專利名稱：因子Xa抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
概括地說，本發(fā)明涉及的是凝血蛋白抑制劑，更具體地說，本發(fā)明涉及的是凝血酶因子Xa的特異性抑制劑。
背景技術(shù)：
形成凝血的能力對于生存來說是至關(guān)重要的。但是，當處于某些病癥狀態(tài)時，在循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)形成凝血這本身卻是一種發(fā)病源。因此，有時可能會要求防止出現(xiàn)血塊形成這一現(xiàn)象，然而，又不希望完全抑制凝血系統(tǒng)，因為這樣一來會出現(xiàn)威脅生命的大出血現(xiàn)象。
為了減少血管內(nèi)的凝血形成，本領(lǐng)域技術(shù)人員一直在試圖研制出一種凝血酶原酶或因子Xa的有效抑制劑，把這種抑制劑結(jié)合到凝血酶原酶復(fù)合物上，從而在凝血過程中激活凝血酶。
一旦達到凝血酶的閾值濃度，適當濃度的因子Xa抑制劑就會提高誘發(fā)凝血所要求的形成凝血酶原酶試劑的水平，但又不會過渡延長凝血過程。盡管長期以來存在著對這種抑制劑的需求，但直到目前為止，臨床應(yīng)用上仍然尚無有效的特異性因子Xa抑制劑。
在許多臨床應(yīng)用中，十分需要抗凝血劑治療處理。而目前使用的藥物在許多特定臨床應(yīng)用中是不能令人滿意的。例如，將近50％的整體髖骨復(fù)位患者發(fā)展為深度靜脈血栓形成(DVT)。目前批準使用的治療方法包括定劑量低分子量肝素法和變劑量肝素法。即使采用了這些藥物療法，仍有10％-20％的患者發(fā)展為DVT，5％-10％的患者發(fā)展為出血并發(fā)癥。
需要有效抗凝血劑的另一類臨床情形是指實施橫腔(transluminal)冠狀血管成形術(shù)、處于心肌梗塞形成危險或出現(xiàn)逐漸增強性心絞痛的情況。目前普遍接受的治療方法是給予肝素和阿司匹林，在24小時治療過程內(nèi)6％-8％的突發(fā)性脈管閉合癥與此治療方法有關(guān)。另外，因使用肝素而需要輸液治療的出血并發(fā)癥所占的比率大約為7％。此外，盡管認為延遲閉合癥是有意義的，但療程終止后繼續(xù)給予肝素已價值不大，并可能是有害的。
最廣泛使用的凝血抑制劑是肝素和有關(guān)的硫酸化多糖、LMWH和硫酸肝素。這些分子通過促進凝血過程中的天然調(diào)節(jié)劑、抗凝血酶III與凝血酶和因子Xa的結(jié)合而發(fā)揮著它們的抗凝血作用。肝素的抑制活性主要是針對凝血酶的，后者的失活作用比因子Xa要快100倍左右。雖然相對于肝素而言，硫酸肝素和LMWH是更有效的Xa和凝血酶抑制劑，而且作為Xa抑制劑又比凝血酶抑制劑稍有效些，但體外差別并不很大(3-30倍)，對體內(nèi)的作用來說是毫無意義的。水蛭素和hirulog是目前臨床試驗用的另外兩種凝血酶特異性抗凝血劑。但是，這些抑制凝血酶的抗凝血劑也與出血并發(fā)癥有相關(guān)性。
對狒狒和狗所做的臨床前期研究表明，因子Xa的特異性抑制劑能夠防止凝血形成，不會產(chǎn)生使用直接凝血酶抑制劑所觀察到的那種出血副作用。這類因子Xa抑制劑包括如2，7-雙-(4-脒基亞芐基)-環(huán)庚酮和Nα-甲苯磺?；拾滨?3-脒基苯丙氨酸甲酯(“TENSTOP”)，它們的有效抑制濃度(Ki)分別為約20nM和800nM。(+)-(2s)-2-(4({(3s)-1-亞氨代乙?；?3-吡咯烷基}氧基)苯基)-3-(7-脒基-2-萘基)丙酸也代表一類因子Xa抑制劑(Katakure等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.197965-972(1993))。但是迄今為止這些化合物尚未在臨床上進行開發(fā)。
另外，因子Xa的特異性蛋白質(zhì)抑制劑已經(jīng)得到確認，它們包括如antistasin(“ATS”)和蜱抗凝血劑肽(“TAP”)。ATS是由水蛭(Haememterin officinalis)分離得到的，含有119個氨基酸，對因子Xa的Ki為約0.05nM。TAP是由蜱(Ornithodoros moubata)分離得到的，含有60個氨基酸，對因子Xa的Ki為約0.5nM。
業(yè)已在大量動物模型系統(tǒng)中研究了重組產(chǎn)生的ATS和TAP的效果。這兩種抑制劑相對于其它抗凝血劑而言均可減少出血時間，并且在促凝血酶原激酶誘導(dǎo)的結(jié)扎頸靜脈的深度靜脈血栓形成模型中能夠防止血凝現(xiàn)象。該模型達到的結(jié)果與當前選用的藥物肝素所獲得的結(jié)果是相互關(guān)聯(lián)的。
還發(fā)現(xiàn)，皮下ATS在促凝血酶原激酶誘導(dǎo)的播散性血管血凝(DIC)模型中是一種有效的治療劑。TAP能夠有效地防止“高剪切”動脈血栓形成和“流速降低”，這兩種現(xiàn)象均是由于外科手術(shù)放置聚酯(“DACRON”)移植物引起的，所說的移植物的放置劑量能夠達到臨床上可接受的延長激活部分促凝血酶原激酶時間(aPTT)，即小于大約2倍的延時。相比之下，即使給予增加aPTT5倍劑量的標準肝素，仍不能防止血栓形成和移植物內(nèi)的流速降低。aPTT是一種對凝血酶抑制劑特別敏感的臨床凝血分析值。
ATS和TAP一直未能進行臨床開發(fā)。這兩種抑制劑的一個主要缺點是，需要重復(fù)劑量給藥，由此產(chǎn)生使之失效的抗體，限制它們在臨床上的有效應(yīng)用。另外，TAP和ATS的大小不可能口服給藥，進一步限制了能夠受益于這些藥劑的患者人數(shù)。
因子Xa特異性抑制劑在醫(yī)藥實踐中具有實際應(yīng)用價值。具體而言，因子Xa抑制劑在當前可選擇的藥物，即肝素和有關(guān)的硫酸化多糖這樣的環(huán)境下是有效的，后兩種是無效或僅僅勉強有效。因此，需要有一種有效的，不會引起不期望副作用的，低分子量的因子Xa特異性凝血抑制劑。本發(fā)明滿足了這一需求，并帶來了相應(yīng)的優(yōu)點。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了具有特異性抑制因子Xa活性的化合物。本發(fā)明的化合物具有結(jié)構(gòu)X1-Y-I-R-X2，其中X1為氫(H)、?；?、烷基或芳基烷基、或者一種或多種氨基酸，X2為修飾的C-末端基團，一種或多種羧基保護基團(見下文)，一種或多種氨基酸，或其它的取代基團，Y、I和R分別為氨基酸酪氨酸、異亮氨酸和精氨酸，以及分別具有酪氨酸、異亮氨酸和精氨酸同樣功能活性的肽分解模擬(peptidomimetic)結(jié)構(gòu)或有機結(jié)構(gòu)。另外。本發(fā)明的化合物具有如本文所定義的結(jié)構(gòu)A1-A2-(A3)m-B。
本發(fā)明的化合物可以是線型的或環(huán)狀的，長度為約2-43個殘基，N-末端或C-末端或兩者均可被修飾。這些化合物具有因子Xa特異性抑制活性，Ki≤100μM，優(yōu)選Ki≤2nM，并且基本上不會抑制包括在凝血鏈中的其它蛋白酶的活性。這些化合物的具體實例包括Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Ala-NH2、Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2、Ac-(iBu)Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2、Ac-Tyr-Ile-Arg-N(CH3)O(CH3)、Ac-Tyr-{ψ(CH2NH)}-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2(其中“ψ”表示假肽鍵，可以是如“(CH2NH)”所示的還原鍵；假肽鍵用括號中的“ψ”即“{ψ}”表示)、Ac-Tyr-Ile-Arg-NH-CH2(4-吡啶基)、Ac-Tyr-Ile-{ψ(CH2NH)}-Arg-Leu-Pro-NH2、Ac-Tyr-Chg-Arg(NO2)-{ψ(CH2NH)}-Leu-NH2、Ac-Tyr-Ile-Arg-{ψ(COCH2)}-Gly-Pro-NH2、Ac-Tyr-Ile-Dab(Nγ-C3H7N)-Leu-Ala-NH2、Ac-Tyr-Ile-PalMe(3)-NH2、Tyr-Ile-Arg-NH2、(D)-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2、Ac-(Bzl)Gly-(Chx)Gly-(3-胍基丙基)Gly-NH2、環(huán)(Gly-Tyr-Ile-Arg-Gly)、Tfa-(iBu)Tyr-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2、Ac-pAph-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2、Ac-Nal(2)-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2、Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2，以及它們的可成藥鹽和C-末端衍生物如它們的酰胺、酯、醇和醛(參見表5)。本發(fā)明還提供了特異性抑制因子Xa活性的方法和抑制個體血凝的方法。本發(fā)明同時還提供了測定因子Xa水平或活性的方法。


圖1給出了凝血鏈的示意圖。
圖2例舉了本發(fā)明化合物的結(jié)構(gòu)。
圖3給出了制備某些本發(fā)明化合物的合成路徑。
發(fā)明詳述血凝作用是一復(fù)雜的過程，涉及一系列漸次擴大的酶激活反應(yīng)，其中血漿酶原依次被一定的蛋白水解作用激活。從機上說，凝血鏈分為內(nèi)源和外源兩條路徑，當因子X激活時匯聚在一起，隨后進入同一條路徑產(chǎn)生凝血酶(參見圖1)。
本發(fā)明證明，內(nèi)源路徑在保證纖維蛋白形成和生長方面起著重要作用，而外源路徑在血液凝固開始階段是很關(guān)鍵的。通常認為，當組織因子/因子VIIa復(fù)合物形成時，在物理意義上血凝開始。所說的復(fù)合物一旦形成即通過激活因子IX和X快速引發(fā)血液凝固。新產(chǎn)生的因子Xa與因子Va和磷脂形成一對一的復(fù)合物以形成凝血酶原酶復(fù)合物，后者負責(zé)將可溶性纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為不溶性纖維蛋白。隨著時間的推移，因子VIIa/組織因子復(fù)合物的活性(外源路徑)受到Kunitz型蛋白酶抑制劑蛋白、TFPI的抑制，當它們復(fù)合為因子Xa時，可以直接抑制因子VIIa/組織因子的蛋白水解活性。在受抑外源系統(tǒng)的參與下，為了維持血凝過程，通過內(nèi)源路徑的凝血酶的調(diào)節(jié)活性生產(chǎn)額外的因子Xa。因此，凝血酶扮演著雙重自動催化角色，即調(diào)節(jié)自身的產(chǎn)率和纖維蛋白原向纖維蛋白的轉(zhuǎn)化作用。
凝血酶生成的自動催化性質(zhì)對非調(diào)節(jié)性出血是重要的安全保障，它確保，一旦達到凝血酶原酶的給定閾值，血液凝固就將完成，例如有效結(jié)束出血癥狀。因此，特別希望研制出即能夠抑制血凝作用又不會直接抑制凝血酶的藥劑。
本發(fā)明提供了YIR肽，這類肽是具有抑制因子Xa活性，但基本上不會抑制包括在血凝途徑中的其它蛋白酶活性的化合物。本文所用術(shù)語“化合物”或“YIR肽”是指非自然存在的Tyr-Ile-Arg(YIR)肽及其類似物和模擬物，它們能夠抑制因子Xa的活性。YIR序列本身是指“YIR基元序列”，由三肽酪氨酸-異亮氨酸-精氨酸組成，或是其功能等同物，如pAph-Chg-PalMe(3)、pAph-Chg-PalMe(3)-NH2和pAph-Chg-AMP(4)(參見表1所列縮寫)。本發(fā)明的化合物包括至少一個YIR基元序列或其功能等同物，并且能夠特異性地抑制因子Xa的活性。為了方便起見，本文主要采用術(shù)語“化合物”和“YIR肽”來表示本發(fā)明的肽，包括功能等同物如肽類似物、肽模擬物和合成有機化合物。本發(fā)明YIR肽的功能等同物其部分特征在于具有本文所公開的結(jié)構(gòu)，且其抑制因子Xa活性的Ki為≤100μM(參見實施例XXXVII)。
本發(fā)明YIR肽的類似物包括，如含有非自然存在的氨基酸或經(jīng)化學(xué)修飾的氨基酸的肽，這些肽使化合物保留了因子Xa抑制活性(參見如表2)。同樣，肽模擬物是模擬本發(fā)明YIR肽的結(jié)構(gòu)，且保持因子Xa抑制活性的非氨基酸化學(xué)結(jié)構(gòu)物。這類模擬物通常其特征在于具有類似于在相應(yīng)的正常YIR肽所發(fā)現(xiàn)的物理特征，如尺寸、電荷或疏水性，這些特性表現(xiàn)在適當?shù)目臻g取向作用方面。肽模擬物的一個具體實例是其中一個或多個氨基酸中的酰胺鍵被如碳-碳鍵或本領(lǐng)域所熟知的其它鍵所取代的那種化合物(如參見Sawyer，Peptide Based DrugDesign P.387-422(ACS，Washington DC 1995)，該文獻引入本文以供參考)。因此，本發(fā)明還提供了具有A1-A2-(A3)m-B結(jié)構(gòu)的因子Xa抑制化合物，其中m為0或1，如本文所公開的(見下文)。本發(fā)明提供了這類肽的實例，這類肽可以是模擬化合物。
最廣義地說，本文所用的術(shù)語“氨基酸”是指能夠由基因編碼翻譯的、組成蛋白質(zhì)鏈節(jié)的自然界存在的20種氨基酸，包括L-氨基酸和D-氨基酸，除非另有說明，同時還指經(jīng)化學(xué)修飾的氨基酸如氨基酸類似物，通常不結(jié)合到蛋白質(zhì)上的自然界存在的氨基酸如正亮氨酸，以及具有本領(lǐng)域已知的氨基酸特性的化學(xué)合成化合物。例如，能夠使肽化合物的構(gòu)象限制與天然苯丙氨酸或脯氨酸相同的Phe或Pro的類似物或模擬物包含在“氨基酸”的定義中，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在本文中所說的類似物和模擬物是指氨基酸的“功能等同物”。氨基酸和氨基酸類似物的其它實例已由Roberts和Vellaccio給出(ThePeptidesAnalysis，Synthesls，Biology，Eds.Gross and Meiennofer，Vol.5，p.341，Academic Press，Inc.，N.Y.1983，該文獻引入本文作為參考)。表1列出了氨基酸、氨基酸類似物和模擬結(jié)構(gòu)物的縮寫。
表1本說明書中使用的縮寫化合物縮寫#1縮寫#2乙?；?Ac丙氨酸 AlaA3-(2-噻唑基)-L-丙氨酸 Tza脒AMDN偕胺肟(C(NH2)＝N-OH) (CNOH.NH2)(N-甲基吡啶鎓)甲基 AMP(4-(N-甲基吡啶鎓))甲基 AMP(4)1-(N-甲基吡啶鎓)乙-1-基AEMP1-(4-(N-甲基吡啶鎓))乙-1-基AEMP(4)精氨酸ArgR天冬酰胺 AsnN天冬氨酸 AspD苯甲?；? Bz2-苯并呋喃羧基Bzf芐基 Bzl芐氧羰基 Cbz5-苯并咪唑羧基5-Bzim叔丁氧羰基Boc苯并三唑-1-基氧-三-(二甲基氨基)-六氟磷酸磷Bopβ-丙氨酸βAlaβ-纈氨酸βVal
β-(2-吡啶基)-內(nèi)氨酸 Pal(2)β-(3-吡啶基)-丙氨酸 Pal(3)β-(4-吡啶基)-丙氨酸 Pal(4)β-(3-N-甲基吡啶鎓)-丙氨酸PalMe(3)溴代-三-吡咯烷酮基-六氟磷酸磷 PyBroP叔丁基 tBu，But叔丁氧羰基 Boc咖啡酸 Caff羰基二咪唑 CDI半胱氨酸 Cys C5-氯吲哚-2-羧基CICA環(huán)己基 Chx環(huán)己基丙氨酸 Cha環(huán)己基甘氨酸 Chg2，4-二氨基丁酸DabDab-衍生的二甲基amidinium Dab(Nγ-C3H7N)2，3-二氨基丙酸DapDap-衍生的二甲基amidinium Dap(Nβ-C3H7N)3，5-二硝基酪氨酸 Tyr(3，5-NO2) Y(3，5-NO2)3，5-二碘代酪氨酸以Tyr(3，5-I) Y(3，5-I)3，5-二溴代酪氨酸 Tyr(3，5-Br)Y(3，5-Br)N，N-二異丁基甲酰胺DIBAN，N-二異丙基甲酰胺DIPA4-N，N-二甲基氨基吡啶 DMAP9-芴基甲氧羰基 Fmoc5-氟代吲哚-2-羧基 FICA甲?；?For谷氨酰胺 Gln Q谷氨酸 Glu Eγ-羧基谷氨酸 Gla甘氨酸 Gly G
組氨酸 His H高精氨酸 hArghR5-羥基吲哚-2-羧基5-HicN-羥基苯并三唑 HOBt3-羥脯氨酸 Hyp亞氨基二乙酸 Ida5-氨基吲哚-2-羧基5AM2IN5-硝基吲哚-2-羧基5NOINDCDL-二氫吲哚-2-羧基 2INCA異丁基 iBu異亮氨酸 Ile I異煙酸 IsnN-甲基-異煙酸IsnMe異哌啶甲酸 Ina異丙醇 iPrOH1-異喹啉羧基 1-Iqc3-異喹啉羧基 3-Iqc亮氨酸 Leu L叔亮氨酸 Tle賴氨酸 Lys K巰基-β，β-1，5-亞戊基丙酸 Mpp巰基乙酸 Mpa巰基丙酸 Mpr甲醇 MeOH蛋氨酸 Met M4-嗎啉代甲酰胺 MORAN-甲基嗎啉 NMM1-萘基丙氨酸 Nal(1)2-萘基丙氨酸 Nal(2)煙酸 Nic哌啶甲酸 NpaN-甲基煙酸 NicMe正精氨酸 nArgnR正亮氨酸 NLe nL
正纈氨酸 Nva nV鳥氨酸Orn鳥氨酸衍生的二甲基amidinium Orn(Nδ-C3H7N)苯基 Ph苯丙氨酸 Phe F對胍基苯丙氨酸Phe(Gua)F(pGua)對氨基苯丙氨酸Phe(NH2) F(pNH2)對氯苯丙氨酸 Phe(Cl) F(pCl)對氟苯丙氨酸 Phe(F) F(pF)對硝基苯丙氨酸Phe(NO2) F(pNO2)對羥苯基甘氨酸Pgl(OH)對甲苯磺?；? Tos2，2，5，7，8-五甲基-苯并二氫吡喃-6-磺?；?Pmc間脒基苯丙氨酸mAph對脒基苯丙氨酸pAph苯基甘氨酸Pgl苯基丙二酸Pma哌啶基PIP1-哌啶子基甲酰胺 PIPAL-哌啶酸 Pip脯氨酸Pro P2-吡嗪羧基Pza2-喹啉羧基2-Qca4-喹啉羧基4-Qca肌氨酸SarS-叔丁基 SBut結(jié)合在“TENTAGEL”上的SCAL聯(lián)結(jié)子 SCAL-TG絲氨酸Ser S四氫異喹啉-3-羧基 Tic蘇氨酸Thr T三氟乙?；鵗fa色氨酸Trp W
酪氨酸 Tyr Y3-碘代酪氨酸Tyr(3-I)Y(3-I)O-甲基酪氨酸Tyr(Me) Y(Me)纈氨酸 Val V*D-構(gòu)型的氨基酸用前綴D-加上三個字母的代碼表示(如，D-Ala、D-Cys、D-Asp、D-Trp)，或者用一個字母代碼的小寫字母表示(分別是a、c、d、w)。
本文所用術(shù)語“因子Xa活性”是指因子Xa本身或以稱為凝血酶原酶復(fù)合物的亞單位形式催化凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶的能力。相對于因子Xa活性而言，術(shù)語“抑制作用”包括對因子Xa活性的直接和間接兩種抑制作用。例如，通過使本發(fā)明的YIR肽結(jié)合到因子Xa或結(jié)合到凝血酶原酶上，從而防止凝血酶原結(jié)合到凝血酶原酶復(fù)合物的活性位點上可以實現(xiàn)對因子Xa活性的直接抑制作用。又如通過把本發(fā)明的化合物結(jié)合到可溶性因子Xa上以防止其連接到凝血酶原酶復(fù)合物上可以實現(xiàn)對因子Xa活性的間接抑制作用。
在本發(fā)明中，針對因子Xa活性抑制而言的術(shù)語“特異性”是指YIR肽可以抑制因子Xa的活性，但基本上不會抑制包括血漿酶和凝血酶在內(nèi)的其它特定蛋白酶的活性(采用同樣的抑制劑濃度)。在血液凝固和纖維蛋白溶解鏈中涉及到所說的這些蛋白酶(參見表2及實施例XXVII)。
表2選用的化合物對五種酶的抑制活性Ki(μM)化合物 Xa凝血酶血漿酶 胰蛋白酶彈性蛋白酶Ac-Y-I-R-L-A-A-F-T1.5100 NT ＞200*＞100Ac-Y-I-R-L-P 0.5＞200 ＞200＞200＞100y-I-R-L-P 0.2＞200 ＞200＞200＞100Ac-(iBu)Y-I-R-L-P0.04 25＞200NT ＞100″TENSTOP″2 2＞200NT＞200*說明當采用試驗用化合物(所給出的)的最高濃度時對酶活性沒有顯著的抑制作用。
表2的結(jié)果證明，本發(fā)明的YIR肽作為因子Xa的抑制劑是有效的，但它基本上不能抑制其它絲氨酸蛋白酶如凝血酶或血漿酶的活性，這些蛋白酶涉及血液凝固和纖維蛋白溶解過程。
本文所用術(shù)語“取代基”是指在本文所述肽、肽類似物、模擬物或有機化合物的主鏈或側(cè)鏈上進行取代的任何各種化學(xué)基團。取代基可以包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種不同的部分(如參見Giannis and kolter，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.321244-12679(1993)，該文獻引入本文作為參考)。本發(fā)明公開了大量的實施例來證明取代基的取代作用，其中包括例如pNH2取代基取代在苯丙氨酸上獲得F(pNH2)，鹵素取代在酪氨酸上獲得如Y(3-I)或Y(3，5-I)。另外，取代基可以是例如雜原子如氮(N，參見如Pal)、氧(O，參見如鄰-甲基酪氨酸)或硫(S，參見如Tyr(SO3H))，它們可以被取代基取代。因此，含N-、S-或O-的部分如-SO3H也被認為是本文所定義的“取代基”。此外，取代基還可以是氨基保護基團或羧基保護基團。
從最廣義上說，本文所用術(shù)語“烷基”是指飽和或不飽和的、直鏈、支鏈或環(huán)狀的約1-13個碳原子鏈。因此，術(shù)語“烷基”包括，如甲基、乙基、正丙基、異丙基、仲丁基、1-甲基丁基、2，2-二甲基丁基、2-甲基戊基、2，2-二甲基丙基、正戊基和正己基，亞烷基、環(huán)碳鏈如環(huán)己基和環(huán)戊基，以及直鏈或支鏈和環(huán)碳鏈的組合，如甲基-環(huán)己基或環(huán)丙基-亞甲基。另外，應(yīng)當知道，本發(fā)明定義的烷基可以被取代基進一步取代。同樣，最廣義地說，術(shù)語“?；笔侵负恤然娘柡突虿伙柡偷?、約1-13個碳原子的直鏈、支鏈或環(huán)狀鏈。因此，術(shù)語“?；卑ㄈ缂柞；?、乙酰基和苯甲?；?。
術(shù)語“芳基”是指含有約5-13個碳原子，且至少一個具有共軛π電子系統(tǒng)的“環(huán)”基團的芳香基團。芳基的實例包括如雜環(huán)芳基、二芳基和它們的類似物及衍生物，所有的這些基團可以被一個或多個取代基取代，也可以不被取代。術(shù)語“芳烷基”是指如上所定義的被芳基取代的烷基。適宜的芳烷基包括芐基和吡啶甲基等，所有的這些基團還可以被進一步取代，或不被取代。
本文也采用術(shù)語“雜烷基”、“雜芳烷基”和“雜芳基”，是指分別被一個或多個雜原子如N、O或S原子取代的烷基、芳烷基和芳基。另外，所用術(shù)語“雜環(huán)”是指被一個或多個雜原子取代的環(huán)烷基或芳基。例如在表1和3中公開了眾多雜烷基、雜芳烷基、雜芳基和雜環(huán)的實例，或者是現(xiàn)有技術(shù)已知的。
本發(fā)明的肽在其N-末端或C-末端可以分別用氨基保護基或羧基保護基進行修飾。本發(fā)明公開了眾多這類修飾物(如參見表3)。肽或肽類似物的N-末端可以進行化學(xué)修飾，這樣即使得N-末端氨基被如乙?；h(huán)戊基羧基、異喹啉基羧基、呋喃甲?；?、甲苯磺?；?、吡嗪羧基或其它基團取代，它們可被如上所述的取代基取代。N-末端還可以用如可逆酰胺鍵取代。應(yīng)該知道，廣義上說，術(shù)語“氨基”是指存在于肽中的任何游離氨基，包括伯、仲或叔氨基。相對而言，術(shù)語“N-末端”是指存在于按常規(guī)方式書寫的肽上的第一個氨基酸中的α-氨基。
本發(fā)明肽的N-末端可以通過與氨基保護基團連接而保護起來。廣義上說，術(shù)語“氨基保護基團”是指能夠與自由氨基基團，包括如本發(fā)明肽N-末端上的α-氨基基團反應(yīng)的化學(xué)基團。通過與之進行反應(yīng)，氨基保護基團能夠保護活性氨基基團使之避免如在合成過程中或由于外切肽酶對最終化合物的活性作用而發(fā)生不期望的反應(yīng)。對氨基基團的修飾還可以帶來其它好處，包括例如提高化合物的溶解性或活性。各種氨基保護基團如本文所述(見表3)，或者是現(xiàn)有技術(shù)已知的那些，它們包括例如?；缫阴；?、吡啶甲酰基(picoloyl)、叔丁基乙?；?、叔丁氧羰基、芐氧羰基、苯甲?；ㄈ?-芳基-2-O-苯甲醛肟(benzyloxime)(參見實施例XVI)之類的苯甲醛肟，以及氨基?；鶜埢@些基團本身可以被氨基保護基團修飾。例如在The Peptides(eds.Grossand Meienhofer，Vol.3，Academic Press，Inc.，N.Y.1981)以及Greene和Wuts的Protective Groups in Organic Synthesis(第二版，P309-405，John Wiley&Sons，New York 1991)中還公開了其它氨基保護基團，這些文獻均引入本發(fā)明作為參考。在本發(fā)明中，本發(fā)明肽或肽類似物的N-末端氨基經(jīng)修飾的任何產(chǎn)物均被稱為“N-末端衍生物”。
同樣，肽C-末端的羧基基團可以用羧基保護基團進行化學(xué)修飾。術(shù)語“羧基基團”和“C-末端”與上述“氨基基團”和“N-末端”定義方式相同。例如存在于肽C-末端上的羧基可以通過將C-末端羧基還原為醇或醛，或通過生成口服用酯，或用諸如噻唑基、環(huán)己基或其它基團之類的取代基取代羧基實現(xiàn)修飾?？诜悯ナ潜绢I(lǐng)域公知的，包括例如烷氧甲基基團如甲氧甲基、乙氧甲基和異丙基甲基等；α-(C1-C4)烷氧乙基如甲氧乙基、乙氧乙基、丙氧乙基和異丙氧乙基等；2-氧代-1，3-二氧代(dioxolen)-4-基甲基基團如5-甲基-2-氧代-1，3-二氧代-4-基甲基和5-苯基-2-氧代-1，3-二氧代-4-基甲基等；C1-C3烷基硫代甲基基團如甲基硫代甲基、乙基硫代甲基和異丙基硫代甲基等；酰氧甲基如新戊酰氧甲基和α-乙酰氧甲基等；乙氧羰基-1-甲基；α-酰氧基-α-取代的甲基基團如α-乙酰氧乙基、3-苯并[c]呋喃酮基或5，6-二甲基苯并[c]呋喃酮基、1-(C1-C4烷氧羰基氧)乙-1-基基團如1-(乙氧羰基氧)乙-1-基；以及1-(C1-C4烷氨基羰基氧)乙-1-基基團如1-(甲氨基羰基氧)乙-1-基。
本發(fā)明的肽可以通過將其連接到羧基保護基團上而實現(xiàn)修飾。羧基保護基團是本領(lǐng)域公知的，通過將其連接到肽上能夠保護羧基基團防止發(fā)生不期望的反應(yīng)(如參見Greene and Wuts，supra，P224-276(1991)，該文獻引入本文作為參考)。本領(lǐng)域技術(shù)人員都知道可以對肽上的N-末端氨基或C-末端羧基進行上述修飾，同樣，也可以對存在于如本發(fā)明肽中的氨基酸或氨基酸類似物側(cè)鏈上的活性氨基或羧基實現(xiàn)上述修飾。用于這種修飾的方法在本文中有說明，或者是本領(lǐng)域已知的。
本發(fā)明提供了特異性抑制因子Xa活性的化合物。本發(fā)明化合物具有通式結(jié)構(gòu)X1-YIR-X2或其功能等同物，其中X1為H、?；?、烷基、芳烷基或一個或多個氨基酸，X2為經(jīng)過修飾的C-末端基團、一個或多個羧基保護基團，或者一個或多個氨基酸或其它取代基團如氨基保護基團。本發(fā)明的化合物用作治療各種臨床病癥的抗凝血劑。本發(fā)明化合物還用于各種實驗室方法以防止血液樣品凝固。
本發(fā)明還提供了一種具有通式A1-A2-(A3)m-B的特異性抑制因子Xa活性的化合物，其中m為0或1，A1為R1-R2-R3，A2為R4-R5-R6；且A3是R7-R8-R9；其中的R1選自1-20個氨基酸； X選自N、CH和NC(O)，R′1和R″1分別選自H、烷基、酰基、芳基、芳烷基和氨基保護基團，其中R1可以被取代基取代；R2為-CR99R100-，其中R99和R100分別選自H、烷基、芳烷基、雜芳烷基和雜芳基，并且R99和R100分別可以被取代基取代；R3選自-C(O)-、-CH2-、-CHR99-C(O)-和-C(O)-NR35-CH2-C(O)-，其中R35為橋連基團-C(O)-CR55-中的CHR55基團；R4為選自-CH2-和-NR50-，其中R50選自H、烷基、芳烷基和雜環(huán)；R5為＞CR201R202，其中R20l和R202分別選自H、烷基、芳基和芳烷基，并且R201和R202分別可以被取代基取代；R6選自-C(O)-、-CH2-和-CHR99-C(O)-；R7選自-CH2-和-NR51-，其中R51為H、烷基、芳烷基、雜烷基和雜芳烷基，并且這些基團部分均可被選自Q或-(CH2)n-Q的基團取代，其中n為0-5，Q選自氨基、脒基、咪唑基和胍基，這些基團可以被取代基取代，可以是其一、二、三或四烷基銨的可成藥鹽、其異酰脲或異硫酰脲；R8為-CR210R211-，其中R210和R211分別選自H、烷基、烷芳基、雜環(huán)，并且這些基團部分均可被選自Q或-(CH2)n-Q的基團取代，其中n為0-5，Q選自氨基、脒基、咪唑基和胍基，這些基團可以被取代基取代，可以是其一、二、三或四烷基銨的可成藥鹽、其isoureide或isothioueide；R9選自-C(O)-、-CH2-和-CHR99-C(O)-；其中，當m為1時，B選自1-20個氨基酸、-NHR52、-NR60R61、-OR70和-CHR60R61，其中R52選自H、烷基、芳烷基、雜芳烷基和雜芳基；R60和R61分別選自H、烷基、芳烷基、芳基、雜芳烷基和雜芳基，R70選自H、?；?、烷基、芳烷基和雜芳烷基，而當m為0時，B選自1-20個氨基酸、-OR70、-NHR52和-NR60R61，并通過酰胺鍵或酯鍵連接到R6上；B可以被取代基取代，如果當R3為-CH2-或-CHR99-C(O)-時，R4則為NR50；當R4為-CH2-時，R3則為-C(O)-或-CHR99-C(O)-；當R6為-CH2時，R7為-NHR51-，當R7為CH2時，R6為-C(O)-或-CHR99-C(O)-；當R4為-NR50-和R1為 時，R50和R′1共同構(gòu)成具有式-C(O)-CHR55-的橋連基團，其中CHR55代表R50，羰基代表R′1，R″1和R55分別為H、C1-C6烷基或芳烷基；當R3是-C(O)-NR35-CH2-C(O)-時，則R4是-NR50，R1為 時，R35和R′1共同構(gòu)成具有式-C(O)CHR55-的橋連基團，其中C(O)代表R′1，CHR55代表R35；R″1和R55分別為H或C1-C6烷基(參見圖2)。
本發(fā)明的化合物可以含有由R1、R2和R3，如果需要還可以有R4形成的環(huán)狀N-末端。這種化合物例如能夠由如上所述的結(jié)構(gòu)A1-A2-(A3)m-B來定義，其中R4為-NR50-，R1為 R50和R′1共同構(gòu)成具有式-C(O)-CHR55的橋連基團，其中R55為H；R1為H或甲基；R99和R100分別選自H、芳烷基、烷基和雜烷基或1-3個碳原子，R99和R100可以進一步連接到選自下組基團的部分上苯基、噻吩基、噻唑基、吡啶基、萘基、萘硫酚基(thionaphthyl)、吲哚基或飽和烷基烷氧基、一烷基氨基、二烷基氨基、四烷基銨、芳烷基氨基、氨基烷芳基、羧基、鹵代、羥基、氨基、酰氨基、脒基、胍基、三唑基和磺酰基，R3選自-C(O)-和-C(O)-NR35-CH2-C(O)-。
另外，在化合物A1-A2-(A3)m-B中，R′1和R″2部分可以被如包括烷基在內(nèi)的多達6個取代基取代，還可以通過諸如-OCH2-、-SCH2-、＞N-CH2-、＞NC(O)-、-CO-或-NY-CO-NZ之類的基團連接在一起，也可以不連接在一起，其中Y和Z可以是H、烷基、芳烷基或雜芳烷基。此外，R99和R100分別可以被如苯基、噻吩基、噻唑基、吡啶基、萘基、萘硫酚基或吲哚基，或上述相應(yīng)的飽和基團之類的取代基取代，也可以被多達五個選自下述的取代基團烷基、烷氧基、一、二、三或四烷基胺、四烷基銨、芳烷基氨基、氨基烷芳基、羧基、鹵素、羥基、氨基、酰胺、脒基、胍基、三唑基或磺?；Ｔ赗2位上帶有取代基的優(yōu)選化合物為其中R100是H，R99是 的化合物。該取代化合物中的W可以是如鹵素、羥基、氨基或脒基，J可以是如O、S或-NR，而R為H或烷基、芳基或芳烷基。
在A2部分上含有取代基的且具有因子Xa抑制活性的本發(fā)明化合物例如其R50、R201或R202上可以帶有一個或多個雜原子取代基如N、O或S。R202還可以被選自如下的取代基所取代 其中X為C、N或S；R不存在，或為H或烷基，并可以被雜原子取代，n為1-5。
在A3部分上含有取代基的且具有因子Xa抑制活性的本發(fā)明化合物例如可以包括其取代基R51上帶有一個或多個取代基如H、烷基、芳烷基或雜環(huán)，還可以被雜原子如N、O或S所取代，也可以不被雜原子取代。R210和R211例如可以是取代基-(CH2)n-Q，其中n為約1-5，Q為氨基、脒基、脲、咪唑、胍基、一、二、三或四烷基銨的可成藥鹽、異酰脲或異硫酰脲。另外，R210或R211可以是如烷基、芳基或烷芳基。這些基團可以進一步被取代基如羥基或C1-C4烷氧基取代。
本發(fā)明的化合物可以含有交替排列的包括B部分在內(nèi)的取代基。取代基的交替排列可以包括如R52被N、O或S所取代，或者R60、R61或R70被一個或多個雜原子或烷基所取代。
本文所公開的通式結(jié)構(gòu)代表本發(fā)明的各種化合物，這些化合物保持三肽即YIR賦予的因子Xa抑制活性。本文所公開的結(jié)構(gòu)物還代表含有非天然存在氨基酸、氨基酸模擬物和具有類似功能的其它有機結(jié)構(gòu)及其取代物。這些功能等同物提供了適當?shù)乃桦姾扇汉涂臻g力的空間分布，從而具有因子Xa有效抑制劑的功能。
本發(fā)明化合物的具體實例包括，例如，Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Ala-NH2；Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2；Ac-(iBu)-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2；Ac-Tyr-Ile-Arg-N(CH3)O(CH3)；Ac-Tyr-{ψ(CH2NH)}-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2；Ac-Tyr-Ile-Arg-NH-CH2(4-吡啶基)；Ac-Tyr-Ile-{ψ(CH2NH)}-Arg-Leu-Pro-NH2；Ac-Tyr-Chg-Arg(NO2)-{ψ(CH2NH)}-Leu-NH2；Ac-Tyr-Ile-Arg-{ψ(COCH2)}-Gly-Pro-NH2；Ac-Tyr-Ile-Dab(Nγ-CH3H7N)}-Leu-Ala-NH2；Ac-Tyr-Ile-PalMe(3)-NH2；Tyr-Ile-Arg-NH2；D-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2；Ac-(Bzl)Gly-(Chx)Gly-(3-胍基丙基)Gly-NH2；環(huán)(Gly-Tyr-Ile-Arg-Gly)；Tfa-(iBu)Tyr-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2；Ac-pAph-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2；以及Ac-Nal(2)-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2。表3和5還給出了本發(fā)明其它的YIR肽。
本發(fā)明還提供了一種具有結(jié)構(gòu)A1-A2-(A3)m-B的化合物，其中R1為 R′1選自H、-CO-Ra、-SO2-Ra、氨基保護基團、可以被取代的1-6個氨基酸，其中所說的1-6個氨基酸的N-末端被選自H、-CO-Ra、-SO2-Ra和氨基保護基團中的取代基所取代；Ra選自烷基、芳基和雜烷基；R″1選自H、酰基和烷基；X為N；R2為-CHR99-，其中R99選自烷基、芳基、芳烷基、雜烷基和雜芳基，并且可以被選自下組中的1-6個取代基取代氟、氯、溴、碘、氨基、硝基、脒基、酰氨基、羧基、酯、醚和羥基；R3為-C(O)-；R4為-NH-；R5為-CHR201-，其中R201為烷基；R6為-C(O)-；R7為-NH-；R8為-CHR210-，其中R210為帶有至少一個形式正電荷的雜烷基，其中雜原子為1-6個氮原子；R9為-C(O)-；B選自O(shè)Rb和-N-RcRd，其中Rb選自H、烷基和羧基保護基團，Rc選自H和烷基，Rd選自烷基、雜烷基和1-20個氨基酸，并且可以被取代基取代，其中所說化合物的C-末端可以用羧基保護基團、伯酰胺基團或與R1上的氨基形成仲酰胺基團或叔酰胺基團的環(huán)肽部分進行修飾。這種化合物可以含有一個或多個氨基保護基團。
例如，本發(fā)明的化合物其A1選自Tyr、F(pNH2)、mAph、pAph和Nal(2)，且含有0或1個氨基保護基團；A2選自Ile和Chg；A3選自Arg、PalMe(3)、Dab(Nγ-C3H7N)、Dap(Nβ-C3H7N)和Orn(Nδ-C3H7N)；B選自-H、-OH、NH2、1-5個氨基酸或其功能等同物以及羧基保護基團。這類化合物的實例包括Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-CH2-Chx；Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-Chx；Bzf-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH2；Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；環(huán)戊基-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；3-Iqc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；2-呋喃甲?；?pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；5-Me-噻吩基-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2和Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-醇(參見表5)。
本發(fā)明還提供了一種具有結(jié)構(gòu)A1-A2-B，即其中m為0的A1-A2-(A3)m-B的化合物。在該化合物中，B可以是雜芳烷基如(4-(N-甲基吡啶鎓))甲基；2-(3-(N-甲基吡啶鎓))乙-1-基；1-(4-(N-甲基吡啶鎓))乙-1-基；(對脒基)芐基；2-(4-(N-甲基吡啶鎓))丙-2-基和2-(4-(N-甲基吡啶鎓))乙-1-基。Ac-pAph-Chg-AMP(4)和Ac-pAph-Chg-AEMP(4)是這類化合物的實例。
在本發(fā)明化合物中是包括L-氨基酸還是包括D-氨基酸對此所作的選擇在一定程度上取決于所需肽的性質(zhì)。例如，連接有一個或多個D-氨基酸能夠提高化合在體外或體內(nèi)的穩(wěn)定性。連接有一個或多個氨基酸還可以提高或降低化合物的藥理學(xué)活性。有時可能要求化合物僅僅保留很短時間的活性。在這種情況下，化合物中結(jié)合有一個或多個L-氨基酸能夠使個體內(nèi)的內(nèi)源肽酶消化體內(nèi)化合物，由此而限制個體與活性化合物的接觸。本領(lǐng)域技術(shù)人員在綜合考慮了如個體的年齡和總體健康狀況后可以確定所需要的本發(fā)明化合物的性質(zhì)。
本發(fā)明的化合物可以采用如自動合成裝置經(jīng)化學(xué)合成得到(參見實施例I)。對反應(yīng)基團如存在于氨基酸側(cè)鏈上的基團或者肽的N-末端或C-末端反應(yīng)性基團的選擇性修飾可以賦予本發(fā)明化合物以所需的特性，如提高穩(wěn)定性或增強抑制能力。
當采用固相合成法時，在使初生肽連接到樹脂上的同時或肽已經(jīng)從樹脂中裂解出來后，可以控制化合物的化學(xué)組分，以獲得例如N-末端衍生物，如N-末端乙?；幕衔?。同樣，也可以對化合物的羧基，包括C-末端羧基進行修飾，例如可以使羧基酰胺化。本領(lǐng)域技術(shù)人員還可以采用溶液相有機化學(xué)合成本發(fā)明的YIR肽。合成后的化合物可以通過已知方法如反相高壓液相色譜法(RP-HPLC；參見實施例I)或其它如基于化合物大小、電荷或疏水性的分離方法進行提純。同樣地，可以采用諸如氨基酸序列分析法或質(zhì)譜法(MS)之類的已知方法來表征本發(fā)明的化合物結(jié)構(gòu)(參見實施例I)。
本發(fā)明的YIR肽可以是線型的或環(huán)狀的(如見下表3)。通過在兩個不相鄰的殘基、部分或取代基之間形成橋可以實現(xiàn)環(huán)化，所說的殘基、部分或取代基可以在YIR基元序列之內(nèi)或之外。例如通過在YIR基元序列內(nèi)的一個殘基與YIR序列外的一個不相鄰的殘基、部分或取代基之間形成橋也可以實現(xiàn)環(huán)化。例如，通過S-S、-CH2-S-、-CH2-O-CH2-、內(nèi)酰胺或酯鍵或如前所提到的可以使肽或肽模擬物環(huán)化(參見Hruby，Life Sci.31189-199(1982)；Toniolo，Int.J.Pept.Prot.Res.35287-300(1990)；Kates et al.，Tetr.Lett.341549-1552(1993)，上述文獻均引入本發(fā)明作為參考)。
本文所用術(shù)語“YIR基元序列外”是指不包括酪氨酸、異亮氨酸或精氨酸殘基的YIR序列或存在于本發(fā)明YIR肽中的其等同物。反之，術(shù)語“YIR基元序列內(nèi)”是指包括至少一個酪氨酸、異亮氨酸和精氨酸的YIR序列或其等同物。對于環(huán)狀化合物而言，術(shù)語“橋”是指存在于本發(fā)明YIR肽中的兩個不相鄰氨基酸之間所形成的鍵。
例如，通過在X1和X2之間形成二硫鍵或內(nèi)酰胺鍵可以實現(xiàn)環(huán)化。能夠形成二硫鍵的殘基包括如Cys、Pen、Mpr和Mpp以及其含2-氨基基團的等同物。能夠形成內(nèi)酰胺鍵的殘基包括如Asp、Glu、Lys、Orn、α，β-二氨基丙酸、α-氨基-己二酸、α，γ-二氨基丁酸、二氨基乙酸、氨基苯甲酸和巰基苯甲酸。本文所公開的化合物例如可以通過內(nèi)酰胺鍵，即可以利用一個側(cè)鏈上不相鄰殘基連接到X1或Y的N-末端氨基基團上形成共價鍵而達到環(huán)化。還可以采用另一種橋結(jié)構(gòu)使本發(fā)明化合物，包括如肽和肽模擬物成環(huán)，即可以通過S-S、-CH2-S-、-CH2-O-CH2-、內(nèi)酰胺鍵、酯鍵或其它連接鍵成環(huán)(如參見Hruby，supra，1982；Toniolo，supra，1990；Kates et al.，supra，1993)。
本發(fā)明的組合物可以作為均一組合物或含有各種組合取代基的化合物的混合物形式提供。取代基選擇上的靈活性在很大程度上得以控制肽化合物類似物的物化性質(zhì)。對取代基的選擇也影響到化合物的鍵親合力(參見實施例)。
含不同取代基排列的各化合物對因子Xa的抑制活性水平不同。這些化合物是按照實施例所描述的方法合成得到的。采用實施例XXXVII和XXXVIII所述的分析法測試肽的抑制活性。使用這些方法，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以合成本發(fā)明所公開的化合物，包括其修飾物，測定化合物對因子Xa的抑制活性。
本發(fā)明提供了特異性抑制因子Xa活性的化合物。這些化合物對因子Xa活性的Ki≤100μM，優(yōu)選≤2nM，并且相對于因子Xa活性而言，基本上不會抑制凝固過程中涉及到的其它蛋白酶的活性和與因子Xa的抑制有關(guān)的纖維蛋白溶解作用(見上表2)。所說的其它蛋白酶包括如凝血酶和血漿酶。本發(fā)明化合物的特異性在下述實施例XXXVII中得到證實(同時請參見上表2)。
本發(fā)明的化合物可以有益地用作抗凝血劑，可以與血樣接觸以防止其凝固。例如，可以使有效量的本發(fā)明化合物與新抽出的血樣進行接觸以防止該血樣凝固。針對本發(fā)明化合物而言，術(shù)語“有效量”是指能夠抑制因子Xa活性的化合物用量。本領(lǐng)域技術(shù)人員都知道，本發(fā)明化合物的有效量可以采用本文所公開的方法(見實施例XXXVII和XXXVIII)或現(xiàn)有技術(shù)已知的其它方法測得。從所公開的本發(fā)明化合物的用途看，本領(lǐng)域技術(shù)人員還應(yīng)知道，可以用本發(fā)明的化合物代替肝素之類的制劑。相對于其它抗凝血劑來說，使用本發(fā)明的化合物例如可以節(jié)省費用。
另外，可將本發(fā)明的化合物藥予個體以治療各種臨床癥狀，包括例如治療心血管疾病或者如與感染或外科手術(shù)有關(guān)的并發(fā)癥。心血管疾病的實例包括血管成形術(shù)后的再狹窄、成人呼吸窘迫綜合癥、多發(fā)性器官病變、中風(fēng)和播散性血管凝血障礙。與外科手術(shù)有關(guān)的并發(fā)癥的實例包括，如外科手術(shù)后可能發(fā)生的深度靜脈血栓形成和近端血栓形成。因此，本發(fā)明的化合物可以用作減小或抑制個體內(nèi)有害的凝血癥狀的藥物。
由于本發(fā)明的YIR肽可以抑制因子Xa的活性，因此這種化合物可以用于減小或抑制個體內(nèi)的凝血作用。本發(fā)明所用術(shù)語“個體”是指脊椎動物，包括哺乳動物，如人類，在這類個體中因子Xa包括在其凝血鏈中。
通過給予個體治療有效量的本發(fā)明YIR肽可以減小或抑制個體內(nèi)的凝血作用。本文所用術(shù)語“治療有效量”是指為了抑制個體的因子Xa活性所必須給予該個體的YIR肽劑量。具體地說，治療有效量的本發(fā)明化合物能夠在凝血酶原酶復(fù)合物中或作為可溶性亞單位直接抑制因子Xa的催化活性，或者，通過抑制因子Xa組合到凝血酶原酶復(fù)合物中而間接地抑制因子Xa的催化活性。更具體而言，這些化合物能夠以Ki≤100μM，優(yōu)選Ki≤2nM抑制因子Xa的活性。采用例如實施例XXXVII和XXXVIII所述的方法或現(xiàn)有技術(shù)已知的其它方法可以確定該治療有效量。
在實施本發(fā)明的治療方法過程中，為了達到治療有效量而給予個體本發(fā)明藥物組合物的具體劑量將取決于各種因素的考慮，包括如疾病的性質(zhì)或嚴重程度、給藥時間和個體年齡及身體條件。采用醫(yī)藥領(lǐng)域已知的臨床法可以確定適宜的劑量。因此，本發(fā)明提供了一種通過使因子Xa與具有序列X1-YIR-X2的化合物，或其中m為0或1的A1-A2-(A3)m-B的化合物，或它們的功能等同物接觸從而特異性抑制因子Xa活性的方法。本發(fā)明還提供了一種通過給予治療有效量的本發(fā)明化合物而減小或抑制個體內(nèi)血凝形成的方法。
本發(fā)明的化合物通常以含有該化合物和藥物可接受的載體的組合物形式給予個體。術(shù)語“藥物可接受的載體”是指對個體是無毒的，或是被適當?shù)墓芾頇C構(gòu)確認為具有可接受毒性的介質(zhì)或組分。在本發(fā)明中術(shù)語藥物可接受的載體包括任何標準藥物載體，如磷酸鹽緩沖鹽水、水、乳濁液如油/水或水/油乳濁液，或各種類型的潤濕劑。Martin公開了適宜的藥物載體及其配方(Remington′s Pharmaceutical Sciences，15th Ed.(Mack Publishing Co.，Easton 1975)，該文獻引入本發(fā)明作為參考)。一般來說，組合物包括治療有效量的本發(fā)明化合物和適當量的載體，以便對個體給藥時能夠提供適當?shù)膭┝俊Ｒ虼?，本發(fā)明所要求保護的化合物可以用作抑制因子Xa的活性和個體內(nèi)血液凝固的藥物。
藥物可接受的載體還可以包括，如其他介質(zhì)、化合物或者是能夠提高藥理學(xué)功效的因子Xa抑制劑化合物的改性。藥物可接受的介質(zhì)可以包括例如酸加成鹽，如由無機酸或有機酸形成的鹽，所說的無機酸例如為鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸或高氯酸，所說的有機酸例如為乙酸、草酸、馬來酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸或丙二酸。其他的可成藥鹽包括例如無機硝酸鹽、硫酸鹽、乙酸鹽、蘋果酸鹽、甲酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽和對-甲苯磺酸鹽等，這些鹽包括但不限于以堿金屬或堿土金屬為基礎(chǔ)的陽離子，如鈉、鋰、鉀、鈣或鎂，以及無毒的銨、季銨和胺陽離子，如銨、甲基銨、二甲基銨、三甲基銨、四甲基銨、乙基銨、三乙基銨和四乙基銨。
能夠提高化合物藥理學(xué)功效的改性實例包括，例如酯化，如形成C1-C6的烷基酯，最好是C1-C4的烷基酯，其中烷基為直鏈或支鏈。其它可接受的酯包括如C5-C7的環(huán)烷基酯和芳烷基酯，如芐基酯。這些酯可以通過肽化學(xué)領(lǐng)域已知的常規(guī)方法由本發(fā)明所述的化合物制得。
藥物可接受的改性還包括例如形成肽酰胺。可以在本發(fā)明化合物上實現(xiàn)的酰胺改性包括，例如，由氨、其中烷基為直鏈或支鏈的伯C1-C6二烷基胺或具有不同取代基的芳胺衍生得到酰胺。當為仲胺時，也可以是含如氮原子的5或6元雜環(huán)。制備這些酰胺的方法是本領(lǐng)域熟知的。
在本發(fā)明的另一實施方案中，YIR肽可以用于分析試驗中以鑒定因子Xa的存在或分離出基本上純的因子Xa。最好用如放射性同位素標記本發(fā)明的化合物，該標記的化合物可以用測定特定標記的常規(guī)方法進行測定。另外，YIR肽的優(yōu)點還在于可以用作探針以測定因子Xa的活性部位或在其體內(nèi)、體外、或離體后的活性度。
應(yīng)當理解，只要基本上不會影響本發(fā)明各實施方案的活性所作的任何改變都應(yīng)包括在本發(fā)明公開的范圍內(nèi)。因此下面的實施例只是對本發(fā)明的詳細說明而不是限制。
實施例I肽的合成方法合成用原料來自化學(xué)廠商，如Aldrich、Sigma、Fluka、Nova Biochem和Advance Chemtech。在這些化合物的合成過程中，應(yīng)當用保護基團將用于這些反應(yīng)的氨基酸衍生物上的官能基團保護起來以防止在偶合反應(yīng)步驟中發(fā)生副反應(yīng)。在Peptides，supra 1981和Vol.9，Udenfriend and Meienhofer ed.1987中描述了適用的保護基團及其用途，該文獻引入本發(fā)明作為參考。
采用一般的固相肽合成法來制備本發(fā)明的化合物。例如Steward和Young(Solid Phase Peptide Synthesis(Freeman and Co.，San Francisco，1969)，引入本發(fā)明作為參考)公開描述了這些方法。
除非另有說明外，肽均是在與1％二乙烯基苯交聯(lián)的聚苯乙烯樹脂上進行合成的。酸敏性聯(lián)結(jié)子(Rink聯(lián)結(jié)子)被偶合在固態(tài)載體上(Rink的Tetr.Lett.283787(1987)；Sieber的Tetr.Lett.282107(1987)，該兩篇文獻均引入本發(fā)明作為參考)。偶合反應(yīng)是在等當量HOBt存在下，采用N，N′-二異丙基碳化二亞胺(DIC)進行的。所有的偶合反應(yīng)均在室溫(RT)下，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)或DMF∶二氯甲烷(1∶1混合物)中進行40分鐘。利用茚三酮試驗監(jiān)視偶合反應(yīng)是否完成。
利用在DMF中的50％哌啶進行10分鐘完成Fmoc基團脫保護。由脫保護后的溶液在300nm處的吸收、洗液體積和合成過程中所用樹脂的重量可以確定釋放的Fmoc量。當?shù)谝淮闻己戏磻?yīng)不完全時可以進行第二次(二次)偶合。每一輪偶合反應(yīng)和方法如下步驟做法 試劑和溶劑11克肽樹脂10毫升DMF2過量2.4倍的氨基酸衍生物32.4當量 DIC42.4當量 HOBt5偶合反應(yīng)40分鐘6洗滌(3×8毫升) DMF7茚三酮試驗8脫保護(10分鐘) 8毫升50％哌啶/DMF9洗滌(6×8毫升) DMF10 洗滌(2×8毫升) 二氯甲烷(DCM)11 茚三酮試驗12 從步驟2開始重復(fù)。
在完成了肽到樹脂的組合后，進行最后的Fmoc脫保護反應(yīng)，接著進人通常的洗滌循環(huán)過程，測定脫保護反應(yīng)所釋放的Fmoc基團的量。有時，通過將肽樹脂與于DCM中的過量20倍的乙酸酐/吡啶(1∶1)一起搖振15分鐘使Nα-未受保護的肽乙?；?。依次用DCM、DMF、和DCM洗滌肽樹脂，然后進行真空干燥。
在RT下，將肽樹脂懸浮于試劑K(King等人，Int.J.Pept.prot.Res.36255-266(1990)，該文獻引入本發(fā)明作為參考)雞尾酒中(5毫升/克肽樹脂)，時間為180分鐘，然后在無水乙醚中過濾經(jīng)裂解的混合物，離心分離出固體沉淀物，再于真空中KOH固體小丸粒上干燥。利用適當梯度的于水和乙腈(ACN)中的0.1％TFA對干燥后的肽進行HPLC提純。收集含有所要合成產(chǎn)物的峰，將此肽溶液凍干，然后對所說的肽進行鑒定，包括電噴霧MS(electrospray MS)和氨基酸分析以證實合成的是正確的化合物。
為了提純肽，將凍干肽粗品溶解于含有10-50％ACN的0.1％TFA水溶液的混合物中。肽溶液一般是通過連接在0.45微米的尼龍“ACRODISC”13(GelmanSciences；Ann Arbor MI)過濾器上的注射器來過濾的。將適當體積的經(jīng)過濾的肽溶液注入半制備C18柱(Vydac Protein and Peptide C18，218TP1010；TheSeparation Group；Hesperia CA)。利用Beckman“SYSTEM GOLD”HPLC維持梯度液，即作為洗脫液的0.1％TFA緩沖劑和ACN(HPLC級)的異構(gòu)裂化混合物的流速。通過在230nm處的UV測定監(jiān)測對肽的洗脫過程(Beckman，System Gold，Programmable solvent Module 126，以及由“SYSTEM GOLD”軟件控制的Programmable Detector Module 166)。利用MS鑒定相應(yīng)合成化合物的峰后，收集該化合物，凍干，進行生物學(xué)試驗。MS是用SCIEX API III+儀器做的。另外，NMR是用通用電器公司的儀器(300MHz)做的。做NMR時，一般是在六氘二甲基亞砜或氘代氯仿(CDCl3；Aldrich)中測定樣品。
采用現(xiàn)有技術(shù)已知的方法制備氨基酸醛。例如Fehrentz和Castro在Synthesisz中第676頁(1983)、Bajusz等人在J.Med，Chem.331729(1990)、Kawamura等人在Chem.Pharm.Bull.171902(1969)，以及Someno等人在Chem.Pharm.Bull.341748(1986)中均已報導(dǎo)了氨基酸和肽醛，上述每篇文獻均引入本發(fā)明作為參考。還原肽鍵的合成是以溶液中存在的二肽(如Tyr-{ψ-(CH2NH)}-Ile)量為基礎(chǔ)進行的，然后通過固相肽合成法將經(jīng)適當保護的二肽與樹脂上剩余的肽偶合。另外，利用Ho等人所述的方法把經(jīng)保護的氨基酸醛偶合到樹脂中的肽上(Pept.Res.610-12(1993)，該文獻引入本發(fā)明參考)。
實施例IIAc-Tyr-Ile-Arg-Leu-Ala-NH2的合成為了合成Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Ala-NH2，將1克Rink樹脂(0.6毫摩爾NH2/克樹脂)用于上述方法中。通過MS分析所得肽。(M+H)+實測值為659.4，計算值(calc.)為659.9。
實施例IIIAc-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2的合成為了合成Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2，將1克Rink樹脂(0.6毫摩爾NH2/克樹脂)用于實施例I所述方法中。所得肽的(M+H)+實測值為685.4，calc.為685.9。
實施例IVAc-(iBu)Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2的合成使用1克Rink樹脂(0.6毫摩爾NH2/克樹脂)。采用上述一般固相合成法。當Tyr脫保護和肽樹脂經(jīng)適當?shù)南礈旌?，加入于DMF中且含2％冰醋酸的50當量異丁醛。在RT下振蕩所得混合物4小時。用含2％醋酸的DMF(2×8毫升)洗滌該肽樹脂后，加入于10毫升含2％醋酸的DMF中的1克NaBH3CN。再將此肽樹脂振蕩30分鐘，然后進行過濾，再加入新鮮的NaBH3CN于DMF/醋酸中的混合物，繼續(xù)反應(yīng)30分鐘。
此后，用DMF/2％醋酸(2×8毫升)和DMF(2×8毫升)洗滌上述肽樹脂。再用于DMF中的乙酸酐三乙胺混合物(30當量，6小時)對所得一烷基化的肽樹脂進行乙酰化。肽樹脂經(jīng)適當洗滌后，如實施例I所述將肽裂解及脫保護。通過MS分析經(jīng)HPLC提純的肽。(M+H)+實測值為758.4，calc.為758.5。
實施例VTfa-(iBu)Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2的合成用實施例IV所述的同樣方法制備(iBu)Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-Rink樹脂。在二異丙基乙胺(DIEA)和N-甲基咪唑(NMI)存在下，用0.7M三氟乙酸酐(該三種物質(zhì)的比為0.3∶1∶3當量)處理45分鐘實現(xiàn)最終的三氟乙?；?。如實施例IV所述由樹脂上裂解出肽，并將之分離。通過MS鑒定提純后的肽。(M+H)+實測值為812.4，calc.為812.5。
實施例VIAc-Tyr-Ile-Arg-N(CH3)O(CH3)的合成按照文獻記載的方法(Fehrentz and Castro，supra，1983)合成Boc-Arg(NG-Tos)-N(CH3)O(CH3)。在RT下，把Boc-Arg(Nγ-Tos)-N(CH3)O(CH3)(200毫克)與5毫升三氟乙酸(TFA)混合在一起，攪拌20分鐘。通過薄層色譜(TCL)(CHCl3∶MeOH∶CH3COOH為90∶9∶1)以及茚三酮噴霧顯色和UV照明肉眼觀察監(jiān)視原料是否消失。在真空中將剩余TFA蒸發(fā)，并在真空中KOH丸粒上進行干燥，得到具有適當質(zhì)量的固體材料。(M+H)+實測值為371.2，calc.為371.4。
在一燒瓶中，把如上制備的150毫克原料溶解于1毫升的DMF中，然后加入57微升三乙胺，將此混合物冷卻到0℃。在第二個燒瓶中，把171毫克的Z-Tyr-Ile-OH(Biochem Bioscience Inc.；Philadephia PA)溶解于無水四氫呋喃(THF)中，并冷卻至-10℃，然后在N2環(huán)境下加入44微升NNM和52微升氯甲酸異丁酯，攪拌該混合物15分鐘。把先行制備的Arg(Tos)N(CH3)OCH3于DMF中的溶液加入到Z-Tyr-Ile-OH二肽混合酐中，該混合物在-10℃下攪拌30分鐘，然后在RT下攪拌過夜。
如實施例I所述將反應(yīng)混合物后處理后，將肽進行真空干燥，并將其中的一小部分用HPLC提純，通過MS進行分析；該肽具有所期望的分子量(781)。把所得肽Z-Tyr-Ile-Arg(Tos)-N(CH3)OCH3與500微升茴香醚混合在一起，然后用常規(guī)方法進行HF脫保護。進行后處理后，分離出169毫克產(chǎn)物Tyr-Ile-Arg-N(CH3)O(CH3)，并且用MS進行鑒定(實測值為493.6，calc.為494)。將殘余的肽溶解于1毫升1N HCl中，并凍干。
把Tyr-Ile-Arg-N(CH3)OCH3·2HCl(76毫克)溶解在ACN中，冷卻到0℃，加入13微升吡啶，然后再加入15微升乙酸酐。將此混合物在0℃下攪拌3小時，用茚三酮試驗監(jiān)視反應(yīng)是否完成。在RT下攪拌8小時后，將反應(yīng)混合物后處理，通過MS表征產(chǎn)物，即Ac-Tyr-Ile-Arg-N(CH3)OCH3(試驗值為535.6，calc.為535.3)。
實施例VIIAc-Tyr-{ψ-(CH2NH)}-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2的合成a.Fmoc-Tyr(But)-H的合或按照Ho和Ngu(J.Org.Chem.582315(1993)，該文獻引入本發(fā)明作為參考)描述的方法使4.6克(10.0毫摩爾)Fmoc-Tyr(But)-OH、2.1克(10.1毫摩爾)二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)、1.26克(10.1毫摩爾)芐硫醇和0.12克DMAP在DCM中發(fā)生反應(yīng)。后處理后，分離出Fmoc-Tyr(But)-S-CH2C6H5，在10％鈀碳催化劑存在下，用三乙基硅烷在攪拌下還原硫酯，再通過閃式色譜法提純，得到產(chǎn)率為81％的Fmoc-Tyr(But)-H。產(chǎn)物的NMR及質(zhì)量在期望的范圍內(nèi)。b.Fmoc-Tyr(But)-{ψ-(CH2NH)}-Ile-(O-烯丙基)的合成把0.73克(1.66毫摩爾)fmoc-Tyr(But)-OH和于20毫升含1％AcOH的DMF中的0.209克(3.32毫摩爾)NaBH3CN加入到0.516克(1.82毫摩爾)TFA·Ile-(O-烯丙基)于2毫升DMF中的溶液中。2小時后對反應(yīng)混合物進行后處理，利用快速色譜法(乙酸乙酯∶己烷＝35∶65)提純最終產(chǎn)物，得到具有適當NMR和MS的油狀產(chǎn)物。(M+H)實測值為599，calc.為598.7。c.Fmoc-Tyr(But)-{ψ-(CH2NH)}-Ile-OH的合成向于10毫升DCM中的0.467克(0.78毫摩爾)Fmoc-Tyr(But)-{ψ-(CH2NH)}-Ile-O-烯丙基中加入89微升(1.56毫摩爾)HOAc、20微升三乙胺(TEA)和0.02克復(fù)合物PdCl2(Ph3)2。一次性加入231微升(0.86毫摩爾(nmol))Bu3SnH，將該混合物在RT下攪拌1小時。將反應(yīng)混合物后處理后，用閃式色譜法(CHCl3∶MeOH＝20∶1)提純產(chǎn)物，得到產(chǎn)率為69％(0.319克)的預(yù)望肽。(M+H)+實測值為559，calc.為558。然后采用實施例I所述的一般固相法將Fmoc-Tyr(But)-{ψ-(CH2NH)}-Ile-OH偶合到Arg(Pmc)-Leu-Pro-Rink樹脂上。再利用實施例I的同樣方法使合成肽樹脂Ac-Tyr(But)-{ψ-(CH2NH)}-Ile-Arg(Pmc)-Leu-Pro-Rink脫保護，并發(fā)生裂解，然后用HPLC在C18柱上提純。
實施例VIIIAc-Tyr-Ile-Arg-NH-CH2(4-吡啶基)的合成在DIC/HOBt存在下，使肟樹脂(DeGrado and Kaiser，J.Org.Chem.451295(1980))(0.862克，0.6毫摩爾/克)與Boc-Arg(Tos)-OH偶合過夜。先用DMF，再用DCM洗滌該樹脂，然后在DCM中用乙酸酐/DIEA(1∶1當量)將樹脂乙酰化。用DCM、DMF和DCM洗滌樹脂后，在DCM中用25％的TFA使樹脂脫保護，時間為30分鐘。脫保護后的樹脂用DCM、異丙醇和DCM洗滌。在DCM中，1.5當量DIEA存在下，將對稱酸酐形式的Boc-Ile-OH(3當量)偶合到TFA·Arg(Tos)-OxmR上。重復(fù)上述的洗滌、乙酰化和脫保護循環(huán)。脫保護后，以與Ile同樣的方式偶合Boc-Tyr(2-BrZ)-OH，然后將所得肽樹脂Boc-Tyr(2-BrZ)-Ile-Arg(Tos)-OxmR脫保護，并進行乙酰化反應(yīng)，得到Ac-Tyr(2-BrZ)-Ile-Arg(Tos)-OxmR。在真空中于燥此肽樹脂，總重量增加0.216克。
在6毫升DCM中，60微升冰醋酸和120微升DIEA存在下，向1/3樹脂中添加100微升(800微摩爾)的4-(二甲氨基)吡啶。在RT下，振蕩該樹脂過夜。將DCM溶液過濾后，用3毫升DMF洗滌樹脂，把洗滌液與DCM濾液合并在一起，蒸發(fā)掉溶劑后，用HF/茴香醚使殘留肽脫保護，按通常方法處理得到預(yù)期的肽。進行電噴霧MS分析。(M+H)+實測值為582.3，Calc.為582。
實施例IXAc-Tyr-Ile-{ψ(CH2NH)}-Arg-Leu-Pro-NH2的合成a.Boc-Ile-H的合成按照Fehrentz和Castro(supra，1983)所述方法由1克Boc-Ile-N(Me)OMe合成醛。按參考文獻所述，通過TLC和NMR鑒定該醛。b.Arg(Tos)-Leu-Pro-MBHA的合成按實施例I所述的一般固相法合成三肽樹脂。c.Boc-Ile-{ψ(CH2NH)}-Arg(Tos)-Leu-Pro-MBHA的合成利用在含1％乙酸的DMF中的NaBH3CN，通過還原胺化作用使Boc-Ile-H偶合到三肽樹脂Arg(Tos)-Leu-Pro-MBHA上。按常規(guī)方法使Boc-基團裂解，用DIC/HOBt偶合Ac-Tyr-OH。利用HF/硫代茴香醚混合物使所得肽樹脂(0.7克)脫保護，并從樹脂上裂解出來。將19毫克Ac-Tyr-Ile-{ψ(CH2NH)}-Arg-Leu-Pro-NH2粗品在C18柱上進行HPLC提純，由此得到5毫克純度大于90％的預(yù)期肽。(M+H)+實測值為688.4，Calc.為687.9。
實施例XAc-Tyr-Ile-Dab(Nγ-C3H7N)-Leu-Ala-NH2的合成采用實施例I所述的方法，使0.2克SCAL-TG(0.2毫摩爾NH2/克)(Patek&Lebl，tetr.Lett.323891-3894(1991)，該文獻引入本發(fā)明作為參考)與Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Dab(Boc)-OH、Fmoc-Ile-OH和Fmoc-Tyr(But)-OH偶合在一起。將N-末端乙?；⑼ㄟ^TFA使所說的鏈脫保護后，將肽樹脂洗滌、中和并用于DMF中的0.3MPyBroP/NMI處理肽樹脂Ac-Tyr-Ile-Dab-Leu-Ala-SCAL-TG2小時。利用在DMF中的1M三苯膦/(CH3)3SiCl(3×1小時)，再用100％的TFA(1小時)把所要肽從樹脂上裂解出來。通過乙醚沉淀分離出粗制肽后，用0.1％的TFA水溶液將該肽凍干。用HPLC提純肽Ac-Tyr-Ile-Dab(Nγ-C3H7N)-Leu-Ala-NH2，并通過MS表征。(M+H)+實測值為676.4，Calc.為676.4。
實施例XIAc-Tyr-Ile-PalMe(3)-NH2的合成采用實施例I所述的方法，把Fmoc-Pal(3)-OH、Fmoc-Ile-OH和Fmoc-Tyr(But)-OH偶合到1.0克Rink樹脂(0.48毫摩爾NH2/克)上。向0.25克所要肽樹脂即Ac-Tyr(But)-Ile-Pal(3)-Rink中添加500微升于DCM中的甲基碘(MeI)，振蕩該肽樹脂6小時。然后按實施例I所述方法將所要肽樹脂F(xiàn)moc-Tyr(But)-Ile-PalMe(3)-Rink脫保護、乙酰化和進行裂解。將其中一部分粗品肽用HPLC進行提純，并MS對成品肽進行表征。
實施例XIIAc-環(huán)(Glu-Tyr-Ile-Arg-Leu-Lys)-NH2的合成采用實施例I所述的方法，使1克SCAL-TG(0.29毫摩爾NH2/克)(參見實施例X)與Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(But)-OH和Fmoc-Glu-(OtBu)-OH偶合在一起。脫去Fmoc后，將該肽樹脂乙酰化，并先用DMF，再用DCM洗滌。利用試劑K使肽樹脂Ac-Glu(OtBu)-Tyr(But)-Ile-Arg(Pmc)-Leu-Lys(Boc)-SCAL-TG脫保護，洗滌、中和，并用于DMF中的BOP/HOBt/DIEA(5∶5∶5當量)環(huán)化作用2小時。如Kaiser所述(Kaiser等人，Anal.Biochem.34595(1970)，該文獻引入本發(fā)明作為參考)，利用茚三酮試驗監(jiān)視偶合反應(yīng)是否完成。環(huán)化反應(yīng)后，從樹脂上裂解出肽，用HPLC提純，MS表征。(M+H)+實測值為844.5，Calc.為844.5。
實施例XIII環(huán)(Gly-Tyr-Ile-Arg-Gly)的合成在DIC/HOBt存在下，使1克肟樹脂(參見實施例VIII)(0.6毫摩爾NH2/克)與Boc-Gly-OH過夜偶合在一起。將該樹脂洗滌和脫保護后，用實施例VIII所述的方法Boc-Arg(Tos)-OH、Boc-Ile-OH和Boc-Tyr(2-BrZ)-OH進行偶合反應(yīng)。將其中三分之一的肽樹脂Boc-Tyr(2-BrZ)-Ile-Arg(Tos)-Gly-肟樹脂脫保護，并通過DIC/HOBt與Boc-Gly偶合在一起。將所要肽樹脂脫保護、中和，并在含有1％醋酸的DMF中并過夜環(huán)化。把所說的樹脂過濾和洗滌(DMF)，合并濾液，真空蒸發(fā)除去有機溶劑。將殘留的肽進行脫保護(HF/茴香醚)、凍干、HPLC提純、M.S表征。(M+H)+實測值為547.8，Calc.為547.8。
實施例XIVN-取代的甘氨酸化合物的合成Ac-(Bzl)Gly-(Chx)Gly-(3-胍基丙基)Gly-NH2的合成采用Zuckermann等人所述的方法合成N-取代的甘氨酸(J.Am.Chem.Soc.11410646(1992)，該文獻引入本發(fā)明作為參考)。在DCM/DMF中使1克SCAL-TG(0.29毫摩爾NH2/克)(參見實施例X)與溴乙酸對稱酐偶合在一起。重復(fù)該偶合反應(yīng)兩次。向Br-CH2CO-SCAL-TG樹脂中添加于DMSO中的Boc-NH-CH2CH2CH2NH2，振蕩該樹脂2小時。脫保護后，通過交替進行Br-CH2COOH至樹脂的偶合和溴乙酸樹脂與適當胺的反應(yīng)進行反復(fù)處理。在DMF中用乙酸酐/DIEA/NMI(1∶l∶0.25)使(Bzl)Gly-(Chx)Gly-(Boc-NH-(CH2)3)Gly-SCAL-TG樹脂乙?；^夜。脫去保護基團Boc后，在RT，于DMF中的DIEA(1∶1)存在下，用1.8M羧基脒基吡唑·HCl(Bernatowicz等人，J.Org.Chem.572497-2502(1992)，該文獻引入本發(fā)明作為參考)處理樹脂Ac-(Bzl)Gly-(Chx)Gly-(3-氨丙基)Gly-SCAL-TG3小時。通過kaiser試驗監(jiān)視鳥苷酸化反應(yīng)是否完成。如實施例X所述對所得肽進行裂解和處理，并做M.S分析。(M+H)+實測值為502.3，Calc.為502.3。
實施例XV二酮基哌嗪化合物的合成環(huán)(Ser-Ida)-Ile-Arg-Leu-Ala-NH2的合成通過使Fmoc連接到Rink樹脂(參見實施例I)上制備起始被保護的四肽，即Fmoc-Ile-Arg(Pmc)-Leu-Ala-Rink。該肽樹脂脫去Fmoc保護后，依次用Fmoc-Ida(OMe)-OH(3當量，DIC、HOBt)和Fmoc-Ser(tBu)-OH(7當量，對稱酐)進行偶合。通過與50％哌啶/DMF接觸1小時同時進行最終的脫保護和自發(fā)閉環(huán)反應(yīng)。在洗滌步驟之后，利用TFA/硫代茴香醚/H2O(95∶2.5∶2.5)使最終的肽裂解和脫保護。如上所述對所得肽進行處理，并通過HPLC(＞95％)和MS進行分析。(M+H)+實測值為655.4，Calc.為655.38。
實施例XVIPh-C(NOCH2Ph)-CO-I-R-NH2的合成使0.2克Rink樹脂與Fmoc-Arg(Pmc)-OH和Fmoc-Ile-OH偶合在一起，隨后脫去Fmoc保護(參見實施例I)。利用上述DIC/HOBt方法把Ph-C(NOCH2Ph)-COOH偶合到肽樹脂Ile-Arg(Pmc)-Rink上。如實施例I所述進行后處理得到所要的肽樹脂Ph-C(NOCH2Ph)-CO-Ile-Arg(Pmc)-Rink，并進行MS分析。(M+H)+實測值為524.3，Calc.為524.6。
實施例XVIIAc-pAph-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2的合成按照實施例I所述方法，用下述氨基酸衍生物在100毫克Rink樹脂(0.48毫摩爾/克)上進行合成Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Ile-OH和Fmoc-pAph-(Fmoc)-OH(外消旋混合物)。如實施例I所述進行肽的裂解和分離。通過RP-HPLC分離出兩種非對映肽，并通過MS進行鑒定。(M+H)+實測值為754.4，Calc.為754.5。
實施例XVIIIAc-Tyr-Chg-Arg-醇的合成利用實施例I所述方法，在0.25克Fmoc-Arg(Pmc)-Sasrin樹脂(0.5毫摩爾NH2/克樹脂；Bachem Bioscience)上構(gòu)成肽序列。N-末端脫去Fmoc保護基團，并乙?；?，通過還原裂解從樹脂上裂解下作為保護肽的C-末端醇(Mergler等人，Peptides P177-178(eds.Schneider and Eberle；Leiden1993)，該文獻引入本發(fā)明作為參考)。將該肽樹脂與在2毫升THF∶EtOH(6∶1)中的NaBH4(4當量)溶液一起振蕩24小時。在裂解反應(yīng)之后，用DCM洗滌該樹脂，合并裂解溶液與洗滌液，凍干。通過用TFA/水/硫代茴香醚(90∶5∶5)處理2小時使凍干的肽脫保護，再經(jīng)沉淀分離。用MS分析經(jīng)HPLC提純的肽。(M+H)+實測值為505.3，Calc.為505.3。
實施例XIXAc-Tyr-Chg-Arg-醇·乙酸酯的合成按實施例XVIII所述制備被保護的肽醇。將10毫克粗品原料溶解于DCM/ACN中，并在TEA(2.4毫摩爾)存在下，用乙酸酐(2毫摩爾)處理20分鐘。將此溶液過濾、蒸發(fā)，并如上所述使肽脫去保護。用MS分析HPLC提純后的肽。(M+H)+實測值為547.3，Calc.為547.3。
實施例XXAc-Phe(pNH2)-Chg-Orn(C(NH)CH3)-Leu-Pro-NH2的合成按實施例X所述，用SCAL聯(lián)結(jié)子使1克“TENTAGEL S”NH2樹脂(0.28毫摩爾NH2/克樹脂；Rapp Polymer；tubingen Germany)官能化，隨后偶合氨基酸Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Orn(Boc)-OH和Fmoc-Chg-OH。用于DCM中的50％TFA處理肽樹脂F(xiàn)moc-Chg-Orn(Boc)-Leu-Pro-SCAL-TG(一次洗滌1分鐘，后一次洗滌30分鐘)，用DCM洗滌3次，用于DCM中的5％DIEA(2×30秒鐘)中和，然后再用DCM洗滌2次。向肽樹脂中添加于4毫升吡啶DIEA為1∶1和3毫升DMF中的1.5克鹽酸乙酰亞氨酸乙酯(ethyl acetimidate)(Aldrich)的溶液，在RT下連續(xù)偶合過夜。
在DMF中用20％的哌啶使肽樹脂F(xiàn)moc-Chg-Orn(C(NH)CH3)-Leu-Pro-SCAL-TG脫保護12分鐘，然后用DMF洗滌4次，DCM洗滌4次，在DMF中利用DIC/HOBt將Fmoc-Phe(pNH-Boc)-Oh偶合。脫去Fmoc保護基團，再用乙酸酐∶吡啶(1∶1)乙?；?0分鐘，由此得到肽樹脂，即Ac-Phe(pNH-Boc)-Chg-Orn(C(NH)CH3)-Leu-Pro-SCAL-TG。還原SCAL聯(lián)結(jié)子，裂解肽，隨后再通過HPLC提純粗品，得到期望的化合物。(M+H)+實測值為740.2，Calc.為740.48。
實施例XXIAc-Phe(pNH2)-Chg-Dap(NβC6H11N)-Leu-Pro-NH2的合成使0.5克SCAL-TG(0.32毫摩爾NH2/克)與Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Dap(Boc)-OH和Fmoc-Chg-OH偶合在一起。用50％的TFA除去側(cè)鏈上的Boc基團，時間為20分鐘，通過用10％DIEA/DCM洗滌中和該肽樹脂。通過在DMF中用0.3M PyBroP/NMI處理肽樹脂20分鐘使側(cè)鏈上的游離氨基基團轉(zhuǎn)化為二甲基脒鎓(dimethylamidinium)基團。利用50％的哌啶/DMF脫去Fmoc保護基團，時間為60分鐘，由此而導(dǎo)致二甲基脒鎓被Dap側(cè)鏈上的哌啶鎓基團所交換。通過偶合Fmoc-Phe(Boc)-OH，并脫去Fmoc保護基團，完成了所需序列。如實施例X所述使肽乙?；?，并且裂解。用MS分析經(jīng)HPLC提純的肽。(M+H)+實測值為752.4，Calc.為752.4。
實施例XXIIAc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2的合成通過乙酰氨基丙二酸酯方法(Wagner等人，DDR專利號155954，1982年7月21日授權(quán)，1988年11月9日再審查，該專利引入本發(fā)明作為參考)合成外消旋H-Phe(pCN)-OH。通過將相應(yīng)的硫代亞氨酸甲酯(methylthioimidate)進行氨解轉(zhuǎn)化氰基(氰基與硫化氫反應(yīng))，隨后再通過MeI甲基化合成得到外消旋Ac-pAph-OH。
用1克“TENTAGEL”樹脂(取代度＝0.21毫摩爾NH2/克樹脂)和Knorr聯(lián)結(jié)子(Bernatowicz等人，Tetr.Lett.304645(1989)，該文獻引入本發(fā)明作為參考)合成肽。如實施例I所述組合二肽Fmoc-Chg-Pal-Knorr-TG。然后在DCM中用1毫升MeI使3-吡啶基丙氨酸甲基化過夜。脫去Fmoc保護基團后，利用DIC/HOBt法偶合Ac-pAph-OH，得到如實施例I所述的肽。(M+H)+實測值為550.3，Calc.為550.31。
實施例XXIIIAc-Tyr-Chg-pAph-Leu-Pro-NH2的合成如實施例I所述，將五肽Ac-Tyr(But)-Chg-Phe(pCN)-Leu-Pro-Knorr-TG組合到0.4克的“TENTAGEL”(取代度＝0.2毫摩爾NH2/克樹脂)上。在密閉注射器中，用8毫升吡啶/三乙胺(75∶25)飽和H2S處理樹脂過夜。在50℃下，用于8毫升丙酮中的0.5毫升MeI使連接有硫代酰胺的樹脂甲基化，時間為30分鐘，然后用丙酮和甲醇洗滌。在55℃下，使甲基硫代酰亞胺與乙酸銨在甲醇中反應(yīng)3小時以獲得最終的化合物，如上所述，將該最終化合物從樹脂上裂解下來，并提純。(M+H)+實測值為761.4，Calc.為760.43。
實施例XXIVAc-Phe(pCH2NH2)-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2的合成如實施例I所述，在1克Rink樹脂(0.6毫摩爾NH2/克樹脂)上合成Ac-DL-Phe(pCN)-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2(粗品肽)。將125毫克粗品肽溶解于50毫升MeOH中，并加入0.5毫升Raney Ni懸浮液(Aldrich)。將此肽和催化劑的混合物在RT，35psi下氫化4小時。過濾出催化劑，將溶液蒸發(fā)干燥。從含30％ACN的0.1％含水TFA中凍干殘留物。通過HPLC提純干燥的粗品，用MS進行分析。(M+H)+實測值為741.4，Calc.為741.7。
實施例XXVAc-Phe(pC(NOH)NH2)-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2的合成將按實施例XXIV所述制備的21.1毫克粗品肽與60.3毫克的NH2OH·HCl(Aldrich)在1.5毫升MeOH、0.7毫升吡啶和0.5毫升TEA中混合。在RT下攪拌該混合物72小時，然后在真空中蒸發(fā)溶劑和揮發(fā)性物質(zhì)。利用HPLC提純所說的肽，并用MS進行分析。(M+H)+實測值為770.4，Calc.為770.3。
實施例XXVIA1-A2-B化合物的合成按圖3所示路線制備A1-A2-B化合物，即其中m為0的A1-A2-(A3)m-B化合物。簡單地說，使外消旋N-乙?；?4-氰基苯丙氨酸與L-環(huán)己基甘氨酸甲酯(H-Chg-OMe)偶合在一起，得到兩種非對映二肽的混合物，通過色譜法分離該混合物。通過與L-環(huán)己基甘氨酸甲酯形成鹽部分拆分外消旋N-乙?；?4-氰基苯丙氨酸?；静蝗艿腄，L-鹽很容易被結(jié)晶，隨后偶合得到基本上純的Ac-f(pCN)-Chg-OMe?！澳敢骸备缓琇，L-鹽，偶合導(dǎo)致得到粗品Ac-F(pCN)-Chg-OMe，后者通過色譜法在硅膠上進一步被提純。在RT下，甲醇/水中，利用氫氧化鋰水解這些二肽酯至相應(yīng)的酸。通過與適當?shù)陌?、RNH2進行常規(guī)的偶合所說的兩種二肽酸均轉(zhuǎn)化為取代的酰胺。采用標準化學(xué)方法制備不能商購得到的那些胺。
采用標準的化學(xué)方法，即通過硫代酰胺和硫代亞氨酸甲酯或通過氫化相應(yīng)的偕胺肟(實施例XXV)使氰基轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的脒。所說的偕胺肟是通過腈與羥基胺反應(yīng)而獲得的。下述實施例詳細地說明了采用所選擇的方法制備標題化合物。應(yīng)當知道，本發(fā)明的化合物是可以其它方法來制備的，選擇所例舉的方法僅僅是為了方便起見。
實施例XXVIIAc-pAph-Chg-NHCH2-(4-甲基吡啶翁)的合成采用實施例XXII所述的方法，通過轉(zhuǎn)化Ac-F(pCN)-Chg-NHCH2-(4-吡啶基)完成Ac-pAph-Chg-NHCH2-(4-甲基吡啶鎓)的合成。用實施例I所述的HPLC方法提純最終的化合物。MS分析(M+H)+實測值為493.3，Calc.為493.29。
如下所述制備原料a).將2.32克(10毫摩爾)的Ac-(D，L)-F(pCN)加溫溶解于75毫升乙醇中。向其中添加L-環(huán)己基甘氨酸甲酯(1.75克，10毫摩爾)，在RT下攪拌該混合物2小時。過濾出沉淀的結(jié)晶，干燥得到1.55克D，L-鹽。將濾液進行部分蒸發(fā)，并用乙醚稀釋。收集分離的結(jié)晶，干燥至留下2.1克的含有D，L-鹽雜質(zhì)的L，L-鹽。將此粗品L，L-鹽與20毫升DMF、0.71克HOBt、和1.18克DCC合并。在RT下攪拌該混合物24小時。過濾掉尿素，蒸發(fā)濾液。將蒸發(fā)殘留物溶解于二氯甲烷中，用1N HCl和飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌上述溶液。干燥蒸發(fā)有機層。在60克硅膠上，用含20％(V/V)丙酮的二氯甲烷進行洗脫，對殘留物進行色譜分離。將用二氯甲烷/乙醚/己烷得到的澄清餾份合并后進行結(jié)晶，由此得到1.6克熔點(mp)為178-180℃的無色晶體Ac-F(pCN)-Chg-OMe。
b).在RT，氮氣氛下，將1.93克(5毫摩爾)Ac-F(pCN)-Chg-OMe(來自上述實施例XXVII.a.)、100毫升甲醇、10毫升水和0.75克氫氧化鋰水合物的混合物攪拌24小時。然后添加2毫升乙酸，蒸發(fā)掉溶劑，使殘留物在含20％異丙醇的二氯甲烷和1N的HCl之間進行分配。干燥蒸發(fā)有機層，使殘留物從二氯甲烷/乙醚/己烷中結(jié)晶出來得到1.6克mp為216-218℃的無色晶體Ac-F(pCN)-Chg-OH。
c).在RT下，將150毫克(0.4毫摩爾)Ac-F(pCN)-Chg-OH(如上)、65毫克(0.6毫摩爾)4-氨基甲基吡啶、124毫克(0.6毫摩爾)DCC、60毫克(0.44毫摩爾)HOBt和5毫升DMF的混合物攪拌20小時。過濾除去尿素，蒸發(fā)濾液。用甲醇制殘留物漿液，過濾收集不溶性產(chǎn)物，得到140毫克無色Ac-F(pCN)-Chg-NHCH2(4-吡啶基)。用丙酮∶二氯甲烷∶甲醇(4∶5∶1)在硅膠上進行色譜分離獲得分析用樣品。該結(jié)晶固體的mp為＞250℃。
實施例XXVIIIAc-f(4-脒基)-Chg-NHCH2(4-甲基吡啶鎓)使150毫克Ac-f(pCN)-Chg-NHCH2(4-吡啶基)(見上)先與硫化氫，然后再與甲基碘和乙酸銨反應(yīng)制得該化合物。通過HPLC分離出作為均一物質(zhì)的產(chǎn)物，MS分析為(M+H)+實測值為493.3，Calc.為493.29。
如下所述制備原料a).在RT下，將2.8克Ac-f(pCN)，(L)-環(huán)己基甘氨酸甲酯、940毫克HOBt、1.57克DCC和30毫升DMF的混合物攪拌2天。過濾除去尿素，蒸發(fā)濾液。將蒸發(fā)殘留物溶解于二氯甲烷中，用1N HCl和10％的碳酸氫鈉水溶液洗滌上述溶液。干燥蒸發(fā)有機層。用二氯甲烷/乙醚/己烷對殘留物進行結(jié)晶，由此得到2.05克mp為181-183℃的無色Ac-f(pCN)-Chg-OMe。
b).如實施例XXVII所述對于L，L-異構(gòu)體的處理，在100毫升甲醇和10毫升水中用0.75克氫氧化鋰一水合物水解1.93克的Ac-f(pCN)-Chg-OMe(如上)，并從二氯甲烷/乙醚中結(jié)晶出來，得到1.65克mp為180-182℃的Ac-f(pCN)-Chg-OH。
c).在RT下，將225毫克Ac-F(pCN)-Chg-OH(如上)、100毫克4-氨甲基吡啶、90毫克HOBt、180毫克DCC和6毫升DMF的混合物攪拌1個周末。過濾除去尿素，蒸發(fā)濾液。殘留物與甲醇一起攪拌，過濾除去固體物，留下190毫克mp為＞250℃的晶體Ac-f(pCN)-Chg-NHCH2(4-吡啶基)。
實施例XXIXAc-pAph-Chg-NHCH2CH2(3-甲基吡啶鎓)用硫化氫來飽和125毫克Ac-F(pCN)-Chg-NHCH2CH2(3-吡啶基)、2毫升DMSO、10毫升吡啶和5毫升三乙胺的混合物，同時在冰/水中進行冷卻。在RT下，在一密封管形瓶中攪拌過夜后，蒸發(fā)溶劑，用丙酮/乙醚收集殘留物，干燥得到125毫克硫代酰胺。將該物質(zhì)與2毫升DMSO、5毫升丙酮和0.75毫升甲基碘合并，并在RT下一密封管形瓶中攪拌此混合物過夜。用甲苯稀釋后，蒸發(fā)除去溶劑，把殘留物和乙醚一起攪拌。潷析出乙醚，用新鮮的乙醚置換，繼續(xù)攪拌直到樹脂物質(zhì)固化，然后過濾出剩下的乙醚，把殘留物干燥。
將所得殘留物溶解于20毫升甲醇中，并用0.3毫升乙酸和0.4克乙酸銨處理。把此混合物加熱到55-60℃2.5小時，然后蒸發(fā)除去溶劑。將殘留物溶解于水/ACN/TFA中，凍干。通過HPLC提純此粗制產(chǎn)物。MS分析為(M+H)+實測值為507.3，Calc.為507.31。
如下所述獲得原料在RT下，將150毫克(0.4毫摩爾)Ac-F(pCN)-Chg-OH、120毫克(0.6毫摩爾)2-(3-吡啶基)乙胺二鹽酸、125毫克DCC、60毫克HOBt、0.5毫升二異丙基乙胺和10毫升DMF的混合物攪拌24小時。蒸發(fā)除去溶劑后，將殘留物與甲醇一起攪拌，過濾收集不溶性產(chǎn)物，并用甲醇和乙醚洗滌得到110毫克無色晶體。蒸發(fā)濾液，把殘留物溶解于二氯甲烷/異丙醇中。用10％碳酸氫鈉水溶液洗滌此溶液，干燥，蒸發(fā)。殘留物用二氯甲烷∶丙酮∶甲醇(5∶4∶1)在14克硅膠上進行色譜分離，得到40毫克mp為265-268℃的Ac-F(pCN)-Chg-NHCH2CH2(3-吡啶基)。
b).如下所述制備2-(3-吡啶基)乙胺二鹽酸鹽。在Parr氫化器中，35psi下，使1.3克3-吡啶基乙腈、大約3克阮內(nèi)鎳和含10％(體積)氨的30毫升甲醇的混合物進行氫化反應(yīng)20小時。用硅藻土過濾除去催化劑，蒸發(fā)濾液。將殘留物溶解于二氯甲烷中，用硫酸鎂干燥，過濾，蒸發(fā)。在二惡烷中利用氯化氫使產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為二鹽酸化物。用甲醇/乙醚進行結(jié)晶得到1.4克mp為145-148℃的無色晶體。
實施例XXXAc-pAph-Chg-NHCH2CH2(4-甲基吡啶鎓)按如上實施例所述方法，使Ac-f(pCN)-Chg-NHCH2CH2(4-吡啶基)先與硫化氫反應(yīng)，再用甲基碘甲基化，然后再與乙酸銨反應(yīng)制得該化合物。通過HPLC來提純粗品。MS分析為(M+H)+實測值為507.3，Calc.為507.31。
如上實施例XXIX所述，通過Ac-F(pCN)-Chg-OH與2-(4-吡啶基)乙胺二鹽酸發(fā)生偶合反應(yīng)獲得原料。
按如上所述制備2-(3-吡啶基)乙胺二鹽酸的方法，在氨存在下，用阮內(nèi)鎳氫化吡啶基-4-乙腈制得2-(4-吡啶基)乙胺二鹽酸。該二鹽酸化物的mp為220℃。
實施例XXXIAc-pAph-Chg-NHCH2(4-脒基苯基)按上述同樣方法，用于DMSO中硫化氫、吡啶和三乙胺處理Ac-f(pCN)-Chg-NHCH2(4-氰基苯基)。在DMSO/丙酮中用甲基碘使所獲得的雙硫代酰胺甲基化，然后再按如上所述使之與乙酸銨反應(yīng)。通過HPLC來提純粗品。MS分析為(M+H)+實測值為520.3，Calc.為520.30。
如下所述獲得原料。在RT下，將75毫克(0.2毫摩爾)Ac-F(pCN)-Chg-OH、50毫克(0.3毫摩爾)(4-氰基苯基)甲胺鹽酸鹽、62毫克DCC、30毫克HOBt、0.2毫升DIEA和2毫升DMF的混合物攪拌24小時。過濾后，蒸發(fā)除去溶劑，將殘留物溶解于含有20％異丙醇的二氯甲烷中。用1N HCl和10％碳酸氫鈉水溶液洗滌此溶液，然后干燥，蒸發(fā)。將殘留物與少量的甲醇/水一起攪拌，收集分離的固體物，干燥得到80毫克Ac-F(pCN)-Chg-NHCH2(4-氰基苯基)。
如下所述制備(4-氰基苯基)甲胺鹽酸。將2克(10毫摩爾)α-溴代-對甲苯基氰、2克(10.8毫摩爾)鄰苯二甲酰亞胺和30毫升DMF的混合物加熱至回流1分鐘。冷卻后，用乙酸酸化該混合物，并用水稀釋以結(jié)晶出產(chǎn)物。過濾出晶體，用水洗滌，干燥，得到2.24克mp為182-184℃的無色N-(4-氰基苯基)-甲基鄰苯二甲酰亞胺。
將1.5克N-(4-氰基苯基)甲基鄰苯二甲酰亞胺懸浮于50毫升沸騰的甲醇中，并用1毫升水合肼處理。5分鐘后得到澄清的溶液。蒸發(fā)除去甲醇，并用2NHCl處理殘留物。將懸浮液加熱至沸騰，然后在冰上冷卻。過濾出固體物，蒸發(fā)濾液。使殘留物溶解于水中。把該溶液再次加熱到沸騰，冷卻，過濾。用氫氧化鈉使濾液呈堿性，并用含有異丙醇的二氯甲烷萃取。干燥蒸發(fā)有機相，把殘留物轉(zhuǎn)化為鹽酸鹽，從異丙醇/乙醚中結(jié)晶出來，得到0.43克mp＞260℃的無色晶體。
使α-溴代-間甲苯基氰與鄰苯二甲酰亞胺鉀反應(yīng)以便得到mp為147-148℃的N-(3-氰基苯基)甲基鄰苯二甲酰亞胺從而制得(3-氰基苯基)甲胺。該物質(zhì)與水合肼反應(yīng)，轉(zhuǎn)化為如上給出的mp為223-226℃的(3-氰基苯基)甲胺的鹽酸鹽。
實施例XXXIIAc-pAph-Chg-NHCH2(3-脒基苯基)采用如上所述的方法制備該化合物。用于DMSO中硫化氫、吡啶和三乙胺處理Ac-F(pCN)-Chg-NHCH2(3-氰基苯基)。在DMSO/丙酮中用甲基碘使所獲得的雙硫代酰胺甲基化，然后再按如上所述使之與乙酸銨反應(yīng)。通過HPLC來提純粗品。MS分析為(M+H)+實測值為520.3，Calc.為520.30。
如下所述獲得原料。在RT下，將300毫克(0.8毫摩爾)Ac-F(pCN)-Chg-OH、200毫克(1.2毫摩爾)(3-氰基苯基)甲胺鹽酸鹽、250毫克DCC、120毫克HOBt、0.8毫升DIEA和10毫升DMF的混合物攪拌24小時。過濾后，蒸發(fā)除去溶劑，將殘留物溶解于大量的含有20％異丙醇的二氯甲烷中。用1N HCl和10％碳酸氫鈉水溶液洗滌此溶液，然后干燥，蒸發(fā)。將殘留物與異丙醇/乙醚一起攪拌，收集分離的固體物，干燥得到400毫克的Ac-F(pCN)-Chg-NHCH2(3-氰基苯基)。
實施例XXXIIIAc-pAph-Chg-NHCH(Me)(4-甲基吡啶鎓)使Ac-F(pCN)-Chg-NHCH(Me)(4-吡啶基)兩種非對映體的混合物先與硫化氫，再與甲基碘和乙酸銨反應(yīng)制得標題化合物的非對映體的混合物。通過HPLC來分離該非對映體。MS分析為(M+H)+實測值為507.3，Calc.為507.31。
如下所述制備原料。在RT下，將150毫克(0.4毫摩爾)Ac-F(pCN)-Chg-OH、120毫克(0.6毫摩爾)外消旋1-(4-吡啶基)乙胺二鹽酸鹽、125毫克DCC、60毫克HOBt、0.5毫升DIEA和10毫升DMF的混合物攪拌24小時。過濾后，蒸發(fā)除去溶劑，將殘留物溶解于大量的含有20％異丙醇的二氯甲烷中。用10％碳酸氫鈉水溶液洗滌此溶液，然后干燥，蒸發(fā)。將殘留物與異丙醇/乙醚一起攪拌，收集分離出的固體物，干燥得到125毫克的Ac-F(pCN)-Chg-NHCH(Me)(4-吡啶基)兩種非對映體的混合物。
如下所述制備外消旋1-(4-吡啶基)乙胺二鹽酸。在35psi下，使1克4-乙?；拎?N-氧化物、2克阮內(nèi)鎳和含20％(體積)氨的30毫升甲醇的混合物進行氫化反應(yīng)24小時。用硅藻土過濾除去催化劑，蒸發(fā)濾液。將殘留物溶解于二氯甲烷中，過濾，蒸發(fā)。將殘留物溶解于異丙醇中，并在乙醚中用氯化氫處理。收集沉淀出的晶體，干燥后得到0.9克的mp為198-200℃的物質(zhì)。
實施例XXXIVDIPA(m)pAph-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2的合成a.(對氰基芐基)丙二酸(DIPA(m)Phe(pCN))-OH的N，N-二異丙基酰胺的合成采用改進的方法(參見Pinori等人的US5061911(1991，10)，該專利引入本發(fā)明作為參考)合成2-(對氰基芐基)丙二酸。向于25毫升DMF中的3.8克2，2-二甲基-1，3-二惡烷-4，6-二酮(Meldrum酸，Aldrich)和1.12克NaCNBH3(Aldrich)的溶液中添加2.3克對氰基苯甲醛(Aldrich)，在RT下攪拌該混合物2小時。向此反應(yīng)混合物中添加400毫升的水，在冰浴中冷卻該溶液，滴加濃度為20％的HCl水溶液使pH調(diào)節(jié)至3.8-4。把白色沉淀物收集于中央玻璃瓷漏斗中，用冷水洗滌。收集的沉淀物在真空中CaCl2上干燥24小時。收集的固體在CDCl3中所做的NMR表明該固體為化合物2，2-二甲基-5-(對氰基)芐基-1，3-二噁烷-4，6-二酮(DCBD)，其mp為135-142℃，Rf為0.45(CHCl3∶MeOH∶乙酸＝95∶4∶1)。
向于45毫升DCM中的1.5毫升的二異丙胺中添加3毫升N，O-雙(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(BSA)，在配備有磁攪拌器和冷凝器的反應(yīng)燒瓶中回流該溶液7小時，其中所說的冷凝器上有防護CaCl2管。當溶液冷卻到室溫后，加入0.8克DCBD，再回流反應(yīng)混合物3小時(直到TLC表明完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物止)。將反應(yīng)混合物冷卻后，小心地加入5-8毫升濃度20％的HCl水溶液。分層后，用水洗滌有機層，干燥(MgSO4)，然后蒸發(fā)干燥，得到無需進一步提純即可用于下一步的純凈產(chǎn)物。在CDCL3中做NMR并做MS鑒定該化合物。b.DIPA(m)pAph-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2的合成用實施例I所述方法合成肽樹脂DIPA(m)Phe(pCN)-Chg-Arg(PMC)-Leu-Pro-Rink。所得肽樹脂用實施例XXV所述的羥基胺鹽酸鹽處理得到DIPA(m)Phe(pC(NOH)NH2)-Chg-Arg(PMC)-Leu-Pro-Rink。將肽由樹脂上裂解下來，并凍干后，把此粗品(120毫克)溶解于80毫升MeOH和10毫升NH3在MeOH中的飽和溶液中。向該反應(yīng)混合物中添加0.25毫升阮內(nèi)鎳懸浮物(Aldrich)，該混合物在45psi下進行氫化反應(yīng)24小時。過濾除去催化劑，蒸發(fā)溶劑至干燥，殘留物用其中0.1％TFA水溶液與ACN為1∶1的溶液凍干。用HPLC提純此粗品肽，MS鑒定化合物。(M+H)+實測值為824.2，Calc.為824.5。
實施例XXXV經(jīng)合成并發(fā)現(xiàn)為因子Xa有效抑制劑的帶有多個取代基的化合物No.化合物 Calc.(Found)1. Ac-(2-CF3Bzl)-Y-I-R-L-P-NH2860.5(860.3)2. Ac-(CH3CH2CH2CH(CH3)CH2)-Y- 786.5(786.5)I-R-L-P-NH23. CH3OCO-Y-I-R-L-P-NH2742.4(742.4)4. Ac-Y-Chg-R-NH2518.2(518.2)5. Nal(2)-Cha-R-D(O-Allyl)-NH2679.4(679.4)6. y-Tle-R-Nle-P-NH2660.4(660.4)7. Phe(pF)-I-R-L-P-NH 662.3(662.3)8. Ac-(D)Tic(OH)-I-R-L-P-NH2714.4(714.4)9. Ac-Phe(pCN)-I-R-L-P-NH2711.4(711.4)10.Ac-Phe(pCONH2)-Chg-R-L-P-NH2755.4(755.4)11.y-Chg-R-NH2476.2(476.2)12.Ac-W-Chg-R-L-P-NH2751.3(751.3)13.Ac-Y-I-R-NH-CH(CH3)-(CH2)2-CH3562.3(562.3)14.Ac-Y-Pgl-R-L-P-NH2722.2(722.2)15.Ac-Y-Chg-R-Ina-NH2629.4(629.4)16.Ac-Tza-Chg-R-NH2509.3(509.3)17.Ac-Y-Chg-R-Pip-NH2629.4(629.4)18.Ac-Phe(pNH2)-Chg-R-NH2517.2(517.2)19.Ac-(Bzl)G-(Chx)Gly-(3-胍基丙基)G-NH2502.3(502.3)20.Ac-Y-Chg-R-ol.acetate547.3(547.3)21.Ac-Y-Chg-R-OCH3533.3(533.3)22.Ac-Y-Chg-R-OH519.3(519.3)23.Bz-Y-Chg-R-NH2532.2(532.2)
實施例XXXVI單獨不能提高活性的化學(xué)變化的結(jié)合作用可提高活性測定對因子Xa活性的抑制作用。但是作為衡量本發(fā)明的肽活性來說，可以測定任何有關(guān)的生物活性，如本發(fā)明YIR肽對凝血的作用、體內(nèi)有效性、體內(nèi)半衰期、口服生物利用率、口服有效性或半衰期。
可以闡述許多具體變化。例如，兩種變化結(jié)合起來證明，把甚至原本單一變化并不能明顯提高活性的那些變化結(jié)合在一起能夠進一步提高活性。相對于母體化合物Y-I-R-L-P(Ki＝5.3μM)而言，一種化學(xué)變化方式是生成Ac-Y-I-R-L-P，其Ki＝0.49μM，另一種變化方式是生成(iBu)Y-I-R-L-P，其Ki＝2.6μM。把這兩種變化方式結(jié)合在一起得到AC-(iBu)Y-I-R-L-P-NH2，其Ki＝0.04μM。因此，由這些結(jié)果證明，結(jié)合了兩種化學(xué)變化的本發(fā)明肽相對于單一的相應(yīng)類似變化來說能夠顯著提高因子Xa的抑制活性，甚至在相對于母體Y-I-R-L-P-NH2而言，母體化合物如(iBu)Y-I-R-L-P-NH2不能明顯提高活性的情況下亦是如此。
表3例舉了能夠?qū)е禄衔飳σ蜃覺a的抑制作用的Ki值在100μM-1pM范圍內(nèi)的具體化學(xué)改性實例。
表3具有Ki＜100μM的因子Xa抑制劑結(jié)構(gòu) MS*AA*(2，2-DiMe-Propyl)Y-I-R-L-P-NH2OKOK(2-CF3-Bzl)Y-I-R-L-P-NH2OKOK(2-Et-nBu)Y-I-R-L-P-NH2OKOK(2-Me-Bzl)Y-I-R-L-P-NH2OKOK(2-Me-nBu)Y-I-R-L-P-NH2OKOK(2-Me-nPentyl)Y-I-R-L-P-NH2OKOK(3，3-DiMe-nBu)Y-I-R-L-P-NH2OKOK3-苯氧基丙酰-Y-Chg-R-NH2OKOK5-Bzim-CO-Chg-R-L-P-NH2OKOK5-Bzim-CO-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2OKOKY(3，5-Br)-I-R-L-P-NH2OKOKY(3，5-I)-I-R-L-P-NH2OKOK(Chx-CH2)Y-I-R-L-P-NH2OKOK(iBu)Y-I-R-OH OKOK(iBu)Y-I-R-L-A-NH2OKOK(iBu)Y-I-R-L-P-NH2OKOK(Me)y-I-R-L-A-NH2OKOK(Me)Y-I-R-L-A-NH2OKOK(Me)y-I-R-L-P-NH2OKOK(Me)Y-I-R-L-P-NH2OKOK5-Hic-Chg-R-NH2OKOKAc-(1，2，3，6-4H-Bzl)Y(SO3H)-I-R-L-P-NH2OKOKAc-(1，2，3，6-4H-Bzl)Y-I-R-L-P-NH2OKOKAc-(2，3-DiMe-正苯基)Y(SO3H)-I-R-L-P-NH2OKOKAc-(2，3-DiMe-正苯基)Y-I-R-L-P-NH2OKOKAc-(2-CF3-Bzl)Y(SO3H)-I-R-L-P-NH2OKOKAc-(2-CF3-Bzl)Y-I-R-L-P-NH2OKOKAc-(2Et-nBu)Y-I-R-L-P-NH2OKOKAc-(2-Me-Bzl)Y(SO3H)-I-R-L-P-NH2OKOKAc-(2-Me-Bzl)Y-I-R-L-P-NH2OKOKAc-(2-Me-nBu)Y(SO3H)-I-R-L-P-NH2OKOKAc-(2-Me-nBu)Y-I-R-L-P-NH2OKOKAc-(2-Me-正苯基)Y(SO3H)-I-R-L-P-NH2OKOKAc-(2-Me-正苯基)Y-I-R-L-P-NH2OKOKAc-(3，3-DiMe-nBu)Y(SO3H)-I-R-L-P-NH2OKOKAc-(3，3-DiMe-nBu)Y-I-R-L-P-NH2OKOKAc-(3，3-DiMe-正苯基)Y(SO3H)-I-R-L-P-NH2OKOKAc-(3，5，5-Me-3-正己基)Y-I-R-NH2OKOKAc-(3，5，5-Me-3-正己基)Y-I-R-L-P-NH2OKOKAc-(4-pyridyl-CH2-)Y-I-R-NH2OKOKAc-(4-MeO-Bzl)Y-I-R-NH2OKOKAc-(Bzl)Y-I-R-NH2OKOKAc-(Chx-CH2)Y-I-R-L-P-NH2OKOKAc-(環(huán)丙基-CH2)Y(SO3H)-I-R-L-P-NH2OKOKAc-(環(huán)丙基-CH2)Y-I-R-L-P-NH2OKOKAc-(Et-CH＝C(CH3)-CH2)Y(SO3H)-I-R-L-P-NH2OKOKAc-(Et-CH＝C(CH3)-CH2)Y-I-R-L-P-NH2OKOKAc-(iBu)F(pNH2)-Chg-R-NH2OKOKAc-(iBu)F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2OKOKAc-(iBu)Nal(2)-Chg-R-L-P-NH2OKOKAc-(iBu)Y-Chg-R-NH2OKOKAc-(iBu)Y-Chg-R-L-P-NH2OKOKAc-(iBu)Y-I-Dab(Nγ-C3H7N)-L-P-NH2OKOKAc-(iBu)Y-I-Orn(Nδ-C3H7N)-L-P-NH2OKOKAc-(iBu)Y-I-R-NH2OKOKAc-(iBu)Y-I-R-L-P-NH2OKOKAc-(Me)Y-Chg-R-L-P-NH2OKOKAc-(Me)Y-I-R-L-A-NH2OKOKAc-(Me)Y-I-R-L-P-NH2OKOKAc-(nBu)Y-I-R-NH2OKOKAc-(反式-CH3-CH＝C(CH3)-CH2)Y-I-R-L-P-NH2OKOKAc-Tyr(3，5-NO2)-I-R-L-P-NH2OKOKAc-(Bzl)G-(Chx)Gly-(3-胍基丙基)G-NH2OKOKAc-BAla-Y-I-R-G-NH2OKOKAc-E-Y-I-R-L-K-NH2**OKOKAc-E-Y-I-R-L-P-K-NH2OKOKAc-F(pCONH2)-Chg-R-L-P-NH2OKOKAc-F(pCONH2)-I-R-L-P-NH2OKOKAc-F(pF)-I-R-L-P-NH2OKOKAc-f(pF)-I-R-L-P-NH2OKOKAc-F(pCN)-I-R-L-P-NH2OKOKAc-F(pNH2)-Chg-R-NH2OKOKAc-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2OKOKAc-F(pNH2)-I-R-L-P-NH2OKOKAc-F(pNH2)-Chg-R-(Bzl)G-G-OH OKOKAc-F(pNH2)-Chg-R-(Chx)G-G-OH OKOKAc-F(pNH2)-Chg-R-(CH3CH2CH2OKOK(CH3))G-G-OHAc-G-G-Y-I-R-G-NH2OKOKAc-G-Y-Nle-R-L-NH2OKOKAc-G-y-Nle-R-L-NH2OKOKAc-G-Y-I-R-G-NH2OKOKAc-G-Y-I-R-L-NH2OKOKAc-Nal(1)-I-R-L-P-NH2OKOKAc-Nal(2)-Cha-R-D(O-烯丙基)-NH2OKOKAc-Nal(2)-Cha-R-L-P-NH2OKOKAc-Nal(2)-Chg-R-NH2OKOKAc-Nal(2)-Chg-R-L-P-NH2OKOKAc-Nal(2)-I-R-L-P-NH2OKOKAc-Pgl(OH)-I-R-L-NH2OKOKAc-pAph-Chg-R-L-P-NH2OKOKAc-pAph-I-R-L-P-NH2OKOKAc-Phe(pGua)-I-R-L-P-NH2OKOKAc-S-Y-I-R-L-P-NH2OKOKAc-W-Chg-R-L-P-NH2OKOKAc-W-L-R-L-A-NH2OKOKAc-Y(Me)-I-R-L-A-NH2OKOKAc-Y(Me)-I-R-L-P-NH2OKOKAc-Y-(別-I)-R-L-P-NH2OKOKAc-Y-Cha-R-L-P-NH2OKOKAc-Y-Chg-R-NH2OKOKAc-Y-Chg-R-NH-CH2CH2-N(CH3)4OKOKAc-Y-Chg-R-NH-Bzl-4-OMe OKOKAc-Y-Chg-R-NH-CH2-Chx OKOKAc-Y-Chg-R-NH-CH2CH2-N-(CH3)2OKOKAc-Y-Chg-R-NH-CH2CH2-O-CH3OKOKAc-Y-Chg-R-NH-CH2CH2-COOH OKOKAc-Y-Chg-R-NH-ChxOKOKAc-Y-Chg-R-NH-CH2(2-(1-Et)吡咯烷基) OKOKAc-Y-Chg-R-NH-CH2(2-(6-EtO)芐基噻唑基) OKOKAc-Y-Chg-R-L-P-NH2OKOKAc-Y-Chg-R(NO2)-{ψ(CH2NH)}-L-NH2OKOKAc-Y-Nva-R-NH2OKOKAc-Y-Pen(Me)-R-L-P-NH2OKOKAc-Y-Pgl-R-L-P-NH2OKOKAc-Y-{ψ(CH2N(Ac))}-I-R-L-P-NH2OKOKAc-Y-{ψ(CH2NH)}-I-R-L-P-NH2OKOKAc-Y-I-R-{ψ(COCH2)}-G-P-NH2OKOKAc-Y-I-Dab(Nγ-C3H7N)-L-A-NH2OKOKAc-Y-I-hR-L-A-NH2OKOKAc-Y-I-nR-L-A-NH2OKOKAc-Y-I-PalMe(3)-NH2OKOKAc-Y-I-PalMe(3)-L-P-NH2OKOKAc-Y-I-{ψ(CH2NH)}-R-L-P-NH2OKOKAc-y-I-R-NH2OKOKAc-Y-I-R-NH2OKOKAc-Y-I-R-N(Me)O-CH3OKOKAc-Y-I-R-NH-CH2-4-吡啶基 OKOKAc-Y-I-R-NH-CH2CH2-N(CH3)2OKOKAc-Y-I-R-NH-4-嗎啉基OKOKAc-Y-I-R-NH-OCH3OKOKAc-Y-I-R-Nle-HypOKOKAc-Y-I-R-Nle-Δ2P OKOKAc-Y-I-R-哌啶基 OKOKAc-Y-I-R-I OKOKAc-Y-I-R-I-P OKOKAc-Y-I-R-L OKOKAc-y-I-R-L-A OKOKAc-Y-I-R-L-A OKOKAc-Y-I-R-L-A-A-F-T-NH2OKOKAc-y-I-R-L-P-NH2OKOKAc-Y-I-R-L-P-NH2OKOKAc-Y-I-R-L-P-Dab(Ac-Y-I-R-L-P(G-A)3)-OH OKOKAc-Y-I-R-L-P-Dab(Ac-Y-I-R-L-P(G-A)6)-OH OKOKAc-Y-I-R-L-P-Dab(Ac-Y-I-R-L-P)-OH OKOKAc-Y-I-R-P-NH2OKOKAc-Y-K-R-L-E-NH2OKOKAc-Y-N-R-L-NH2OKOKAc-Y-N-R-L-P-NH2OKOKAc-Y-T(Me)-R-L-P-NH2OKOKBAla-Y-I-R-G OKOKBAla-Y-I-R-G-NH2OKOKCaff-I-R-NH2OKOKCbz-I-R-L-NH2OKOKCbz-Y-I-R-NH2OKOKCClF2-CO-Y-I-R-L-P-NH2OKOKCF2H-CO-Y-I-R-L-P-NH2OKOKCF3-CF2CO-Y-I-R-L-P-NH2OKOKCH3-CHCl-CO-Y-I-R-L-P-NH2OKOKCH3-O-CO-Y-I-R-L-P-NH2OKOKCH3-SO2-Y-I-R-L-P-NH2OKOKCH3CH2-O-CO-Y-I-R-L-P-NH2OKOKCl2CHCO-Y-I-R-L-P-NH2OKOKClCH2CO-Y-I-R-NH2OKOKC-Y-I-R-L-C-NH2OKOKD-Tic-I-R-L-A-A-F-T-NH2OKOKEt(Et)Y-I-R-L-P-NH2OKOKE-Y-I-R-K-NH2OKOKE-Y-I-R-L-K-NH2OKOKE-Y-I-R-L-P-K-NH2OKOKF(pCl)-I-R-I-Sar-NH2OKOKF(pF)-I-R-L-P-NH2OKOKf(pF)-I-R-L-P-NH2OKOKF(pNH2)-I-R-L-A-NH2OKOKF(pNO2)-I-R-L-A-NH2OKOKf-I-R-F-P-NH2OKOKf-I-R-I-P-NH2OKOKF-I-R-L-NH2OKOKF-I-R-L-P-H-Y-G-NH2OKOKF-I-R-L-Y-V-W-N-NH2OKOKFor-y-I-R-L-P-NH2OKOKFor-Y-I-R-L-P-NH2OKOKG-G-Y-I-R-G-NH2OKOKG-Y-I-R-D-NH2OKOKG-Y-I-R-F-NH2OKOKG-Y-I-R-G-NH2OKOKG-Y-I-R-G OKOKG-Y-I-R-H-NH2OKOKG-Y-I-R-I-NH2OKOKG-Y-I-R-K-NH2OKOKG-Y-I-R-L-NH2OKOKG-Y-I-R-L-P-NH2OKOKG-Y-I-R-L-P-A-M-NH2OKOKG-Y-I-R-L-P-P-V-NH2OKOKG-Y-I-R-L-P-Q-T-NH2OKOKG-Y-I-R-L-P-S-Q-NH2OKOKG-Y-I-R-S-NH2OKOKG-Y-I-R-T-NH2OKOKG-Y-I-R-V-NH2OKOKG-Y-I-R-W-NH2OKOKG-Y-I-R-Y-NH2OKOK(pOH)C6H4-CH2CH2(OH)-CO-I-R-L-Sar-NH2OKOK(pOH)C6H4-CH2CH2CO-I-R-L-A-NH2OKOK(pOH)C6H4-CH2CH2CO-I-R-L-P-NH2OKOK(pOH)C6H4-CH2CHOH-CO-I-R-L-P-NH2OKOK(pOH)C6H4-OCH(CH3)CO-I-R-L-P-NH2OKOK(pOH)C6H4-OCH2CO-I-R-L-P-NH2OKOKI-H-L-W-Y-I-R-L-P-NH2OKOKI-H-L-W-y-I-R-L-P-NH2OKOKI-Q-L-G-Y-I-R-L-P-NH2OKOK4-MeO-C6H4-CO-I-R-L-A-NH2OKOKN-嗎啉基-CO-F-I-R-L-P-NH2OKOKNal(2)-Cha-R-D(O-烯丙基)-NH2OKOKNal(2)-Cha-R-D(O-烯丙基)-Sar-NH2OKOKNal(2)-Chg-R-L-P-NH2OKOKNal(2)-I-R-C(Me)-P-NH2OKOKN-G-Y-I-R-L-I-H-NH2OKOKpal-C(SBut)-R-L-P-NH2OKOKpal-I-R-C(SBut)-Hyp-NH2OKOKpal-I-R-C(SBut)-P-NH2OKOKPgl(OH)-I-R-L-NH2OKOKPh-C(NOCH2Ph)-CO-I-R-NH2OKOKPh-CH＝CH-CO-I-R-L-A-NH2OKOKPh-CH2CH2CH2-CO-I-R-L-A-NH2OKOKPh-CH2CH2CO-I-R-L-A-NH2OKOKPth-Y-I-R-L-P-NH2OKOKS-Y-I-R-L-P-NH2OKOKTfa-(iBu)F(pNH2)-Chg-R-NH2OKOKTfa-(iBu)F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2OKOKTfa-(iBu)Nal(2)-Chg-R-L-P-NH2OKOKTfa-(iBu)Y-Chg-R-NH2OKOKTfa-(iBu)Y-Chg-R-L-P-NH2OKOKTfa-(iBu)Y-I-Dab(Nγ-C3H7N)-L-P-NH2OKOKTfa-(iBu)Y-I-Orn(Nδ-C3H7N)-L-P-NH2OKOKTfa-(iBu)Y-I-PalMe(3)-NH2OKOKTfa-(iBu)Y-I-R-NH2OKOKTfa-(iBu)Y-I-R-OH 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*MS，質(zhì)譜；AA，氨基酸分析。
**-下劃線表示肽的成環(huán)部分。
實施例XXXVII對所選純凝血酶和其它絲氨酸蛋白酶的體外抑制作用通過測定抑制50％酶活性(IC50)的YIR肽濃度來評價本發(fā)明化合物對因子Xa、凝血酶、血漿酶、彈性蛋白酶和胰蛋白酶的抑制能力。在顯色分析中采用的是純酶。為了確定抑制常數(shù)，考慮到底物競爭，用下式校正IC50值Ki＝IC50×(1/(1＋((底物濃度)/底物Km)})(Chen and Prusoff，Biochem.Pharmacol.223099-3018(1973)，該文獻引入本發(fā)明作為參考)。a.因子Xa分析在分析中采用TBS-P緩沖劑(50mMTris-Cl，pH7.8，200mM NaCl，0.05％(W/V)PEG-8000，0.02％(W/V)NaN3)。把于TBS-P中的25微升入因子Xa(EnzymeResearch Laboratories，Inc.；South Bend IN)、40微升于TBS-P中的10％(V/V)DMSO(非抑制對照)或以TBS-P中的10％(V/V)DMSO稀釋的各種濃度的試驗用肽以及于TBS-P中的底物S-2765(Nα-芐氧基羰基-D-Arg-Gly-L-Arg-對-硝基酰苯胺；Kabi Pharmacia，Inc.；Franklin OH)在適當?shù)腃ostar半面積微量滴定板的孔中混合，由此測定IC50。
把肽抑制劑加上酶預(yù)培養(yǎng)10分鐘進行分析，加入底物使最終體積達到100微升此時開始分析。利用Bio-Tek Instruments動態(tài)平板閱讀器(CeresUV900HDi)，通過在25℃下，一段線性時程內(nèi)(通常在加入底物后的1-5分鐘)，在405nM處的吸收變化來測定顯色底物水解的初始速度。當把相對水解速度(與非抑制對照相比)與肽濃度的對數(shù)作曲線后，通過線性回歸能夠預(yù)測引起底物水解速度降低50％的抑制劑濃度。酶濃度為0.5nM，底物濃度為140μM。b.凝血酶分析該分析采用TBS-P緩沖劑。與實施例XXXVII.a.一樣測定IC50，但底物為S-2366(L-PyroGlu-L-Pro-L-Arg-N-對硝基酰苯胺；Kabi)，酶為人凝血酶(Enzyme Research Laboratories，Inc.；South Bend IN)。酶濃度為1nM，底物濃度為175μM。c.血漿酶分析該分析采用TBS-P緩沖劑。與實施例XXXVII.a.一樣測定IC50，但底物為S-2251((D)-Val-L-Leu-L-Lys-N-對硝基酰苯胺；Kabi)，酶為人血漿酶(Kabi)。酶濃度為5nM，底物濃度為300μM。d.胰蛋白酶分析該分析采用含有10mMCaCl2的TBS-P緩沖劑。與實施例XXXVII.a.一樣測定IC50，但底物為BAPNA(苯甲酰基-L-Arg-N-對硝基酰苯胺；Sigma ChemicalCo.；St.Louis MO)，酶為牛胰腺胰蛋白酶(XIII型，經(jīng)TPCK處理；Sigma)。酶濃度為50nM，底物濃度為300μM。e.彈性蛋白酶分析該分析采用Tris-Cl，pH7.4，300mM NaCl，2％(V/V)N-甲基-吡咯烷酮，0.01％(W/V)NaN3緩沖劑。與實施例XXXVII.a.一樣測定IC50，但底物為琥珀酰-Ala-Ala-Ala-N-對硝基酰苯胺(Calbiochem-Nova Biochem Corp.；San Diego CA)，酶為人類中性白細胞彈性蛋白酶(Athens Research and Technology，Inc.；Athens GA)。酶濃度為75nM，底物濃度為600μM。
上表2給出了所選用的試驗化合物與對照化合物“TENSTOP”(N-α-苯甲磺酰基-Gly-對-脒基苯丙氨酸甲酯；American Diagnostica，Inc.；GreenwichCT)相比的Ki值，其中該對照化合物為一種可逆性因子Xa抑制劑(Sturzebecher等人，Thromb.Res.54245-252(1989)；Hauptmann等人，Thromb.Haem.63220-223(1990)，該兩篇文獻均引入本發(fā)明作為參考)。結(jié)果表明，本發(fā)明的YIR肽能夠抑制因子Xa的活性，但基本上不會抑制在凝血過程和纖維蛋白水解過程中所涉及到的其它各種絲氨酸蛋白酶，包括凝血酶和血漿酶的活性。
實施例XXXVIII測定凝血抑制的方法評價本發(fā)明化合物抑制因子Xa活性的能力。采用人類供血者的混合血漿，通過體外凝血酶原時間(PT)的測定評價不同化合物的有效性。同時還采用離體測定法，其中采集通過靜脈(iv)給予大鼠和兔子化合物后，或大鼠十二指腸內(nèi)給藥后不同時間上的血漿，用PT測定法測定采集的血漿以確定血漿的半衰期。選用能夠獲得延長和高重現(xiàn)性凝血終點的凝血酶原稀釋物來開始PT測定，下文稱之為“稀釋PT測定法”。另外，采用大鼠體內(nèi)動靜脈短路血栓形成模型確定不同化合物的有效性。a.體外稀釋凝血酶原時間測定把100微升預(yù)加熱(37℃)的混合人類血小板缺乏性血漿(PPP)加入到纖維測量杯(Baxter Diagnostics.，Inc.；McGaw Park IL)中。再加入50微升于TBS-BSA中的含鈣的不同濃度的試驗化合物(50mM Tris-Cl，100mM NaCl，0.1％(W/V)牛血清白蛋白，20mM CaCl2)。在對照試驗中，加入含鈣但不含試驗化合物的TBS-BSA以測定非抑制性凝血時間。向纖維測量杯中添加150微升稀釋的預(yù)熱的含鈣兔促凝血酶原激酶(Baxter)，此時纖維性計量儀的計時器開始計時。在測試化合物前即已獲得兔促凝血酶原激酶稀釋曲線，并用該曲線選擇出能夠使非抑制性對照的PT時間約為30秒的促凝血酶原激酶稀釋度。由稀釋曲線時間計算出用試驗化合物(見下表4)達到50％凝血抑制作用的試驗濃度(EC50)(見下表4)。
另外，用“分析”模式在配備有自動凝血儀(IL；Milan，Italy)的Instrumentation Laboratories(IL)ACL3000進行稀釋凝血酶原時間測定。稀釋促凝血酶原激酶直到凝血時間達到30-35秒。采用該凝血時間作為100％活性。用連續(xù)二倍稀釋的稀釋促凝血酶原激酶試劑(IL品牌的兔腦促凝血酶原激酶)建立標準校對曲線。在測定過程中，把50微升試樣(離心分離的血漿)與100微升促凝血酶原激酶試劑混合在一起，讀取濁度大于169秒的讀數(shù)。通過儀器計算光散射變化的最大速率，由該最大速率確定凝血時間。抑制作用百分數(shù)以相對于校對曲線而確定的活性表示。b.離體稀釋凝血酶原時間分析按照批準方法通過尾靜脈(大鼠)或耳靜脈(兔子)靜脈給予試驗用化合物。在給予試驗用化合物后，每隔一段時間從插管頸動脈(大鼠)或耳動脈(兔子)取出1毫升血液樣品。離心分離得到PPP后，立即將血漿儲存在冰上或冷凍起來。
為了測定稀釋凝血酶原時間，將血漿預(yù)熱，并如上所述進行測定。由促凝血酶原激酶稀釋曲線計算百分抑制率，該稀釋曲線是用每一系列樣品作出的，用于確定血漿中尚保留約50％初始抗凝血劑活性的時間(T1/2)。試驗結(jié)果表明，本發(fā)明的YIR肽能夠抑制體外血液凝固，給藥后能夠抑制體內(nèi)血液凝固(見表4)。
表4選用抑制劑的活性及半衰期EC50T1/2人類血庫 大鼠 兔子結(jié)構(gòu) 體外 離體 離體Ac-Y-Chg-R-NH22.5μM5分鐘5分鐘Ac-Y-Chg-R-L-P-NH 225nM 5分鐘5分鐘Ac-Nal(2)-Chg-R-L-P-NH2140nM 6分鐘5分鐘Tfa-(iBu)Y-Chg-R-L-P-NH2300nM 15分鐘 10分鐘另外，采用離體稀釋凝血酶原時間測定法，給大鼠快速給予不同劑量，檢測各種化合物的抗凝血劑活性。表5所列化合物證明，按≤2毫克/公斤所示化合物給藥后10分鐘抑制率至少為30％。這些結(jié)果表明，本發(fā)明的各種有代表性的YIR肽具有明顯的抗凝血活性。表5所列全部化合物的結(jié)構(gòu)均經(jīng)MS和AA加以證實。
表51. Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-CH2-Chx2. Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-2CMT3. Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-Chx4. Ac-F(pNH2)-Chg-Dab(Nγ-C3NH7)L-P-NH25. Bz-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH26. Tos-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH27. Ac-Y(3-I)-Chg-R-L-P-NH28. Ac-pAph-Chg-AMP(4)9. y-Chg-R-L-NH210. Ac-F(pNH2)-Chg-R-ol11. 環(huán)戊基-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH212. 3-Iqc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH213. Bzf-pAph-Chg-PalMe(3)-NH214. 3-Iqc-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH215. Ac-F(pNH2)-Chg-R-噻吩基16. 2-Furoyl-pAph-Chg-PalMe(3)-NH217. 5-Me-thienyl-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH218. Ac-Nal(2)-Chg-R-噻唑基19. 2-Bzf-f(pNH2)-Chg-R-L-P-NH220. Ac-pAph-Chg-Dab(Nγ-C3NH7)-L-P-NH22l. Ac-Orn-Nal(2)-Chq-PalMe(3)-Sar-E-NH2*22. Ac-Phe(3-I，4-NH2)-Chg-R-L-P-NH223. Ac-(iBu)pAph-Chg-R-L-P-NH224. Ac-pAph-Chg-R-Gla-P-NH225. Ac-pAph-Chg-R-Pen(CH2COOH)-P-NH226. Ac-pAph-Chg-R-L-P-NH227. Ac-F(pNH2)-Chg-R-(Me)L-P-NH228. Ac-F(pNH2)-Chg-R-OEt29. Ac-F(pNB2)-Chg-Orn(Nδ-C3H7N)-L-P-NH230. Ac-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH231. Ac-Nal(2)-Chg-R-L-P-NH232. Ac-pAph-Chg-Dab(Nγ-C3H7N)33. Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH234. Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH235. Ac-pAph-Chg-R-NH236. Ac-pAph-Chg-R-OH37. Ac-Y-Chg-R-NH-Nip-NH238. Ac-K-Nal(2)-Chq-R-Hyp-E-NH239. DIPA-pAph-Chg-R-L-P-NH240. DIPA-mF(pNH2)-Chg-R-L-P-NH241. Isn-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH242. Pza-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH243. Tfa-(iBu)F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH244. Tfa-(iBu)Y-Chg-R-L-P-NH245. Tfa-(iBu)Y-I-Orn(Nδ-C3H7N)-L-P-NH2
*下劃線表示化合物的環(huán)狀部分。
在某些試驗中，采用十二指腸內(nèi)給藥法給予小鼠試驗用化合物，按照批準方法，經(jīng)皮下給予氯胺酮/甲苯噻嗪混合物使雄性Sprague-Dawley小鼠麻醉。在右頸動脈插管取血樣。做剖腹手術(shù)，在十二指腸上插入球形端針，并系在能夠保證縫線觸及插入點的位置。另一系頭靠近插入點，以防止胃中的內(nèi)容物泄漏。在每一試驗結(jié)束時，通過壓力試驗測試縫線是否確能保證防止化合物到達插入位點。插入點離開十二指腸-胃接合處大約4厘米。化合物以1毫升標準鹽水的形式給藥。在試驗化合物給藥前以及給藥后的第15分鐘、30分鐘、60分鐘、90分鐘和120分鐘分別抽取0.7毫升的血樣。離心分離出血漿，利用稀釋凝血酶原時間測定法測定凝血抑制效果。
在稀釋凝血酶原時間測定中，按照≤50毫克/公斤化合物經(jīng)十二指腸內(nèi)給藥，下述化合物具有至少30％的抑制率Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-CH2-Chx；Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-Chx；Bzf-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；Ac-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2；Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH2；Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；Ac-Aph-Chg-AMP(4)；環(huán)戊基-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；3-Iqc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；2-呋喃甲?；?pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；5-Me-噻吩基-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；Ac-Y(3-I)-Chg-R-L-P-NH2；Ac-F(pNH2)-Chg-R-醇；Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-醇。c.大鼠動靜脈短路血栓形成模型利用小鼠體外動靜脈(AV)短路評價本發(fā)明各種化合物的抗血栓形成有效性。AV短路回路是這樣組成的插入進右頸動脈內(nèi)的20厘米長的聚乙烯(PE)60管，6厘米長的PE160管，該管內(nèi)裝有6.5厘米長的絲光棉線(5厘米暴露在血流中)，另一根PE60管(20厘米)，該管完成回路進入左頸靜脈。在插入前，整個回路內(nèi)填充標準鹽水。
利用注射泵和蝶形導(dǎo)管將試驗化合物連續(xù)注入尾靜脈給藥(注入量1.02毫升/小時)。給予所說化合物30分鐘，然后打開回路，使血液流動15分鐘(總的注入時間為45分鐘)。到15分鐘時，用夾子取出回路，小心地去掉棉線，在分析天平上稱重。由僅注入鹽水的對照小鼠所獲得的血栓重量計算出血栓形成抑制百分率。
下述化合物以≤30微克/公斤/分鐘注入后至少達到約30％的血栓形成抑制率Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-CH2-Chx；Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-Chx；Bzf-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH2；Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；Ac-Aph-Chg-AMP(4)；環(huán)戊基-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；3-Iqc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；2-呋喃甲?；?pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；5-Me-噻吩基-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-醇和Tos-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2。
雖然已經(jīng)結(jié)合所述實施方式對本發(fā)明加以了說明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員都懂得對具體試驗的描述僅僅是為了詳細地說明本發(fā)明。應(yīng)當理解，在不違背本發(fā)明精神的情況下可以有各種改進。因此，本發(fā)明僅僅受到權(quán)利要求的限定。
權(quán)利要求
1.一種特異性抑制因子Xa活性的化合物，該化合物具有通式A1-A2-(A3)m-B，其中m為0或1；A1為R1-R2-R3；A2為R4-R5-R6；A3為R7-R8-R9；其中R1選自于i).1-20個氨基酸；ii). 和iii). 其中的X選自N、CH和NC＝O，以及R′1和R″1分別選自H、烷基、?；⒎蓟?、芳烷基和氨基保護基團，R1可以被取代基取代；R2為-CR99R100-，其中R99和R100分別選自H、烷基、芳烷基、雜芳烷基和雜芳基，并且R99和R100可分別被取代基取代；R3選自-C(O)-、-CH2-、-CHR99-C(O)-和-C(O)-NR35-CH2-C(O)-，其中R35為橋連基團-C(O)-CR55-中的CHR55基團；R4選自-CH2-和-NR50-，其中R50選自H、烷基、芳烷基和雜環(huán)；R5為-CR201R202-，其中R201和R202分別選自H、烷基、芳基和芳烷基，并且R201和R202可分別被取代基取代；R6選自-C(O)-、-CH2-和-CHR99-C(O)-；R7選自-CH2-和-NR51-，其中R51為H、烷基、芳烷基、雜烷基和雜芳烷基，并且這些基團部分均可被選自Q和-(CH2)n-Q的基團取代，其中n為0-5，Q選自氨基、脒基、咪唑和胍基，這些基團可以被取代基取代，可以是其一、二、三或四烷基銨的可成藥鹽、其異酰脲或異硫酰脲；R8為-CR210R211-，其中R210和R211分別選自H、烷基、烷芳基、雜環(huán)，并且這些基團部分均可被選自Q或-(CH2)n-Q的基團取代，其中n為1-5，Q選自氨基、脒基、咪唑基和胍基，這些基團可以被取代基取代，可以是其一、二、三或四烷基銨的可成藥鹽、其異酰脲或異硫酰脲；R9選自-C(O)-、-CH2-和-CHR99-C(O)-；其中，當m為1時，B選自1-20個氨基酸、-NHR52、-NR60R61、-OR70和-CHR60R61，其中R52選自H、烷基、芳烷基、雜芳烷基和雜芳基；R60和R61分別選自H、烷基、芳烷基、芳基、雜芳烷基和雜芳基，和R70選自H、?；?、烷基、芳烷基和雜芳烷基，而當m為0時，B選自1-20個氨基酸、-OR70、-NHR52和-NR60R61，并通過酰胺鍵或酯鍵連接到R6上；B可以被取代基取代，條件是當R3為-CH2-或-CHR99-C(O)-時，R4則為NR50；當R4為-CH2-時，R3則為-C(O)-或-CHR99-C(O)-；當R6為-CH2時，R7為-NHR51-；當R7為CH2時，R6為-C(O)-或-CHR99-C(O)-；當R4為-NR50-和R1為 時，R50和R′1共同構(gòu)成具有式-C(O)-CHR55-的橋連基團，其中CHR55代表R50，羰基代表R′1，R″1和R55分別為H、C1-C6烷基或芳烷基；以及當R3為-C(O)-NR35-CH2-C(O)-時，則R4為-NR50-，R1為 R35和R′1共同構(gòu)成具有式-C(O)CHR55-的橋連基團，其中C(O)代表R′1，CHR55代表R35；R″1和R55分別為H或C1-C6烷基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R4為-NR50-，R1為 R50和R′1共同構(gòu)成具有式-C(O)-CHR55的橋連基團，其中R55為H；R1為H或甲基；R99和R100分別選自H、芳烷基、烷基和雜烷基或1-3個碳原子，并且R99和R100可以進一步連接到選自下組基團的部分上苯基、噻吩基、噻唑基、吡啶基、萘基、萘硫酚基、吲哚基或飽和烷基、烷氧基、一烷基氨基、二烷基氨基、四烷基銨、芳烷基氨基、氨基烷芳基、羧基、鹵代、羥基、氨基、酰氨基、脒基、胍基、三唑基和磺?；?，R3選自-C(O)-和-C(O)-NR35-CH2-C(O)-。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中該化合進一步包括在選自R10和R1、R9和R1、R8和R1、R5和R1、R5和R2、R5和R8、R5和R9中的兩部分之間形成橋連結(jié)構(gòu)，其中所說的橋連結(jié)構(gòu)是由結(jié)構(gòu)-CR400R410(X-Y)-R500R510C-組成的，其中R400、R410、R500和R510選自H、烷基、環(huán)烷基、芳烷基和芳基；X和Y分別選自碳、氮、氧、硫、-CO-NH-、-CH2-O-CH2，以及它們的功能等同物；R400、R410、R500、R510可以被選自烷基和雜原子的部分所取代。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R′1和R″1分別被選自下組的取代基所取代C1-C6烷基、-OCH2-、-SCH2-、＞N-CH2-、＞NC(O)-、-CO-或-NY-CO-NZ，其中Y和Z分別選自H、C1-C8烷基、C5-C12芳烷基和雜芳烷基。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R2被選自下組的取代基所取代苯基、噻吩基、噻唑基、吡啶基、萘基、萘硫酚基、吲哚基、烷基、烷氧基、一烷基胺、二烷基胺、四烷基銨、芳烷基氨基、氨基烷芳基和羧基。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的化合物，其中R2被選自下組中的1-5個取代基所取代烷基、烷氧基、一烷基氨基、二烷基氨基、四烷基銨、芳烷基氨基、氨基烷芳基、羧基、鹵素、羥基、氨基、酰胺基、脒基、胍基、三唑基或磺?；?。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R100為H，R99選自 其中W選自H、氨基、低級烷基，并且可以被胺、酰胺、羥基、羧基和脒基進一步取代，也可以不被取代；J選自氧、硫、NH和NR，其中R選自C1-C6烷基、C5-C12芳烷基、C1-C6烷?；虲5-C12芳?；?br> 8.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R50被選自含N-、O-和S-部分的取代基所取代。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R50選自H、烷基、芳烷基和雜芳烷基。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R201和R202進一步被選自含N-、O-和S-部分的取代基所取代。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R202為H，R201選自 其中X為C、N或S，R選自H和烷基，該烷基可以被雜原子取代；n為1-5。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R51被選自含N-、O-和S-部分的取代基所取代。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R210或R211被選自Q和(CH2)n-Q的取代基所取代，n為1-5。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R52被選自含N-、O-和S-部分的取代基所取代。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R60和R61分別被烷基取代。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R70被烷基取代。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中R1為 R′1選自H、-CO-Ra、-SO2-Ra、氨基保護基團、可以被取代的1-6個氨基酸，其中所說的1-6個氨基酸的N-末端被選自H、-CO-Ra、-SO2-Ra和氨基保護基團中的取代基所取代；Ra選自烷基、芳基和雜烷基；R″1選自H、?；屯榛?；X為N；R2為-CHR99-，其中R99選自烷基、芳基、芳烷基、雜烷基和雜芳基，并且可被選自下組中的1-6個取代基取代氟、氯、溴、碘、氨基、硝基、脒基、酰氨基、羧基、酯基、醚基和羥基；R3為-C(O)-；R4為-NH-；R5為-CHR201-，其中R201為烷基；R6為-C(O)-；R7為-NH-；R8為-CHR210-，其中R210為帶有至少一個形式正電荷的雜烷基，其中雜原子為氮原子；R9為-C(O)-；B選自O(shè)Rb和-N-RcRd，其中Rb選自H、烷基和羧基保護基團，Rc選自H和烷基，Rd選自烷基、雜烷基和1-20個氨基酸，并且可以被取代基取代，其中所說化合物的C-末端可以用羧基保護基團、伯酰胺基團或與R1氨基形成仲酰胺基團或叔酰胺基團的環(huán)肽部分進行修飾。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的化合物，其中A1選自Tyr、F(pNH2)、mAph、pAph和Nal(2)。
19.根據(jù)權(quán)利要求17的化合物，其中該化合物含有氨基保護基團。
20.根據(jù)權(quán)利要求17的化合物，其中A2選自Ile和Chg。
21.根據(jù)權(quán)利要求17的化合物，其中A3選自Arg、PalMe(3)、Dab(Nγ-C3H7N)、Dap(Nβ-C3H7N)和Orn(Nδ-C3H7N)。
22.根據(jù)權(quán)利要求17的化合物，其中A1選自Tyr、F(pNH2)、mAph、pAph和Nal(2)，這些基團含有0或1個氨基保護基團；A2選自Ile和Chg；A3選自Arg、PalMe(3)、Dab(Nγ-C3H7N)、Dap(Nβ-C3H7N)和Orn(Nδ-C3H7N)；和B選自-H、-OH、-NH2、1-5個氨基酸或其功能等同物以及羧基保護基團。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的化合物，其中該化合物選自Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-CH2-Chx；Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-2CMT；Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-Chx；Ac-F(pNH2)-Chg-Dab(Nγ-C3NH7)-L-P-NH2；Bz-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2；Tos-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2；Ac-Y(3-I)-Chg-R-L-P-NH2；y-Chg-R-L-NH2；Ac-F(pNH2)-Chg-R-醇；環(huán)戊基-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；3-Iqc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；Bzf-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；3-Iqc-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2；Ac-F(pNH2)-Chg-R-NH-2-噻唑基；2-呋喃甲?；?pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；5-Me-2-噻吩基-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；Ac-Nal(2)-Chg-R-NH-2-噻唑基；2-Bzf-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2；Ac-pAph-Chg-Dab(Nγ-C3H7N)-L-P-NH2；Ac-(iBu)pAph-Chg-R-L-P-NH2；Ac-pAph-Chg-R-Gla-P-NH2；Ac-pAph-Chg-R-Pen(CH2COOH)-P-NH2；Ac-pAph-Chg-R-L-P-NH2；Ac-F(pNH2)-Chg-R-(Me)L-P-NH2；Ac-F(pNH2)-Chg-R-OEt；Ac-F(pNH2)-Chg-Orn(Nδ-C3H7N)-L-P-NH2；Ac-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2；Ac-Nal(2)-Chg-R-L-P-NH2；Ac-pAph-Chg-Dab(Nγ-C3H7N)-NH2；Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH2；Ac-pAph-Chg-R-NH2；Ac-pAph-Chg-R-OH；Ac-pAph-Chg-R-醇；DIPA-(m)pAph-Chg-R-L-P-NH2；DIPA-(m)F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2；Isn-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2；Pza-F(pNH2)-Chg-R-L-P-NH2；Tfa-(iBu)Y-Chg-R-L-P-NH2；和Tfa-(iBu)Y-I-Orn(NδC3H7N)-L-P-NH2。
24.根據(jù)權(quán)利要求22的化合物，其中該化合物選自Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-CH2-Chx；Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-Chx；Bzf-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH2；Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；環(huán)戊基-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；3-Iqc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；2-呋喃甲酰基-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；5-Me-噻吩基-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；和Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-醇。
25.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其中m為0。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的化合物，其中B為雜芳烷基。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的化合物，其中所說的雜芳烷基選自(4-(N-甲基吡啶鎓))甲基；2-(3-(N-甲基吡啶鎓))乙-1-基；2-(4-(N-甲基吡啶鎓))乙-1-基；(對脒基)芐基；2-(4-(N-甲基吡啶鎓))丙-2-基；和2-(4-(N-甲基吡啶鎓))乙-1-基。
28.根據(jù)權(quán)利要求26的化合物，該化合物選自Ac-pAph-Chg-AMP(4)和Ac-pAph-Chg-AEMP(4)。
29.一種特異性抑制因子Xa活性的非自然界存在的化合物，該化合物具有結(jié)構(gòu)X1-YIR-X2，其中X1選自H、?；?、烷基、酰烷基、芳烷基和1-20個氨基酸，且X2選自經(jīng)修飾的C-末端基團，一種或多種羧基保護基團和1-20個氨基酸，其中所說的化合物可以被取代基取代。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的化合物，其中X1選自H、1個氨基酸和2個氨基酸，X2選自經(jīng)修飾的C-末端基團，一種或多種羧基保護基團和1-17個氨基酸。
31.根據(jù)權(quán)利要求29的化合物，其中所說的化合物是線型的。
32.根據(jù)權(quán)利要求29的化合物，其中所說的化合物是環(huán)狀的。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的化合物，其中通過YIR基元序列外的橋成環(huán)。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的化合物，其中成環(huán)作用包括與存在于YIR基元序列內(nèi)的Ile殘基形成橋。
35.選自下組的權(quán)利要求29的化合物Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Ala-NH2，Ac-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2，Ac-(iBu)Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2，Ac-Tyr-Ile-Arg-N(CH3)O(CH3)，Ac-Tyr-{ψ(CH2NH)}-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2，Ac-Tyr-Ile-Arg-NH-CH2(4-吡啶基)，Ac-Tyr-Ile-{ψ(CH2NH)}-Arg-Leu-Pro-NH2，Ac-Tyr-Chg-Arg(NO2)-{ψ(CH2NH)}-Leu-NH2，Ac-Tyr-Ile-Arg-{ψ(COCH2)}-Gly-Pro-NH2，Ac-Tyr-Ile-Dab(Nγ-C3H7N)-Leu-Ala-NH2，Ac-Tyr-Ile-PalMe(3)-NH2，Tyr-Ile-Arg-NH2，D-Tyr-Ile-Arg-Leu-Pro-NH2，Ac-(Bzl)Gly-(Chx)Gly-(3-胍基丙基)Gly-NH2，環(huán)(Gly-Tyr-Ile-Arg-Gly)，Tfa-(iBu)Tyr-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2。Ac-pAph-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2，Ac-Nal(2)-Chg-Arg-Leu-Pro-NH2，Ac-pAph-Chg-PalMe-NH2，以及它們的可成藥鹽、酰胺、酯、醇和醛。
36.一種特異性抑制因子Xa活性的方法，該方法包括使因子Xa與權(quán)利要求1的化合物接觸。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中R1為 R′1選自H、-CO-Ra、-SO2-Ra、氨基保護基團、1-6個氨基酸，它們可被取代，其中所說的1-6個氨基酸的N-末端被選自H、-CO-Ra、-SO2-Ra和氨基保護基團中的取代基所取代；Ra選自烷基、芳基和雜烷基；R″1選自H、?；屯榛籜為N；R2為-CHR99-，其中R99選自烷基、芳基、芳烷基、雜烷基和雜芳基，并且可被選自下組中的1-6個取代基取代氟、氯、溴、碘、氨基、硝基、脒基、酰氨基、羧基、酯基、醚基和羥基；R3為-C(O)-；R4為-NH-；R5為-CHR201-，其中R201為烷基；R6為-C(O)-；R7為-NH-；R8為-CHR210-，其中R210為帶有至少一個形式正電荷的雜烷基，其中雜原子為1-6個氮原子；R9為-C(O)-；B選自-ORb和-N-RcRd，其中Rb選自H、烷基和羧基保護基團，Rc選自H和烷基，Rd選自烷基、雜烷基和1-20個氨基酸，并且可以被取代基取代，其中所說化合物的C-末端可以用羧基保護基團、伯酰胺基團或與R1氨基形成仲酰胺基團或叔酰胺基團的環(huán)肽部分進行修飾，或者被還原為醇。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的方法，其中A1選自Tyr、F(pNH2)、mAph、pAph和Nal(2)，這些基團含有0或1個氨基保護基團；A2選自Ile和Chg；A3選自Arg、PalMe(3)、Dab(Nγ-C3H7N)、Dap(Nβ-C3H7N)和Orn(Nδ-C3H7N)；和B選自-H、-OH、-NH2、1-5個氨基酸或其功能等同物以及羧基保護基團。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所說的化合物選自Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-CH2-Chx；Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH-Chx；Bzf-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-L-P-NH2；Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；環(huán)戊基-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；3-Iqc-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；2-呋喃甲酰基-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；5-Me-噻吩基-CO-pAph-Chg-PalMe(3)-NH2；和Ac-pAph-Chg-PalMe(3)-醇。
40.根據(jù)權(quán)利要求38的化合物，其中所說的化合物選自Ac-Y-I-R-L-A-NH2，Ac-Y-I-R-L-P-NH2，Ac-(iBu)Y-I-R-L-P-NH2，Ac-Y-I-R-N(CH3)O(CH3)，Ac-Y-{ψ(CH2NH)}-I-R-L-P-NH2，Ac-Y-I-R-NH-CH2(4-吡啶基)，Ac-Y-I-{ψ(CH2NH)}-R-L-p-NH2，Ac-Y-Chg-R(NO2){ψ(CH2NH)}-L-NH2，Ac-Y-I-R-{ψ(COCH2)}-G-P-NH2，Ac-Y-I-Dab(Nγ-C3H7N)-L-A-NH2，Ac-Y-I-PalMe(3)-NH2，Y-I-R-NH2，D-Y-I-R-L-P-NH2，Ac-(Bzl)Gly-(Chx)Gly-(3-胍基丙基)Gly-NH2，環(huán)(G-Y-I-R-G)，Tfa-(iBu)Y-Chg-R-L-P-NH2，Ac-pAph-Chg-R-L-P-NH2，Ac-Nal(2)-Chg-R-L-P-NH2，以及它們的可成藥鹽、酰胺、酯、醇和醛。
41.一種抑制個體內(nèi)血凝的方法，該方法包括給予個體權(quán)利要求1的化合物。
42.一種診斷樣品中因子Xa水平的方法，該方法包括使樣品與權(quán)利要求1的化合物接觸并測定結(jié)合的量。
43.一種診斷樣品中活性因子Xa水平的方法，該方法包括使樣品與權(quán)利要求1的化合物接觸并測定因子Xa酶促催化活性的量。
全文摘要
本發(fā)明提供了能夠特異性抑制因子Xa活性的化合物。該化合物由結(jié)構(gòu)X1-YIR-X2組成，其中X
文檔編號C07K5/103GK1147261SQ95192811
公開日1997年4月9日 申請日期1995年4月25日 優(yōu)先權(quán)日1994年4月26日
發(fā)明者法赫德·阿爾-奧貝迪, 米哈爾·列布爾, 詹姆斯·A·奧斯特里姆, 佩維爾·薩法爾, 埃琳娜·斯蒂蘭多娃, 彼德·斯特羅普, 阿明·沃爾澤 申請人:西萊克泰德公司