專利名稱：利用天然微納米級凹凸棒土提高哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用天然微納米凹凸棒土提高哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)率的方法。
背景技術(shù)：
伴隨著DNA重組技術(shù)和淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)的發(fā)明而誕生的生物制藥高新技術(shù)在過去的近40年里得到了快速發(fā)展，近25年來，世界生物技術(shù)工業(yè)就創(chuàng)造了 35種重要的治療性生物技術(shù)藥物，極大地改善和提高了人們的健康生活水平，因此，世界各國都把生物制藥確定為21世紀(jì)科技發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)和新興產(chǎn)業(yè)。盡管如此，相比于化學(xué)藥，普通百姓通常是難以承受生物藥其昂貴費用。利用大規(guī)模哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)具有醫(yī)用價值的生產(chǎn)因子、干擾素、激素、疫苗、單抗和酶等，已成為生物制藥高技術(shù)產(chǎn)業(yè)鏈的核心。但在哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)過程中，如CO2、乳酸、氨、尿素、吲哚等代謝廢物的積聚會抑制哺乳動物細(xì)胞的生長，阻礙細(xì)胞密度提高，進而大幅提升哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)成本和生物藥成本。因此，優(yōu)化哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境、提高哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)率、降低哺乳動物細(xì)胞的培養(yǎng)成本是目前生物制藥產(chǎn)業(yè)技術(shù)重要研究方向之一。素有“千用之土，萬土之王”的凹凸棒石粘土是一種稀有非金屬礦石，理想的化學(xué)式是Al (OH2)4 (OH)2Mg5Si8. 4H20，其基本構(gòu)造單元式由兩層硅氧四面體和一層鋁氧八面體組成。這種獨特的納米通道結(jié)構(gòu)使得凹凸棒土具有超大的比表面積(146 210m2/g)，使其具有了良好的吸附性，已在機械、化工、建材、石油、催化載體和抗菌劑載體等方面得到廣泛應(yīng)用。近幾年來，納米級凹凸棒土在生物領(lǐng)域的應(yīng)用研究得以開展2007年，Jin等人通過血紅蛋白直接沉積到NNATP黏土膜修飾的玻璃碳電極，并通過UV-vis、FTIR和電化學(xué)手段研究ATP和血紅蛋白之間 的相互作用，從而發(fā)現(xiàn)固定化的血紅蛋白在凹凸棒土表面保持其原始構(gòu)象，表現(xiàn)出極佳的電化學(xué)催化活性，對過氧化氫表現(xiàn)出很高的親和性和敏感性，其電催化反應(yīng)在一定范圍內(nèi)與過氧化氫濃度線性相關(guān)。該研究表明ATP能夠作為一個良好的蛋白固定化基質(zhì)，用于制作不需要介導(dǎo)體的第三代生物傳感器；2009年，Wang等人通過Ca2+離子交聯(lián)海藻酸鈉制作了殼多糖-g_聚丙烯酸/ATP/海藻酸鈉(CTS-g-PAA/APT/SA)復(fù)合材料的水凝膠微球。該微球作為藥物呈遞的基質(zhì)具有PH敏感性，其對雙氯芬酸鈉(DS)的累計釋放率在PH6. 8時要慢于pH7. 4時，且隨著ATP含量的增加而減少，故ATP引入CTS-g-PAA網(wǎng)絡(luò)能夠延長DS的釋放時間，這表明將黏土引入聚合物網(wǎng)絡(luò)能夠簡單而有效的制備新的藥物呈遞系統(tǒng)；2011年，Ma等人通過將修飾后ATP加入聚氨酯制得生物大分子載體，并使用FTIR、SEM等方法對其進行表征分析，發(fā)現(xiàn)有機修飾的ATP的加入能夠提升載體的結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)，并促進微生物的固定化。凹凸棒土具有較強的吸附性能，具有優(yōu)化哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境、提高細(xì)胞產(chǎn)率中的潛力。本發(fā)明目的是提供天然微納米凹凸棒土提高哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)率的方法，拓寬微納米級凹凸棒土的應(yīng)用領(lǐng)域，實現(xiàn)高技術(shù)含量凹凸棒土在生物產(chǎn)業(yè)中應(yīng)用，提高其附加值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用天然微納米凹凸棒土提高哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)率的方法。利用天然微納米級凹凸棒土提高哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)率的方法，包括以下步驟(I)取粒徑小于1000目的純度大于99%的天然微納米凹凸棒土與去離子水混合，高壓滅菌后配制成濃度為O. 001mg/mL lmg/mL的凹凸棒土溶液；(2)當(dāng)哺乳動物細(xì)胞處在對數(shù)生長期時，取上述凹凸棒土溶液與細(xì)胞密度為IO3 IO5個/mL的細(xì)胞懸浮液按1:1到1:10的體積比共培養(yǎng)；(3)對于大規(guī)模哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)時，讓細(xì)胞反應(yīng)釜中的細(xì)胞培養(yǎng)液循環(huán)流填充天然微納米級凹凸棒土的管道，管道中填充的天然微納米凹凸棒土與流過的細(xì)胞培養(yǎng)液的體積比為I 10_3。步驟(I)中配制的凹凸棒土溶液的濃度為O. Olmg/mL lmg/mL。步驟(2)中所述共培養(yǎng)的方法為接觸式或非接觸式共培養(yǎng)方法。所述接觸式共培養(yǎng)方法為凹凸棒土溶液與細(xì)胞懸浮液混合后共同接種于培養(yǎng)皿中。所述非接觸式共培養(yǎng)方法為凹凸棒土溶液與細(xì)胞懸浮液分別置于具有連通性的分離式培養(yǎng)皿中。

步驟(3)中所述管道中填充的天然微納米凹凸棒土與流過的細(xì)胞培養(yǎng)液的體積比為 KT1 1(Γ3。本發(fā)明方法的有益效果為采用天然凹凸棒土與哺乳動物細(xì)胞接觸式或非接觸式共培養(yǎng)方式，會降低細(xì)胞培養(yǎng)液中的銨離子和乳酸濃度，優(yōu)化哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境，提高哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)率，降低培養(yǎng)成本。本發(fā)明具有方法簡單、成本低廉、細(xì)胞產(chǎn)率高、在生物制藥產(chǎn)業(yè)具有較大的應(yīng)用價值和市場前景。


圖1為與天然微納米凹凸棒土共培養(yǎng)的293細(xì)胞活性圖。圖2為凹凸棒土透射電鏡圖以及共培養(yǎng)的VERO細(xì)胞圖。圖3為添加天然微納米凹凸棒土與共培養(yǎng)的VERO細(xì)胞活性圖。圖4為添加凹凸棒土前后細(xì)胞培養(yǎng)液中銨離子、乳酸濃度圖
具體實施例方式下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步詳細(xì)說明。實施例1取粒徑小于1000目的純度大于99%天然微納米凹凸棒土與去離子水混合，高壓滅菌后分別配制濃度為O. 005mg/mL、0. lmg/mL的天然微納米級凹凸棒土溶液，當(dāng)293細(xì)胞處在對數(shù)生長期時，按體積比為1:10的比例，分別將濃度為O. 005mg/mL、0. lmg/mL的天然微納米級凹凸棒土溶液與細(xì)胞密度為IO3個/mL的細(xì)胞懸浮液進行接觸式共培養(yǎng)，用于提高293細(xì)胞的產(chǎn)率，并設(shè)置空白對照。其結(jié)果見圖1所示，與對照相比，添加濃度為O. 005mg/mL、0. lmg/mL的天然微納米級凹凸棒土溶液的293細(xì)胞活性增強。實施例2取粒徑小于1000目的純度大于99%天然微納米凹凸棒土與去離子水混合，高壓滅菌后分別配制濃度為O. 25mg/mL的天然微納米級凹凸棒土溶液，當(dāng)293細(xì)胞處在對數(shù)生長期時，按體積比為1:1的比例，將天然微納米級凹凸棒土溶液和細(xì)胞密度為IO3個/mL的293細(xì)胞懸浮液進行接觸式共培養(yǎng)，用于提高293細(xì)胞的產(chǎn)率。結(jié)論與實施例1相同，天然微納米級凹凸棒土?xí)鰪?93細(xì)胞活性。實施例3取粒徑小于1000目的純度大于99%天然微納米凹凸棒土與去離子水混合，高壓滅菌后配制濃度為O. Olmg/mL的天然微納米級凹凸棒土溶液，按體積比為1:1和細(xì)胞密度為IO3個/mL的VERO細(xì)胞進行接觸式共培養(yǎng)，提高VERO細(xì)胞的產(chǎn)率，并設(shè)置空白對照。天然微納米凹凸棒土透射電鏡(TEM)圖以及共培養(yǎng)的VERO細(xì)胞圖如圖1所示，培養(yǎng)結(jié)果如圖3，從圖中可以看出天然微納米凹凸棒土提高VERO細(xì)胞活性，并且會降低細(xì)胞培養(yǎng)液中的銨離子和乳酸濃度，優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境，如圖4所示。實施例4取粒徑小于1000目的純度大于99%天然微納米凹凸棒土與去離子水混合，高壓滅菌后配制濃度為O. Olmg/mL的天然微納米級凹凸棒土溶液，按體積比為1:1和細(xì)胞密度為IO3個/mL的SP20細(xì)胞進行接觸式共培養(yǎng)，提高SP20細(xì)胞的產(chǎn)率，并設(shè)置空白對照。結(jié)論天然微納米凹凸棒土提高SP20細(xì)胞活性，并且會降低細(xì)胞培養(yǎng)液中的銨離子和乳酸濃度。實施例5 取粒徑小于1000目的純度大于99%天然微納米凹凸棒土與去離子水混合，高壓滅菌后配制濃度為lmg/mL的天然微納米級凹凸棒土溶液，按體積比為1:10和細(xì)胞密度為IO3個/mL的VERO細(xì)胞采取接觸式共培養(yǎng)方式，用來提高VERO細(xì)胞的產(chǎn)率。實施例6對于大規(guī)模培養(yǎng)的CHO細(xì)胞，取粒徑小于1000目的純度大于99%天然微納米凹凸棒土，選取細(xì)胞密度為IO5個/mL CHO細(xì)胞培養(yǎng)液循環(huán)流過填充天然微納米級凹凸棒土的管道，管道中填充的天然微納米凹凸棒土與流過的細(xì)胞培養(yǎng)液的體積比為O. 1，并設(shè)置空白對照組。結(jié)論與上述實施例中的結(jié)論相同，天然微納米凹凸棒土提高CHO細(xì)胞的產(chǎn)率。實施例7對于大規(guī)模培養(yǎng)的CHO細(xì)胞，取粒徑小于1000目的純度大于99%天然微納米凹凸棒土，選取細(xì)胞密度為IO5個/mL CHO細(xì)胞培養(yǎng)液循環(huán)流過填充天然微納米級凹凸棒土的管道，管道中填充的天然微納米凹凸棒土與流過的細(xì)胞培養(yǎng)液的體積比為O. 01，并設(shè)置空白對照組。結(jié)論與上述實施例中的結(jié)論相同，天然微納米凹凸棒土提高CHO細(xì)胞的產(chǎn)率。
權(quán)利要求
1.利用天然微納米級凹凸棒土提高哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)率的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)取粒徑小于1000目的純度大于99%的天然微納米凹凸棒土與去離子水混合，高壓滅菌后配制成濃度為0. OOlmg/mL lmg/mL的凹凸棒土溶液； (2)當(dāng)哺乳動物細(xì)胞處在對數(shù)生長期時，取上述凹凸棒土溶液與細(xì)胞密度為IO3 IO5個/mL的細(xì)胞懸浮液按1:1到1:10的體積比共培養(yǎng)； (3)對于大規(guī)模哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)時，讓細(xì)胞反應(yīng)釜中的細(xì)胞培養(yǎng)液循環(huán)流填充天然微納米級凹凸棒土的管道，管道中填充的天然微納米凹凸棒土與流過的細(xì)胞培養(yǎng)液的體積比為1(T3 I。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用天然微納米級凹凸棒土提高哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)率的方法，其特征在于，步驟(I)中配制的凹凸棒土溶液的濃度為0. Olmg/mL lmg/mL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用天然微納米級凹凸棒土提高哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)率的方法，其特征在于，步驟(2)中所述共培養(yǎng)的方法為接觸式或非接觸式共培養(yǎng)方法。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用天然微納米級凹凸棒土提高哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)率的方法，其特征在于，所述接觸式共培養(yǎng)方法為凹凸棒土溶液與細(xì)胞懸浮液混合后共同接種于培養(yǎng)皿中。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的利用天然微納米級凹凸棒土提高哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)率的方法，其特征在于，所述非接觸式共培養(yǎng)方法為凹凸棒土溶液與細(xì)胞懸浮液分別置于具有連通性的分離式培養(yǎng)皿中。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用天然微納米級凹凸棒土提高哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)率的方法，其特征在于，步驟(3)中所述管道中填充的天然微納米凹凸棒土與流過的細(xì)胞培養(yǎng)液的體積比為10_3 10'
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于生物技術(shù)領(lǐng)域的一種利用天然納米級凹凸棒土提高哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)率的方法。本發(fā)明的方法采用天然凹凸棒土與哺乳動物細(xì)胞接觸式或非接觸式共培養(yǎng)的方式，會降低細(xì)胞培養(yǎng)液中的銨離子和乳酸濃度，優(yōu)化哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境，提高哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)率，降低培養(yǎng)成本。本發(fā)明具有方法簡單、成本低廉、細(xì)胞產(chǎn)率高、在生物制藥產(chǎn)業(yè)具有較大的應(yīng)用價值和市場前景。
文檔編號C12N5/071GK103045532SQ201210559039
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月20日
發(fā)明者丁克儉, 賀麗, 吳昊, 王楠, 鄭青 申請人:北京交通大學(xué)