSRAKICSYNNSTKARKQGLAKQEPK</table></tables><tablesid="table4"num="004"><tablewidth="997">1001001201234567891234567891234S678991NpQEVVLVNVTENFNHWKNDMVEQMHEDIIDHILMGSGEDIRNIDQTVSRLYEDKTSNTYMDpDYFSH</table></tables><tablesid="table5"num="005"><tablewidth="996">130140150123456789123456789123456789121SLWDQSLKpCVKLTPLCVSLKCTDLKNDTNNEEEVMLCVTMNKHVTTASEQNDINYGGMTQSHQWRIIGKFLS</table></tables><tablesid="table6"num="006"><tablewidth="988">1601701801234567891234S6789123456789151TSNNVTSSSWGRNIMEEGEIKNCSFNISTSNKSSKTTKNWKREIDREKMTKPYKVTKGIENVTISKEKTGQAGVRTYQPNGSQWVIGSRRQEQMILGTVNKLTE</table></tables><tablesid="table7"num="007"><tablewidth="991">190200210123456789123456789123456789181IRGKVQKEYAFFYKLDIIPIDKGNDSNDLGDRIKQDNSLLRNHVVQVKDSDINPKDAVKNQMHRVRTYHRTLAKLGNTSRSEKETASTNTPMEEGSKTQGHHVSSNN</table></tables><tablesid="table8"num="008"><tablewidth="986">220230240123456789123456789123456789211TTSYKFTLTSCNTSVITQACPKVSFESTTNANTWKRIIHSRTTVKSITQSNIRNYINDSALTDSGKTIM</table></tables><tablesid="table9"num="009"><tablewidth="987">250260270123456789123456789123456789241PIPIHYCAPAGFAILKCNNKTFNGTGPCTNFMFTGTYVMFKDAKSKEQKHLRSPEESSHECTSTQIR</table></tables><tablesid="table10"num="010"><tablewidth="985">280290300123456789123456789123456789271VSTVQCTHGIRPVVSTQLLLNGSLAEEEVVITSRTKITHITSKGGIKVHSTSRKRDRRKGIDM</table></tables><tablesid="table11"num="011"><tablewidth="987">310320330123456789123456789123456789301IRSANFTDNAKTIIVQLNQSVEINCTRPNNLMGDDISNSVRIWLAHKEPIAVVYIESIVAELMEGTDNVTTATLQTAAKMVSPAGVDAVMEEYKKLHTTHHQ</table></tables><tablesid="table12"num="012"><tablewidth="988">340350360123456789123456789123456789331NTRKSIRIQRGFGRAFVTIGKILGNMRQAKVNRRYHRHIAPKQVIHATRRKISDIGKYKSGNYKMPSSRKTWYVRKQSRANLLTRPQTHLYLMMSVFRLDDGVFTSRSIVGPSWYINMEAVANITV</table></tables><tablesid="table13"num="013"><tablewidth="986">370380390123456789123456789123456789361HCNISRAKWNNTLKQIDSKLREQFGNNKTIYKLAGEQKAVIEGVVKSYKKKYKDQSVTVNKTDSKAVQKLATQQAHLDHTYERNERISRTEHGVRSMASAFDNLRIIP</table></tables><tablesid="table14"num="014"><tablewidth="986">400410420123456789123456789123456789391IFKQSSGGDPEIVTHSFNCGGEFFYCNSTQVSNHHACCLVTMYNLIVRDIDTSGNLTSPISLLTTVAANAAKGVHMWRPKSNTQHEK</table></tables><tablesid="table15"num="015"><tablewidth="993">430440450123456789123456789123456789421LFNSTWFNSTWSTKGSNNTEGSDTITLPCRMDSNIYRLNKAGIEWNSGMKENNNLIHQKIDTCNVGDDPIKDGDGGREGPVVILTGFSDSKKNTCGTSNQARELKDAGMGMLDIQSKRS</table></tables><tablesid="table16"num="016"><tablewidth="986">460470480123456789123456789123456789451IKQIINMWQEVGKAMYAPPISGQIRCSSNIEFVRIAGTRQSTDLFGRVLSFIKRRARLTQEKESKIKTTVLVELT</table></tables><tablesid="table17"num="017"><tablewidth="987">490500510123456789123456789123456789481TGLLLTRDGGANENNESEIFRPGGGDMRDNTIVSSVTDQTSDTVVISLTNIKNIIEESKSAGENTLAEDGTAKRNLVGEDKTII</table></tables><tablesid="table18"num="018"><tablewidth="986">550560570123456789123456789123456789541EKRAVGEIGALFLGFLGAAGSTMGAASMTLKEIFIVVMSIVSSAVALAVQAVTLMVLPRPIAMFIGVLITT</table></tables><tablesid="table19"num="019"><tablewidth="987">580590600123456789123456789123456789571TVQARQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQAGRTHHVMKDHSMKGQMKPPLDRDELKQRS</table></tables><tablesid="table20"num="020"><tablewidth="988">610620630123456789123456789123456789601LTVWGIKQLQARILAVERYLKDQQLLGIWGSIVRRLVQLTFIRERRMEFLWTLISLQNKIRMGSNNL</table></tables><tablesid="table21"num="021"><tablewidth="986">640650660123456789123456789123456789631CSGKLICTTAVPWNASWSNKSLEQIWNNMTRKRTVPTKSTGRRTMDDFDKTMHYNFASYNQNMGHLIFNGVSSQTNASRKKW</table></tables><tablesid="table22"num="022"><tablewidth="988">670680690123456789123456789123456789661WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNELQEKLVDSVSNTYTILTDAAIGIQIKQHEKIGIFNEQQTDQVQQSDVNDRKEV</table></tables><tablesid="table23"num="023"><tablewidth="990">700710720123456789123456789123456789691QELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIKLFIMLDGNETNSSSSQSRIAVIRAASKGYGKKKKQLDQ</table></tables><tablesid="table24"num="024"><tablewidth="985">730740750123456789123456789123456789721IVGGLVGLRIVFAVLSVVNRVRQGYSPLSFVIAAIIVKVIMSIFCIIKSFSAQLATNLRNINI</table></tables><tablesid="table25"num="025"><tablewidth="986">760770780123456789123456789123456789751QTHLPIPRGPDRPEGIEEEGGERDRDRSIRIRTHVQEELGQLDRTDGGDQGKGTWVGLANTTGAETQGEGPGGQPPIARQESKNPFGSSA</table></tables><tablesid="table26"num="026"><tablewidth="986">790800810123456789123456789123456789781LVNGSLALIWDDLRSLCLFSYHRLRDLLLIALDFSTQFYECWTCFSSCRLTNFASTSPHLPLVGNIIIWLQSSSCICVTCQGAGTQSTH</table></tables><tablesid="table27"num="027"><tablewidth="985">820830840123456789123456789123456789811VTRIVELLGRRGWEALKYWWNLLQYWSQELAAKTIDIKHGLLDGIRLLGSVVLIKIVALSTRLLINICICAAMIGRKLKYVGCTTMVRL</table></tables><tablesid="table28"num="028"><tablewidth="986">850860870123456789123456789123456789841KNSAVSLLNATAIAVAEGTDRVIEVVQGAYRIVINWFDTIVVTGEGILIARRICQSFSFVAVSNRKAAGATLTLWATVGFV</table></tables><tablesid="table29"num="029"><tablewidth="663">88088912345678912345678871RAIRHIPRRIRQGLERILLQGFLNVHTVFKGLQTIVIAAVRS</table></tables>因此，基于以上特定的替代例子，可通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)制備另一種替代以提供本發(fā)明中其它的包膜蛋白變異體，如，通過在產(chǎn)生不同的免疫反應(yīng)包膜蛋白或多包膜蛋白變異體中制備一個(gè)或多個(gè)替代、插入或刪除。本發(fā)明中EPV氨基酸序列的變化可通過DNA突變的方法制備。這樣的EPVs包括，例如，對于氨基酸序列中編碼不同氨基酸殘基的核苷酸進(jìn)行刪除、插入或替代。很明顯，編碼EPV核酸中制備的突變不能置于閱讀框架之外且優(yōu)選地也不能制造出互補(bǔ)區(qū)以使mRNA出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)〔見如Ausubel(1995綜述)前述；Sambrook(1989)，前述〕。根據(jù)本發(fā)明的講授和指導(dǎo)，本發(fā)明中編碼EPV的核酸也可用對編碼包膜蛋白或其突變體的DNA、RNA的核苷酸擴(kuò)增或進(jìn)行定點(diǎn)誘變來制備，且據(jù)此合成或反轉(zhuǎn)錄編碼DNA以制備編碼EPV的DNA或RNA〔見如Ausubel(1995綜述)前述；Sambrook(1989)前述〕。本發(fā)明中的表達(dá)EPVs的重組病毒，重組包膜蛋白變異體或編碼它們的核酸載體包括了一套有限的EPV編碼序列作為替代核苷酸，基于本發(fā)明的講授和指導(dǎo)，本領(lǐng)域的任何普通技術(shù)人員不需過多實(shí)驗(yàn)，可常規(guī)得到此替代核苷酸。查詢有關(guān)蛋白質(zhì)化學(xué)和結(jié)構(gòu)的詳細(xì)描述見Schulz.G.E.等，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)原理，Springer-Verlag,NewYork,NY(1978)和CreieightonT.E.，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子特征，W.H.Freeman&amp;Co.,SanFrancisco；CA(1983)。查詢有關(guān)核酸序列替換，如密碼子優(yōu)先，見Ausubel等編，當(dāng)前分子生物學(xué)方法。GreenePublishing.Assoc.NewYorkNY(1987、1988、1989、1990、1991、1992、1993、1994、1995)(在下文，“Ausubel(1995綜述)”)在§§A.1.1-A.1.24和SambrookJ．等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(ColdSpringHarborLaboratoryPress)ColdSpringHarbor.NY(1989)的附錄(和附錄1)。因此，參照本發(fā)明的講授和指導(dǎo)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將會(huì)明白如何在包膜蛋白DNA或RNA的其他位置替代其他的氨基酸以得到多種可選擇的EPV，包括替代、刪除或插入變異體。HIV活性的篩選測定為了從免疫了本發(fā)明疫苗的個(gè)體中篩選抗HIV活性的血清或細(xì)胞，本領(lǐng)域眾所周知的任何已知和/或合適的篩選測定方法都可使用。如已知的HIV測定包括病毒感染性測定〔見如Chesebro等，病毒學(xué)雜志62:3779-3788(1988)；Aldovini等編，HIV研究技術(shù)pp71-76(1990)〕；中和測定〔見如Golding等，艾滋病研究與人類逆轉(zhuǎn)錄病毒10:633-643(1994)；Hanson.艾滋病研究與人類逆轉(zhuǎn)錄病毒10:645-648(1994)；Laal等，人類反轉(zhuǎn)錄病毒研究9:781-785(1993)；Hanson獲得性免疫缺損綜合征7:211-219(1994)〕；外周單核細(xì)胞(PMN)測定〔見如Arduino等，抗微生物試劑及化學(xué)治療(Antimicrob.AgentsChemother)37:1095-1101(1990)〕；和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)測定〔見如Hammond等，實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志176:1531-1542(1992)；McElrath等，病毒學(xué)雜志68:5074-5083(1994)；Walker等，細(xì)胞免疫學(xué)119:470-475(1989)；Winhold等，艾滋病研究與人類逆轉(zhuǎn)錄病毒8:1373(1992)〕。其他合適的活性單獨(dú)或聯(lián)合使用的方法包括但不局限于轉(zhuǎn)錄、復(fù)制、翻譯、病毒顆粒的摻入、毒性、病毒產(chǎn)量和/或形態(tài)發(fā)生的定量和/或定性。具體實(shí)施方案編碼EPVs的重組痘苗病毒多包膜蛋白疫苗及其制備和應(yīng)用方法概述表達(dá)HIV包膜蛋白(如gp41、gp120和/或gp160或其一部分)的重組痘苗病毒為用于生產(chǎn)和檢測能誘發(fā)針對病毒的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)中至少一種的混合疫苗，以及B細(xì)胞和細(xì)胞毒性T(CTL)細(xì)胞決定簇的分析提供了材料。本發(fā)明的多包膜蛋白疫苗由n種不同的重組痘苗病毒組成，其中“n”是一個(gè)從4-10,000(或其中的任何范圍或數(shù)值)，其中每一種痘苗病毒載體構(gòu)建體表達(dá)HIV包膜蛋白(EPV)的變異體(如gp41、gp120或gp160)。重組痘苗病毒功能上編碼EPV，它是通過將野生型痘苗病毒與質(zhì)粒重組制備的。多種不同的編碼EPV的質(zhì)粒能通過用一種EPV編碼序列替代另一種制備，如用限制酶切片段或誘變的方法。重組痘苗病毒的制備制備單個(gè)質(zhì)粒(每一質(zhì)粒表達(dá)特定的HIV蛋白序列)的方法可利用DNA或RNA擴(kuò)增將分離到的包膜蛋白變異體序列替代入一個(gè)載體(如pVenv4或pVenv1)〔Hallenberger等，病毒學(xué)193:510-514(1993)〕，此載體編碼已知的HIV包膜蛋白序列(如可從NIAIDAIDSResearch&amp;ReferenceReagentProgram,RockvilleMD得到)。根據(jù)本發(fā)明的講授和指導(dǎo)不需過多試驗(yàn)，可應(yīng)用本領(lǐng)域眾所周知的擴(kuò)增RNA或DNA的方法。已知的DNA或RNA擴(kuò)增方法包括但不局限于多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)及相關(guān)的擴(kuò)增方法(見如美國專利Nos.4,683,195、4,683,203、4,800,159、4,965,188Mullis等；4,795,699和4,921,794Taber等；5,142,033Innis等；5,122,464Wilson等；5,091,310Innis等；5,066,584Gyllensten等；4,889,818Gelfand等；4,994,370Silver等；4,766,067Biswas等；4,656,134Ringold等)和用目的基因的反義RNA做模板合成雙鏈DNA的RNA介導(dǎo)的擴(kuò)增(美國專利Malek等，No.5,130,238，其商品名為基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA))。例如，用這種途徑制備的重組痘苗病毒構(gòu)建體可用于接種并可誘發(fā)HIV特異的T和/或B細(xì)胞反應(yīng)。引物利用HIV保守序列且可成功地從多種不同的HIV-1病人樣品中擴(kuò)增包膜蛋白基因。這里描述的基本技術(shù)可類似地應(yīng)用于PCR或其他類型的擴(kuò)增引物從而將現(xiàn)場分離物的較小或較大的包膜蛋白序列以編碼HIV包膜蛋白的載體中相應(yīng)序列替代。見如Ausubel后述，Sambrook后述。編碼EPV的核酸此技術(shù)開始為從感染了HIV的細(xì)胞中分離DNA并且用PCR擴(kuò)增包膜蛋白基因。PCR或其他擴(kuò)增產(chǎn)物提供了分離HIV序列最簡單的方法。但是，任何其他合適的和已知的方法如EPV編碼核酸或蛋白的克隆和分離也可應(yīng)用(見Ausubel后述；Sambrook后述)。優(yōu)選地，限制性酶切位點(diǎn)摻入PCR或其他擴(kuò)增引物序列以便于基因克隆。分離的用于PCR的DNA可從多種病毒來源制備，包括新鮮的或冰凍的HIV陽性(HIV+)病人全血及體外感染了病毒分離物的細(xì)胞。為了制備新的HIV包膜蛋白構(gòu)建體，多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)優(yōu)選地用于從每個(gè)不同的HIV病人樣品中擴(kuò)增100-2700堿基對(bp)的包膜蛋白基因。PCR引物代表了保守性強(qiáng)的HIV序列，它們適于從已知包膜蛋白基因樣品，分離到的HIV或不同的HIV病人樣品中擴(kuò)增包膜蛋白基因。此擴(kuò)增的DNA優(yōu)選地包括gp120和gp41(二者都是gp160的一部分)中編碼10-900個(gè)(如100-400個(gè)、400-600個(gè)或600-900個(gè)或這里的任何范圍或數(shù)值)氨基酸的部分。優(yōu)選地，一個(gè)或多個(gè)包膜蛋白變異區(qū)(V1-V5)和保守區(qū)(C1-C5)，更優(yōu)選的地，V1、C1、V2、C2、V3、C3、V4、C4和V5的絕大部分區(qū)域包含于PCR產(chǎn)物。另外，擴(kuò)增產(chǎn)物能編碼gp120/gp41切點(diǎn)以外的1-200個(gè)氨基酸。優(yōu)選地，整個(gè)包膜蛋白基因的大部分或全部被擴(kuò)增。任選地，擴(kuò)增的編碼gp160的序列缺失編碼跨膜區(qū)和/或胞質(zhì)末端區(qū)域的部分或全部序列?！惨娙鏗allenberger等，(1993)〕。PCR引物可以設(shè)計(jì)地使痘苗病毒載體中的包膜蛋白基因序列的兩側(cè)為限制性酶切位點(diǎn)，從而這些限制性切點(diǎn)摻入擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物中。通過使用眾所周知的替代克隆技術(shù)，表達(dá)來自1-10,000個(gè)病人的包膜蛋白變異體序列的痘苗病毒質(zhì)粒衍生物可通過用病人EPV編碼序列的一部分替代痘苗病毒質(zhì)粒中的包膜蛋白序列的相應(yīng)部分來制備，如可用限制性酶切片段來替代。例如，用KpnⅠ和BsmⅠ處理pVenv4質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物以獲得編碼截短的gp160的1-639位氨基酸，它缺乏跨膜區(qū)和gp41的胞質(zhì)末端區(qū)域〔見如Halenberger等，(1993)〕。將PCR產(chǎn)物和pVenv4產(chǎn)物連接后，通過許多本領(lǐng)域眾所周知的方法中的任何一種，如電穿孔，將連接混合物轉(zhuǎn)化入細(xì)菌宿主細(xì)胞，并通過測序挑選和鑒定重組菌落。編碼HIV包膜蛋白的重組痘苗病毒構(gòu)建體編碼EPV的痘苗病毒在宿主細(xì)胞中與野生型痘苗病毒重組，表達(dá)EPV的病毒噬斑被篩選出來從而制備到了病毒原種(stock)。VVenv’s的病毒原種中的每一個(gè)都包含有不同的編碼EPV的序列，它們與至少4-40最多至約10,000種不同的重組病毒混合形成本發(fā)明中的多包膜蛋白疫苗。對包含有EPV序列的重組痘苗病毒質(zhì)粒，任選地測序或用HIV包膜蛋白特異的抗體篩選以確定不同的包膜蛋白變異體(EPVs)。Sanger雙脫氧鏈終止反應(yīng)法測序是優(yōu)選的。該方法是從以前描述的方法中優(yōu)先選用的?！睸ambrook等，(1989)后述；美國生物化學(xué)的測序酶2.0版-DNA測序試劑盒，第9版，Amsherman生命科學(xué)公司(1994)〕，從引物位置開始應(yīng)讀約50-300個(gè)堿基對。制備重組痘苗病毒表達(dá)載體的方法在本領(lǐng)域眾所周知〔見Mackett.M.等，美國國家科學(xué)院院報(bào)79:7415-7419(1982)；Panicali.D.和PaolettiE.美國國家科學(xué)院院報(bào)79:4927-4931(1982)；美國專利No.4,169,763Mazzara,G.P.等，酶學(xué)方法217:557-581(1993)；Ausubel等，后述，§§16.15-16.19〕。以前描述過的pSC11載體〔Chakrabarti,S.等，分子細(xì)胞生物學(xué)5:3403-3409(1985)〕可優(yōu)選地用于制備編碼包膜蛋白質(zhì)粒如pVenv4。作為病毒載體，痘苗病毒有許多有用的特征，包括克隆大片段外源DNA的能力(大于20kb)，外源基因插入后感染性的保留，宿主范圍廣泛，相對高的蛋白合成水平，表達(dá)蛋白一級結(jié)構(gòu)所決定的正確地轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌、加工和翻譯后修飾和宿主類型的使用。例如，表達(dá)蛋白可忠實(shí)地進(jìn)行N-O糖基化、磷酸化、十四烷基化、切割及裝配。痘苗病毒載體的幾種變異體已開發(fā)出來并適用于本發(fā)明(如見Ausubel等，后述§§16.15-16.19)。最常見的是，得到病毒原種后(Ausubel后述§16.16)，編碼EPV的核酸序列置于痘苗病毒啟動(dòng)子的控制之下并整合到痘苗病毒的基因組中從而保持感染性(Ausubel等，后述§16.17)。另一種方法，將含有痘苗病毒啟動(dòng)子控制的編碼EPV基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到有野生型痘苗病毒感染過的細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。優(yōu)選地，這些細(xì)胞和痘苗病毒載體都適于并被批準(zhǔn)用于哺乳動(dòng)物和人的接種。可用已知的多種方法使這些重組病毒具有特性(Ausubel等，后述§16.18)。在進(jìn)一步的一種變異體中，噬菌體T7RNA多聚酶鏈可被整合到痘苗病毒基因組，這樣編碼EPV的序列將在T7啟動(dòng)子的控制下表達(dá)，無論是質(zhì)粒還是重組痘苗病毒，此基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的胞質(zhì)中表達(dá)。因?yàn)榧?xì)胞或其他病毒啟動(dòng)子常常不被痘苗病毒的轉(zhuǎn)染裝置所識別，痘苗病毒啟動(dòng)子被優(yōu)先選用。優(yōu)選地，早期/晚期啟動(dòng)子聯(lián)合應(yīng)用于用以多包膜蛋白疫苗的重組痘苗病毒，因?yàn)樗杀磉_(dá)EPV作抗原，后者與主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ或Ⅱ呈現(xiàn)于重組痘苗病毒感染細(xì)胞中。與HIV包膜蛋白復(fù)合物相關(guān)的MHC形成細(xì)胞毒性T細(xì)胞的靶子，這樣初次免疫的哺乳動(dòng)物會(huì)產(chǎn)生針對表達(dá)的HIVEPVs的細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)和/或體液反應(yīng)。這是因?yàn)槎幻绮《据d體在宿主細(xì)胞中誘導(dǎo)MHC對這種抗原的呈遞的能力在感染后期降低的緣故。起始于早期的轉(zhuǎn)錄在序列TTTTTNT后終止，因此導(dǎo)致了不充分的MHC呈遞。另一種方法是，為了增強(qiáng)宿主細(xì)胞中包膜蛋白抗原的MHC呈遞，如果使用了痘苗病毒早期啟動(dòng)子，可通過誘變改變基因編碼序列內(nèi)的終止序列。(Earl等，后述1990)。為了模仿痘苗病毒的mRNAs，如果非翻譯先導(dǎo)區(qū)和3′-終止序列用于摻入有HIVEPV編碼序列的痘苗病毒質(zhì)粒中，它們應(yīng)該比較短。優(yōu)選地，設(shè)計(jì)用于制備根據(jù)本發(fā)明痘苗構(gòu)建體的質(zhì)粒，其具有痘苗啟動(dòng)子下游env基因插入的限制性酶切位點(diǎn)(Ausubel等，下述§16.17)。更為優(yōu)選地，該質(zhì)粒已經(jīng)含有包膜蛋白的編碼序列，其中的限制性位點(diǎn)特征性地出現(xiàn)于靠近包膜蛋白編碼序列每個(gè)首尾端。然后EPV編碼序列中的相同限制性片段可替代質(zhì)粒中相應(yīng)的序列。在這種情況，從質(zhì)粒中去除大多數(shù)或所有包膜蛋白編碼序列后可插入EPV編碼序列的主要部分。優(yōu)選地，得到的痘苗病毒構(gòu)建體(包含有EPV編碼序列和痘苗病毒啟動(dòng)子)的兩側(cè)為痘苗病毒DNA以便于將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入野生型痘苗病毒感染過的細(xì)胞中時(shí)發(fā)生同源重組。所選的痘苗病毒DNA序列不能使之在重組時(shí)破壞關(guān)鍵的病毒基因。不經(jīng)過選擇，重組痘苗病毒與親代痘苗病毒的比例通常約為1∶1000。盡管此比例足夠高可用于噬斑雜交(見Ausubel等，后述§§6.3和6.4)或免疫篩選(Ausubel等，后述§6.7)的方法挑選重組病毒，利于確定重組病毒的許多方法已被應(yīng)用。這種選擇或篩選的非限制實(shí)例在本領(lǐng)域?yàn)橐阎?見Ausubel等，后述§16.17)。通常，表達(dá)盒的兩側(cè)為痘苗病毒胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因片段，從而重組將導(dǎo)致TK基因失活。在5-溴-脫氧尿苷(5-Br-dU)存在時(shí)，通過感染TK陰性的細(xì)胞系，TK陰性表型的病毒可與TK陽性表型病毒區(qū)別開來，其中的5-BrdU經(jīng)TK磷酸化后可致死性地?fù)饺氩《净蚪M。另外一種方法或附加地，重組病毒可通過細(xì)菌抗生素抗性基因，如氨芐青霉素(amp)或鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(gpt)共表達(dá)來篩選。進(jìn)一步的一個(gè)實(shí)例中，大腸桿菌lacZ基因的表達(dá)可與X-gal共同篩選重組病毒噬斑(Ausubel，后述§16.17)。本發(fā)明中表達(dá)EPV的重組痘苗病毒可任選地根據(jù)已知方法進(jìn)行減毒或滅活，如加熱、低聚甲醛處理、紫外線照射、propriolactene處理、形成雜合體或嵌合體或其他已知方法。〔見如Zagury等，自然332:728-731(1988)；Ito等，癌癥研究50:6915-6918(1990)；Wellis等，免疫學(xué)雜志99:1134-9(1967)；D.Honcht，疫苗10(增刊)548-52(1992)；Selenka等，ArchHygBakteriol,153:244-253(1969)；Grundwald-Bearch等，臨床腫瘤學(xué)癌癥研究雜志117:561-567(1991)〕。例如，60℃熱滅活將很大程度地降低病毒滴度。這樣的減毒技術(shù)經(jīng)過了安全性檢驗(yàn)，因?yàn)椴煌耆臏缁钣锌赡軐?dǎo)致病人的死亡〔Dorozynski和Andorson科學(xué)252:501-502(1991)〕。當(dāng)病人免疫系統(tǒng)受損時(shí)應(yīng)用減毒的或滅活重組痘苗病毒，因?yàn)槭褂没畹亩幻绮《緯?huì)導(dǎo)致并發(fā)癥甚至死亡。藥物組合物本發(fā)明中適于接種或非腸道施用或口服的藥物制劑包括由至少4種多至10,000種，優(yōu)選地4-1000種，更優(yōu)選地約10-100種不同重組病毒的多包膜蛋白重組病毒疫苗。其中的重組病毒為細(xì)胞裂解物形式、膜結(jié)合碎片形式、部分純化或完全純化的形式。優(yōu)選地，多包膜蛋白疫苗包括包含細(xì)胞裂解物(或其膜結(jié)合碎片)的重組病毒，細(xì)胞裂解物中進(jìn)一步包括重組病毒已表達(dá)的EPV蛋白?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)表達(dá)的EPVs能增強(qiáng)初次抗體反應(yīng)。多包膜蛋白疫苗組合物可以無菌水或非水溶液、懸浮液或乳濁液形式，也可包括本領(lǐng)域所知的輔助劑或賦形劑。如在此講述的至少約4-40到10,000種不同病毒的每一種都編碼和表達(dá)不同的EPV?？蛇x擇編碼EPVs的DNA以代表存在于特定隔離社區(qū)的艾滋病人的EPV。例如，疫苗可代表TN州孟菲斯市的序列并且此疫苗是針對此地區(qū)應(yīng)用的。設(shè)計(jì)代表一地理上限定區(qū)域的疫苗也可用于靶社區(qū)以外的社區(qū)。另外的方法，可選擇代表地理上遠(yuǎn)離的社區(qū)、城市或國家如進(jìn)化枝(clades)的編碼EPVs的DNA。例如，在一種多包膜蛋白疫苗中可代表多個(gè)克隆。多包膜蛋白組合物可進(jìn)一步包括免疫調(diào)制劑如細(xì)胞因子，它們可加強(qiáng)對病毒感染的免疫反應(yīng)。見如Berkow等編Merk手冊，第十五版，MerkandCo.,Rahway,NY(1987)；Goodman等編Goodman和Gilman’s治療學(xué)的藥物學(xué)基礎(chǔ)，第八版，Pergamon出版公司，Elmsford,NY(1990)；Avery的藥物治療臨床藥物學(xué)和治療學(xué)的原理和實(shí)踐，第二版、AIDS出版社公司，Williams和Wilkins.Baltimore,MD(1987)；Katzung編，基礎(chǔ)和臨床藥物學(xué)，第五版，Appleton和LangeNorwalkCT(1992)。在此引用的文獻(xiàn)代表了本領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀。本領(lǐng)域的普通人員都可理解，本發(fā)明的多包膜蛋白疫苗提供給個(gè)體時(shí)，它可包含于可進(jìn)一步包括至少鹽、緩沖液、佐劑或其他有助于提高組合物效果的物質(zhì)的組合物中。佐劑是能用于特異性增強(qiáng)至少一種免疫反應(yīng)的物質(zhì)。通常，佐劑和復(fù)合物在呈遞于免疫系統(tǒng)前混合，或分別在同一免疫部位呈遞?；诮M成，佐劑可大致分為幾類，這幾類包括油類佐劑、無機(jī)鹽(如硫酸鋁鉀(AlK(SO4)2)、硫酸鋁鈉(AlNa(SO4)2)、硫酸鋁銨(AlNH4(SO4))、二氧化硅、高嶺土和碳)、多聚核苷酸(如多聚IC和多聚AU核酸)及一些自然物質(zhì)(如來自結(jié)核分枝桿菌的蠟D，存在于小棒桿菌呀百日咳桿菌及布魯氏菌屬某些成員中的物質(zhì))。在以上物質(zhì)中做為佐劑尤其有用的是皂苷如QuilA,SuperfosA/s,Denmark)，適合于疫苗組合物的實(shí)例公布于如Osol.A.ed.雷明頓(Remington)的藥物科學(xué)，Mack出版公司Easton.PA(1980)pp1324-1341。本發(fā)明的多包膜蛋白藥物組合物可進(jìn)一步或附加包括至少一種抗病毒化療復(fù)合物非限制性的實(shí)例可從下面的物質(zhì)中選擇至少一種γ-球蛋白、金剛胺、胍、羥基苯并咪唑、干擾素α、干擾素β、干擾素γ、白介素-16(IL-16,Kwrth自然，December8.1995)；縮氨基硫脲、甲紅硫脲、利福平、ribvirin、嘧啶類似物(如AZT，和/或3TC)、嘌呤類似物、foscarnet、磷酰乙酸、無環(huán)鳥苷、雙脫氧核苷、蛋白酶抑制劑(如Saquinavir(Hoffmann-LaRoche)、indinavir(Merck)；ritonavir(Abbottlabs)；AG1343(Agouronpharmacenticals)；VX-2/78(GlaxoWellcome)；趨化因子如RANTES、MIP1α或MIP1β〔科學(xué)270:1560-1561(1995)〕或9-(1,3-二羥-2-丙氧甲基)鳥嘌呤。見如Richman艾滋病研究與人類逆轉(zhuǎn)錄病毒8:1065-1071(1992)；藥物毒理學(xué)年評33:149-164(1993)；抗微生物試劑化療37:1207-1213(1993)；艾滋病研究與人類逆轉(zhuǎn)錄病毒10:901(1994)；Katzung(1992)后述，在此引述的文獻(xiàn)分別在798-800頁和680-681頁。藥物的應(yīng)用多包膜蛋白疫苗(或它引發(fā)的抗血清)可用于預(yù)防或治療，更優(yōu)選地，是用于預(yù)防。當(dāng)用于預(yù)防時(shí)，在未檢測到HIV感染時(shí)或未出現(xiàn)艾滋病癥狀時(shí)，給以多包膜蛋白活疫苗組合物，化合物的預(yù)防性施用可避免或減弱隨后的HIV感染。當(dāng)用于治療時(shí)，一檢測到確實(shí)存在感染癥狀，就給以多包膜蛋白疫苗。只有當(dāng)確定病人的免疫系統(tǒng)能夠?qū)Χ喟さ鞍谆钜呙缡┯闷鸱磻?yīng)而基本不出現(xiàn)不適并發(fā)癥或死亡時(shí)，病人感染HIV后才可施用多包膜蛋白活疫苗，而且要施用能夠減弱任何確實(shí)的HIV感染必需劑量的活疫苗。另一種方法，當(dāng)病人的免疫反應(yīng)受損時(shí)，治療性的施用優(yōu)選地包括減毒的或滅活的多包膜蛋白疫苗組合物。在此，重組病毒按如上所述的方法減毒或滅活。見如Berkow(1987)后述，Goodman(1990)后述，Avery(1987)后述，Katzung(1992)后述，Dorozynski和Anderson科學(xué)252:501-502(1991)。如果組合物的施用能被受試者忍受，就說它在藥物學(xué)上是可接受的。如果施用的量生理上有意義則這種試劑被說成是以治療和預(yù)防上有效量施用。如果本發(fā)明的疫苗或組合物存在時(shí)，使受試病人出現(xiàn)生理學(xué)上可檢測到的變化，優(yōu)選地，可加強(qiáng)針對HIV的體液或細(xì)胞免疫反應(yīng)，則它具有生理學(xué)意義。所謂的“保護(hù)”不一定是絕對的，即只要相對于對照來說，病人具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上很明顯的改善，HIV感染或艾滋病不一定是完全避免或消除。保護(hù)可限于緩和病癥開始的嚴(yán)重性或速度。藥物的施用本發(fā)明的疫苗能對一種以上的HIV株產(chǎn)生抵抗力。因此，本發(fā)明涉及并提供了預(yù)防或減弱至少一株HIV感染的方法。正如在此使用的，如果向個(gè)體的施用導(dǎo)致病癥或病情全部或部分的減弱(或抑制)或?qū)е聜€(gè)體對疾病有全部或部分的免疫性，則說此疫苗抵抗或減輕了疾病。用此處描述的藥物組合物，可用任何方法施用本發(fā)明的多包膜蛋白疫苗中的至少一種可達(dá)到預(yù)期的目的。例如，使用這樣的組合物可用各種非腸道途徑如皮下、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)、經(jīng)皮或口內(nèi)途徑。皮下施用是最優(yōu)選的。非腸道用藥可通過巨丸劑注射或長期緩慢灌注完成。見如Berkow(1987)后述，Goodman(1990)后述，Avery(1987)后述和Katzung(1992)后述。用于抵御、抑制或治療可由活動(dòng)而特異的細(xì)胞免疫治療引發(fā)的細(xì)胞免疫反應(yīng)緩解疾病或狀態(tài)的典型方案包括如上所述的有效數(shù)量疫苗組合物的施用，在一段包括一個(gè)星期到長達(dá)24個(gè)月的時(shí)期內(nèi)，可做為一次單獨(dú)治療施用，也可重復(fù)用作增強(qiáng)或加強(qiáng)劑量。根據(jù)本發(fā)明，疫苗組合物的“有效量”指足夠達(dá)到預(yù)期生物學(xué)效應(yīng)的疫苗組合物，在此情況下，指能夠產(chǎn)生針對HIV的細(xì)胞或體液免疫反應(yīng)中的至少一種。可以理解，有效劑量依賴于年齡、性別、健康狀況及受試者的體重，如有的話也包括共存的治療方式種類，治療的頻率及預(yù)期效應(yīng)的本質(zhì)。下面提供的有效劑量的范圍并非意在限制本發(fā)明而代表優(yōu)選的劑量范圍。然而，最優(yōu)選的劑量應(yīng)根據(jù)具體的每個(gè)受試者而定，無需過多實(shí)驗(yàn)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員很容易理解和確定這一點(diǎn)。見如Berkow(1987)后述，Goodman(1990)后述，Avery(1987)后述，Ebadi藥物學(xué)，LittleBrown和Co.Boston,MA(1985)和Katsung(1992)后述?？偟膩碚f，成年人的劑量為每劑約105-109，優(yōu)選地為106-108噬斑形成單位(pfu)/kg或集落形成單位(CFU)/kg。無論用什么樣的劑量，應(yīng)該是由此描述的已知方法確定安全有效的量。受試者本發(fā)明疫苗的接受者可以是能通過針對HIV的細(xì)胞或體液免疫反應(yīng)獲得特異免疫性的任何哺乳動(dòng)物，其中，細(xì)胞反應(yīng)由主要組織相容性復(fù)合物Ⅰ或Ⅱ蛋白介導(dǎo)。在哺乳動(dòng)物中，優(yōu)選的受試者是靈長目動(dòng)物(包括人類、猩猩、類人猿和猴)。最優(yōu)選的接受者是人類。優(yōu)選的受試者感染了HIV或提供HIV感染的模型〔如Hu等，自然328:721-723(1987)〕。已經(jīng)總的描述了本發(fā)明，通過參照下面的例子，相同的內(nèi)容很容易被理解，下面的實(shí)施例以說明方式提供且不意味著限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例實(shí)施例1HIV包膜蛋白表達(dá)的痘苗病毒載體的制備命名，為了便于參考，重組痘苗病毒構(gòu)建體在此稱為VVenv構(gòu)建體，特定的病毒構(gòu)建體根據(jù)病人或庫(構(gòu)建體中envDNA的ATCC或GenBank來源)命名。例如，VVenv-Doe指具有來自病人Doe的env序列的痘苗病毒載體構(gòu)建體，且VVenv-U28305指具有來自GenBank編號為U28305的env序列的痘苗病毒載體。多包膜蛋白疫苗由4-100種不同重組病毒組成，其中每一種都表達(dá)不同的HIV-1包膜蛋白。為便于參考，每個(gè)病毒稱為VVenv，最終的病毒混合物稱作多包膜蛋白。如下描述，每一種VVenv的制備使用稱為pVenv4的質(zhì)粒和稱為NYCDH的野生型痘苗病毒。查詢細(xì)節(jié)，見Ryan等，“用于HIV蛋白表達(dá)和免疫的痘苗病毒載體的制備和應(yīng)用”《免疫學(xué)方法手冊》Lefkovits編，學(xué)術(shù)出版社(AcademicPress)(1996)。載體和宿主細(xì)胞前述pSC11載體〔ChakrabartiS.等，分子細(xì)胞生物學(xué)5:3403-3409(1985)〕可用于將各種HIV基因重組到VV基因組中。pSC11質(zhì)粒的元件包括Laz基因(是一個(gè)報(bào)告基因，通過它可將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌和VV重組體鑒定出來，因?yàn)樗鼈兙哂笑?半乳糖苷酶活性)，編碼胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因的一部分及一個(gè)氨芐青霉素抗性基因(amp)。克隆到pSC11的基因通過野生型病毒的TK基因與pSC11中的TK基因部分的同源重組插到VV基因組中。質(zhì)粒DNA插入病毒TK座位會(huì)使病毒基因失活因而重組病毒可通過在溴脫氧尿嘧啶(BudR)中生長而很容易從TK陽性病毒的背景中被篩選出來。為了使重組TK陰性病毒在選擇中生存下來，它們必須生長于不能提供有活性的TK酶的細(xì)胞中，如TK-143細(xì)胞系，它是源于人細(xì)胞系R970-5的TK缺陷的骨瘤細(xì)胞系。〔Rhim,J.S.等，國際癌癥雜志15:23-29(1975)〕，它能夠支持痘苗病毒的生長〔Weir等，后述(1982)〕，通過將HIV基因全長插入到pSC11載體的SmaⅠ位點(diǎn)，HIV基因片段可以表達(dá)。全長基因可在P7.5K啟動(dòng)子的控制下表達(dá)。作為全長HIV基因克隆的替代方法，人們可用部分基因序列取代已克隆到pSC11的HIV基因。例如，稱為pVenv1的構(gòu)建體是由pSC11制備而來且表達(dá)BH10HIV包膜蛋白(env)基因〔Hallerberger等，后述(1993),Kilpatrick等，生物化學(xué)雜志262:116-121(1987)〕。此構(gòu)建體可用作母載體用以替代和表達(dá)來自野生HIV分離物的多種包膜蛋白區(qū)域。同樣地，稱為pVenv4的載體構(gòu)建自pSC11以表達(dá)BH10包膜蛋白，它被截短去除了編碼gp41序列的跨膜區(qū)和胞質(zhì)末端區(qū)域而保留了寡聚化區(qū)域〔Hallenberger等，(1993)后述〕。本領(lǐng)域技術(shù)人員很容易理解，術(shù)語“寡聚化區(qū)域”功能上指“gp41的一部分能夠使包膜蛋白寡聚化即有足夠的結(jié)構(gòu)進(jìn)行寡聚化。pVenv4載體編碼截短了的gp160(也即gp160t,gp140)，人們發(fā)現(xiàn)它能形成與呈現(xiàn)于HIV感染細(xì)胞的表面加工后的gp41/gp120寡聚體(二聚體、三聚體或四聚體)相似的四級結(jié)構(gòu)。這種四級結(jié)構(gòu)以分泌和膜結(jié)合形式存在〔Hallenberger等，(1993)〕。此載體優(yōu)選地用作母載體用于替代其他分離到的env序列。在此實(shí)施例中，如下詳述，每一個(gè)VVenv構(gòu)建體的制備涉及了pVVenv4、野生型病毒NYCDH及合適的宿主細(xì)胞的應(yīng)用。pVenv4將HIV-1包膜蛋白編碼序列插入到pSC11痘苗病毒重組載體中制備到了pVenv4載體〔Hallenberger等，病毒學(xué)193:510-514(1993)；Chakrabati等，分子細(xì)胞生物學(xué)5:3403-3409(1985)〕。HIV-1序列來自活病毒的實(shí)驗(yàn)室原種。此序列被命名為“BH10”〔Ratner等，自然313:277-284(1985)〕。用PCR技術(shù)，不同的、來自感染了HIV-1病人的包膜蛋白序列被擴(kuò)增并替代入BH10序列以產(chǎn)生新的載體。如下的引物可用于PCR(A)有義，位點(diǎn)5785(SEQIDNO:1):AGCAGAAGACAGTGGCAATGAGAGTGA(B)反義，位點(diǎn)7694(SEQIDNO:2):CCACTCCATCCAGGTCATGTTATTCCAAAT(C)KpnⅠ-有義，位點(diǎn)5903(SEQIDNO:3):GTGGGTCACAGTCTATTATGGGGTACCTGTGT(D)BsmⅠ-反義，位點(diǎn)7659(SEQIDNO:4):CCAGAGATTTATTACTCCAACTAGCATTCCAAGG(E)(任選)DraⅢ-有義，位點(diǎn)6153(SEQIDNO:5):CCATGTGTAAAATTAACCCCACTCTGTG(F)(任選)Bsu361-反義，位點(diǎn)6917(SEQIDNO:6):TACAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG引物是以5′→3′方向，下面劃線的核苷酸是限制性酶切位點(diǎn)(標(biāo)有數(shù)字的位置根據(jù)BH10序列)〔Ratner等，自然313:277-284(1985)〕。PCR策略為了制備新的HIV-1env構(gòu)建體，多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)用于從40個(gè)不同HIV-1病人樣品中擴(kuò)增包膜蛋白基因的1800個(gè)堿基對(bp),PCR引物代表了HIV-1序列的高保守區(qū)因而能成功地從多種不同的HIV-1病人樣品中擴(kuò)增env基因。擴(kuò)增的DNA覆蓋了除此蛋白末端約10個(gè)高保守氨基酸之外的全部gp120蛋白。所有的包膜蛋白變異區(qū)(V1-V5)包括于PCR產(chǎn)物中。另外，擴(kuò)增的序列編碼gp120/gp41切割位點(diǎn)以外約100個(gè)氨基酸。位于pVenv4中BH10包膜蛋白基因序列的兩側(cè)具有帶有KpnⅠ和BsmⅠ限制性酶切位點(diǎn)的PCR引物摻入到擴(kuò)增的DNA產(chǎn)物中。第一輪PCR在一個(gè)500μl微量離心管中混勻-1μl引物A(SEQIDNO:1)300ng/μl-1μl引物B(SEQIDNO:2)300ng/μl-10μlMdNTP每種各2.5μl-1μgDNA-10μl10×PCR緩沖液及-HPLCH2O至終體積99μl將Taq貯存液振勻，取1μl滴入PCR反應(yīng)，混勻，覆以礦物油。在熱循環(huán)儀上如下述運(yùn)行-95℃孵育3分鐘以熔解DNA-運(yùn)行40個(gè)循環(huán)95℃1分鐘；45℃2分鐘；72℃3.5分鐘第二輪PCR用上述方法準(zhǔn)備PCR反應(yīng)體系，但用引物C和D(分別為SEQIDNO:3和4)，不加DNA。終體積為95μl覆以石蠟油。用一過濾吸頭，從第一次PCR反應(yīng)液中取5μl(石蠟油下的部分)。將其混于石蠟下的第二次反應(yīng)液中，如前的程序進(jìn)行循環(huán)。30個(gè)循環(huán)比較合適。每10個(gè)循環(huán)后取2μl反應(yīng)液進(jìn)行凝膠電泳分析以監(jiān)測產(chǎn)物直至出現(xiàn)一條約1800bp的清晰條帶。用眾所周知的替代克隆技術(shù)，制備了分別表達(dá)來自40個(gè)病人的env序列而非BH10包膜蛋白序列的pVenv4的衍生物。簡而言之，用KpnⅠ和BsmⅠ分別切割pVenv4質(zhì)粒和PCR產(chǎn)物，瓊脂糖電泳分離大的pVenv4片段，丟棄BH10env的小片段。同時(shí)分離切割后的PCR產(chǎn)物，并與pVenv4的大片段相連以產(chǎn)生嵌合包膜蛋白序列，后者包括由來自病人DNA的變異的1800bp的env基因。PCR產(chǎn)物與pVenv4相連接后，連接產(chǎn)物通過本領(lǐng)域許多熟知的技術(shù)中任何一個(gè)，包括如電穿孔轉(zhuǎn)入細(xì)菌宿主細(xì)胞，重組菌落被挑選并用測序的方法鑒定。質(zhì)粒pVerv4或由pVenv4制備的重組體可通過野生型病毒的胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因和質(zhì)粒的TK序列之間的同源重組促進(jìn)基因插入到痘苗病毒基因組。pVenv4DNA插入到病毒TK座位產(chǎn)生了含有在7.5K早期/晚期啟動(dòng)子控制下表達(dá)的HIV包膜蛋白基因的痘苗病毒。由于TK座位的破壞，病毒的生長活性減弱。pVenv4的另一個(gè)元件是編碼β-半乳糖苷酶活性的lacZ基因，lacZ活性可用于選擇痘苗病毒重組子(見下面)。由pVenv4表達(dá)的包膜蛋白基因被截短從而刪除了gp41序列的跨膜區(qū)/C-末端區(qū)。此載體表達(dá)產(chǎn)物以寡聚體形式存在于細(xì)胞內(nèi)及有分泌形式中。痘苗病毒-NYCDH每一個(gè)新的，替代質(zhì)粒單獨(dú)與野生型痘苗病毒NYCDH重組。此病毒來自A.T.C.C.(許可號VR-325)，并在使用前用噬菌斑純化。(Buck.C和panlinoM.S.編，美國典型培養(yǎng)物保藏中心動(dòng)物病毒、抗血清、衣原體、立克次氏體目錄第6版，美國典型培養(yǎng)物保藏中心，RockvilleM.D.(1990)p138)。細(xì)菌宿主細(xì)胞此質(zhì)?？稍诒绢I(lǐng)域任何合適的宿主中生長〔如見Ausubel，后述(1995綜述)§§16.15-16.19〕。非限制性實(shí)例是DH5α。TK缺陷細(xì)胞轉(zhuǎn)化及痘苗病毒替代都是在人的TK-143B細(xì)胞系上完成的。此細(xì)胞系為源于人的骨瘤細(xì)胞系R970-5的TK缺陷細(xì)胞系〔Rhim等，(1975)后述〕，它可支持VV的生長〔Weir等，(1982)后述〕。包含有特異HIV包膜蛋白基因序列的每一痘苗病毒重組子的選擇基于lacZ基因的表達(dá)(病毒噬斑覆以Bluo-gal并通過藍(lán)色的顯現(xiàn)篩選有β-半乳糖苷酶活性的病毒斑)要進(jìn)行兩輪PCR。實(shí)施例2多包膜蛋白疫苗的制備Vero細(xì)胞最后的生產(chǎn)步驟是在Vero細(xì)胞上培養(yǎng)n個(gè)VVenv構(gòu)建體，Vero細(xì)胞新近購自A.T.C.C.(許可號CCL81或X38)并經(jīng)過了克隆和擴(kuò)增以用于病毒生長。世界衛(wèi)生組織批準(zhǔn)Vero細(xì)胞系用于開發(fā)疫苗〔Hay.Retal編，美國典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞系和雜交瘤目錄，第七版，美國典型培養(yǎng)物保藏中心RockvilleMD(1992)p48〕。Vero細(xì)胞培養(yǎng)于含有谷胺酰胺(Bio-Whittaker)及熱滅活的胎牛血清(Hyclone,Inc)的DMEM(Bio-Whittaker)培養(yǎng)基中。另一種方法，無血清培養(yǎng)基也可使用。每一種VVenv構(gòu)建體接種于單層融合的Vero細(xì)胞上，并在細(xì)胞由于病毒感染產(chǎn)生病變時(shí)收獲之。收獲后凍存前，細(xì)胞提取物以PBS(Bio-Whitter)充分洗滌。然后用凍融、超聲或低速離心(任選)的方法破碎細(xì)胞。上清部分貯存于-70℃，即使是減毒的VV，如制備物加熱至60℃并保持1小時(shí)，裂解物中包膜蛋白的濃度足以在動(dòng)物模型中引發(fā)HIV包膜蛋白抗異的抗體(由ELISA檢測)。疫苗產(chǎn)物來自Vero細(xì)胞的每一病毒(VVenv構(gòu)建體)原種都經(jīng)過分別凍存、滴度測定及安全性檢驗(yàn)。檢測完成后，將每一病毒的等份相混合以產(chǎn)生108總噬斑形成單位(pfu)/ml的疫苗原種。(pfu代表噬斑形成單位)。如果40個(gè)VVenv構(gòu)建體用于一個(gè)疫苗產(chǎn)品中，優(yōu)選地每個(gè)VVenv量相等，每個(gè)VVenv的滴度為2.5×106噬斑形成單位/ml，最后此疫苗產(chǎn)品應(yīng)產(chǎn)生1×108總噬斑形成單位。多包膜蛋白疫苗的估價(jià)小鼠以1×107pfu表達(dá)env的VV腹膜內(nèi)注射感染小鼠。感染后三星期，按前述方法，用HIVELISA和中和測定法鑒定抗體。在制造人用多包膜蛋白疫苗以前，制備了一組相似的病毒以在小鼠上進(jìn)行疫苗檢測。這些病毒通過腹膜內(nèi)或皮下方式施用于小鼠。然后，我們檢測血清中HIV-1特異性抗體。血清活性以酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測。此測定涉及將完整的、斷裂的HIV-1(HTLVⅢB)鋪于ELISA板上，用牛血清白蛋白封閉ELISA板。血清樣品以1∶100,1∶1000,1∶10000的稀釋度加入PBS。此測定用堿性磷酸酶偶聯(lián)的羊抗鼠免疫球蛋白抗體和對硝基苯磷酸顯色。顯色反應(yīng)用氫氧化鈉溶液中止，且在ELISA板讀出器上405nm處讀取其光密度。如圖2所示，用含106-107pfu痘苗病毒(含有單一的HIV/包膜蛋白編碼序列和表達(dá)的膜結(jié)合形式的包膜蛋白)的細(xì)胞裂解液制劑接種一次會(huì)引發(fā)在6個(gè)月的實(shí)驗(yàn)期間中持續(xù)存在的針對HIV-1的強(qiáng)抗體反應(yīng)。這樣的抗體反應(yīng)明顯地比以前報(bào)道的免疫產(chǎn)生的抗體反應(yīng)強(qiáng)。這樣強(qiáng)的抗體反應(yīng)也許應(yīng)歸于疫苗制劑中膜結(jié)合包膜蛋白的存在。如圖3所示，這些反應(yīng)為劑量依賴性的。施用劑量106pfu的哺乳動(dòng)物反應(yīng)比施用劑量107pfu的哺乳動(dòng)物反應(yīng)低。也制備了表達(dá)不同HIV包膜蛋白的痘苗病毒混合物。小鼠接受107pfu5種病毒混合物時(shí)，它們的反應(yīng)在數(shù)值上與由107pfu單個(gè)痘苗病毒重組子產(chǎn)生的反應(yīng)相同(圖4)。高數(shù)量的多種表達(dá)包膜蛋白的痘苗病毒的混合還未見報(bào)道，期望它能產(chǎn)生廣譜的中和抗體。人類混合的病毒原種實(shí)驗(yàn)先于臨床試驗(yàn)進(jìn)行，第一批實(shí)驗(yàn)用于劑量梯度和安全性測試。臨床實(shí)驗(yàn)是劑量梯度的研究，其涉及了4個(gè)志愿組的組合，每一組接受下面其中的一個(gè)劑量的疫苗(1)2×104pfu(2)2×105pfu(3)2×106pfu(4)2×107pfu每一志愿者通過皮下注射方式接受了0.5ml鹽水形式的混合型病毒疫苗。實(shí)施例3在猩猩中用多包膜蛋白痘苗病毒為基礎(chǔ)的HIV-疫苗誘導(dǎo)的初級分離物中和免疫原性用一批混雜的(sophisticatedarray)包膜蛋白武裝(armed)HIV分離物總體(population)包膜蛋白是全部由病毒編碼的外部蛋白而且是中和抗體活性的靶蛋白，然而針對一株分離物引發(fā)的抗體不一定能中和另一株分離物?；谶@個(gè)原因，我們制備了一個(gè)表達(dá)多種Env蛋白的HIV疫苗雞尾酒多包膜蛋白(PolyEnv)。疫苗制備開始于制備30種不同的VV-重組子，每一重組子表達(dá)不同的包膜蛋白。然后VVenv單獨(dú)或聯(lián)合(多包膜蛋白)在猩猩模型中進(jìn)行檢測。四只猩猩皮下免疫了三次單個(gè)VVenv(猩猩1和2)或多包膜蛋白(猩猩3和4)，然后把于明礬中的重組的gp120/gp41蛋白進(jìn)行肌內(nèi)注射。在四只動(dòng)物中表現(xiàn)出安全性，只有其中的兩只在注射位點(diǎn)表現(xiàn)出潰爛。用多次HIV結(jié)合試驗(yàn)和中和實(shí)驗(yàn)監(jiān)測血清樣品。猩猩3和4的抗體表現(xiàn)出最高質(zhì)量的抗體活性。對一實(shí)驗(yàn)室分離物和一HIV初級分離物中和功能表現(xiàn)出來，這兩株分離物都不特異存在于此疫苗中。因此，用混合包膜蛋白引發(fā)的淋巴細(xì)胞提供了一種引發(fā)針對不同HIV-1的高質(zhì)量抗體的有前途的方法。材料和方法pVenv4，痘苗病毒重組載體pVenv4是通過將終止密碼子引入BH10包膜蛋白序列，并將此修飾過的BH10包膜蛋白基因(env)插入pSC11制備的pVenv4表達(dá)一個(gè)包膜蛋白產(chǎn)物，此蛋白在640位氨基酸處被截短，并且能分泌和寡聚化。前面已描述過表達(dá)此截短的BH10包膜蛋白重組痘苗病毒，VVenv4的制備〔Hallenberger等，病毒學(xué)193:510-514(1993)〕。用PCR方法從感染了HIV-1的個(gè)體中擴(kuò)增env序列PCR用于擴(kuò)增HIVenv序列。通常地，樣品來自感染了HIV-1的個(gè)體第一次診斷HIV時(shí)采集的血樣。其他樣品來自具有艾滋病臨床癥狀的個(gè)人或艾滋病研究和參比試驗(yàn)庫。對于血樣，DNA是通過將血或感染細(xì)胞逐滴加入以SDS為基礎(chǔ)的裂解液中并在65℃孵育30分鐘加以制備。將0.5mg/ml的鏈霉蛋白酶(Pronase)加入其中，裂解物在45℃繼續(xù)孵育過夜。用酚抽提兩遍后，進(jìn)行乙醇沉淀，然后將DNA重懸于水中。用標(biāo)準(zhǔn)方法對所有的DNA樣品進(jìn)行兩輪PCR。引物序列的選擇基于已發(fā)表的BH10序列〔Ratner等，自然313:277-284(1985)〕。為了獲得包括所有變異區(qū)和一部分gp41序列，實(shí)例1中描述的PCR引物運(yùn)用于此。運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)方法，將PCR產(chǎn)物通過替代克隆到pVenv4載體中。用Sanger法和引物ccatgtgtaaaattaaccccactctgtg(SEQIDNO:5)對新質(zhì)粒進(jìn)行測序。VVenv的制備通過以新的替代質(zhì)粒(見上)轉(zhuǎn)染到VV(NYCDHATCC)感染的細(xì)胞中制備新的VV重組體。依據(jù)生產(chǎn)商的推薦，轉(zhuǎn)染(Transfectam)(Promega公司)和Lipofectamine(Gibco,BRL)用以促進(jìn)轉(zhuǎn)染。然后用噬菌斑純化VV。免疫感染了VVenv的細(xì)胞裂解通過皮下注射接種于猩猩。VVenv或單用或聯(lián)合使用。每次注射中每只動(dòng)物的總VV量以pfu表示相似(約107pfu)。肌肉注射中的每一接種物是由約40微克gp120(Cat#12101,IntracelCambridge,MA)、20微克gp41(Cat#036001Intracel)和500微克明礬(Rehsorptar,AlnminumhydroxideAdsorptiveGel.Intergen.Co.purchase,NY)組成的混合物。ELISAs按下述進(jìn)行5個(gè)ELISA:ELISA#1:Abbott臨床ELISA購自Abbott實(shí)驗(yàn)室并且按照制造商的推薦進(jìn)行操作(HIVABHIV-1/HIV-2(rDNA)EIA,Abbottlaboratories.AbbottPark,I.L.)。ELISA#2將重組Mn-gp160(QualityBiologicalGalthersburg,MD)以1μg/ml鋪于板上而進(jìn)行。板經(jīng)包被后用3倍系列稀釋的血清進(jìn)行檢測。板經(jīng)洗滌后通過堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗人IgG記錄結(jié)果。ELISA#3以1μg/ml的LAI-gp120(CHO細(xì)胞來源的蛋白，Intracel)包被板子，血清以1∶100稀釋后鋪于板上并通過堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗人IgG(鼠抗人IgG1-AP,Cat#9050-04,SouthernBiologicalAssociates.Inc.Birmingham.A.L.)和對硝基苯磷酸記錄結(jié)果，在405nm處讀取光密度(O.D.)值。ELISA#4ELISA按3號測定進(jìn)行，不同之處在于以1μg/ml的ⅢB-gp120(桿狀病毒來源的蛋白，Intracel,Cat#12001Cambridge.MA)包被板子。ELISA#5此ELISA按測定3進(jìn)行，不同之處在于以1μg/ml的ⅢB病毒裂解液包被板子(Organon.Teknika.Co.DurhamN.Y.)。中和測定用實(shí)驗(yàn)室分離物或初級分離物進(jìn)行中和測定〔Montefior等，臨床微生物學(xué)雜志26:231-237(1988),Montefiori等，傳染性雜志173:60-67(1996)〕實(shí)驗(yàn)室分離物，病毒以1∶20與血清樣品混合并鋪于MT-2或CEM-X174細(xì)胞上。中性紅染色用于估價(jià)細(xì)胞的生存力。與對照培養(yǎng)物比較，細(xì)胞死亡率降低35-40％定義為陽性偏轉(zhuǎn)(positivedeflection)。初級分離物病毒以1∶4與每一血清樣品混合，并鋪于植物凝集素刺激的PBMC(外周血單核細(xì)胞)上。測定得分為p24。與對照培養(yǎng)物比較，感染率至少下降75％對陽性得分是必須的。結(jié)果新的VVenv重組痘苗病毒的制備為了制備新的表達(dá)獨(dú)特HIV-1包膜蛋白的痘苗病毒重組子(VVenv)首先從HIV-1樣品中分離DNA。大多數(shù)DNA來自于沒有外在癥狀而最初診斷為HIV感染個(gè)體的血樣。另外的DNA來自艾滋病人或由艾滋病研究和參比試劑庫。用含有KpnⅠ和BsmⅠ限制性位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR。片段在KpnⅠ和BsmⅠ處被替代入如圖所示的pVenv4載體中(pVenv4最初表達(dá)截短了的HIV-1蛋白BH10)。以這種方式，BH10的gp120(V1-V5)和gp41序列被PCR產(chǎn)物的各個(gè)序列取代。隨著每一替代質(zhì)粒，制備新的VV重組病毒(VVenv)。此方法提供了一種簡單的途徑，通過它，很多種包膜蛋白序列被摻入到獨(dú)特的VV重組子中(VVenv)。有趣地是，大部分序列都可表達(dá)，這提示原病毒基因組(大部分PCR產(chǎn)物的來源)中的包膜蛋白序列很少有缺陷。用于此疫苗混合物的VVenv有很大的多樣性。用單個(gè)或混合的VVenv免疫猩猩四只猩猩用于檢測單個(gè)或混合的VV重組體疫苗。免疫程序列于表2。前三次注射劑包含VV而最后一次注射是包括gp120,gp41和明礬組合并肌肉內(nèi)注射。猩猩1和猩猩2在前三次的每一次注射劑中只接受了一種痘苗病毒和各自的包膜蛋白。猩猩3和猩猩4接受了10種重組VV混合物(和第一次注射劑中相應(yīng)的蛋白)的注射，第二次注射的是10種另外的包膜蛋白，最后一次免疫為10種獨(dú)特的包膜蛋白，在用蛋白加強(qiáng)以前總共接種了30種不同的載體。所有猩猩接受了相似噬斑形成單位的總痘苗病毒及相似數(shù)量的總重組蛋白。表2用混合的VV重組子免疫猩猩的程序日期注射猩猩1和2:1/9/96VV(Env#1)4/16/96VV(Env#1)6/11/96VV(Env#1)7/30/96重組gp120和重組gp41+明礬猩猩3和4:1/9/96VV(Env#1-10)4/16/96VV(Env#11-20)6/11/96VV(Env#21-30)7/30/96重組gp120和重組gp41+明礬重組VVenv的使用可不導(dǎo)致創(chuàng)傷、監(jiān)測四只猩猩系統(tǒng)疾病癥狀和注射位點(diǎn)創(chuàng)傷的形成。每天都觀察動(dòng)物的腹瀉、鼻溢、咳嗽、打噴、呼吸短促、倦怠、活動(dòng)受限及食欲喪失。在任何時(shí)候，這些癥狀在任何動(dòng)物中都不明顯。在第一次VV接種后以規(guī)則的時(shí)間間隔對注射位點(diǎn)拍照結(jié)果表明四只動(dòng)物中有明顯的腫脹。猩猩1和3的注射位點(diǎn)有典型的接種天花時(shí)的輕微創(chuàng)傷，而猩猩2和4則沒有明顯的創(chuàng)傷。在所有動(dòng)物中，第二次、第三次、第四次注射都沒有出現(xiàn)病癥、腫脹或損傷，這表明第一次接種引發(fā)了VV特異的免疫力。VVenv注射后用蛋白加強(qiáng)免疫產(chǎn)生了ELISA陽性的抗體。在免疫程序中用5種不同的ELISA監(jiān)測HIV特異的抗體。ELISA用于檢測每只動(dòng)物中抗體的相對質(zhì)量而非絕對數(shù)量。在大多數(shù)情況下，檢測是用缺少天然Env典型的三維結(jié)構(gòu)和寡聚體結(jié)構(gòu)的病毒片段進(jìn)行的。在這些情況下，ELISA只與一部分HIV特異的抗體結(jié)合。用AbbottELISA得到的結(jié)果列于圖6。猩猩3在第1次VV接種后，超過了陽性截止點(diǎn)(cut-off)。而猩猩4在第二次VVenv接種后超過了陽性截止點(diǎn)。猩猩3和猩猩4在免疫結(jié)束時(shí)的反應(yīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了猩猩1和猩猩2的反應(yīng)。在用MNgp160進(jìn)行檢測的ELISA#2中，猩猩3是唯一的高反應(yīng)者。此反應(yīng)出現(xiàn)于蛋白加強(qiáng)免疫之前，而不被加強(qiáng)免疫注射擾亂。在用與加強(qiáng)免疫的純化蛋白相同的抗原作抗原時(shí)，對結(jié)合于ELISA板上的CHO-LAI的反應(yīng)(ELISA#3)表明只有猩猩3有很強(qiáng)的反應(yīng)。用ⅢB-gp120結(jié)合的板上進(jìn)行的ELISA#4中，猩猩2有很強(qiáng)的本底，也許由于高本底的原因，它是所有動(dòng)物中反應(yīng)值最高的。第5個(gè)ELISA反應(yīng)中，四只動(dòng)物血清對OrganonTachnikaⅢB病毒裂解液的反應(yīng)皆為陽性。對于初級分離物和實(shí)驗(yàn)室分離物的中和反應(yīng)來自每只動(dòng)物的血清都分別與實(shí)驗(yàn)室分離物和初級分離物進(jìn)行了中和反應(yīng)。第一次測定在T細(xì)胞系上進(jìn)行，后一個(gè)測定在血清陰性的植物凝集素刺激的外周血單核細(xì)胞上(PBMC)進(jìn)行的。所有情況下，分離物不與HIV-1疫苗中的HIV匹配。如表3所列，猩猩2、3、4的樣品在T細(xì)胞中對實(shí)驗(yàn)室分離物MN有一個(gè)陽性偏差(病毒生長有35-40％的抑制)。其他兩株實(shí)驗(yàn)室病毒的分析(一個(gè)是ⅢB〔Lockey等，艾滋病研究與人類逆轉(zhuǎn)錄病毒12:1297-1299(1996)〕，一個(gè)是SF2貯存種)與任何樣品都不反應(yīng)。用四種分離物在PHA刺激的PBMC上中和分析的結(jié)果〔Montefior等，1988前述；Montefior等，1996前述〕列于下。病毒在這些測定中難以被中和，因?yàn)榧词挂?∶2稀釋，病人血清經(jīng)常出現(xiàn)陰性結(jié)果?！睩enyo等，艾滋病10:S97-S106(1996)；MooreandHo艾滋病9:S117-S136(1995)；Montefior等，1996前述〕。有趣地是，猩猩4的血清以1∶4稀釋時(shí)能中和測試初級分離物中的一種。這種情況與其他用Env疫苗實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)不同，在以前很多情況下，來自接種Env個(gè)體的血清與初級分離物進(jìn)行中和測定時(shí)，結(jié)果為陰性?！睸teele,NIH研究雜志6:40-42(1994)；Moore，自然376:115(1995)〕。表3猩猩抗血清與疫苗中非典型(notspeciallyrepresented)的中和反應(yīng)<tablesid="table30"num="030"><tablewidth="662">分離物猩猩1猩猩2猩猩3猩猩4實(shí)驗(yàn)室株MN-陽性偏轉(zhuǎn)陽性偏轉(zhuǎn)陽性偏轉(zhuǎn)初級分離物#1----初級分離物#2----初級分離物#3---陽性初級分離物#4----</table></tables>混合的VVenv比單個(gè)VVenv引發(fā)的HIV-1特異的抗體質(zhì)量高。ELISA和中和測定的結(jié)果總結(jié)于表4，表4列出了在上述7種檢測中有較高反應(yīng)的猩猩。從中看到，7次實(shí)驗(yàn)中，猩猩3和4有5次陽性而猩猩1和2只有3次陽性，或許這個(gè)結(jié)果可以反映與單個(gè)包膜蛋白疫苗相比，多包膜蛋白疫苗引發(fā)的抗體質(zhì)量更高。表4ELISA和中和測定總結(jié)<tablesid="table31"num="031"><tablewidth="672">測定接受單個(gè)VV產(chǎn)生高反應(yīng)的猩猩接受混合VV產(chǎn)生高反應(yīng)的猩猩Abbott(ⅢB-gp41)-ELISA#1猩猩3和猩猩4MNgp160BACELISA#2猩猩3ⅢB-gp120-BACELISA#3猩猩2LAI-gp120-CHO-ELISA#4猩猩3Ⅲb病毒裂解物ELISA#5猩猩1和猩猩2猩猩3和猩猩4實(shí)驗(yàn)室分離物中和測定(偏轉(zhuǎn))猩猩2猩猩3和4初級分離物中和測定猩猩4</table></tables>討論此實(shí)施例中設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)是為了檢測HIV-1痘苗病毒疫苗的安全性并比較包膜蛋白雞尾酒與單個(gè)包膜蛋白疫苗的引發(fā)效率。結(jié)果表明，首先，痘苗病毒可用作免疫原而不會(huì)誘發(fā)開放性(open)傷口。其次，用多包膜蛋白“雞尾酒”可引發(fā)較大范圍的HIV-1特異的活性。猩猩模型可使我們在靈長類中檢測多包膜蛋白的安全性。我們特別感興趣于決定開放性傷口形成的程度，因?yàn)榻臃NVV時(shí)，活病毒疫苗對未免疫個(gè)體會(huì)造成危害。就HIV而言，因?yàn)榘滩∪瞬荒茏钃鮒V感染，因而它更是一個(gè)嚴(yán)肅的問題。為了考察這一問題，我們用皮下注射免疫猩猩以檢測是否可以避免開放性傷口。事實(shí)上，4只猩猩中只有2只出現(xiàn)開放性傷口。這與在牛痘疫苗臨床試驗(yàn)中，用NYCDH痘苗病毒貯存種進(jìn)行皮下接種時(shí)出現(xiàn)的結(jié)果相似。〔Connor等，傳染病雜志135:167-175(1977)；Benenson等，傳染病雜志135:135-144(1977)〕。如果對注射過程多加注意并進(jìn)一步照料注射點(diǎn)，開放性傷口在所有病例都可能不會(huì)出現(xiàn)。結(jié)果表明，安全性問題不會(huì)成為痘苗病毒用作HIV-1疫苗載體的障礙。包膜蛋白雞尾酒已在小鼠(實(shí)施例2)和兔子實(shí)驗(yàn)中得以檢測。在小鼠實(shí)驗(yàn)中，在注射一次VVenv后，抗HIV抗體就可檢測到，而在兔子中，VVenv用于加強(qiáng)DNA引發(fā)的反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)表明，VVenv可以引發(fā)或加強(qiáng)HIV特異抗體，而此抗體反應(yīng)可以中和初級分離物。猩猩被分為兩組以檢測混合VVenv(多包膜蛋白)的潛力。前兩只猩猩只接受1種VVenv，而猩猩3和4則分別接受由30種不同的VVenv組成的“雞尾酒”。受到痘苗病毒免疫后，所有四只猩猩都接受了一次混于明礬中的gp120/gp41的加強(qiáng)免疫。四只猩猩中每只猩猩的血清分別以5種不同的ELISA檢測，每種ELISA用Env的不同部分或不同構(gòu)象的Env。有趣地是，猩猩1和2只在其中的一種ELISA中反應(yīng)強(qiáng)，而猩猩3和4的血清在4種測定中反應(yīng)都很強(qiáng)。因?yàn)槊恳粶y定只是檢測每一動(dòng)物中HIV特異抗體的一部分，結(jié)果很可能反映了由混合疫苗引發(fā)的抗體結(jié)合反應(yīng)范圍很廣泛。我們也進(jìn)行了針對實(shí)驗(yàn)室分離物和初級分離物的中和測定。有趣地是，盡管初級分離物沒有特異地包括在疫苗混合物中，猩猩4能產(chǎn)生針對此分離物的陽性反應(yīng)。這些結(jié)果再次表明，多包膜蛋白疫苗雞尾酒可引發(fā)的抗體范圍更為廣泛。疫苗中抗原復(fù)雜性的增加或許會(huì)導(dǎo)致淋巴細(xì)胞及相應(yīng)抗體反應(yīng)的多樣性。針對疫苗中不存在的初級分離物的中和抗體的引發(fā)表明線性結(jié)構(gòu)不同的蛋白具有共同的構(gòu)象。這一點(diǎn)也為感染了HIV-1的病人的免疫反應(yīng)所證實(shí)，因?yàn)楸┞队诓煌罅坎《镜膬蓚€(gè)體，當(dāng)病毒交叉暴露時(shí)，兩個(gè)體都可免于超感染。多包膜蛋白的應(yīng)用代表了在猩猩系統(tǒng)中第一次嘗試模仿HIV-1病人的狀況，即中和抗體由一大批而不是一個(gè)包膜蛋白引發(fā)。概括地說，我們在猩猩模型中測試了一個(gè)名為多包膜蛋白的以VV為基礎(chǔ)的HIV-1疫苗雞尾酒。1)VV可用作疫苗而不誘發(fā)開放性損傷；2)此疫苗可引發(fā)廣泛的HIV-1特異的抗體活性；及3)與單個(gè)Env構(gòu)建體相比，Env構(gòu)建體(多包膜蛋白)雞尾酒能夠產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)的HIV特異的抗體。野生型痘苗病毒和重組型痘苗病毒很早就被認(rèn)為是強(qiáng)有力的疫苗。VV的威力在于它能夠征集免疫反應(yīng)中的B細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞。VV包括唯一能夠根除人類一種疾病(天花)的疫苗。此實(shí)施例提供的數(shù)據(jù)表明重組痘苗病毒載體將有助于未來對HIV-1的控制。實(shí)施例4雙功能質(zhì)粒的制備幾種不同的系統(tǒng)(流感，HIV-1等中)已證明，DNA疫苗能引發(fā)強(qiáng)的抗體反應(yīng)和CTL反應(yīng)。流感病毒DNA疫苗和HIV-1DNA疫苗已用于健康成年志愿者的臨床實(shí)驗(yàn)。痘苗病毒也是免疫計(jì)劃的重要基礎(chǔ)。事實(shí)上，痘苗病毒是唯一能夠根除人類一種疾病(天花)的疫苗。如在動(dòng)物研究中所證明的，大量的重組痘苗病毒引發(fā)了強(qiáng)的免疫反應(yīng)。上述證據(jù)證明了多包膜蛋白及聯(lián)合免疫策略的效率，如DNA疫苗和病毒疫苗的效率。既可作DNA疫苗又可作痘苗病毒重組載體的雙功能質(zhì)粒已得以構(gòu)建。圖7為此質(zhì)粒的圖譜，它包括一個(gè)用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)的CMV啟動(dòng)子，及用于制備重組痘苗病毒的痘苗病毒早期和晚期啟動(dòng)子。純化質(zhì)粒DNA的直接注射可在受試者體內(nèi)引發(fā)針對HIV包膜蛋白的免疫反應(yīng)。此質(zhì)粒也將用于制備和驗(yàn)證活的重組痘苗病毒，后者將用于HIV包膜蛋白免疫載體。也可以多層次的治療方案接種受試者。此治療方案包括DNA接種和重組痘苗病毒接種，接種可為任意順序的一次注射也可多次注射和/或與另外的疫苗載體聯(lián)合接種。本發(fā)明的范圍不局限于在此描述的特定的實(shí)施方案。事實(shí)上，除此之外，根據(jù)前面的描述和附圖，本發(fā)明的多種修飾對本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是顯而易見的。這些修飾將包括于附加權(quán)利要求中。需要進(jìn)一步明白，賦予核酸或多肽所有的堿基大小或氨基酸大小，及所有分子量或分子量值是近似的且為了便于描述。此處引用了很多出版物，現(xiàn)將之做為一個(gè)整體列于參考文獻(xiàn)中。參考文獻(xiàn)Ausuber等編，當(dāng)代分子生物學(xué)方法，GreenPublishingAssoc.,NewYork,NY(1987、1988、1989、1990、1991、1992、1993、1994、1995)Avery’s藥物治療；臨床藥物學(xué)和治療學(xué)的原理和實(shí)踐第三版，AIDS出版公司，WilliamsandWilkins,Baltimore,MD(1987)Belshe,R.B.等，美國醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)雜志272:431-431(1994)Berkow等編，Merck手冊，第15版，MerckandCo.,Rahway,NJ(1987)Birnboim,H.C.和Doly,J.,核酸研究7:1513-1523(1979)Buck,C和Paulino,M.S.編，動(dòng)物病毒、抗血清、衣原體立克次氏體目錄第6版，美國典型培養(yǎng)物保藏中心Rockville,MD(1990)Burns,D.P.W.和Desrosiers,R.C.微生物免疫學(xué)現(xiàn)代論題188:185-219(1994)Chakrabarti.S.等，分子細(xì)胞生物學(xué)5:3403-3409(1985)Cooney等，美國國家科學(xué)院院報(bào)90:1882-1886(1993)Creghton,T.E.，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子特征，W.H.Freeman&amp;Co.,SanFrancisco,CA(1983)DevitaJr.,V.T.等，艾滋病，病原學(xué)診斷治療和預(yù)防第3版，J.B.LippincottCo.,Philadelphia,PA(1992)D’Honcht，疫苗10增刊548-52(1992)Dorozynski和Anderson科學(xué)252:501-502(1991)Ebadi，藥物學(xué)，LittleBrown和Co.,Boston,MA(1985)Eichberg，艾滋病國際會(huì)議7:88(1991)Embreston,J.等，自然362:359-362(1993)Enami等，病毒學(xué)雜志65:2711-2713(1991)Enami等，美國國家科學(xué)院院報(bào)87:3802-3805(1990)Fauci，科學(xué)264:1072-1073(1994)Goodman等編，Goodman和Gilman’s的治療學(xué)藥物基礎(chǔ)第八版，PergamonPress,Inc.Elmsford,NY(1990)Gorse，艾滋病研究與人類逆轉(zhuǎn)錄病毒，10(增刊2):141-143(1994)Gribskov和Burgess核酸研究14:6745(1986)Graham等，傳染病雜志166:244-252(1992)；傳染性雜志167:533-537(1993)Grundwald-Bearch等，臨床腫瘤學(xué)癌癥研究雜志117:561-567(1991)Hallenberger等，病毒學(xué)193:510-514(1993)Hay,R.等編，美國典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞系和雜交瘤目錄第七版，美國典型培養(yǎng)物保藏中心Rockville,MD(1992)Hirsch,M.S.和Curran,J.“人類免疫缺損病毒，生物學(xué)和醫(yī)學(xué)特性”《病毒學(xué)》，F(xiàn)ields和Knipe編，RavenPress,Ltd.,NewYork,NY(1990),PP1545-1570Hu等，自然328:721-723(1987)Ish-Horowicz,D.和Bruke,J.F.，核酸研究9:2989-2998(1981)Ito等，病毒學(xué)雜志65:5491-5498(1991)Ito等，癌癥研究50:6915-6918(1990)Javaherian,K.等，美國國家科學(xué)院院報(bào)86:6768-6772(1989)Katzung編，基礎(chǔ)和臨床藥物學(xué)第五版，AppletonandLange,Norwalk,CT(1992)Keefer等，艾滋病研究與人類逆轉(zhuǎn)錄病毒10(增刊2):S139-143(1994)Kieny等，艾滋病國際會(huì)議5:541(1989)Kilpatrick等，生物化學(xué)雜志262:116-121(1987)Luytjes等，細(xì)胞59:1107-1113(1989)Mackett,M．等，美國國家科學(xué)院院報(bào)79:7415-7419(1982)Mazzara,G.P．等，酶學(xué)方法217:557-581(1993)McElrah等，傳染病雜志169:41-47(1994)Needleman和Wunsch，分子生物學(xué)雜志48:443(1970)Osol,A.，編雷明頓藥物科學(xué)MackPublishingCo,Easton,PA(1980),pp1324-1341Panicali,D.，和Paoletti，E.，美國國家科學(xué)院院報(bào)79:4927-4931(1982)Pantaleo,G.等，自然362:355-358(1993)Rhim,J.S.等，國際癌癥雜志15:23-29(1975)Richman，艾滋病研究與人類逆轉(zhuǎn)錄病毒8:1065-1071(1992)Richman，藥物毒理學(xué)年評33:149-164(1993)Richman，抗微生物試劑化學(xué)治療37:1207-1213(1993)Richman，艾滋病研究與人類逆轉(zhuǎn)錄病毒10:901(1994)Richmond和Mckinney編，微生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全第3版，U.S.DeptofHealth&amp;HumanServices,WashintonDC(1993)Sambook,J等，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，冷泉港(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor),NY(1989)Schulz,G.E．等，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)原理，Springer-Verlag,NewYork,NY(1978)Schwartz和Dayhoff編，蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖集，NationalBiomedicalResearchFoundation,〔WashingtonDC？-wp〕(1979),pp.353-358Selenka等，Arch,Hyg,Bakteriol.153:244-253(1969)Smith和Waterman，應(yīng)用數(shù)用進(jìn)展2:482(1981)Starcich等，細(xì)胞45:637(1986)Towbin,H．等，美國國家科學(xué)院院報(bào)76:4350(1979)UnitedStatesBiochemical，測序酶，2.0版-DNA測序試劑盒第9版(NinthEdition),AmershamLifeScience,Inc.Boise,Idaho(1994)Weir等，美國國家科學(xué)院院報(bào)79:1210-1214(1982)Wellis等，免疫學(xué)雜志99:1134-9(1967)Wong-Staal,F.，“人類免疫缺損病毒及其復(fù)制”《病毒學(xué)》Fields和Knipe,編，RavenPress,Ltd.,NewYork,NY(1990),pp.1529-1543Wrin等，獲得性免疫缺損綜合征雜志7:211-219(1994)Wu等，核酸研究分子生物學(xué)進(jìn)展21:101-141(1978)Zagury等，自然332:728-731(1988)序列表(1)一般信息(ⅰ)申請人圣·朱迪兒童研究醫(yī)院(Children’sResearchHospital)332NorthLauderdalePOBox318Memphis,TN38101-0318美國申請人/發(fā)明者Hurwitz,JuliaL.Coleclough,ChristopherOwens,RandallJ.Slobod,Karen(ⅱ)發(fā)明題目針對人免疫缺損病毒的混合型包膜蛋白疫苗病毒載體的制品及應(yīng)用(ⅲ)序列數(shù)目7(ⅳ)通訊地址(A)收信人KLAUBER&amp;JACKSON(B)街道411HACKENSACKAVENUE(C)城市HACKENSACK(D)州NJ(E)國家美國(F)郵編07601(ⅴ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒介形式軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBMPC兼容機(jī)(C)運(yùn)行系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInReleaes#1.0,Version#1.30(ⅵ)當(dāng)前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)柎?B)提交日期附此(C)分類(ⅷ)代理人/事務(wù)所信息(A)姓名PaulF.Fehlner(B)登記號35,135(C)參考/存檔13401011/PCT(ⅸ)電信信息(A)電話201-487-5800(B)傳真201-343-1684(2)SEQIDNO:1信息(ⅰ)序列特征(A)長度27個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:1AGCAGAAGACAGTGGCAATGAGAGTGA(2)SEQIDNO:2信息(ⅰ)序列特征(A)長度30個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:2CCACTCCATCCAGGTCATGTTATTCCAAAT(2)SEQIDNO:3信息(ⅰ)序列特征(A)長度32個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:3GTGGGTCACAGTCTATTATGGGGTACCTGTGT(2)SEQIDNO:4信息(ⅰ)序列特征(A)長度34個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:4CCAGAGATTTATTACTCCAACTAGCATTCCAAGG(2)SEQIDNO:5信息(ⅰ)序列特征(A)長度28個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:5CCATGTGTAAAATTAACCCCACTCTGTG(2)SEQIDNO:6信息(ⅰ)序列特征(A)長度26個(gè)堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)鋵W(xué)線性(ⅱ)分子類型cDNA(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:6TACAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG(2)SEQIDNO:7信息(ⅰ)序列特征(A)長度880個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型兩者具備(both)(D)拓?fù)鋵W(xué)兩者具備(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQIDNO:7LysGluGlnLysThrValAlaMetArgValLysGluSerGlnMetLys151015LysGlnHisLeuTrpArgTrpGlyTrpArgTrpGlyThrMetLeuLeu202530GlyLeuMetIleCysSerAlaThrGluLysLeuTrpValThrValTyr354045TyrGlyValProValTrpLysGluAlaThrThrThrLeuPheCysAla505560SerAspAlaLysAlaTyrAspThrGluValHisAsnValTrpAlaThr65707580HisAlaCysValProThrAspProAsnProGlnGluValValLeuVal859095AsnValThrGluAsnPheAsnMetTrpLysAsnAspMetValGluGln100105110MetHisGluAspIleIleSerLeuTrpAspGlnSerLeuLysProCys115120125ValLysLeuThrProLeuCysValSerLeuLysCysThrAspLeuLys130135140AsnAspThrAsnThrSerAsnAsnValThrSerSerSerTrpGlyArg145150155160AsnIleMetGluGluGlyGluIleLysAsnCysSerPheAsnIleSer165170175ThrSerIleArgGlyLysValGlnLysGluTyrAlaPhePheTyrLys180185190LeuAspIleIleProIleAspLysGlyAsnAspSerAsnAspThrThr195200205SerTyrLysPheThrLeuThrSerCysAsnThrSerValIleThrGln210215220AlaCysProLysValSerPheGluProIleProIleHisTyrCysAla225230235240ProAlaGlyPheAlaIleLeuLysCysAsnAsnLysThrPheAsnGly245250255ThrGlyProCysThrAsnValSerThrValGlnCysThrHisGlyIle260265270ArgProValValSerThrGlnLauLeuLeuAsnGlySerLeuAlaGlu275280285GluGluValValIleArgSerAlaAshPheThrAspAsnAlaLysThr290295300IleIleValGlnLeuAsnGlnSerValGluIleAsnCysThrArgPro305310315320AsnAsnAsnThrArgLysSetIleArgIleGlnArgGlyPheGlyArg325330335AlaPheValThrIleGlyLysIleLeuGlyAsnMetArgGlnAlaHis340345350CysAsnIleSerArgAlaLysTrpAsnAsnThrLeuLysGlnIleAsp355360365SerLysLeuArgGluGlnPheGlyAsnAsnLysThrIleIlePheLys370375380GlnSerSerGlyGlyAspProGluIleValThrHisSerPheAsnCys385390395400GlyGlyGluPhePheTyrCysAsnSerThrGlnLeuPheAsnSerThr405410415TrpPheAsnSerThrTrpSerThrLysGlySerAsnAsnThrGluGly420425430SerAspThrIleThrLeuProCysArgIleLysGlnIleIleAsnMet435440445TrpGlnGluValGlyLysAlaMetTyrAlaProProIleSerGlyGln450455460IleArgCysSerSerAsnIleThrGlyLeuLeuLeuThrArgAspGly465470475480GlyAlaAsnGluAsnAsnGluSerGluIlePheArgProGlyGlyGly485490495AspMetArgAspAsnTrpArgSerGluLeuTyrLysTyrLysValVal500505510LysIleGluProLeuGlyValAlaProThrLysAlaLysArgArgVal515520525ValGlnArgGluLysArgAlaValGlyGluIleGlyAlaLeuPheLeu530535540GlyPheLeuGlyAlaAlaGlySerThrMetGlyAlaAlaSerMetThr545550555560LeuThrValGlnAlaArgGlnLeuLeuSerGlyIleValGlnGlnGln565570575AsnAsnLeuLeuArgAlaIleGluAlaGlnGlnHisLeuLeuGlnLeu580585590ThrValTrpGlyIleLysGlnLeuGlnAlaArgIleLeuAlaValGlu595600605ArgTyrLeuLysAspGlnGlnLeuLeuGlyIleTrpGlyCysSerGly610615620LysLeuIleCysThrThrAlaValProTrpAsnAlaSerTrpSerAsn625630635640LysSerLeuGluGlnIleTrpAsnAsnMetThrTrpMetGluTrpAsp645650655ArgGluIleAsnAsnTyrThrSerLeuIleHisSerLeuIleGluGlu660665670SerGlnAsnGlnGlnGluLysAsnGluGlnGluLeuLeuGluLeuAsp675680685LysTrpAlaSerLeuTrpAsnTrpPheAsnIleThrAsnTrpLeuTrp690695700TyrIleLysLeuPheIleMetIleValGlyGlyLeuValGlyLeuArg705710715720IleValPheAlaValLeuSerValValAsnArgValArgGlnGlyTyr725730735SerProLeuSerPheGlnThrHisLeuProIleProArgGlyProAsp740745750ArgProGluGlyIleGluGluGluGlyGlyGluArgAspArgAspArg755760765SerIleArgLeuValAsnGlySerLeuAlaLeuIleTrpAspAspLeu770775780ArgSerLeuCysLeuPheSerTyrHisArgLeuArgAspLeuLeuLeu785790795800IleValThrArgIleValGluLeuLeuGlyArgArgGlyTrpGluAla805810815LeuLysTyrTrpTrpAsnLeuLeuGlnTyrTrpSerGlnGluLeuLys820825830AsnSerAlaValSerLeuLeuAsnAlaThrAlaIleAlaValAlaGlu835840845GlyThrAspArgValIleGluValValGlnGlyAlaTyrArgAlaIle850855860ArgHisIleProArgArgIleArgGlnGlyLeuGluArgIleLeuLeu865870875880權(quán)利要求1．一種多包膜蛋白疫苗，包括至少約4-10,000種不同的重組病毒，其中每一種病毒包括編碼人免疫缺損病毒(HIV)多包膜蛋白不同變異體的env變異體(EV)的核酸，其中a)EV核苷酸編碼包膜蛋白變異體的變異區(qū)和保守區(qū)；并且b)此多包膜蛋白疫苗能夠引發(fā)哺乳動(dòng)物對一個(gè)HIV株的細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)中的至少一種。2．根據(jù)權(quán)利要求1的多包膜蛋白疫苗，包括約10-100種包含不同HIV包膜蛋白(env)變異體的重組病毒。3．根據(jù)權(quán)利要求1的多包膜蛋白疫苗，其中的重組病毒選自痘苗病毒、金絲雀痘病毒、腺病毒和腺病毒伴隨病毒(AAV)。4．根據(jù)權(quán)利要求1的多包膜蛋白疫苗，其中的包膜蛋白變異體包括gp120和足以使env蛋白寡聚化的gp41的一部分。5．根據(jù)權(quán)利要求4的多包膜蛋白疫苗，其中的包膜蛋白變異體核苷酸包括HIV包膜蛋白編碼核苷酸的KpnⅠ-BsmⅠ限制性片段。6．根據(jù)權(quán)利要求1的多包膜蛋白疫苗，其中的EV核苷酸是從一個(gè)限定的地理區(qū)域內(nèi)感染了HIV病毒的病人或從不同進(jìn)化枝(clades)內(nèi)感染了HIV病毒的病人中分離得到的。7．根據(jù)權(quán)利要求9的多包膜蛋白疫苗，其中的疫苗包括了由重組病毒表達(dá)的包膜蛋白變異體。8．根據(jù)權(quán)利要求1的多包膜蛋白疫苗，其中的多包膜蛋白疫苗進(jìn)一步包括了藥物上可接受的載體、佐劑和抗病毒化療化合物中的至少一種。9．制備多包膜蛋白疫苗的方法，包括將至少4-約10,000種不同重組病毒混合成混合物以獲得多包膜蛋白疫苗，其中，&lt;ⅰ&gt;每一重組病毒包括編碼不同的HIV包膜蛋白變異體的env變異體(EV)核苷酸；&lt;ⅱ&gt;此EV核苷酸編碼包膜蛋白變異體的變異區(qū)和保守區(qū)；&lt;ⅲ&gt;此多包膜蛋白疫苗能夠引發(fā)哺乳動(dòng)物對一個(gè)HIV株的細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)中的至少一種。10．根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中約10-100種包括不同HIV包膜蛋白變異體的重組病毒被混合。11．根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中的重組病毒選自痘苗病毒、金絲雀痘病毒、腺病毒和腺病毒伴隨病毒(AAV)。12．根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中的包膜蛋白變異體包括gp120和足以使env蛋白寡聚化的gp41的一部分。13．根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中的EV核苷酸包括HIV包膜蛋白編碼核苷酸的KpnⅠ-BsmⅠ限制性片段。14．根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中的EV核苷酸是從一個(gè)限定的地理區(qū)域內(nèi)感染了HIV病毒的病人或從不同進(jìn)化枝(clades)內(nèi)感染了HIV病毒的病人中分離出來的。15．根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中的疫苗包括了由重組病毒表達(dá)的包膜蛋白變異體。16．根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中的組合步驟進(jìn)一步包括添加藥物上可接受的載體、佐劑和抗病毒化療化合物中的至少一種。17．根據(jù)權(quán)利要求9的方法制備的多包膜蛋白疫苗。18．一種引發(fā)哺乳動(dòng)物對人免疫缺損病毒(HIV)的體液或細(xì)胞免疫反應(yīng)或兩種反應(yīng)都產(chǎn)生的方法，包括給動(dòng)物施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的多包膜蛋白疫苗。19．根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中的重組病毒為痘苗病毒，包括皮下途徑施用此多包膜蛋白疫苗。20．根據(jù)權(quán)利要求18的方法，進(jìn)一步包括給哺乳動(dòng)物施用有效量的根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)另一種多包膜蛋白疫苗，其中另一種多包膜蛋白疫苗的重組病毒與權(quán)利要求18的疫苗的重組病毒不同。21．根據(jù)權(quán)利要求18的方法，進(jìn)一步包括通過施用&lt;ⅰ&gt;有效量的至少一種重組HIV包膜蛋白或&lt;ⅱ&gt;有效量的至少一種可表達(dá)重組HIV包膜蛋白的DNA載體，&lt;ⅲ&gt;或前兩者都有引發(fā)或加強(qiáng)體液或細(xì)胞免疫反應(yīng)或兩種反應(yīng)均引發(fā)，其中DNA載體可在重組HIV包膜蛋白施用之前，之后或同時(shí)施用。22．根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中的重組HIV包膜蛋白與佐劑形成復(fù)合物或通過肌內(nèi)注射或兩者都進(jìn)行；或其中的DNA載體用基因槍施用。23．權(quán)利要求24的雙功能質(zhì)粒，其中的動(dòng)物表達(dá)控制序列是一個(gè)巨細(xì)胞病毒立即早期(CMV)啟動(dòng)子，且病毒表達(dá)控制序列是痘苗病毒早期啟動(dòng)子，痘苗病毒晚期啟動(dòng)子或兩者俱備。24．包括異源基因的權(quán)利要求24的雙功能質(zhì)粒，其中的異源基因?yàn)榫幋aHIV包膜蛋白變異體的變異區(qū)和保守區(qū)的env變異體(EV)核苷酸。全文摘要本發(fā)明提供多包膜蛋白疫苗,其中包括至少約4－10,000不同重組病毒的混合物,每一重組病毒表達(dá)一種不同的HIV包膜蛋白變異體或含有其保守區(qū)和變異區(qū)在內(nèi)的一部分;以及制備和應(yīng)用此多包膜蛋白疫苗和病毒的方法,包括其活的、減毒或滅活的形式在HIV感染的預(yù)防和治療中的應(yīng)用。本發(fā)明的病毒疫苗最適于與重組HIV包膜蛋白加強(qiáng)疫苗或與重組HIV包膜蛋白基因DNA初次或加強(qiáng)疫苗聯(lián)合使用。文檔編號C07K14/16GK1214083SQ97193234公開日1999年4月14日申請日期1997年1月23日優(yōu)先權(quán)日1996年1月23日發(fā)明者J·胡爾維茨,C·克勒科羅,R·奧文斯,K·斯羅波德申請人:圣朱迪兒童研究醫(yī)院