專利名稱：調(diào)節(jié)淋巴細胞活性的抗體雜合物的制作方法
本申請是1988年4月4日提交的176，825號美國專利申請的后續(xù)部分，該申請作為本文的參考文獻。
本發(fā)明涉及新的抗體雜合物，及其調(diào)節(jié)淋巴細胞活性(例如T細胞和B細胞)的應用。更具體地說，本發(fā)明涉及至少包含兩種抗體的雜合物，它們相互偶聯(lián)，每種抗體都能與不同的淋巴細胞表面抗原反應。這些雜合物似乎是這樣起作用的首先與淋巴細胞結(jié)合，從而使它們與之反應的各種細胞表面抗原在空間上相互接近，因此提高或降低淋巴細胞的信號轉(zhuǎn)導和增殖。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選方案，使一種能與T細胞受體或與其結(jié)合的CD3復合物反應的抗體與另一種抗體交聯(lián)，后者能與第二種T細胞表面抗原反應，例如CD2、CD4、CD6或CD8，從而增強T細胞的活化作用和功能。根據(jù)另一優(yōu)選方案，使一種能與T細胞表面抗原CD5反應的抗體與一種能與第二種T細胞表面抗原(例如CD4、CD6或CD8)反應的抗體交聯(lián)，以增強淋巴細胞的活化作用和功能。在另一個優(yōu)選方案中，使一種能與CD45抗原族反應的抗體與另一種抗體交聯(lián)，后者能與第二種T細胞表面抗原反應，例如CD2、CD3、CD5或CD28，以抑制淋巴細胞的活化作用和功能。在另一個優(yōu)選的具體方案中，使一種能與CD4抗原反應的抗體與一種能與CD45抗原反應的抗體交聯(lián)，以增強淋巴細胞的活化作用和功能。本發(fā)明的抗體雜合物、方法及組合物可用于調(diào)節(jié)淋巴細胞的作用，以改善治療某些疾病時的細胞免疫應答，這些疾病有例如傳染病、癌癥、艾茲病和自身免疫疾病。
T淋巴細胞在本領(lǐng)域內(nèi)也稱為T細胞，已知它至少能以兩種不同途徑介導免疫應答作用。細胞毒性T細胞涉及特異靶細胞的溶解，而輔助T細胞則協(xié)助B細胞的增殖和分化，導致抗原特異性抗體的生成(參見J.W.Kimball編《免疫學導論》第2版11-13章，MacmillanPublishingCo.，1986)。任一種T細胞都可在活化后行使其功能，T細胞受體(Ti)或T細胞表面與其結(jié)合的CD3復合物(也稱為CD3/Ti受體復合物)與具抗原細胞上的抗原作用便可使T細胞活化(參見E.L.Reinherz等人，“人T淋巴細胞的克隆型表面結(jié)構(gòu)抗原受體復合物的功能及生化分析”，Immuno.Rev.8195-129，1984)。
然而，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，T細胞對抗原的應答只在這樣的情況下發(fā)生即該抗原與具抗原細胞的由特異MHC(主要組織相容性復合物)編碼的抗原相結(jié)合。因此，認為T細胞對抗原的識別局限于與抗原結(jié)合的MHC編碼產(chǎn)物的類別。這種MHC限制作用的結(jié)果是，細胞毒性T細胞通過與Ⅰ類MHC抗原結(jié)合的抗原活化，而輔助T細胞通過與Ⅱ類MHC抗原結(jié)合的抗原活化(J.W.Kimball編，《免疫學導論》286-89和348-58頁)。
進一步還知道，由Ⅱ類MHC限制的T細胞除了表達CD3/Ti受體復合物外，還表達一種稱為CD4的細胞表面抗原，而Ⅰ類MHC限制的T細胞則表達細胞表面抗原CD8。MHC限制作用和CD抗原表達間的這種聯(lián)系導致這樣的假設在T細胞的活化過程中，不同的MHC抗原是CD抗原的天然配體，即輔助T細胞上的CD4抗原與具抗原細胞(如巨噬細胞)上的Ⅱ類MHC分子相作用，而細胞毒性T細胞上的CD8抗原與特異靶細胞(如病毒感染細胞)上的Ⅰ類MHC分子相作用(F.Emmrich等人，“T細胞受體復合物與亞類特異性分化抗原的交聯(lián)促進人CD4和CD8T細胞中的白細胞介素2受體表達”，Eur.J.Immunol.17529-34，1987)。此外，還有人認為，T細胞對抗原的識別可通過四級復合物進行，其中，與CD抗原(例如CD4或CD8)結(jié)合的T細胞表面的CD3/Ti受體復合物，“看見”與合適的MHC編碼抗原相結(jié)合的抗原(P.Anderson等人，“T3(CD3)與T4(CD4)的交聯(lián)增強休止T淋巴細胞的增殖”，J.Immunol.139678-82，1987)。
本申請中的CD抗原是指天然產(chǎn)生的細胞表面分化抗原，由單克隆抗體與細胞表面的反應性定義，它們由國際討論會(InternationalWorkshop)所命名，該組織的作用是為這些抗原提供一種統(tǒng)一的命名(A.J.McMichael編《白細胞分類Ⅲ》，牛津大學出版社，1987)。大量CD抗原已進行了分子克隆，并因此確定了所有特征(同上)。著名的CD抗原包括廣泛的T抗原CD3、CD2、CD5、CD6和CD7，一種對于輔助T細胞亞類特異性的CD抗原CD4，以及一種對于抑制型T細胞亞類特異性的CD抗原CD8(J.A.Ledbetter等人，《免疫遺傳學及組織相容性展望》第6卷，E.Heise編，淋巴細胞表面抗原1984，325-40頁，美國組織相容性及免疫遺傳學學會，紐約1984)。CD28是一種大多數(shù)T細胞上具有的抗原(Yamada等人，Eur.J.Immunol.151164-1169，1985)。雖然由上述可以看出，這些分化抗原被認為是作為受體起作用并與T細胞的信號轉(zhuǎn)導相聯(lián)系，但仍不了解它們在T細胞活化中的具體功能，而這正是需進行廣泛研究的課題。
例如，已在分子水平上進行了研究，以確定CD抗原在T細胞活化中的作用。已知CD3/Ti受體復合物與單克隆抗體或抗原的反應在T細胞中導致跨膜“信號”的產(chǎn)生。此信號通常通過肌醇磷酸(1、2和3)的生成以及胞質(zhì)游離鈣濃度(〔Ca2+〕i)的上升而測定(J.B.Imboden等人，“T細胞抗原受體的跨膜信號”，J.Exp.Med.161446-56，1985;J.B.Imboden等人，“人T細胞克隆對抗原的識別導致肌醇三磷酸的上升”，J.Immunol.1381322-24，1987)。
但是，此信號的產(chǎn)生可能并不足以刺激T細胞增殖(同上，873頁)。在實驗條件下發(fā)現(xiàn)，如果T細胞表面的CD3抗原通過與帶有交聯(lián)抗體的細胞反應而交聯(lián)，則會導致T細胞的增殖。所述交聯(lián)抗體是通過副衛(wèi)細胞的存在(例如，通過單核細胞Fc受體與針對CD3的抗體上的Fc部分相互作用)，或通過將抗體固定在固相基質(zhì)上而進行交聯(lián)的。
因此，偶聯(lián)于固相基質(zhì)上的針對CD3/Ti受體復合物的單克隆抗體能夠刺激T細胞增殖(P.Anderson等人，同上;C.Walker等人，“通過抗CD3抗體與第二抗T細胞抗體的交聯(lián)活化T細胞機理及亞類特異性活化作用”，Eur.J.Immunol.17873-80，1987)，這一部分是由于CD3抗原的交聯(lián)，一部分是由于阻止了CD3/Ti受體復合物的內(nèi)化，此內(nèi)化作用將抑制T細胞的活化(J.A.Ledbetter等人，“CD3的結(jié)合效價及CD3細胞表面復合物的內(nèi)化控制T細胞對第二信號的應答”，J.Immunol.1363945-52，1986)。但是，對于活體中的治療應用來說，用一種固定在固相基質(zhì)上的抗CD3抗體來增強T細胞的活化存在相當?shù)睦щy。這樣一種應用將涉及固相基質(zhì)(通常是小珠)的注射，但接受注射的病人將承受某種危險，例如動脈的阻斷或阻隔。
另外還有人認為，在生理條件下，即使這種通過CD3抗原交聯(lián)的CD3/Ti刺激作用也只能產(chǎn)生很弱的信號，它需要通過T細胞表面上的CD3/Ti和其他CD抗原之間的相互作用而增強(P.Anderson等人，同上，678頁)。
此外，還不清楚T細胞活化中CD抗原相互作用的確切效應。例如，對自發(fā)的CD4缺失變異進行的分析(P.Marrack等人，“T細胞上MHC限制的抗原受體Ⅱ，L3T4產(chǎn)物的作用”，J.Exp.Med.1581077-91，1983)，以及基團轉(zhuǎn)移實驗(D.Gay等人，“人T細胞蛋白CD4和MHCHLA-DR抗原間的功能性相互作用”，Nature328626-29，1987)都表明，CD4的表達增強了T細胞對特異抗原的應答，并且，如果抗原濃度在最適以下，或者T細胞對于抗原/MHC編碼抗原的親和力很低，則CD4所起的作用非常重要(A.Regnier-Bigouroux等人，“輔助分子及T細胞活化Ⅰ?？乖荏w親合力不等地影響T細胞對于針對LFA-1和L3T4的單克隆抗體抑制作用的敏感性”，Eur.J.Immunol.161385-90，1986;S.Shaw等人，“細胞毒性T淋巴細胞克隆對于抗T3和抗T4(但不抗LFA-1)單克隆抗體抑制作用的敏感性隨著細胞毒性T淋巴細胞與靶子間相互作用的“親和力”而不同”，J.Immunol.1343019-26，1985)。此外，如果將與CD3和CD4反應的單克隆抗體固定在同樣的固相基質(zhì)上，則將增強與此固化抗體接觸的T細胞的增殖。同樣，如果針對CD3和CD8的單克隆抗體偶聯(lián)在固相基質(zhì)上，則T細胞增殖的提高超過僅使用針對CD3一種抗體的情況(P.Anderson等人，同上)。
然而，對可溶性CD4單克隆抗體的研究表明，可溶性抗體抑制T細胞應答，這似乎表明CD4可能傳遞一種抑制T細胞活化的負信號(J.P.Bank等人，J.Exp.Med.1631294，1985;J.P.Tite等人，“L3T4在T細胞活化中的作用L3T4可能既是Ia結(jié)合蛋白又是傳遞負信號的受體”，J.Cell.Mol.Immunol.2179-90，1986;P.M.Rosoff等人，“L3T4分子在分裂素和抗原活化的信號轉(zhuǎn)導中的作用”，Cell49845-53，1987)。
B淋巴細胞也稱為B細胞，它是抗體生成(漿)細胞的前體。如果B細胞受到抗原的刺激(這需要輔助T細胞和巨噬細胞的協(xié)同作用)，B細胞則開始增殖，并分化成漿細胞和記憶B細胞。在B細胞上鑒別到的CD抗原包括CD19、CD20、CDw45、CD45、CD45R和Bgp95(此抗原目前還沒有CD命名)(McMichael，《白細胞分類Ⅲ》，同上)。
另一種感興趣的CD抗原是白細胞都有的抗原CD45(L-CA，也稱為T200或Ly-5)。CD45包括一類主要的糖蛋白，其分子量范圍是180-220KDa，它只存在于造血譜系的細胞上(Trowbridge等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA72157-161，1975;Komuro等人，Immunogenetics1452-456，1975;Schied等人，Immunogenetics9423-433，1979;Dalchau等人，Eur.J.Immunol.10737-744，1980;Omary等人，J.Exp.Med.152842-852，1980)。mRNA的不同剪接產(chǎn)生CD45的各種同形體。這些同形體由T和B淋巴細胞亞群不等地表達。針對人CD45抗原的某些單克隆抗體識別所有CD45同形體都具有的決定簇，即分子量為220、205、190和180KDa的同形體(Cobold等人，《白細胞分類Ⅲ》同上，第15章788-803頁)。然而，其他單克隆抗體只識別CD45的220KDa同形體(稱為CD45R)，它是通過B淋巴細胞和T細胞亞群的選擇表達產(chǎn)生的(Cobold，同上;Dalchau等人，J.Exp.Med.153753-765，1981;Morimoto等人，J.Immunol.1341508-1515，1985;Ledbetter等人，J.Immunol.1351819-1825，1985)。另一種單克隆抗體UCHL-1選擇性地與180KDa分子結(jié)合，此分子只存在于皮質(zhì)胸腺細胞和一個活化的或記憶T細胞亞類上(Smith等人，Immunology5863-70，1986)。
最近，已經(jīng)由cDNA核苷酸順序推導出了大鼠(Thomas等人，Cell4183-93，1985;Barclay等人，EMBOJ.61259-1264，1987)、小鼠(Saga等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA836940-6944，1986;W.C.Raschke，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84161-165，1987;Thomas等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA845360-5363，1987;Saga等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA845364-5368，1987)和人(Ralph等人，EMBOJ.61251-1257，1987;Streuli等人，J.Exp.Med.1661548-1566，1987)CD45(L-CA)的一級結(jié)構(gòu)。CD45是一種膜結(jié)合蛋白，它有一個705-707氨基酸的大片段伸入胞質(zhì)中，一個22氨基酸的跨膜片段，及一個范圍在400-550氨基酸的胞外結(jié)構(gòu)域。CD45的各種同形體是通過單一基因初始轉(zhuǎn)錄后對mRNA進行不同剪接產(chǎn)生的，它們具有不同的胞外結(jié)構(gòu)域，但具有相同的跨膜片段和胞質(zhì)片段(Barclay，同上;Ralph，同上;Streuli，同上)。胞質(zhì)片段有兩個同源的高度保守的結(jié)構(gòu)域，大約有300個殘基。
企圖確定CD45的功能的研究工作產(chǎn)生了有沖突的結(jié)果(Cobold，同上)。據(jù)報道，針對人和小鼠抗原的單克隆抗體抑制T和B細胞增殖(Harp等人，J.Immunol.13310-15，1984;Bernabeu等人，Eur.J.Immunol.171461-1466，1987;Mittler等人，J.Immunol.1383159-3166，1987)、抗體形成細胞的生成(Yakura，J.Exp.Med.1571077-1088，1983)、天然殺傷(NK)細胞和細胞毒性T細胞活性(Seaman等人，J.Immunol.127982-986，1981;W.Newman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA793858-3862;Nakayama等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA761977-1981，1979;Lefrancois等人，Nature(London)314449-452，1985)。Thomas(同上)提出，此分子中具有兩個保守的同源區(qū)的80KDa的胞質(zhì)部分可能對CD45的功能起關(guān)鍵作用。最近發(fā)現(xiàn)這些結(jié)構(gòu)域與一種主要的低分子量蛋白酪氨酸磷酸酶同源，此酶是從人胎盤的可溶組分和顆粒組分中分離出(Tonks等人，J.Biol.Chem.2636722-6730，1988;Charbonneau等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA857182-7186，1988)。這表明CD45是一種膜結(jié)合的蛋白酪氨酸磷酸酶，它可能通過與其他膜結(jié)合分子的相互作用而發(fā)揮其功能。
本發(fā)明澄清了上述的某些不確定的觀點，并提供了至少包括兩種抗體的抗體雜合物，這兩種抗體能與淋巴細胞(例如T細胞)上表達的不同的表面抗原反應，并且抗體間相互交聯(lián)。這些雜合物中有一些在T細胞活化過程中能增強信號轉(zhuǎn)導作用，這是通過它們能夠提高T細胞中的〔Ca2+〕i而確定的，即它們在比僅用針對CD3抗原的抗體時低大約兩個數(shù)量級的蛋白濃度下就能夠提高T細胞中的鈣離子濃度。
此外，本發(fā)明的雜合物包括那些能夠抑制淋巴細胞的活化和功能的雜合物。
荼痙⒚韉撓叛》槳福鼓苡隒D3/Ti受體復合物或其組分反應的單克隆抗體與另一種單克隆抗體交聯(lián)，后者能與T細胞表面的第二種抗原反應，例如CD2、CD4、CD6或CD8抗原，從而形成能在T細胞活化過程中增強信號轉(zhuǎn)導的雜合物。根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選方案，使一種能與T細胞表面抗原CD5反應的單克隆抗體與另一種單克隆抗體交聯(lián)，后者能與T細胞表面的第二種抗原反應，例如CD4、CD6或CD8抗原。一個特別優(yōu)選的方案涉及這樣一種雜合物，它包括相互交聯(lián)的針對CD3的抗體和針對CD4的抗體。
根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選方案，使一種能與CD45T細胞表面抗原反應的單克隆抗體與另一種單克隆抗體交聯(lián)，后者能與T細胞表面的第二種抗原反應，例如CD2、CD3、CD5或CD28抗原，從而形成抑制淋巴細胞活化和增殖的雜合物。一個特別優(yōu)選的方案涉及這樣一種雜合物，它包含相互交聯(lián)的CD3抗體和能與CD45抗原或其同形體反應的抗體。
本發(fā)明還包括用本發(fā)明雜合物處理淋巴細胞的方法，以在產(chǎn)生細胞免疫應答的過程中增強或抑制淋巴細胞的活化作用。因此，本發(fā)明的雜合物可用于藥物組合物中，例如那些包括治療有效量的至少一種本發(fā)明雜合物和一種藥物上可接受的載體的組合物。因此，本發(fā)明的雜合物、方法和組合物能用于免疫治療中以增強或調(diào)節(jié)免疫應答，例如，可用于治療傳染病、癌癥、艾茲病和自身免疫疾病。


圖1給出了用不同濃度的不同抗體刺激外周血淋巴細胞后，胞質(zhì)中游離鈣濃度(〔Ca2+〕i)上升的比較圖形;(A)使用本發(fā)明的CD3/CD4雜合物G19-4/G17-2，(B)使用抗CD3的單克隆抗體G19-4。
圖2給出了外周血淋巴細胞(PBL)或具有本發(fā)明CD3/CD4雜合物(即G19-4/G17-2)的CD4+T細胞在刺激后的〔Ca2+〕i應答及應答細胞百分比的比較圖形。還給出了用CD4單克隆抗體G17-2預處理細胞，然后用雜合物刺激的抑制效應。
圖3給出了在5mMEGTA存在下，本發(fā)明的G19-4/G17-2雜合物( )或CD3單克隆抗體G19-4(□)對于CD4+T細胞的〔Ca2+〕i活性的滴度比較。
圖4給出了用CD3抗體G19-4(·)或本發(fā)明的CD3/CD4雜合物G19-4/G17-2(△)以1μg/ml刺激CD4+T細胞后的肌醇磷酸上升的比較圖形。還給出了零時和10分鐘時未處理對照(O)的肌醇磷酸水平。A圖描繪了肌醇磷酸1(InsP1)的上升，B圖描繪了肌醇磷酸2(InsP2)的上升，C圖描繪了肌醇磷酸3(InsP3)的上升。
圖5描繪了兩個獨立實驗的結(jié)果，其中，用生物素結(jié)合的CD4抗體(G17-2)預處理CD4+T細胞，然后用CD3抗體(G19-4)、G17-2、CD3/CD4雜合物(G19-4/G17-2)或抗生物素蛋白中任一種和其結(jié)合物刺激CD4+T細胞，然后測定InsP1的上升。
圖6描繪了CD3單克隆抗體(CD3Mono)、CD3/CD3同合物(CD3Homo)、CD4/CD4同合物(CD4Homo)及本發(fā)明的CD3/CD4雜合物(CD3+4Hetero)對于T細胞增殖的效應，此效應是通過CD4+T細胞對〔3H〕-胸苷的摻入而標明的，條件是有或沒有PMA(佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯)或CD28抗體。
圖7描繪了CD4+T細胞對各種處理的增殖應答的比較圖形，縱座標是3H-胸苷的摻入，橫座標是G19-4(CD3Mono)+PMA(
)、G19-4+CD28抗體(α-CD28)(
)、CD3/CD4雜合物(CD3+4Hetero)+PMA(
)、CD3/CD4雜合物+α-CD28(
)、CD3/CD3同合物(CD3 Homo)+PMA(
)或CD3/CD3同合物+α-CD28(
)中任一種的濃度。
圖8描繪了用PHA(植物凝血素)、本發(fā)明的CD3/CD4雜合物G19-4/G17-2、CD3/CD3同合物G19-4/G19-4、作為對照的CD3/CD8雜合物G19-4/G10-1和CD4/CD4同合物G17-2/G17-2中任一種刺激T細胞3天后，經(jīng)過第一、第二或第三細胞周期的CD4+T細胞的百分比。
圖9描繪了由固定化CD3單克隆抗體G19-4誘導的對于T細胞增殖應答的抑制作用的比較圖形，此結(jié)果是僅由〔3H〕-胸苷的摻入(·)或相對于CD45單克隆抗體9.4(□)或p97單克隆抗體96.5(□)中任一種的濃度而得到的，沒有(A)或有(B)PMA(還給出了在溶液中用CD45單克隆抗體9.4的增殖結(jié)果作為比較(△);給出的是平均值;校準誤差＜15%)。
圖10描繪了通過〔Ca2+〕i的上升測定的CD45受體對T細胞信號轉(zhuǎn)導的調(diào)節(jié)作用;測定是如后面的實例4所述，單獨或與CD45單克隆抗體9.4或CD45R單克隆抗體3AC5一起使T細胞上的受體交聯(lián)后進行的(左邊給出了每個實驗中〔Ca2+〕i的平均值，右邊則給出了應答細胞的百分比;箭頭標明加入單克隆抗體或抗生物素蛋白的時間)。
為了使本發(fā)明得到更好的理解，下面給出更詳細的說明。
本發(fā)明涉及一種新的抗體雜合物，以及它們在增強或抑制淋巴細胞活化和功能中的應用。更具體地說，本發(fā)明涉及至少包含兩種互相交聯(lián)的抗體的雜合物，每種抗體能與不同的淋巴細胞表面抗原反應。為了增強活性，偶合物中的一種抗體最好能與T細胞受體(Ti)或與其結(jié)合的CD3抗原復合物反應，而另一抗體則能與第二種T細胞表面抗原反應，例如CD抗原(如CD2、CD4、CD6或CD8)。另一種選擇是，偶合物中的一種抗體能與CD5抗原反應，而另一抗體能與第二種T細胞表面抗原反應，例如CD4、CD6或CD8。雜合物CD4/CD5也導致T細胞活性的增強。為了進行抑制，雜合物中的一種抗體最好能與CD45抗原族(同形體)反應，而另一抗體能與T細胞表面抗原如CD2、CD3、CD5或CD28反應。
本文所述的雜合物并不受現(xiàn)有理論的束縛，當它們與淋巴細胞反應時，通過與細胞表面不同抗原的結(jié)合，一定能使這些抗原在空間上相互密切接近，這一步可能模仿了發(fā)生于T細胞受體和CD4之間的共聚作用，即在T細胞活化過程中使輔助T細胞與具抗原的細胞接觸后發(fā)生的共聚作用(A.Kupfer等人，“CD4(L3T4)分子與T細胞受體的共聚作用是通過輔助T細胞和具抗原細胞的輔助作用的特異直接作用誘導的”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA845888-5892，1987)。細胞表面的T細胞抗原之間的這種相互作用似乎可增強CD3/Ti介導的跨膜信號傳遞，并因此促進T細胞的活化作用。
雖然并不了解CD45抗原對淋巴細胞產(chǎn)生效應的機理，但本文所述的CD45雜合物可能在空間上與淋巴細胞密切相近時，通過從功能上修飾其他的淋巴細胞受體而起作用，例如在某些CD受體(如CD3抗原)聚集后導致抑制作用。最近提出CD45的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域與人胎盤主要蛋白質(zhì)酪氨酸磷酯酶之間具有同源性，這提示前者實際上是一種膜結(jié)合的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酯酶，其功能是在白細胞中使其他膜結(jié)合分子(如CD3的Z鏈上)上的關(guān)鍵的酪氨酰殘基去磷酸化，從而調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導作用(Klausner等人，J.Biol.Chem.26212654-12659，1987)。CD45還能夠調(diào)節(jié)與CD4結(jié)合的蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性，而CD4的功能通常是調(diào)節(jié)抗原驅(qū)動的信號轉(zhuǎn)導(Rudd等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA855190-5194，1988)。另外，CD4結(jié)合的酪氨酸激酯可使CD45抗原在其酪氨酰殘基上磷酸化，從而改變其活性。這一點能夠解釋下面實例所示的由于CD4和CD45受體交聯(lián)而產(chǎn)生的獨特的增強活性。由此模式可以預測，關(guān)鍵酪氨酰殘基的磷酸化在鈣動員之前發(fā)生，并且為后者所必需。膜結(jié)合形式的酶如果只有與其他膜結(jié)合蛋白密切相近時才能起作用，則它能用來將蛋白質(zhì)酪氨酸激酶/磷酯酶調(diào)節(jié)作用定位于特異的細胞表面分子上。因此，相信本發(fā)明的雜合物能夠增強或抑制淋巴細胞的活化作用和功能。
應當注意到，本發(fā)明的T細胞調(diào)節(jié)作用(即抑制作用)可以是廣泛的T細胞調(diào)節(jié)作用，也可是特定亞類或T細胞克隆的調(diào)節(jié)作用。廣泛的T細胞調(diào)節(jié)作用是這樣產(chǎn)生的使T細胞與能夠調(diào)節(jié)所有T細胞群落的雜合物接觸。這些雜合物包含能與所有T淋巴細胞上的T細胞抗原反應的抗體。這種雜合物包含能與所有T淋巴細胞上的T細胞抗原反應的抗體。這種雜合物的實例之一即是本發(fā)明的CD3/CD2雜合物，CD3和CD2都是廣泛的T細胞抗原(J.A.Ledbetter等人，《免疫遺傳學與組織相容性展望》，同上，表1)。
然而，通過使用合適的雜合物，能達到更具專一性的調(diào)節(jié)作用。例如在這樣的情況下，即只需要活化一個特異的T細胞亞群落時，例如輔助細胞或抑制細胞亞類，則可通過構(gòu)建這樣一種雜合物而達到此目的，即該雜合物中的抗體之一能與特異的T細胞亞群落反應，也就是說，一種抗體必須能與特異于該亞群落的抗原反應。偶合物中的另一抗體則最好是特異于廣泛的T細胞抗原。那么，根據(jù)這一具體方案，本發(fā)明的CD3/CD4或CD5/CD4雜合物特異性地增強輔助T細胞的活化(CD4專一于輔助T細胞亞類)，而CD3/CD8或CD5/CD8雜合物則特異性地增強抑制T細胞亞群落的活化(CD8特異于抑制T細胞亞類)。
另一種選擇是，本發(fā)明的CD3/CD45雜合物特異性抑制具有CD45抗原的T細胞的活化作用。由于T細胞亞類上還表達CD45受體的同形體，本發(fā)明中含有能與CD45同形體反應的抗體的雜合物還可用來調(diào)節(jié)這些T細胞亞類。
最后，如果需要進行克隆型調(diào)節(jié)，也即調(diào)節(jié)特異的T細胞克隆，則本發(fā)明的雜合物將包含一個抗克隆型(Ti)的抗體組分，也就是說，一個能與待調(diào)節(jié)的克隆上的T細胞受體可變區(qū)反應的抗體。因此，如果某一克隆型T細胞不能完全看見某一特異抗原(如腫瘤或病毒抗原)并發(fā)生應答，或其應答受到抑制，則可應用本發(fā)明中包括特異于該T細胞的克隆型抗體(Ti/CD4、Ti/CD8、Ti/CD6、Ti/CD2)的雜合物調(diào)節(jié)這些T細胞克隆。另一種選擇是，為了抑制特異的T細胞克隆，可以使用由Ti/CD45組成的雜合物(或Ti/CD45同形體)。根據(jù)這一具體方案，雜合物中的Ti組分基本上可看作是取代了調(diào)節(jié)特異T細胞時抗原的位置。雜合物中的另一抗體可以是廣泛的T細胞特異性或亞類特異性的抗體，或是能與CD45或CD45同形體反應的抗體。
因此，組成本發(fā)明雜合物的抗體包括所有能與淋巴細胞表面抗原反應的抗體。根據(jù)一個優(yōu)選方案，偶合物中的抗體之一能與Ti或CD3T細胞抗原反應。根據(jù)進一步的優(yōu)選方案，使一種能與CD3T細胞表面抗原反應的抗體與一種能與T細胞表面的CD4抗原反應的抗體相交聯(lián)。
可能組成本發(fā)明雜合物的其他抗體包括但不限于，能與其他CD抗原反應的抗體，例如淋巴細胞上的CD2、CD5、CD6、CD7、CD8、CD28和CD28(A.Bernard等人編《白細胞分類》，SpringerVerlag，Heidelberg，1984;J.A.Ledbetter等人，《免疫遺傳學與組織相容性展望》，同上)。因此，根據(jù)另一個優(yōu)選方案，使一種能與CD5T細胞表面抗原反應的抗體與一種能與CD4、CD6或CD8抗原反應的抗體交聯(lián)，從而形成本發(fā)明的雜合物。在另一優(yōu)選方案中，使一種能與CD3T細胞表面抗原反應的抗體與另一種抗體交聯(lián)，后者能與淋巴細胞表面的CD45抗原或其同形體反應。
組成本發(fā)明雜合物的抗體可以是多克隆的，但優(yōu)選單克隆的，可以是完整的抗體分子或是含有該抗體活性結(jié)合區(qū)的片段，例如Fab或F(ab′)2;而且能夠利用本領(lǐng)域的公知技術(shù)生產(chǎn)(參見下面實例1-3提出的參考文獻，即描述如何制備抗CD3、抗CD4、抗CD5和抗CD2單克隆抗體的出版物)。此外，針對許多CD抗原(如CD2、CD3、CD4和CD5抗原)的單克隆抗體可從商業(yè)上得到(Becton Dickinson，Mountainview，CA)，或可從國際白細胞分類討論會得到。如果使用單克隆抗體，抗體可以是來自小鼠或人的抗體，或可以是嵌合抗體(V.T.Oi“嵌合抗體”，Biotechniques4214-221，1986)。進一步，本發(fā)明還包括雙特異性的或重組單克隆抗體，其中，抗體的一種特異性是能與T細胞抗原反應，另一種特異性則是針對第二種T細胞抗原。這種雙特異性抗體可如美國專利4，474，893所述，從四瘤或三瘤細胞中生產(chǎn)，或可通過化學合成生產(chǎn)(Brennan等人，Science22981-83，1985)。
組成本發(fā)明雜合物的抗體可通過本領(lǐng)域的公知技術(shù)共價結(jié)合在一起，例如使用雜雙功能交聯(lián)劑GMBS(馬來酰亞胺丁氧基琥珀酰亞胺)或SPDP(N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶基二硫)丙酸鹽)(R.R.Hardy，“用于流式細胞光度術(shù)的熒光蛋白的純化和偶聯(lián)”，《實驗免疫學手冊》第1卷，免疫化學，D.M.Weir等人編，31.4-31.12頁，第4版，1986;參見其中關(guān)于常規(guī)的抗體偶聯(lián)技術(shù)的討論)。
因此，應當理解，本發(fā)明包括任一種至少由兩種這樣的分子組成的雜合物，即它們能與相同淋巴細胞上不同的淋巴赴乖從?，该杂恒曪的作用矢`鑾炕蛞種屏馨拖赴幕罨饔煤凸δ?。悲d⒚韉腦雍銜锘褂Φ輩喚鲇隩細胞還有B細胞上的抗原反應。
很明顯，除了抗體以外，本發(fā)明的雜合物可摻入能與淋巴細胞受體結(jié)合的配體。例如，已證實CD4受體能與配體gp120反應(人免疫缺損病毒或“HIV”的一種糖蛋白受體)(Linsley等人，J.Virology623695-3702，1988)。因此，由相互交聯(lián)的CD3抗體和配體gp120組成的雜合物可通過使CD3和CD4受體交聯(lián)而增強T細胞活性。還可考慮到其他的配體偶合物，即由相互交聯(lián)的與T細胞受體反應的配體和與不同的T細胞受體反應的配體組成的偶合物。
在一個優(yōu)選方案中，例舉了本發(fā)明的雜合物及其在T細胞活化中的應用，在此方案中，使一種能與T細胞表面的CD3抗原反應的抗體與一種能與CD4抗原反應的抗體結(jié)合，以形成本發(fā)明新的CD3/CD4雜合物。用此雜合物處理CD4+T細胞，導致輔助T細胞亞類中的信號轉(zhuǎn)導作用增強，這是通過下述現(xiàn)象證實的，即與僅用CD3抗體處理細胞相比較，胞內(nèi)的〔Ca2+〕i動員顯著增強，而且肌醇磷酸1、2和3的形成也大量上升。CD3/CD4雜合物的這種信號增強活性并不是簡單地由于寡聚作用所致，因為CD3/CD3和CD4/CD4同合物或其混合物并未表現(xiàn)出這種增強的活性。而且，現(xiàn)有技術(shù)在以前還曾證實，CD3/CD4抗體的混合物是降低而不是增高這種活性(P.M.Rosoff等人，同上)。進一步，通過雜合物增強的活性受到用可溶性CD4單克隆抗體預處理T細胞的抑制。
此外，CD3/CD4雜合物還表現(xiàn)出對于T細胞活化的新的功能活性，即在能與CD28反應的單克隆抗體的存在下，此雜合物能誘導CD4+T細胞的增殖，并且在低至100ng/ml的濃度下，也能完全與CD28刺激一起促進有絲分裂。單獨用CD3抗體或CD3/CD3或CD4/CD4同合物觀察不到這種對有絲分裂的共促作用。進一步發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的CD3/CD4雜合物與CD28單克隆抗體結(jié)合后，能夠顯著地驅(qū)動T細胞通過細胞周期，在刺激后的最初三天內(nèi)，使相當一部分的細胞進入第二周期。與此相反，單獨用CD3抗體或CD3/CD3或CD4/CD4同合物不能誘導顯著的細胞周期過渡。
另外還發(fā)現(xiàn)，CD3/CD4雜合物可對T細胞表面的CD3和CD4抗原進行調(diào)節(jié)，使得CD4的表面表達下降。此結(jié)果表明，雜合物的作用不是簡單地將T細胞受體固定于T細胞表面，而以前的研究表明，使用固定化的CD3抗體時情況正是如此(J.A.Ledbetter等人，J.Immunol.，同上)。
用CD3/CD4雜合物得到的結(jié)果證實，T細胞表面的CD4抗原在CD4+輔助T細胞通過CD3/Ti受體復合物和CD4抗原間的物理作用而活化T細胞時，對于信號轉(zhuǎn)導起著積極的陽性作用。
還不十分清楚CD3/CD4雜合物何以能夠增大信號轉(zhuǎn)導作用的分子機理。CD4與CD3/Ti相互作用的至少一個效應似乎是提高肌醇磷酸的產(chǎn)生，這提示CD4可能促進CD3/Ti誘導的對膜上磷酸肌醇的水解，從而導致肌醇三磷酸的產(chǎn)生。我們的實驗數(shù)據(jù)支持這一論點，實驗結(jié)果表明，使細胞與可溶性CD4單克隆抗體反應，能夠抑制CD3/CD4雜合物產(chǎn)生肌醇磷酸的活性。此抑制作用可能是抗體誘導CD4和CD3/Ti解離的結(jié)果，如果單獨的CD3/Ti作為信號轉(zhuǎn)導者效率較低的話。另一種可能是，CD4與其抗體的獨立作用可能傳遞一種抑制肌醇磷酸產(chǎn)生的陰性信號。
由于肌醇三磷酸(InsP3)的產(chǎn)生據(jù)信是介導了T細胞中胞質(zhì)鈣的動員，所以CD4與CD3/Ti的相互作用也似乎能促進從胞內(nèi)儲藏物中釋放鈣。在〔Ca2+〕的動員中，CD3/CD4雜合物與CD3抗體的劑量應答曲線的比較表明，如果CD4和CD3/Ti在鄰近同時受到刺激(即通過使用CD3/CD4雜合物)，則T細胞上的受體比單獨刺激CD3/Ti時少得多，受體間的相互作用也可產(chǎn)生可測出的〔Ca2+〕應答(見圖3)。因此，本發(fā)明CD3/CD4雜合物的性質(zhì)之一是能夠在低水平的受體條件下活化T細胞。
由于已知肌醇磷酸生成和鈣的動員都是與T細胞活化相關(guān)的信號，能導致T細胞增殖，因此，本文給出的數(shù)據(jù)清楚地證實，無論作用機理如何，本發(fā)明的CD3/CD4雜合物可用于增強T細胞的活化和增殖。
本發(fā)明還包括其他類似于CD3/CD4雜合物的雜合物，它們具有在T細胞活化中增強信號傳遞的能力。例如，本發(fā)明的CD3/CD2雜合物、CD3/CD6雜合物、CD3/CD7雜合物、CD3/CD8雜合物也都具有提高的鈣動員活性。另外，根據(jù)本發(fā)明，還構(gòu)建了好幾個含有CD5抗體的雜合物(如CD5/CD4雜合物、CD5/CD6雜合物和CD5/CD8雜合物)，它們在T細胞中也都具有提高的〔Ca2+〕動員活性。
在一個優(yōu)選方案中例舉了本發(fā)明的雜合物，它們摻入有能與CD45抗原或其同形體反應的抗體，并可用于抑制淋巴細胞的活化和功能，或增強T細胞的活化和功能，在該方案中，使一種能與CD3抗原反應的抗體與一種能與CD45抗原反應的抗體結(jié)合，以形成本發(fā)明新的CD3/CD45雜合物。用此雜合物處理T細胞，導致取消了CD3介導的T細胞活化作用(跨膜信號)，這是通過胞內(nèi)鈣動員的顯著降低表明的。
此外，利用單克隆使淋巴細胞的CD45受體與同一淋巴細胞上的另一CD受體交聯(lián)，完成了對T細胞表面各種CD受體間相互作用的誘導，例如CD3、CD2、CD5或CD28、以及CD45受體。此交聯(lián)作用導致消除了胞質(zhì)游離鈣濃度(〔Ca2+〕i)的上升，此上升是由于T細胞抗原共聚物的形成(通過細胞表面共同受體的交聯(lián)而誘導)而產(chǎn)生的。由固定化CD3單克隆抗體的刺激而啟動的T細胞增殖，受到固定于同樣表面(但在溶液中不會)的CD45抗體或CD45R抗體的抑制。與此相似，T細胞分別受到CD2和CD28抗體刺激CD2和CD28受體后的增殖作用，受到與CD2抗體或CD28抗體交聯(lián)的CD45抗體的抑制，但CD45抗體單獨與細胞表面結(jié)合時不會抑制。這些結(jié)果提示，由與CD45或其同形物CD45R反應的抗體及與T細胞的CD抗原反應的抗體組成的雜合物可用于對細胞進行調(diào)節(jié)。
與此相反，通過T細胞上的CD4受體同聚物形成而誘導的〔Ca2+〕i上升，如果利用單克隆抗體使CD4受體與CD45受體交聯(lián)，則會使此上升強烈增加。因此，由CD4抗體和能與T細胞上的CD45或同形物CD45R反應的抗體組成的新雜合物，也可用于增強所有CD4+細胞或由CD45同形物表達而限定的CD4細胞亞群落的T細胞功能。
本發(fā)明的雜合物可用于調(diào)節(jié)淋巴細胞，并因此可用于調(diào)節(jié)疾病狀態(tài)下的細胞免疫應答，例如傳染病、癌癥、艾茲病和自身免疫疾病。這些雜合物尤其適用于調(diào)節(jié)T細胞缺陷或紊亂狀況下的細胞免疫應答。
例如，已經(jīng)證實在某些自身免疫疾病中CD45同形體的表達不正常(Rose等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA827389-7393，1985)。因此，本發(fā)明中含有至少一種與CD45受體或其同形物反應的分子的雜合物，可用于調(diào)節(jié)自身免疫疾病中的淋巴細胞功能。
此外，本發(fā)明的雜合物可用于增強獲得性免疫缺損綜合癥(艾茲病)患者的免疫應答性。已經(jīng)知道，CD4抗原是作為引起艾茲病的人免疫缺損病毒(HIV)的受體起作用的。在病毒對T細胞感染的過程中，相信CD4即是HIV的gp120被膜糖蛋白結(jié)合的受體(L.A.Lasky等人，Cell50975，1987;M.Kowalski等人，Science2371351，1987)。在HIV感染以后，細胞表面的CD4表達被降低，CD4mRNA的含量減少(J.A.Hoxie等人，“HIV感染細胞中T4(CD4)蛋白及mRNA合成的變化”，Science2341123-1127，1986)。這一點也是十分清楚的，即艾茲病患者對可溶性抗原的免疫應答性降低(H.C.Lane等人，“艾茲病患者免疫功能的定量分析”，NewEng.J.Med.31379-84，1985)。體外研究已經(jīng)證實，純化的HIVgp120能夠抑制T細胞對促有絲分裂刺激的應答，此結(jié)果類似于我們用可溶性CD4單克隆抗體所見到的效應(D.L.Mann等人，J.Immunol.1382640-2644，1987，“HTLV-Ⅲ大被膜蛋白(gp120)抑制PHA誘導的淋巴細胞芽生”)。
因此可以認為，艾茲病患者的免疫抑制狀況可能涉及HIV感染對CD4抗原表達的效應，即HIV感染后T細胞上的CD4被降低，這可能通過降低細胞的信號傳遞能力而影響免疫應答性，從而導致T細胞對抗原應答的活化作用降低。我們提到的結(jié)果支持這一模式，我們發(fā)現(xiàn)，CD3刺激的游離鈣濃度的上升在HIV感染細胞中受到影響(G.P.Linette等人，“HIV-1感染的T細胞表現(xiàn)出通過CD3/抗原受體途徑的選擇性跨膜信號傳遞缺陷”，Science241573-576，1988)。這些觀察提示，本發(fā)明的雜合物，尤其是CD3/CD4雜合物，可用于研究或治療由HIV感染導致的T細胞功能缺損。
本發(fā)明還包括在離體或活體條件下，用本文公開的雜合物處理淋巴細胞的方法，以調(diào)節(jié)病理狀態(tài)下的細胞免疫應答。
根據(jù)本發(fā)明的一個具體方案，雜合物能用于T細胞的離體活化中。此活饔每賞ü估醋曰頰叩腡淋巴細胞與至少一種本發(fā)明的雜合物接觸而進行，從而使T細胞被活化，然后再重新輸入原來的供體中(S.A.Rosenberg等人，“通過系統(tǒng)施用類淋巴細胞及白介素2對癌癥進行免疫治療”，J.Biol.Resp.Modif.35501-5511，1984)。此治療法還可包括使T細胞與其他免疫調(diào)節(jié)劑進行離體的共保溫或先保溫。
根據(jù)可供選擇的具體方案，雜合物可用來在活體中活化T細胞，即將雜合物注射給患者，也可以與其他試劑結(jié)合注射，例如白介素2(IL-2)、生長因子或刺激性抗體如CD5(E.A.Clark等人，“刺激性抗體對免疫應答的擴增”，Immunology Today 7267-270，1986)和CD28(見下面的實例1)。不論用何種治療方法，都可使用含有抗體片段(如Fab或F(ab′)2)、嵌合抗體或雙特異性抗體的雜合物。
本發(fā)明的雜合物還能利用常規(guī)方式進行活體施用，這些方式包括但不限于，靜脈內(nèi)、口服、皮下、腹腔內(nèi)或淋巴內(nèi)施用。優(yōu)選靜脈內(nèi)施用。
本發(fā)明含有雜合物的藥物組合物可以有多種劑量形式，它們包括但不限于，固體、半固體和液體劑量形式，例如片劑、丸劑、粉劑、溶液或懸浮液、栓劑、聚合物微膠囊或微載體、脂質(zhì)體，以及可注射或可輸注的溶液。優(yōu)選形式根據(jù)施用方式和治療應用而定。
含有雜合物的組合物中可包含本領(lǐng)域內(nèi)公知的常規(guī)的藥物上可接受的載體，例如血清蛋白如人血清清蛋白，緩沖物質(zhì)如磷酸鹽、水或鹽或電解質(zhì)。
對于本發(fā)明的含有雜合物的組合物來說，最有效的施用方式和劑量根據(jù)疾病的程度和階段、患者的健康狀況及對治療的反應和主治醫(yī)生的判斷而定。因此，對于個別病人來說，雜合物的劑量應當?shù)味āＨ欢?，本發(fā)明雜合物的有效劑量范圍可以是從大約1至大約100mg/m2。對于T細胞的離體處理來說，可以使用從大約200μg-2mg雜合物/109細胞的劑量。
此外，本發(fā)明的雜合物可用于涉及T細胞缺損或紊亂的患者中，以對給定T細胞表面抗原(如CD抗原)的受體功能進行診斷測定。利用本文給出的測量信號轉(zhuǎn)導(見實例1)的鈣檢測法和合適的對照，通過使用本發(fā)明的特異雜合物，能夠通過比較正常人和患者供體T細胞的活化作用，而測定CD功能的缺損。例如，本發(fā)明的CD3/CD4雜合物提高〔Ca2+〕i的動員，所用蛋白濃度卻低于單獨用可溶性CD3抗體觀察到的。因此，在這些低劑量下，實際上是在測量CD4受體的功能?？扇苄訡D4抗體在這些劑量下阻斷CD3/CD4雜合物的活性的能力即反映了這一點(見圖2)。與此相似，以低劑量使用CD3/CD8雜合物，能夠測量CD8受體的功能。因此在這些劑量下，雜合物能用來在各種病理狀態(tài)下(例如癌癥和自身免疫疾病)檢測特異CD受體功能的缺損。另一可選擇的方法是，可用本發(fā)明的任何雜合物以任何劑量進行鈣檢測法，只要同時進行合適的信號抗體對照檢測就行，也就是說，必須使雜合物的活性與組成該雜合物的未結(jié)合抗體的活性進行比較(E.L.Reinherz等人的歐洲專利申請221，768號，1987年5月13日出版)。
為了使本文描述的發(fā)明得到更完整的理解，給出下述實例。應當理解，這些實例的唯一目的是進行解釋，而不是為了用它們以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實例1下述實例描述了本發(fā)明新的雜合物的制備和特征。根據(jù)本方案，使一種與CD3反應的抗體與一種與CD4反應的抗體相交聯(lián)，以形成新的CD3/CD4雜合物，它在用此雜合物處理的CD4+(即輔助)T細胞的活化過程中，增強跨膜的信號傳遞。
本發(fā)明CD3/CD4雜合物的制備用以形成本方案雜合物的CD3和CD4抗體分別是G19-4(Balb/c，IgG1)和G17-2(Balb/c，IgG1)。這些抗體根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)制備(J.A.Ledbetter和E.Clark，“扁桃體生發(fā)中心和套區(qū)B細胞亞類的表面表型及功能”，HumanImmunology1530-43，1986;J.A.Ledbetter等人，“一種具有CD4抗原特異性的免疫球蛋白輕鏈二聚體”，MolecularImmunology241255-1261，1987)。此外，從商業(yè)途徑可得可用于構(gòu)建本方案雜合物的其他CD3和CD4單克隆抗體(例如，T3，CoulterCo.，F(xiàn)L和Leu-3，BectonDickinson，CA)。G19-4和G17-2抗體從腹水中通過鹽沉淀和DEAE層析純化，然后透析，使用前通過0.45μ濾器過濾。
兩種單克隆抗體以1∶1的摩爾比例用雜雙功能交聯(lián)劑GMBS(Calbiochem，LaJolla，CA)和5-亞氨基硫烷(5-iminothiolane)鹽酸(PierceChemicalCo.，Rockford，IL)結(jié)合，所用方法如R.R.Hardy(同上)為了藻紅素偶聯(lián)所述。產(chǎn)生的雜合物通過Superose6(pharmacia，Uppsala，Sweden)FPLC大小排阻層析從游離抗體中分離出來，并測定它與CD3和CD4的反應性，即測定它阻斷熒光素結(jié)合的CD3和CD4單克隆抗體的結(jié)合的能力。這種CD3/CD4雜合物命名為G19-4/G17-2。本發(fā)明的CD3/CD4雜合物對鈣動員的增強然后測定G19-4/G17-2雜合物增強細胞中胞質(zhì)鈣動員的能力，并與單獨用G19-4(CD3抗體)的活性比較。所用細胞是人外周血淋巴細胞，通過在Ficoll-Hypaque上離心從外周血中純化，然后使其粘附于塑料上以除去大部分單核細胞。
根據(jù)以前由P.S.Rabinovitch等人所述的方法(“用PHA或CD3抗體促有絲分裂后T細胞之間的胞內(nèi)游離鈣應答的不均一性。同時應用Indo-1和用流式細胞光度術(shù)法的免疫熒光”，J.Immunol.137952-961，1986;此文作為本申請的參考文獻)，利用indo-1(Molecular Probes，Eugene，OR)和50HH/2150型流式細胞光度儀(Ortho Diagnostic Systems，Inc.，Westwood，MA)測量細胞中的〔Ca2+〕i上升。簡單地說，首先使細胞(5×107/ml)裝上indo-1，即使細胞與其能透過細胞膜的乙酰氧基甲基酯(Molecular Probes，Junction City，OR)保溫，它在細胞內(nèi)被水解成不能透膜的形式。保溫于37℃進行45分鐘，所用基質(zhì)中含有所標明的indo-1濃度。然后洗滌細胞，再以2.5×106/ml懸浮于新鮮基質(zhì)中，分析前于室溫下保存在暗中。對于每一個檢測，用基質(zhì)將裝有indo-1的細胞稀釋至1×106/ml，并在37℃下平衡。根據(jù)Rabinovitch所述(同上)，利用熒光分光光度法和流式細胞光度術(shù)進行測量。通過計算indo-1紫/藍熒光比例對時間的均值而分析柱形圖。此外，還分析應答細胞對時間的百分比，即首先確定indo-1比例的數(shù)值，此數(shù)值兩倍于對照細胞比例的標準誤差，然后用此閾值之上的細胞百分比對時間作圖。在所有的流式細胞光度術(shù)數(shù)據(jù)中，在X(時間)軸上有100個數(shù)據(jù)點。
如圖1所示，提高Ca2+濃度(〔Ca2+〕i)所需的G19-4/G17-2的濃度，比單用G19-4所需的濃度低1.5-2個數(shù)量級。進一步，G19-4/G17-2雜合物的活性限制于CD4+T細胞，因為通過免疫熒光對CD4+細胞的富集導致相應的〔Ca2+〕i活性和應答細胞百分比的上升。這樣，正如圖2所證實，如果用G19-4/G17-2雜合物刺激外周血淋巴細胞，細胞的〔Ca2+〕i平均最高應答大約為1300nM，應答細胞大約有60%。然而，如果只分析CD4+細胞亞類，則〔Ca2+〕i平均最高應答大于10，000nM，應答細胞多于95%。進一步，如果在-5分鐘時用5μg/mlG17-2(CD4抗體)對細胞進行預處理，然后用0.4μg/ml雜合物處理，則雜合物對于CD4+細胞的活性幾乎被完全抑制。
如圖2中的插圖所示，通過CD8陰性、CD11陰性、CD16陰性和CD20陰性細胞的選通作用對CD4+細胞進行分析。對CD4+細胞的這種陰性選擇通過用下列物質(zhì)對外周血淋巴細胞染色進行即藻紅素(PE)結(jié)合的ZH7，一種能與CD20反應的單克隆抗體(E.A.Clark等人，“BP35細胞表面多肽在人B細胞活化中的作用”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 821766-1770，1985)、FC-2，一種針對CD16的單克隆抗體(C.Anasetti等人，“通過綿羊紅細胞結(jié)合蛋白(CD2)和Fc-受體(CD16)的交聯(lián)誘導天然殺傷細胞的鈣流量和溶胞活性的增強”，J.Immunol.1391772-1779，1987)、G10-1，一種針對CD8的單克隆抗體(J.A.Ledbetter等人，“人胸腺類白血病抗原和CD8分子間的共價結(jié)合”，J.Immunol.1344250-4254，1985)、60.1，一種能與CD11反應的單克隆抗體(J.P.Bunyon等人，“LFA族α和β鏈上的決定簇在中性白細胞聚集(如討論會所定義的單克隆抗體)中的不同參與”，《白細胞分類Ⅲ》，同前，844-47頁)，并通過未染色細胞選通，該細胞的CD4陽性大于95%。
在5mMEGTA〔乙二醇雙乙胺醚-N，N′四乙酸〕存在下，還對G19-4和G19-4和G17-2雜合物進行冉系味?，EGTA能螯合并因此除去胞外鈣，以觀察受到雜合物影響的是否是來自胞質(zhì)的鈣動員。圖3表明，在EGTA的存在下，G19-4/G17-2雜合物動員鈣的能力上升了大約兩個數(shù)量級。在胞外鈣的存在下，終點滴定表明其活性大約也上升了兩個數(shù)量級(數(shù)據(jù)未出示)。
為了排除負責CD3/CD4雜合物的〔Ca2+〕i效應的的CD3或CD4抗原結(jié)合效價，我們構(gòu)建了CD3/CD3和CD4/CD4同合物與CD3/CD4雜合物比較。同合物根據(jù)上述CD3/CD4雜合物的方法構(gòu)建，并分別命名為G19-4/G19-4和G17-2/G17-2。如下面的表1所示，CD3/CD3同合物或CD3/CD3與CD4/CD4同合物的混合物都不具有類似于CD3/CD4雜合物的〔Ca2+〕i增加效應。此結(jié)果提示，CD3/CD4雜合物的增強活性并不是雜合物的效價功能所致，因此，它有可能是從CD3和CD4分子的物理接近而導致的，這些抗原和雜合物相互作用時便會發(fā)生這種接近。進一步，在利用間接染色和流式細胞光度術(shù)進行的結(jié)合檢測中，雜合物和同合物的活性略低于游離抗體(數(shù)據(jù)未出示)。因此，CD3/CD4雜合物的獨特活性不大可能是由對于雜合物的第二特異性貢獻的CD3結(jié)合親和性的效應所致。
〔Ca2+〕i應答的檢測如上所述，利用裝有indo-1的外周血淋巴細胞，并用PE結(jié)合的抗CD20、抗CD8和抗CD16抗體染色。對未染色的細胞進行分析，其中包括大于95%的CD4+細胞。在刺激后的最初五分鐘內(nèi)即發(fā)生峰均值應答。
表1CD4+T細胞對于CD3/CD4雜合物及對CD3/CD3和CD4/CD4同合物的〔Ca2+〕應答刺激濃度峰均值基值上的升高ug/ml [Ca2+]i(nM)無-1301.0CD3/CD4雜合物1015，600120210，900830.44，140320.088106.2CD3/CD3同合物502，36018105594.323012.3CD4/CD4同合物1001301.0501301.0CD3/CD3同合物25+255904.5+5+52722.1CD4/CD4同合物1+12511.93本發(fā)明的CD3/CD4雜合物的肌醇磷酸合成效應因為T細胞中胞質(zhì)鈣的動員被認為是由肌醇三磷酸(InsP3)的產(chǎn)生介導的，我們用單獨的CD3單克隆抗體或CD3/CD4雜合物刺激純化的CD4+T細胞后，測量肌醇磷酸的上升。
根據(jù)C.H.June等人所述的方法(“涉及CD28途徑的T細胞增殖與具環(huán)孢素抗性陌捉樗 基因表達相聯(lián)系”，Mol，Cell Biol.74472-4481，1987)純化CD4+T細胞。簡而言之，通過實驗室工作人員的白細胞分離(leukophoresis)而得到外周血淋巴細胞，然后通過Ficoll/Hypaque密度梯度離心。然后，用磁性小球的免疫吸附作用通過陰性選擇分離T細胞中的CD4+亞類，在這之前首先用飽和量的合適的單克隆抗體包裹CD8+、CD11+、CD16+、CD14+和CD20+細胞(大部分抗體都已在前面提及，只是除了CD14單克隆抗體20.3以外，它是通過M.Kamoun等人的方法制備的“由單克隆抗體鑒別的人單核細胞-巨噬細胞分化抗原”，Clin.Immunology and Immunopathology 29181-195，1983)。此戰(zhàn)略利用了外周血液中休止T淋巴細胞上CD4和CD8表面抗原的相互不重迭分布這一性質(zhì)。細胞洗滌3次以除去未結(jié)合的抗體，然后與山羊抗小鼠免疫球蛋白包裹的磁性顆粒(Advanced Magnetics Institute，Cambridge，MA)保溫，通過磁性分離除去小球包裹的細胞。一般說來，回收到大約500×106 CD4+T細胞，通過流式細胞光度術(shù)測定其中有多于98%的CD4+，通過非特異性酯酶染色測定含有少于0.1%的單核細胞。
然后使純化的CD4+T細胞再以2-4×106細胞/ml懸浮于RPMI 1640中，其中補充有10%熱失活的小牛血清(“基質(zhì)”)，此血清中補充有4μg/ml PHA和40μCi/ml2〔3H〕-肌醇(37MBq/ml;Amersham Corp.，Arlington Heights，IL)，于37℃下在含有5%CO2的空氣中保溫。72小時后，細胞洗滌3次，并以5×106細胞/ml再懸浮于補充有10mM LiCl的“基質(zhì)”中。保溫20分鐘后，在0時加入最終濃度為1μg/ml的G19-4或G19-4/G17-2雜合物。然后，在不同的時間點，取出5×106細胞的樣品，在Eppendorf 5414離心機中沉淀10秒鐘。吸出基質(zhì)以后，向細胞沉淀加入1ml冰冷的10%TCA(W/V)。通過900×g離心5分鐘除去不溶物，然后用6倍體積的二乙醚萃取上清液，然后使之中和。利用甲酸鹽形式的Dowex1-×8離子交換層析(100-200目)(Bio-Rad，Richmond，CA)分離〔3H〕-肌醇磷酸，在Bio-Safe 2(Research Products，Int.Mt.Prospect，IL)中通過液閃分光光度法進行定量。這種測量氚化肌醇磷酸的方法J.B.Imboden等人已有過記載(“T細胞抗原受體的跨膜信號傳遞”，同上;J.B.Imboden等人，“人T細胞克隆的抗原識別導致肌醇三磷酸的上升”，同上)。
如圖4所證實，濃度為1μg/ml時，雜合物刺激肌醇磷酸1、2和3形成的顯著上升，而單獨的G19-4只導致肌醇磷酸1的少量上升。還給出了實驗開始(t＝0)和結(jié)束(t＝10分鐘)時，未刺激細胞中的氚化肌醇磷酸水平。
在另外的實驗中(描繪于圖5中)我們觀察到，游離的針對CD4的單克隆抗體G17-2抑制由雜合物導致的肌醇磷酸應答。G17-2不抑制對于游離的CD3單克隆抗體G19-4的肌醇磷酸應答。根據(jù)這些實驗，使CD4+T細胞在含有〔3H〕-肌醇(40μCi/ml)和PHA(4μg/ml)的基質(zhì)中保溫72小時，充分洗滌，然后再懸浮于加有10mM LiCl的基質(zhì)中，于37℃保溫20分鐘。然后向選擇的樣品中加入G17-2(如J.W.Goding所述與生物素結(jié)合《單克隆抗體的原理及實踐》230頁，Academic Press，1983)。5分鐘后，如標明的那樣加入G19-4、G17-2、G19-4/G17-2雜合物和抗生物素蛋白，保溫過程再繼續(xù)10分鐘。細胞樣品(107細胞/樣品)在10%TCA中溶解后，萃取〔3H〕-肌醇磷酸，如上述通過離子交換層析分離并進行定量。圖5中描繪了兩個獨立的實驗。圖中顯示了3份細胞樣品均值的+/-幅度(標準誤差)，并給出了以μg/ml單克隆抗體表示的最終濃度。
因此，這些實驗數(shù)據(jù)不僅證實了本發(fā)明雜合物對肌醇磷酸生成的增強效應，還證實了針對CD4的可溶性抗體抑制此T細胞應答。這些結(jié)果因此提出，CD4抗原在刺激T細胞應答中起著重要作用。CD3/CD4雜合物在T細胞活化中的新活性已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的CD3/CD4雜合物在T細胞活化中具有新的功能活性，利用CD3/CD3和CD4/CD4同合物作為對照的增殖檢測證實了這一點。在這些檢測中，CD4+T細胞以4份重復的樣品培養(yǎng)在平底96孔微量滴定板中，每孔5×104細胞，所用基質(zhì)為含有5%熱失活的小牛血清(Hyclone，Logan，UT)的RPMI 1640。CD4+細胞與G19-4(抗CD3)、G19-4/G19-4(CD3/CD3同合物)、G19-4/G17-2(CD3/CD4雜合物)或G17-2/G17-2(CD4/CD4同合物)一起培養(yǎng)3天，有或沒有PMA(1μg/ml)或單克隆抗體9.3，一種能與T細胞表面CD28抗原反應的抗體〔(Balb/c×C57BL/6)FI，IgG2a〕(J.A.Hansen等人，“鑒別一種新的T細胞抗原和人淋巴細胞Ia抗原的單克隆抗體”，Immunogenetics 10247-52，1980)。所有抗體和結(jié)合物都以1μg/ml使用。在第3天用液閃計數(shù)器測定胸苷的摻入(平均cpm±標準誤差)，在這之前，在3天培養(yǎng)的最后8小時用1μCi/孔的3H-胸苷(New England Nuclear Corp.，Boston，MA)刺激細胞。
如圖6所示，純化的CD4+T細胞單獨與抗CD3試劑或單獨與PMA培養(yǎng)時，沒有觀察到增殖。在PMA的存在下，所有含有針對CD3的單克隆抗體的抗體制劑都誘導出水平相當?shù)摹?H〕-胸苷摻入，而CD4同合物不具有促有絲分裂的作用。然而，測定各種試劑與針對CD28的單克隆抗體9.3的協(xié)同作用時觀察到有顯著差別。只有CD3/CD4雜合物誘導出對于CD28抗體的應答性。以前的研究已經(jīng)證明，雖然針對CD28的單克隆抗體使95%以上的T細胞在PMA存在下通過細胞周期，但CD28刺激對于純化的T細胞并沒有促有絲分裂的作用(C.H.June等人，Mol.Cell.Biol.，同上)。本發(fā)明所發(fā)現(xiàn)的純化T細胞的CD28刺激與液相CD3抗體不具有共促有絲分裂的作用證實了以前的研究結(jié)果(A.Weiss等人，“在人T細胞活化中T3/抗原受體復合物和Tp44之間的協(xié)同作用”，J.Immunol.137819-825，1986)。
為了測定CD3/CD4雜合物和CD3/CD3同合物之間對于CD28刺激的差別究竟是定性的還是定量的，使CD4+T細胞與G19-4、G19-4/G17-2雜合物或G19-4/G19-4同合物以各種濃度一起保溫，并加以PMA(1μg/ml)或抗CD28的單克隆抗體9.3(1μg/ml)。如圖7所示，發(fā)現(xiàn)G19-4/G17-2雜合物即使在低至100μg/ml的濃度也與CD28刺激有完全的共促有絲分裂的作用，而CD3/CD3同合物在10μg/ml也沒有促有絲分裂的作用。與此相反，細胞對PMA和CD3刺激的共促有絲分裂應答在所有測試的濃度都與CD3抗體結(jié)合物相似。進一步，動力學實驗揭示，CD3/CD3同合物與CD3/CD4雜合物對于CD28刺激的差別并不是由于增殖的時間進程的漂移(數(shù)據(jù)未出示)。
因此，在增殖方面對可溶性CD3抗體似乎沒有應答的CD4+T細胞，確實在針對CD28抗體的存在下通過增殖對本發(fā)明的CD3/CD4雜合物具有應答。
為了進一步檢查CD3/CD4雜合物對T細胞增殖的效應，通過某種技術(shù)測定細胞周期的動力學，該技術(shù)能夠區(qū)別受到刺激后的3個連續(xù)細胞周期中每一周期的細胞。用PE結(jié)合的CD 8、CD16和CD20抗體(參見前面)使細胞染色后，在Cytofluorograph 50HH型細胞分類儀(Ortho Diagnostic Systems，Inc.，Westwood，MA)上通過流式細胞光度術(shù)對CD4+T細胞分類。分選出陰性細胞，對分選的群落進行再分析發(fā)現(xiàn)它們有97%是CD4陽性。除了免疫熒光參數(shù)外，還測定進向分散和直角分散數(shù)據(jù)，并用于進行淋巴細胞群落的選通及排除單核細胞、碎片和死細胞。以2000細胞/秒的流速于20℃下對細胞進行分選。
分選的細胞以5×104細胞/孔和4份重復培養(yǎng)在圓底96孔微量滴板(Nunc，Kampstrip，Denmark)中。在培養(yǎng)物中加入5μg/ml的G19-4/G17-2雜合物或CD3或CD4的同合物，或加入10μg/ml的PHA。使細胞在補充有10FBS的RPMI 1640中生長，其中還存在有0.6μg/mlCD28單克隆抗體9.3，1.5×10-4M BrdU，100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素，以及5×10-5M2-巰基乙醇。37℃下(5%CO2)保溫3天后，從孔中輕輕吸出培養(yǎng)基，并置換以0.2ml染色液，其中含有0.1M Tris pH7.4，0.9%NaCl，1mM CaCl2，1.0mM MgCl2，0.2%BSA，0.1%NP40和1μg/ml Hoechst 33258(Sigma)以及5μg/ml溴化乙錠EB(Calbiochem)。細胞于4℃保溫30分鐘，再懸浮，根據(jù)以前P.S.Rabinovitch所述的方法(“牛內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的異常穩(wěn)定的纖維蛋白溶解抑制劑的檢測”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 802956-60，1983)，在連接有PDP11/03計算機(Digital Equipment，Maynard，MA)的ICP-22(Ortho Diagnostic Systems，Inc.)上進行流式細胞光度術(shù)。使用紫外光激發(fā)(UG1濾鏡)，用Hoechst 33258在425-500nm處檢測，在600nm以上檢測熒光。分析大約3-4×103細胞的熒光，并作出Hoechst對EB熒光的二元變量柱圖。根據(jù)P.S.Rabinovitch所報道的方法(同上)，通過分析和曲線配合確定單個細胞周期的分隔大小。
圖8出示了通過第一、第二或第三細胞周期的細胞百分比。正如此圖所證實，只有CD3/CD4雜合物能夠顯著驅(qū)動細胞通過細胞周期，因為用此雜合物刺激3天后，45%的細胞進入了S期或更后，39%的細胞進入了第二增殖周期。因此，在對于CD3/CD4雜合物及CD28抗體刺激的應答中，純化CD4+細胞對3H-胸苷的摻入(如圖6和圖7所示)代表了明顯的增殖應答，并繼續(xù)進入第二和第三代中。與此相反，其他抗體制劑沒有一種能夠誘導顯著的細胞周期轉(zhuǎn)移(見圖8)。圖8還表明，與PHA加CD28抗體的對照相比較，CD3/CD4雜合物的刺激使45%的細胞作出應答，而對照中有70%的分選細胞在培養(yǎng)3天后進入S期。這表明用CD3/CD4雜合物刺激后，有大量的CD4+細胞繼續(xù)其細胞周期。
CD3/CD4雜合物共同調(diào)節(jié)CD3和CD4T細胞抗原測量CD3/CD4雜合物、CD3或CD4同合物或單獨的CD4或CD3抗體對T細胞表面CD3和CD4抗原的調(diào)節(jié)作用，即在有10μg/ml抗體或抗體結(jié)合物的存在下于37℃保溫18小時后，測定CD4+T細胞表面的抗體或抗體結(jié)合物密度，使用具有抗小鼠Ig第二步的免疫熒光，在FACS Ⅳ型流式細胞光度儀上測量。結(jié)果示于下面的表2中，其中，密度表達為在線性標度上測定的超過背景的平均熒光強度的單位。
表2結(jié)合物的調(diào)節(jié)作用調(diào)節(jié)前的調(diào)節(jié)后的特異性表面密度表面密度調(diào)節(jié)百分比CD41504868CD4/CD4同合物2267567CD31779.095CD3/CD3同合物3401099CD3/CD4雜合物3691995如表中所指出，與針對CD3或CD3/CD3同合物的抗體保溫過夜后產(chǎn)生的CD3表面表達幾乎測不出，而與CD4或CD4/CD4同合物抗體作類似保溫后，仍然保留有大量的表面CD4。然而，CD3/CD4雜合物導致CD3和CD4二者的調(diào)節(jié)作用，并似乎降低CD4的表面表達。這些檢測中使用的所有抗體和結(jié)合物都是過量的，因為利用CD3或CD4單克隆抗體的直接熒光結(jié)合物時，在調(diào)節(jié)后檢測不到細胞表面有游離的CD3或CD4抗原(即未被抗體結(jié)合)(數(shù)據(jù)未示出)。因此，本發(fā)明的CD3/CD4雜合物調(diào)節(jié)T細胞表面的CD3和CD4抗原，這表明雜合物不是象以前認為的與固定化的CD3抗體一樣(J.A.Ledbetter等人，J.Immunol.，同上)，只是簡單地將T細胞受體固定在細胞表面。進一步，用可溶性CD3抗體作的研究表明，如果CD3在細胞表面受到調(diào)節(jié)，則CD3/Ti受體被內(nèi)化(O.W.Press等人，“針對人T細胞的蓖麻蛋白A鏈免疫毒素的評價”，CellularImmunol.10210-20，1986;O.W.Press等人，“正常和惡性T淋巴細胞對鼠抗人CD3單克隆抗體的內(nèi)吞和降解”，CancerResearch482249-2257，1988)，這導致T細胞活化的抑制。本發(fā)明的雜合物也導致受體的內(nèi)化，但T細胞活化仍被增強。
如本實例所證實，本發(fā)明的CD3/CD4雜合物在CD4+T細胞的活化中增高Ca2+動員和肌醇磷酸的產(chǎn)生。此外，在針對CD28的抗體存在下，雜合物還具有CD4+T細胞增殖中的新功能活性，從而在刺激后的最初3天內(nèi)，驅(qū)動大量的細胞進入第二細胞周期。進一步，雜合物對于它與之反應的抗原似乎有共調(diào)節(jié)作用，因此支持了這一假設，它在T細胞活化中使這些抗原密切接近。
實例2本實例描述本發(fā)明其他雜合物的構(gòu)建和特征，它們包括相互交聯(lián)的能與CD3抗原反應的抗體和能與CDT細胞抗原反應的其他抗體中的任一種。
如實例1所述構(gòu)建的抗體雜合物有a)CD3/CD2雜合物，包含單克隆抗體G19-4(抗CD3)(參考前面)和9.6(抗CD2)(P.J.Martin等人，“人T細胞表面蛋白Tp50上的兩種不同抗原決定基的鑒別和功能特征”，J.Immunol.131180，1983);b)CD3/CD5雜合物，含有單克隆抗體G19-4和10.2(抗CD5)(P.J.Martin等人，“一種新的人T細胞分化抗原慢性淋巴白血病細胞上的意外表達”，Immunogenetics11429，1980;P.J.Martin等人，“識別正常人T淋巴細胞和惡性B淋巴細胞的單克隆抗體的比較研究”，J.Immunol.121920，1981);c)CD3/CD6雜合物，含有單克隆抗體G19-4和G3-6(抗CD6)，G3-6是IgG1同型的CD6單克隆抗體，用T白血病細胞系HSB2免疫Balb/c小鼠而產(chǎn)生。雜交瘤通過使小鼠脾細胞與NSI骨髓瘤系融合產(chǎn)生，通過與正常T細胞的結(jié)合和與CD6參考抗體12.1的交聯(lián)篩選(P.J.Martin等人，J.Immunol，127，同上);d)CD3/CD7雜合物，含有單克隆抗體G19-4和G3-7(抗CD7)。G3-7是IgG1同型的CD7單克隆抗體，通過用T白血病細胞系HSB2免疫Balb/c小鼠生成。雜交瘤通過使小鼠脾細胞與NSI骨髓瘤系融合產(chǎn)生，并通過與正常T細胞的結(jié)合和與CD7參考抗體3A1的交聯(lián)進行篩選，它可從美國典型培養(yǎng)物收集中心得到。此外，CD7單克隆抗體還可由商業(yè)上得到(BectonDickinson，Mountainview，CA)(E.L.Reinherz等人編《白細胞分類Ⅱ》第1卷3-30頁，1986);e)CD3/CD8雜合物，含有單克隆抗體G19-4和G10-1(抗CD8)(參考前面);f)CD3/CD28雜合物，含有單克隆抗體G19-4和9.3(參見前面)。
如實例1所述，測定這些雜合物提高T細胞中胞質(zhì)Ca2+動員的能力。每種雜合物以1μg/ml測試，在此濃度下單用CD3抗體的活性低于最佳值，但可檢測到結(jié)合物的增強活性。用雜合物刺激細胞后的最初5分鐘內(nèi)，裝有indo-1的外周血淋巴細胞發(fā)生〔Ca2+〕i的峰應答。未刺激的細胞具有130nM的〔Ca2+〕i。在使用CD3/CD4和CD3/CD8雜合物的實驗中，分別對CD4+和CD8+T細胞亞類測量結(jié)合物的活性。下面的表3給出了這些雜合物在鈣動員中的活性。
表3抗CD3雜合物在鈣動員中的活性結(jié)合物峰[Ca2+](nM)CD3/CD3(G19-4/G19-4)186CD3/CD2(G19-4/9.6)2722CD3/CD4(G19-4/G17-2)3349CD3/CD5(G19-4/10.2)155CD3/CD6(G19-4/G3-6)836CD3/CD7(G19-4/G3-7)276CD3/CD8(G19-4/G10-1)2690CD3/CD28(G19-4/9.3)204如表3所指出，CD3/CD2、CD3/CD6、CD3/CD7和CD3/CD8雜合物(以及CD3/CD4雜合物)與未刺激或CD3/CD3刺激的細胞的活性相比較，在用這些雜合物處理的T細胞內(nèi)鈣動員顯著上升。相信這些雜合物與實例1所述的CD3/CD4雜合物一樣，通過使它們與之反應的不同抗原密切接近而起作用，導致增強的跨膜信號傳遞及T細胞活化。
實例3本實例描述本發(fā)明其他雜合物的構(gòu)建和特征，它們含有相互交聯(lián)的能與CD5T細胞表面抗原反應的抗體和其他CDT細胞抗原中的任何一種。
如實例1構(gòu)建的這些抗體雜合物包括下列a)CD5/CD2雜合物，含有單克隆抗體10.2和9.6;b)CD5/CD28雜合物，含有單克隆抗體10.2和9.3;c)CD5/CD4雜合物，含有單克隆抗體10.2和G17-2;d)CD5/CD6雜合物，含有單克隆抗體10.2和G3-6;e)CD5/CD7雜合物，含有單克隆抗體10.2和G3-7，以及f)CD5/CD8雜合物，含有單克隆抗體10.2和G10-1。本具體方案中用來構(gòu)建雜合物的所有單克隆抗體都已在前面論及。
這些雜合物也如實例1一樣舛ㄋ竊赥細胞中增加胞質(zhì)Ca2+動員的能力。這些實驗的結(jié)果示于下面的表4中。表中指出了這些實驗中所用每種雜合物的濃度。在刺激后的最初10分鐘內(nèi)，裝有indo-1的外周血淋巴細胞發(fā)生〔Ca2+〕i的峰應答。未刺激細胞的〔Ca2+〕i為130nM。如表中所示，CD5/CD5同合物表現(xiàn)出的〔Ca2+〕i為180nM。CD5/CD4和CD5/CD8雜合物分別在CD4+和CD8+T細胞亞類上進行測試。
表4抗CD5雜合物在鈣動員中的活性結(jié)合物峰[Ca2+]i(nM)CD5/CD5(10.2/10.2，20μg/ml)180CD5/CD2(10.2/9.6，20μg/ml)204CD5/CD28(10.2/9.3，10μg/ml)196CD5/CD4(10.2/G17-2，2μg/ml)640CD5/CD6(10.2/G3-6，2μg/ml)421CD5/CD7(10.2/G3-7，15μg/ml)178CD5/CD8(10.2/GIO-1，2μg/ml)546如表4所示，與未刺激或CD5/CD5刺激的細胞相比較，CD5/CD4、CD5/CD6和CD5/CD8雜合物在鈣動員中表現(xiàn)出顯著上升。相信這些雜合物與本文所述的其他雜合物一樣，可用于增強T細胞的活化。
實例4在本實例中，T細胞表面的CD3和CD45抗原與能與CD3和CD45抗原反應的抗體組成的雜合物之間由單克隆抗體誘導的相互作用被用來研究這些過程對于T細胞活化的效應。
細胞制備如前述(Clark等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA821766-1770，1985;Clark等人，Hum.Immunol.16100-113，1986;兩篇都作為本文的參考文獻)制備外周血單核細胞和由外周血中制備不附著于尼龍棉的淋巴細胞。簡而言之，如下述通過尼龍棉分離得到不附著于尼龍棉的淋巴細胞尼龍柱中(在Oncogen，Seattle，WA制備)裝上含有5%小牛血清的RPMI基質(zhì)，于37℃預保溫45分鐘后使用。將細胞上到柱中，使其流入柱中，然后于37℃保溫45分鐘。利用熱基質(zhì)從柱中收集6ml，以1200rpm離心8分鐘兩次，然后再懸浮于增殖緩沖液中(15%人AB血清)(大約1.5ml)。計數(shù)不附著的細胞，根據(jù)檢測法中的應用調(diào)整其體積。
使用下述針對人白細胞標記的Balb/c小鼠單克隆抗體9.4(IgG2a)，CD45抗體(Cobold，同上);G1-15(IgG1)和3AC5(IgG2a)，CD45R抗體(Ledbetter，同上;Ladbetter等人，《免疫遺傳學和組織相容性展望》，E.Heise編，ASHI，NewYork，325-340頁);96.5(Brown等人，J.Immunol.127(2)639-546，1981)。由P.Beverley博士惠贈的UCHL-1(IgG1)，抗CD45(180形)(Smith，同上);G19-4(IgG1)，抗CD3(Ledbetter，同上);9.6，抗CD2(參見前面);9.3，抗CD28(參見前面)。用大鼠抗小鼠K特異性單克隆抗體187.1(Ware等人，J.Immunol.Meth.7493-104，1984)與小鼠單克隆抗體交聯(lián)。單克隆抗體雜合物的制備單克隆抗體雜合物如上面實例1所述，以1∶1的摩爾比例用雜雙功能交聯(lián)劑GMBS(Calbiochem，La Jolla，CA)和5-氨基硫烷HCl(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)制備。更具體地說，使抗體(1mg/ml)在偶聯(lián)緩沖液中透析過夜(0.1M Na2HPO4，7分子水的0.1M NaCl pH7.5)。結(jié)合物中的第一抗體通過攪拌加入氨基硫烷HCl鹽(2-IT來自Pierce Chemical Co.，Rockford，IL;50μl(0.5mg)2-IT溶液(10mg/ml)在偶聯(lián)緩沖液中)而巰基化(thiolated)。結(jié)合物的第二抗體用GMBS，5μl(14μg GMBS溶液(1mg在360μl二甲基甲酰胺(DMF)中)處理。溶液于室溫下保溫1小時。使抗體通過分開的用偶聯(lián)緩沖液預平衡的PD-10柱(Pharmacia，Uppsala，Sweden)。在總共排出2.6ml體積后，以雙倍的初始體積收集固?，使抗体混合，灾o椅孿鹵Ｎ 小時，通過加入1μl25mMβ-巰基乙醇(1μl560μl偶聯(lián)緩沖液)于室溫下保溫15分鐘而抑制反應。通過加入11μl(11μg)N-乙基馬來亞酰胺(Sigma Chemical Co.，St.Louls，MO)(在DMF中配制成1mg/ml)終止此反應。
結(jié)合物在磷酸緩沖液(PBS)中透析過夜。如實例1所述，在Superose6FPLC上從游離抗體中分離出產(chǎn)生的CD3/CD45雜合物，它被命名為G19-4/9.4。
如前人所述(R.R.Hardy，《實驗免疫學手冊》，Weir等人編，BlackwellOxford.31.1-31.2頁，1986，此公開作為本文的參考文獻)，利用生物素琥珀酰亞胺(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)使單克隆抗體與生物素結(jié)合。佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)和抗生物素蛋白得自SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO.重組白介素2(rIL2)購自Genzyme(Boston，MA)，用它促進某些檢測中的增殖作用。
如實例1所述，利用106細胞/ml在200μl的微量滴定孔中通過〔3H〕胸苷(New England Nuclear;比活為27Ci/mmol;1ci＝37GBq)的摻入測量血液T細胞的增殖。更具體地說，對于增殖檢測來說，如Ledbetter等人所述(J.Immunol.1351819-1825，1985;此文作為本申請的參考文獻)培養(yǎng)單核細胞，簡而言之，在Ficoll-Hypaque上通過密度離心由外周血液中分離出單核細胞，然而通過粘附于塑料以分開大部分單核細胞。細胞以2.5×105/ml用4份樣品培養(yǎng)在96孔微量滴定板中(Falcon，Becton-Dickinson，Oxnard，CA)，孔中有含有青霉素、鏈霉素和15%人AB血清(Pel Freez，Brown Deer，WI)的RPMI基質(zhì)。用分裂素植物凝血素(PHA;Wellcome Diagnostics，Greenville，NC)或偶聯(lián)于Sepharose的抗CD3單克隆抗體(G19-4)刺激T細胞。培養(yǎng)3或4天以后，小孔用0.5μCi〔3H〕胸苷/孔(New England Nuclear，Boston，MA;6.7Ci/mmol比活)刺激6小時。然后利用細胞收集器將細胞收集于玻璃纖維濾器上，在液閃計數(shù)器中測量放射活性。在某些實驗中，以25U/ml使用重組的IL2(rIL-2，Genzyme，Boston，MA)。在3天實驗的最后6小時中測定〔3H〕胸苷的攝取，測試前以10μg/ml的單克隆抗體G19-4的對微量滴定板的小孔進行預覆蓋。溶液中CD45單克隆抗體9.4的濃度是1μg/μl，將它以10mg/ml固定于微量滴定板上。以4份重復培養(yǎng)細胞并給出平均值。標準誤差小于11%。
結(jié)果概括于表5中。
表5顯示，與CD3抗體一起固化的CD45抗體抑制T細胞增殖超過75%，而溶液中的CD45抗體不抑制。即使在低于最佳濃度的PMA或外來rIL2的存在下，固定化CD45抗體的抑制效應仍是很明顯的。
表5CD45在CD3刺激后調(diào)節(jié)T細胞增殖增殖(〔3H〕胸苷摻入，cpm×10-3)PMA溶液中的固化抗活化(1ng/ml)基質(zhì)抗CD45CD45基質(zhì)-0.30.40.3+0.50.50.4固化抗CD3-137.9143.532.3+204.3198.393.2+rIL-2(100單位/ml)-196.3183.967.1用CD3單克隆抗體(G19.4)刺激后，還用固化的CD3單克隆抗體和固化或溶液中的CD45R單克隆抗體(G1-15和3AC5)測量T細胞增殖。增殖測定的方法如上面對CD45抗體所述。所用的CD45R單克隆抗體G1-15和3AC5濃度在溶液中是1μg/ml，固定化時是10μg/ml。用針對黑素瘤抗原p97的IgG2a單克隆抗體96.5對照作為非反應對照，溶液濃度為1μg/ml，固化時為10μg/ml。表6給出了此實驗的結(jié)果。
表6CD45在CD3刺激后調(diào)節(jié)T細胞增殖增殖(〔3H〕胸苷摻入，cpm×10-3)PMArIL-2活化基質(zhì)(lng/ml)100U/ml基質(zhì)0.10.50.4固定化抗CD3+基質(zhì)143.6281.5291.8+0.-15抗-CD45R(溶液)137.5261.5309.4+3AC5抗-CD45R(溶液)177.8266.2294.6+96.5(溶液)147.9262.1312.4固定化抗CD3+G1-15抗-CD45R(固定化)0.10.70.6+3ACS抗-CD45R(固定化)10.168.295.5+86.5(固定化)154.4247.1280.4
當CD45R(3AC5)或CD45R(G1-15)單克隆抗體與抗CD3抗體一起固化時，抑制作用很明顯，但如果CD45R在溶液中則不。而且，無論PMA或rIL-2都不能克服這種抑制作用。當針對黑素瘤抗原p97的單克隆抗體對照96.5與抗CD3抗體一起在溶液中或被固定時，不抑制作為對固定化CD3抗體的應答的增殖作用。
為了證實用固定化CD45單克隆抗體(9.4)觀察到的抑制作用不是簡單地由于從塑料表面取代了CD3單克隆抗體(G19-4)所致。用單獨的抗CD3抗體、抗CD3加抗CD45抗體或抗CD3加對照單克隆抗體96.5涂復于微量滴定板的小孔上。用固定于微量滴定板孔中的CD3單克隆抗體G19-4刺激外周血單核細胞，即使其于室溫下在磷酸緩沖液中保溫2小時，所用濃度為4、8、16和32μg/ml，單獨或與CD45單克隆抗體9.4一起保溫，或與對照單克隆抗體96.5一起保溫，它們的濃度都與CD3單克隆抗體相同。加入牛血清清蛋白使蛋白質(zhì)進一步附著。用溶液中CD45單克隆抗體9.4的增殖作為對照。在有或沒有1ng/ml PMA存在的情況下測量增殖作用。細胞以4份重復培養(yǎng)3天，最后6小時內(nèi)用〔3H〕胸苷刺激。圖9給出了這些實驗的結(jié)果(給出了平均值，每點上平均值的標準誤差小于15%)。
圖9顯示(a)用來涂復小孔的CD3抗體越多，則增殖越多，這與以前的報道是一致的(Geppert等人，J.Immunol.1381660-1666，1987);(b)CD45單克隆抗體9.4在所有濃度都導致大量抑制，但必須是固定化的;(c)用同型對照96.5單克隆抗體同時涂復時，基本上不導致抑制作用，表明CD45抗體的抑制不是取代CD3抗體的結(jié)果。在培養(yǎng)物中加入1ng/mlPMA，只有當涂復的單克隆抗體是4μg/ml或更低時才會逆轉(zhuǎn)固定化CD45抗體的抑制作用，但在更高濃度時不行(圖9B)。這一結(jié)果提示，在有PMA存在時，CD45抗體可能需要一臨界濃度才能與塑料表面的CD3抗體密切接近，從而維持抑制作用。
用單克隆抗體9.3和9.6(在溶液中)分別刺激CD28和CD2，隨后在第二步中用抗K單克隆抗體187.1進行交聯(lián)，可以產(chǎn)生導致增殖的T細胞活化(Van Lier等人，Eur.J.Immunol.18167-175，1988;Ledbetter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 841384-1388，1987)。為了研究在此系統(tǒng)中CD45連接的效應，在有或沒有交聯(lián)的單克隆抗體187.1的CD28抗體或CD2抗體溶液中加入CD45抗體(Ware等人，同上)。如上述通過〔3H〕胸苷的攝入測量增殖。以每種1μg/ml的CD28單克隆抗體9.3和CD2單克隆抗體9.6進行活化。所用的CD45單克隆抗體9.4為1μg/ml，用抗K單克隆抗體187.1交聯(lián)抗體，單克隆抗體187.1與小鼠單克隆抗體的最終比率為4∶1。在有或沒有rIL-2的存在下(100單位/ml)測量增殖。表7給出了結(jié)果(每點平均值的標準誤差小于12%)。
表7CD45在CD2和CD28刺激后調(diào)節(jié)T細胞增增殖(〔3H〕胸苷摻入，cpm×10-3)抗CD45+rIL-2單克隆抗抗單克隆抗刺激(100U/ml)基質(zhì)體187.1CD45體187.1基質(zhì)-0.20.31.60.4+6.84.237.62.5抗CD28-0.24.347.40.4+12.636.172.59.6抗CD2-0.50.212.70.2+4.47.037.34.0很明顯，單獨加入CD45抗體能夠促進由CD2或CD28單克隆抗體(mAb)誘導的細胞增殖，而不需要有外源rIL2(表7)。在所有的情況下，加入rIL2即使在沒有其他刺激的情況下也進一步擴大細胞增殖。這些現(xiàn)象也許是由于CD45連接對于IL2的高親和性受體的表達的效應所致(Ledbetter，同上)。
與此相反，通過加入187.1抗KmAb而使CD45與CD2或CD28交聯(lián)會逆轉(zhuǎn)單獨用CD45的促進效應，并在有或沒有rIL2的存在下降低CD2或CD28的刺激作用(表7)。這并不是由于187.1的非特異性抑制活性，因為在沒有包括進CD45mAb9.4時，187.1能增強CD28或CD2二者的刺激作用。
如果CD3、CD2和CD28被連接在細胞表面，則這些受體與信號轉(zhuǎn)導途徑相偶聯(lián)，并因此導致〔Ca2+〕i的上升
(Ledbetter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 841384-1388，1987)。在使CD3、CD2或CD28受體在有或沒有CD45mAb9.4存在下交聯(lián)后測量〔Ca2+〕i(圖10)。在此實驗中，生物素結(jié)合的mAb結(jié)合于外周血T細胞上，然后通過加入抗生物素蛋白在細胞表面交聯(lián)。測量裝有indo-1(Molecular Probes，Junction City，OR)的外周血液單核T細胞中的〔Ca2+〕i上升，在這之前，先使T細胞上的受體如下述與抗CD45mAb9.4或抗CD45RmAb3AC5一道或一起交聯(lián)(條件參考圖10給出)1.在時間＝1.5分鐘時，使CD3受體與生物素結(jié)合的抗CD3mAbG19.4(2μg/ml)交聯(lián)，然后在時間＝5.5分時加入抗生物素蛋白(8μg/ml)(-)。將它與CD3受體在抗CD45mAb9.4(10μg/ml)(-)存在下的同樣的交聯(lián)相比較，或與生物素結(jié)合的抗CD45mAb9.4(10μg/ml)然后加入抗生物素蛋白(48μg)的同樣的交聯(lián)相比較(……)。還使用了另外一種對照，即生物素結(jié)合的抗CD45mAb9.4(10μg/ml)然后是抗生物素蛋白(40μg/ml)(-)(圖10A)。
2.將25μg/ml抗CD3mAbG19.4的效應(-)與50μg/mlCD3/CD45雜合物(由抗CD3mAbG19-4和抗CD45mAb9.4組成)的效應(……)相比較(圖10B);
3.CD2受體與時間＝-3分時加入的10μg/ml的生物素結(jié)合的抗CD2mAb9.6交聯(lián)，然后在時間＝1.5分時加入40μg/ml抗生物素蛋白(-)(圖10C);
4.使CD28受體與時間＝-3分時加入的10μg/ml生物素結(jié)合的抗CD28mAb9.3交聯(lián)，然后在時間＝-3分時加入40μg/ml抗生物素蛋白(-)，通過在時間＝-3分時加入10μg/ml抗CD28mAb9.3和10μg/ml抗CD45mAb9.4，然后在時間＝1.5分時加入的80μg/ml抗生物素蛋白使CD28和CD45受體同時交聯(lián)(……)，并將二者作一比較(圖10D);
5.使CD4受體與在時間＝-3分時加入的10μg/ml生物素結(jié)合的抗CD4mAbG17-2交聯(lián)，然后在時間＝1.5分時加入40μg/ml抗生物素蛋白(-)。將它與CD4和CD45受體的同時交聯(lián)作一比較，此交聯(lián)作用是通過在時間＝-3分時加入10μg/ml生物素結(jié)合的抗CD4mAbG17-2和10μg/ml生物素結(jié)合的抗CD45mAb9.4，然后在時間＝1.5分時加入80μg/ml抗生物素蛋白而完成的(……)。圖中還出示了生物素結(jié)合的抗CD4mAbG17-2(10μg/ml)加抗CD45mAb9.4(10μg/ml)(未結(jié)合的)然后是時間＝1.5分時的抗生物素蛋白的比較(-·-)(圖10E)。
圖10A-E給出了這些實驗的結(jié)果。
明顯可見，在CD3、CD2和CD28交聯(lián)之后觀察到的〔Ca2+〕i上升受到生物素結(jié)合的9.4存在的抑制。如果9.4沒有生物素化，并因此不與抗生物素蛋白交聯(lián)，則仍可觀察到抗CD3抗體誘導的鈣動員有少量上升(圖10A)。然而，完全的抑制似乎要求使CD45和CD3密切接近。進一步，即使用一種抗小鼠免疫球蛋白進行的免疫熒光檢測證實，雜合物能夠與細胞表面的兩種受體結(jié)合(數(shù)據(jù)未出示)，以及25μg的CD3抗體能誘導很強的鈣應答，但CD45和CD3抗體的雜合物仍不能直接提高〔Ca2+〕i(圖10B)。CD45R(例如3AC5)mAb如果與能與細胞受體反應的mAb結(jié)合，則能夠部分抑制〔Ca2+〕i應答，細胞受體有例如圖10C說明的CD2。CD45RmAb產(chǎn)生的部分抑制可能反映了某些但并非所有T細胞上CD45R同形體的表達(Ledbetter，同上)。與對于CD3、CD2和CD28的抑制效應相反，CD45與CD4的連接比之CD4與自身交聯(lián)時產(chǎn)生很強而且可重復的信號傳遞的增強(圖10E)。這一現(xiàn)象的發(fā)生沒有伴隨應答細胞數(shù)目的上升，表明同樣的CD4+細胞在CD45和CD4連接之后應答性更強。因此，CD45似乎不是向上就是向下調(diào)節(jié)跨膜的信號傳遞，這取決于它與之相互作用的受體。
CD45以前的研究提示，它的功能可能是向上或向下調(diào)節(jié)淋巴細胞活性(Ledbetter，同上;Harp，同上和Martorell，同上)。在增加IL-2的產(chǎn)生、IL-2受體的表達和T細胞增殖中，可溶性的針對CD45或CD45R的mAb與PHA或附著于小球的CD3抗體有共同促進作用。可溶性CD45抗體能與CD2或CD28mAb協(xié)同作用(表6)。這些共促效應只局限于CD4+細胞，而不表達CD4的CD8+細胞觀察不到。這部分可能是由于這一事實，CD45對于CD4具有一種不同于它對其他細胞表面抗原(例如CD3或CD2)作用的獨特效應;當CD45與CD4密切接近時，它加速并提高鈣信號通過CD4的傳遞，但當偶聯(lián)于CD3或CD2時則抑制信號的轉(zhuǎn)導作用(圖10)。
上述的實例4證實，CD45抗體的抑制效應最能在這樣的條件下清楚地證實即使CD45置于與信號轉(zhuǎn)導分子(例如T細胞受體CD2、CD3、CD5或CD28)密切接觸的地方，這一點通過使用本發(fā)明的CD4/CD45雜合物得到了證實。抗CD45抗原的抗體能很早地作用于淋巴細胞的活化，抑制胞內(nèi)游離鈣的動員，通常在30-60秒內(nèi)就能測出。通過使CD45受體與CD4受體接近也證實了CD45抗體的增強效應。這些結(jié)果提示，含有能與淋巴細胞上受體反應的分子的雜合物提供了一種可供選擇的方法，以誘導受體間的相互作用，從而增強或抑制淋巴細胞(包括T細胞和B細胞)的活化和功能。
我們在前面已經(jīng)提供了一些本發(fā)明的具體方案，但很顯然，通過改變本發(fā)明的基本構(gòu)成能夠提供導致淋巴細胞活化作用增強的其他方案，例如，其他的淋巴細胞抗原雜合物結(jié)合物，或淋巴細胞功能的抑制。因此，應當認識到，本發(fā)明的范圍由本申請的權(quán)利要求書確定，而不是由用以舉例的特異具體方案所限定。
權(quán)利要求
1.一種可用于調(diào)節(jié)淋巴細胞的雜合物，它包括至少兩種能與淋巴細胞上的抗原結(jié)合的分子，所述分子相互交聯(lián)，每種分子都能與位于單個淋巴細胞表面的不同抗原反應。
2.一種可用于活化T淋巴細胞的抗體雜合物，它包括至少兩種相互交聯(lián)的抗體分子，每種抗體都能與位于T淋巴細胞表面的不同抗原反應。
3.權(quán)利要求1或2的雜合物，其中的抗原是T淋巴細胞表面的CD抗原。
4.權(quán)利要求1或2的雜合物，其中的抗原是B淋巴細胞表面的CD抗原。
5.權(quán)利要求1或2的雜合物，其中，雜合物的一種分子能與T細胞受體或與其結(jié)合的CD3抗原反應。
6.權(quán)利要求1或2的雜合物，其中，雜合物的一種分子能與CD5T細胞表面抗原反應。
7.權(quán)利要求1的雜合物，其中所述的分子是抗體。
8.一種CD3/CD4抗體雜合物。
9.抗體雜合物G19-4/G17-2。
10.由下列構(gòu)成的一組中選擇出的抗體雜合物CD3/CD2，CD3/CD6，CD3/CD7和CD3/CD8。
11.由下列構(gòu)成的一組中選擇出的抗體雜合物CD5/CD4，CD5/CD6和CD5/CD8。
12.權(quán)利要求1或2的雜合物，其中，雜合物的一種分子能與CD45抗原或其同形體反應。
13.抗體雜合物CD3/CD45。
14.抗體雜合物G19-4/9.4。
15.由下列構(gòu)成的一組中選擇出的抗體雜合物CD2/CD45，CD3/CD45和CD28/CD45。
16.由下列構(gòu)成的一組中選擇出的抗體雜合物CD2/CD45R，CD3/CD45R，CD4/CD45R和CD28/CD45R。
17.權(quán)利要求2或7的雜合物，其中的抗體由下列組成的一組中選出的抗體片段組成Fab和F(ab′)2片段。
18.權(quán)利要求2或7的抗體雜合物，其中的抗體是單克隆抗體。
19.權(quán)利要求2或7的雜合物，其中的抗體是嵌合抗體。
20.一種雙特異性抗體，它具有與T淋巴細胞表面兩種不同抗原結(jié)合的親和性。
21.權(quán)利要求1的雜合物，其中所述的分子是能與淋巴細胞表面抗原反應的配體肽。
22.一種活化T淋巴細胞的方法，包括使淋巴細胞與至少一種權(quán)利要求2的雜合物接觸。
23.一種調(diào)節(jié)T淋巴細胞和/或B淋巴細胞功能的方法，包括使淋巴細胞與權(quán)利要求1或2的雜合物接觸。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的調(diào)節(jié)T淋巴細胞和/或B淋巴細胞功能的方法，包括使淋巴細胞與含有至少一種抗體的雜合物接觸，雜合物中至少有一種抗體能與CD45細胞表面抗原或CD45抗原的同形體反應。
25.一種治療疾病的方法，它包括如下步驟(a)通過使淋巴細胞與至少一種權(quán)利要求1的雜合物接觸而離體活化T淋巴細胞;b)將活化的淋巴細胞再輸注入原來的供體中。
26.一種可用于治療疾病的藥物上可接受的組合物，它包括至少一種有效藥物量的權(quán)利要求1或2的雜合物。
27.一種治療疾病的方法，包括給患者施用至少一種藥物有效量的權(quán)利要求22的組合物。
28.權(quán)利要求25或27的方法，其中的疾病是由下列構(gòu)成的一組中選出的傳染病、癌癥、艾茲病和自身免疫疾病。
29.一種診斷患者CD受體功能缺損的方法，該患者患有與T細胞紊亂或功能缺失有關(guān)的疾病，該方法包括測量權(quán)利要求1或2的雜合物對于患者T淋巴細胞的鈣動員活性，并將它與構(gòu)成該雜合物組分的未結(jié)合抗體的活性相比較。
30.一種治療自身免疫疾病的方法，包括施用權(quán)利要求8或12的雜合物，以選擇性地調(diào)節(jié)T和B淋巴細胞的亞群落。
31.一種制備用于調(diào)節(jié)淋巴細胞的雜合物的方法，它包括使至少兩種能與淋巴細胞上的抗原結(jié)合的分子相互交聯(lián)，每種分子都能與單個淋巴細胞表面的不同抗原反應。
32.權(quán)利要求31的方法，其中能與所述分子反應的所述淋巴細胞為T淋巴細胞。
33.權(quán)利要求31的方法，其中的抗原是T淋巴細胞表面的CD抗原。
34.權(quán)利要求31的方法，其中的抗原是B淋巴細胞表面的CD抗原。
35.權(quán)利要求31的方法，其中，雜合物中的一種分子能與T細胞受體或與其結(jié)合的CD3抗原反應。
36.權(quán)利要求31的方法，其中，雜合物中的一種分子能與CD5T細胞表面抗原反應。
37.權(quán)利要求31的方法，其中所述分子是抗體。
38.權(quán)利要求31或32的方法，其中所述分子是能與CD3抗原反應的抗體和能與CD4抗原反應的抗體。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述抗體是相互交聯(lián)的抗體G19-4和抗體G17-2。
40.權(quán)利要求31的方法，其中所述分子是能與CD3抗原反應的抗體和能與由下列構(gòu)成的一組中選出的抗原反應的抗體CD6，CD7和CD8抗原。
41.權(quán)利要求31的方法，其中所述抗體是能與CD5抗原反應的抗體和能與由下列構(gòu)成的一組中選出的抗原反應的抗體CD4，CD6和CD8抗原。
42.權(quán)利要求31的方法，其中，一種分子能與CD45抗原或其同形體反應。
43.權(quán)利要求31的方法，其中，一種分子為由下列構(gòu)成的一組中選出的抗體能與CD2、CD3、CD4和CD28抗原反應的抗體，而另一種分子為能與CD45抗原反應的抗體。
44.權(quán)利要求31的方法，其中，一種分子為由下列構(gòu)成的一組中選出的抗體能與CD2、CD3、CD4和CD28抗原反應的抗體，而另一種分子為能與CD45R抗原反應的抗體。
45.前面權(quán)利要求的任何一項的方法，其中所述分子為單克隆抗體。
46.權(quán)利要求31的方法，其中的分子由下列組成的一組中選出的抗體片段組成Fab和F(ab′)2片段。
47.權(quán)利要求31的方法，其中的分子是嵌合抗體。
48.權(quán)利要求31的方法，其中的分子是能與淋巴細胞表面抗原反應的配體肽。
49.權(quán)利要求31的方法，其中所述的交聯(lián)為化學交聯(lián)。
50.權(quán)利要求49的方法，其中所述的化學交聯(lián)是利用選自下列構(gòu)成的一組中的試劑而進行的
全文摘要
本發(fā)明涉及新的抗體雜合物及其在增強或抑制T或B淋巴細胞中的應用。雜合物至少包括兩種相互交聯(lián)的分子，每種抗體能與同一細胞上不同的細胞表面抗原反應。雜合物的作用似乎是通過雜合物抗體與其不同的細胞表面抗原相互作用而與淋巴細胞結(jié)合，并使這些抗原在空間上相互接近，導致增強或降低淋巴細胞的活化和功能。本發(fā)明的雜合物、方法和組合物因此可用于調(diào)節(jié)淋巴細胞的功能，導致各種疾病狀態(tài)下的細胞免疫應答的改善。
文檔編號C07K16/00GK1036988SQ8910196
公開日1989年11月8日 申請日期1989年4月3日 優(yōu)先權(quán)日1988年4月4日
發(fā)明者杰弗理·A·萊德貝特 申請人:翁科根公司