專利名稱：可復(fù)制型DNA疫苗載體pSFVax1－IRES及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于腫瘤生物治療領(lǐng)域，涉及一種可復(fù)制型DNA疫苗載體的構(gòu)建與制備。
背景技術(shù)：
常規(guī)DNA疫苗有可能與宿主細(xì)胞基因組發(fā)生整合，從而引起宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化；并且DNA疫苗不能在體內(nèi)復(fù)制，外源基因的表達(dá)水平低，達(dá)不到所需要的免疫效果[Nichols W W，Ledwith B J，Manam S V，et al.Potential DNAvaccine integration into host cell genome.[J]Ann N Y AcadSci，1995，77230-39.]。這些局限性促使研究人員去研發(fā)更安全、高表達(dá)、免疫效果更好的疫苗。近年來(lái)用具有“自主復(fù)制”功能的RNA病毒復(fù)制元件構(gòu)建的復(fù)制型DNA疫苗克服了常規(guī)DNA疫苗、RNA疫苗以及RNA復(fù)制子疫苗的缺點(diǎn)，顯示出很好的應(yīng)用前景。所謂“自主復(fù)制”的RNA疫苗(即RNA復(fù)制子疫苗)，是在具有“自我復(fù)制”功能的RNA病毒的基礎(chǔ)上構(gòu)建而成的。這類RNA病毒主要是披膜病毒科的甲病毒，如辛德比斯病毒(SIN)、塞姆利基森林病毒(SFV)、以及委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VEE)等。這種RNA病毒在利用自身的RNA復(fù)制酶實(shí)現(xiàn)自我復(fù)制的同時(shí)，也實(shí)現(xiàn)了外源基因的高效表達(dá)。但該疫苗雖然在外源基因高效表達(dá)上有了突破性進(jìn)展，而RNA的穩(wěn)定性差所帶來(lái)的生產(chǎn)、儲(chǔ)存、運(yùn)輸不便的問(wèn)題仍未解決，因此RNA復(fù)制子疫苗的應(yīng)用還是受到了一定的限制。
用具有“自主復(fù)制”功能的RNA病毒復(fù)制元件構(gòu)建的復(fù)制型DNA疫苗，則克服了上述缺點(diǎn)，并保留了“自主復(fù)制”型RNA疫苗的優(yōu)點(diǎn)。1)RNA復(fù)制酶使得該疫苗具有自我復(fù)制能力，介導(dǎo)RNA復(fù)制子在細(xì)胞質(zhì)中的大量自我復(fù)制，因此外源基因可以得到高效表達(dá)[Hariharan M J，Driver D A，Townsend K，et al.DNA immunization against herpes simplex virusenhanced efficacy using aSindbis virus-based vector[J].J Virol，1998，72(2)950-958.]。2)復(fù)制型DNA疫苗可以產(chǎn)生CTL反應(yīng)和抗體應(yīng)答，同時(shí)還可誘導(dǎo)黏膜免疫和全身免疫，因此該疫苗的免疫效果較好[Lee JS，Hadjipanayis AG，Welkos SL.Venezuelan equineencephalitis virus-vectored vaccine protect mice against anthrax sporechallenge.[J].Infect Immun，2003，711491.]。表達(dá)產(chǎn)物在APC內(nèi)經(jīng)蛋白酶復(fù)合體降解成短肽片段后，一部分在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上與MHC-I類分子結(jié)合，然后表達(dá)于細(xì)胞膜表面，激活CD8+T細(xì)胞，引發(fā)CTL反應(yīng)，從而產(chǎn)生細(xì)胞免疫反應(yīng)。另一部分短肽進(jìn)入溶酶體內(nèi)體區(qū)與MHC-II類分子結(jié)合后運(yùn)至APC表面，激發(fā)CD4+T細(xì)胞克隆的增殖、分化，從而促進(jìn)B細(xì)胞的增殖分化，產(chǎn)生抗體，誘發(fā)體液免疫反應(yīng)[Frolov I，Hoffman TA.Alphavirus-based expression vectorsStrategies and applications.[J]Proc Natl Acad Sci USA，1996，9311371.]。3)該疫苗的自我復(fù)制、轉(zhuǎn)錄表達(dá)均發(fā)生于細(xì)胞質(zhì)中，而且最終會(huì)誘導(dǎo)被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的凋亡，從而消除了與宿主細(xì)胞基因組整合的危險(xiǎn)性，提高了安全性[LeitnerW W，Ying H，Driver D A，et al.Enhancement of tumor-specific immune responsewith plasmid DNA replicon vectors.[J]Cancer Res，2000，6051-55.]。4)由于DNA的理化性質(zhì)比較穩(wěn)定，體外不易降解，所以該疫苗的穩(wěn)定性較好，便于生產(chǎn)、儲(chǔ)存和運(yùn)輸?；谏鲜鰞?yōu)點(diǎn)，作為一種新型疫苗，復(fù)制型DNA疫苗已經(jīng)在許多疾病模型上展示出了良好的免疫效果。[Nordstrom EK，F(xiàn)orsell MN，Barnfield C，et al.Enhanced immunogenicity using an alphavirus replicon DNAvaccine against human immunodeficiency virus type 1.[J].J Gen Virol.2005，86349-354.][Otten GR，Schaefer M，Doe B，et al..Enhanced potency of plasmidDNA microparticle human immunodeficiency virus vaccines in rhesus macaquesby using a priming-boosting regimen with recombinant proteins.[J].J Virol.2005，79(13)8189-8200.][Quintana-Vazquez D，Vazquez-Blomquist DM，GalbanRodriguez E，et al.A vaccination strategy consisting of SemlikiForest-virus(SFV)DNA prime and fowlpox-virus boost significantly protects mice from arecombinant(HIV-1)vaccinia-virus infection.[J].Biotechnol Appl Biochem.2005，4159-66.]西門利克森林病毒(Semliki forest virus，SFV)載體是近年來(lái)構(gòu)建成功的新型甲病毒載體，具有表達(dá)效率高，宿主范圍廣，且表達(dá)蛋白能夠進(jìn)行正確的折疊、加工、轉(zhuǎn)運(yùn)等特點(diǎn)。與痘苗病毒、腺病毒和單純皰疹病毒等病毒載體比較，不但系統(tǒng)簡(jiǎn)單，而且不產(chǎn)生大量的病毒特異性蛋白。因此該載體系統(tǒng)在外源基因的表達(dá)和新型疫苗的研究方面具有較廣泛的應(yīng)用前景。但該載體系統(tǒng)在SP6啟動(dòng)子控制下，外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)必須首先進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，制備5′末端含有帽子結(jié)構(gòu)的重組RNA，這種體外轉(zhuǎn)錄物不但容易降解，而且轉(zhuǎn)染效率低，因而限制了它的應(yīng)用。另外pSFV1表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)酶切位點(diǎn)少，不利于外源基因的插入。為克服pSFV1載體系統(tǒng)的種種限制，本研究對(duì)其進(jìn)行了改造，首先在pSFV1的多克隆位點(diǎn)區(qū)插入含有多種稀有酶位點(diǎn)的接頭；并將真核表達(dá)調(diào)控元件導(dǎo)入了該載體系統(tǒng)。該載體系統(tǒng)的改造，不但可提高外源基因的克隆效率，而且為在DNA水平上進(jìn)行外源基因的操作提供了方便。
綜上所述，“自我復(fù)制”型載體是由Alpha病毒如Sindbis及SFV衍生的DNA/RNA載體被用于外源基因的表達(dá)。此類表達(dá)載體與傳統(tǒng)真核載體對(duì)外源基因的表達(dá)機(jī)制不同。在傳統(tǒng)表達(dá)載體中，RNA聚合酶II直接介導(dǎo)外源基因mRNA的轉(zhuǎn)錄。而在此類復(fù)制性載體中，第一層表達(dá)核也利用CMV即刻-早期增強(qiáng)子作為啟動(dòng)子，但此啟動(dòng)子并不直接指導(dǎo)外源基因的表達(dá)，而是控制具有自身復(fù)制能力的Alpha病毒RNA表達(dá)層(replicon)的表達(dá)。這一復(fù)制子由SFV非結(jié)構(gòu)區(qū)復(fù)制酶基因、病毒復(fù)制所必需的結(jié)構(gòu)基因5’與3’末端，以及替代病毒結(jié)構(gòu)基因的外源基因組成。Alpha病毒RNA的翻譯產(chǎn)生Alpha病毒復(fù)制酶復(fù)合物，繼而介導(dǎo)細(xì)胞漿內(nèi)重組RNA的自身復(fù)制，從而導(dǎo)致外源基因編碼的mRNAs的高水平表達(dá)。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是自主設(shè)計(jì)并構(gòu)建一個(gè)新的可復(fù)制型DNA疫苗載體，為研究可復(fù)制型DNA疫苗提供新的載體系統(tǒng)。在常規(guī)的可復(fù)制型RNA疫苗載體pSFV1的基礎(chǔ)上，增加了CMV IE增強(qiáng)子啟動(dòng)子及牛生長(zhǎng)因子加尾信號(hào)poly(A)加尾信號(hào)，并且增加了雙順?lè)醋颖磉_(dá)元件IRES序列和多種稀有酶位點(diǎn)，從而將以RNA為基礎(chǔ)的pSFV1載體系統(tǒng)構(gòu)建成以DNA為基礎(chǔ)的表達(dá)載體系統(tǒng)pSFVax1-IRES。同時(shí)也將pSFV1中的氨卞青霉素抗性改造成了卡那霉素抗性，更適合將來(lái)構(gòu)建的復(fù)制型DNA疫苗進(jìn)行人體應(yīng)用，以該載體為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)新型復(fù)制型DNA疫苗，將會(huì)更加安全有效。
本發(fā)明構(gòu)建的pSFVax1-IRES可復(fù)制型DNA疫苗載體，其質(zhì)粒全長(zhǎng)11458bp，參見(jiàn)序列表中的SEQ ID №載體全長(zhǎng)序列。重要的功能元件及其在pVAX1-IRES載體中的位置如下CMV promoter10463-11025Multiple cloning site A7403-7478Multiple cloning site B8065-8113IRES7479-8071BGH polyadenylation signal8150-8167Kanamycin resistance gene8553-9347pUC origin9647-10320
圖1為pSFVax1-IRES可復(fù)制型DNA疫苗載體的構(gòu)建策略圖
圖2為IRES的擴(kuò)增片段1.DL2000 2.IRES擴(kuò)增產(chǎn)物圖3為IRES擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序4為IRES插入pVAX1的酶切鑒定電泳圖1.DL2000 2.過(guò)渡載體pVAX1-IRES 3.EcorV和XhoI雙酶切產(chǎn)物圖5為線性化的pVAX1-IRES和酶切后的pSFV11.DL2000 2.過(guò)渡載體pVAX1-IRES3.線性化的pVAX1-IRES4.pSFV1質(zhì)粒5.酶切處理的pSFV1圖6為pSFVax1-IRES的鑒定圖1.DL20002、pVAX1質(zhì)粒3.過(guò)渡載體pVAX1-IRES4、RNA疫苗載體pSFV15、可復(fù)制型載體pSFVax1-IRES6.用SmaI和BamHI雙酶切pSFVax1-IRES的產(chǎn)物具體實(shí)施方式
本發(fā)明提出的pSFVax1-IRES可復(fù)制型DNA疫苗載體的構(gòu)建與制備實(shí)施方式如下(參見(jiàn)圖1)
1、首先設(shè)計(jì)引物，從pIRES-neo載體中擴(kuò)增出IRES序列。在pIRES-neo載體中，IRES序列的位置為1295-1880，擴(kuò)增時(shí)，5’端多出16bp，3’端多出16bp(含一個(gè)SmaI酶切位點(diǎn))。在擴(kuò)增IRES序列的上游引物中，預(yù)先設(shè)計(jì)了限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)EcorV、BamI、ClaI、BstBI、PvuI和PsiI；在擴(kuò)增IRES序列的下游引物中，預(yù)先設(shè)計(jì)了限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)BssHII、SwaI、PacI、NsiI、smaI和XhoI。
2、將上述擴(kuò)增出的IRES片段，在EcorV和XhoI雙酶切位點(diǎn)之間，插入pVAX1載體中，得到pVAX1-IRES過(guò)渡載體。
3、將得到的過(guò)渡載體pVAX1-IRES用NheI酶切，補(bǔ)平末端；再用BamHI酶切，得到線性化pVAX1-IRES；4、用SphI酶切pSFV1，補(bǔ)平末端，再用BamHI酶切，得到pSFV1載體片段。
5、將上述線性化的pVAX1-IRES和pSFV1載體片段進(jìn)行連接，得到pSFVax1-IRES可復(fù)制型DNA疫苗載體。
本發(fā)明更詳細(xì)的實(shí)施方法可參見(jiàn)實(shí)施例，本實(shí)施例是用于解釋、而不是以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1設(shè)計(jì)引物并進(jìn)行合成。
上游引物設(shè)計(jì)EcorV GATATC-ClaI AT/CGATBstBI TT/CGAA-PvuI CGAT/CG-PsiITTA/TAAGATATCGATTCGAACGATCGTTATAATGCAGATATCGATTCGAACGATCGTTATAActagggcggccaattccgcccctctcc(pSFVaxl-IRES)下游引物設(shè)計(jì)NsiI ATGCA/T-PacI TTAAT/TAA-SwaI ATTT/AAAT-BssHII G/CGCGC-XhoICTCGAGATGCATTAATTAATTTAAATGCGCGCTCGAG(正向序列)
ataattcctgcagccaATGCATTAATTAATTTAAATGCGCGCTCGAGTCTAG(pSFVax1-IRES)引物合成由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司完成。
實(shí)施例2從pIRES-neo載體中擴(kuò)增IRES序列，克隆到pSimple18-EcoRV/BAPVector測(cè)序在GeneAmp PCR System 2400型PCR儀上進(jìn)行如下反應(yīng)反應(yīng)體系50μl5xPrimeSTARTMBuffer(Mg2+plus)10μl，dNTPs(2.5mmol/L)4μl，上游引物(20μmol/L)1μl，下游引物(20μmol/L)1μl，PrimeSTARTMHSDNA Polymerase(2.5U/μl)0.5μl，模板(pIRES-neo質(zhì)粒稀釋100倍)1μl，滅菌蒸餾水32.5μl反應(yīng)條件95℃3分鐘(94℃45秒，60℃45秒，72℃1分鐘30秒)循環(huán)30次72℃7分鐘 4℃∞產(chǎn)物鑒定取5μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2％瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果證實(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量在500～750bp范圍，與預(yù)期的682bp一致。
序列分析將PCR產(chǎn)物按照TaKaRa DNA Kination Kit試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行5′末端磷酸化，然后連接到測(cè)序載體pSimple18-EcoRV/BAP Vector中，委托三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)公司進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果測(cè)定序列與預(yù)期序列一致，證明確實(shí)擴(kuò)增出了序列完全正確的IRES基因，并在其兩側(cè)附加了多個(gè)酶切位點(diǎn)。預(yù)期及測(cè)序分析的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列完全一致(測(cè)序圖見(jiàn)圖3)。
實(shí)施例3將IRES克隆到pVAX1真核表達(dá)載體中雙酶切用堿變性法提取含IRES PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的pSimple18-EcoRV/BAP-IRES質(zhì)粒，用EcorV和XhoI雙酶切，純化切出的IRES片段；用EcorV和XhoI雙酶切真核表達(dá)載體pVAX1，純化回收酶切處理后的載體。雙酶切體系為5μl的10×NEBbuffer3，10u/μl的EcoRV 2μl，10u/μl的XhoI 2μl，100×BSA0.5μl，質(zhì)粒30μl，加水至總體積50μl，37℃水浴8小時(shí)。酶切后產(chǎn)物割膠純化回收目的片段。
插入連接取上述純化回收的IRES片段和pVAX1載體各5μl，TaKaRaDNA Ligation Kit＜Mighty Mix＞連接試劑盒中的Ligation Mix 10μl，16℃過(guò)夜，進(jìn)行連接反應(yīng)。次日常規(guī)方法轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)菌中。
鑒定從轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中，挑出3個(gè)克隆提質(zhì)粒用EcorV和XhoI雙酶切進(jìn)行酶切鑒定，獲得了一個(gè)插入了IRES的陽(yáng)性克隆，命名為pVAX1-IRES，酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖4。
實(shí)施例4構(gòu)建可復(fù)制型DNA載體pSFVax1-IRES4.1將得到的過(guò)渡載體pVAX1-IRES用NheI酶切，補(bǔ)平末端；再用BamHI酶切，得到線性化pVAX1-IRES，酶切結(jié)果見(jiàn)圖5。
4.2用SphI酶切pSFV1，補(bǔ)平末端，再用BamHI酶切，得到pSFV1載體片段，酶切結(jié)果見(jiàn)圖5。
4.3將上述線性化的pVAX1-IRES和pSFV1載體片段進(jìn)行連接反應(yīng)，次日常規(guī)方法轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)菌中。
4.4從轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中，挑取克隆提質(zhì)粒用SmaI和BamHI雙酶切進(jìn)行酶切鑒定，獲得了一個(gè)插入了IRES的陽(yáng)性克隆，命名為pSFVax1-IRES，酶切鑒定結(jié)果見(jiàn)圖6。
SEQUENCE LISTING<110>中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所<120>可復(fù)制型DNA疫苗載體pSFVax1-IRES及其構(gòu)建方法<130>參考文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)于申請(qǐng)說(shuō)明書(shū)中<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>11458<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>在常規(guī)可復(fù)制型RNA疫苗載體pSFV1的序列基礎(chǔ)上改造而成，具有PCMV啟動(dòng)子元件、RNA復(fù)制酶元件、IRES序列和多種稀有酶切位點(diǎn)，同時(shí)具有卡那霉素抗性基因<400>1gatggcggat gtgtgacata cacgacgcca aaagattttg ttccagctcc tgccacctcc60gctacgcgag agattaacca cccacgatgg ccgccaaagt gcatgttgat attgaggctg120acagcccatt catcaagtct ttgcagaagg catttccgtc gttcgaggtg gagtcattgc180aggtcacacc aaatgaccat gcaaatgcca gagcattttc gcacctggct accaaattga240tcgagcagga gactgacaaa gacacactca tcttggatat cggcagtgcg ccttccagga300gaatgatgtc tacgcacaaa taccactgcg tatgccctat gcgcagcgca gaagaccccg360aaaggctcga tagctacgca aagaaactgg cagcggcctc cgggaaggtg ctggatagag420agatcgcagg aaaaatcacc gacctgcaga ccgtcatggc tacgccagac gctgaatctc480ctaccttttg cctgcataca gacgtcacgt gtcgtacggc agccgaagtg gccgtatacc540aggacgtgta tgctgtacat gcaccaacat cgctgtacca tcaggcgatg aaaggtgtca600gaacggcgta ttggattggg tttgacacca ccccgtttat gtttgacgcg ctagcaggcg660
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權(quán)利要求
1.一種用于腫瘤生物治療的復(fù)制性DNA疫苗載體pSFVax1-IRES，其特征在于具有PCMV啟動(dòng)子元件、RNA復(fù)制酶元件、IRES序列和多種稀有酶切位點(diǎn)，同時(shí)具有卡那霉素抗性。
2.按照權(quán)利要求1PCMV啟動(dòng)子元件是指CMV IE增強(qiáng)子啟動(dòng)子，在載體的10463-11025bp處，是重要的真核表達(dá)調(diào)控元件。
3.按照權(quán)利要求1RNA復(fù)制酶元件是具有自主復(fù)制功能的RNA病毒復(fù)制元件，這類RNA病毒主要是披膜病毒科的甲病毒，如辛德比斯病毒(SIN)、塞姆利基森林病毒(SFV)、以及委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(VEE)等。
4.按照權(quán)利要求1IRES序列是雙順?lè)醋颖磉_(dá)元件，可以有效地增加載體對(duì)外源基因的表達(dá)能力。此外在向載體引入IRES序列的同時(shí)還引入了兩組有利于外源基因表達(dá)的稀有酶切位點(diǎn)。
5.按照權(quán)利要求1同時(shí)也將pSFV1中的氨卞青霉素抗性改造成了卡那霉素抗性，使本發(fā)明將來(lái)所獲得的復(fù)制型DNA疫苗能夠更適合人體應(yīng)用。
6.pSFVax1-IRES的構(gòu)建方法其特征在于首先獲得pVAX1-IRES過(guò)渡載體，然后經(jīng)酶切補(bǔ)平和平段連接后獲得改造后的新型復(fù)制型DNA載體。
7.新型復(fù)制型DNA載體pSFVax1-IRES在疫苗研究中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于腫瘤生物治療領(lǐng)域，涉及一種可復(fù)制型DNA疫苗載體的構(gòu)建與制備，“自我復(fù)制”型載體是由Alpha病毒如Sindbis及SFV衍生的DNA/RNA載體，可被用于外源基因的高效表達(dá)。此類表達(dá)載體與傳統(tǒng)真核載體對(duì)外源基因的表達(dá)機(jī)制不同，可介導(dǎo)細(xì)胞漿內(nèi)重組RNA的自身復(fù)制，從而導(dǎo)致外源基因編碼的mRNAs的高水平表達(dá)。本發(fā)明所研制的可復(fù)制型DNA疫苗載體pSFVax1－IRES，是在常規(guī)可復(fù)制型RNA疫苗載體pSFV1的基礎(chǔ)上改造而成，該載體的特征在于具有PCMV啟動(dòng)子元件、RNA復(fù)制酶元件、IRES序列和多種稀有酶切位點(diǎn)，同時(shí)具有卡那霉素抗性。該載體系統(tǒng)的發(fā)明，不僅可提高外源基因的克隆表達(dá)效率，而且在DNA水平上方便外源基因的操作，從而為研究可復(fù)制型DNA疫苗提供了新的載體系統(tǒng)。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101053663SQ200610072218
公開(kāi)日2007年10月17日 申請(qǐng)日期2006年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月13日
發(fā)明者于繼云, 閻瑾琦, 劉荷中, 修冰水, 劉國(guó)棟, 陳興, 賈銳, 黃悅, 王浩 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所