沼澤紅假單胞菌菌株、菌劑及菌劑的制備方法、胞外蛋白及其提取方法和應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了沼澤紅假單胞菌菌株、菌劑及菌劑的制備方法、胞外蛋白及其提取方法和應(yīng)用，其中沼澤紅假單胞菌菌株為沼澤紅假單胞菌LY-6（ Rhodopseudomonaspalustris LY-6），保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為 CCTCCM2014525，其菌劑采用沼澤紅假單胞菌菌株經(jīng)活化、種子培養(yǎng)、生產(chǎn)培養(yǎng)、離心后制備得到。本發(fā)明還提供了從沼澤紅假單胞菌菌劑中提取的胞外蛋白，其提取方法包括硫酸銨沉淀-鹽析、離心、SephadexG-25脫鹽、SephadexG-75柱層析分離等步驟。胞外蛋白的提取方法簡(jiǎn)易、流程短、提取效率高，可對(duì)煙草花葉病毒具有體外鈍化作用。CCTCC NO: M 201452520141029
【專(zhuān)利說(shuō)明】
沼澤紅假單胞菌菌株、菌劑及菌劑的制備方法、胞外蛋白及其提取方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物農(nóng)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種沼澤紅假單胞菌菌株、及其菌劑和菌劑的制備方法；還涉及由其菌劑中提取的胞外蛋白及胞外蛋白的提取方法及在煙草花葉病毒防治中的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]植物病毒病是“植物癌癥”，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。植物病毒普遍具有系統(tǒng)侵染性和專(zhuān)性寄生性，因此造成抗病毒藥劑的研發(fā)難度大、效果穩(wěn)定性低等。在煙草的種植過(guò)程中，煙草花葉病毒(TMV)危害尤其嚴(yán)重。煙草花葉病毒病是世界性的重要煙草病害之一，分布范圍廣、發(fā)病危害嚴(yán)重，造成煙葉品質(zhì)下降、產(chǎn)量降低等。
[0003]對(duì)于煙草花葉病毒病的防治，目前還以化學(xué)防治為主。但化學(xué)農(nóng)藥的投入，影響了農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)，破壞了農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)平衡，從而影響農(nóng)田生產(chǎn)的可持續(xù)性，降低了農(nóng)產(chǎn)品的質(zhì)量，且化學(xué)農(nóng)藥的不合理投入，對(duì)非靶標(biāo)毒害及農(nóng)產(chǎn)品殘留超標(biāo)，越來(lái)越受到人們關(guān)注。為了開(kāi)發(fā)理想的抗植物病毒藥劑，研究者們進(jìn)行了大量的定向合成和篩選工作，但至今沒(méi)有開(kāi)發(fā)出像殺蟲(chóng)劑和除草劑、殺菌劑等類(lèi)似的超高效而環(huán)境友好的商品化品種。目前發(fā)現(xiàn)的具有抗病毒活性的化合物主要包括:雜環(huán)類(lèi)化合物、核苷酸、生物堿、取代苯、醛及其縮合物、有機(jī)磷、氨基酸衍生物、維生素、植物激素、抗生素、植物誘導(dǎo)抗病激活劑等。這些化合物中，已有開(kāi)發(fā)成功且在植物病毒防控中起到一定的作用。但是，蛋白類(lèi)的抗病毒藥劑卻仍未見(jiàn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種沼澤紅假單胞菌菌株、菌劑及菌劑的制備方法，從沼澤紅假單胞菌中提取的胞外蛋白，對(duì)煙草花葉病毒具有體外鈍化作用，可應(yīng)用于煙草花葉病毒病的防治，其胞外蛋白的提取方法簡(jiǎn)易、流程短、提取效率高。
[0005]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種沼澤紅假單胞菌菌株，沼澤紅假單胞菌菌株為沼澤紅假單胞菌LY_6 {Rhodopseudomonas palustris LY-6),保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M 2014525。
[0006]作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種沼澤紅假單胞菌菌劑，采用前述的沼澤紅假單胞菌菌株經(jīng)活化、種子培養(yǎng)、生產(chǎn)培養(yǎng)、離心后制備得到。
[0007]作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種前述的沼澤紅假單胞菌菌劑的制備方法，具體包括以下步驟:
(1)活化:將沼澤紅假單胞菌菌株的保存種按雙層平板培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至紅色單菌落出現(xiàn)；
(2)種子培養(yǎng):將步驟(I)培養(yǎng)的紅色單菌落接入至血清瓶中，在溫度為30°C?32°C、光照條件為2500Lx?4000Lx、pH為7.0條件下，用光合細(xì)菌液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期得到菌液；
(3)生產(chǎn)培養(yǎng):將步驟(2)種子培養(yǎng)后得到的菌液接種到生產(chǎn)瓶中，用光合細(xì)菌生產(chǎn)培養(yǎng)基進(jìn)行生產(chǎn)培養(yǎng)，菌液的接種量為光合細(xì)菌菌株生產(chǎn)培養(yǎng)基總體積的5%，在溫度為30°C?32°C、光照條件為2500Lx?4000Lx、pH=7.0條件下，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；
(4)離心:將步驟(3)生產(chǎn)培養(yǎng)得到的菌液進(jìn)行8000rpm、4°C、15min離心后，收集上清，然后用0.22 μ m濾膜進(jìn)行抽濾得到濾液，即制得沼澤紅假單胞菌菌劑。
[0008]作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種胞外蛋白，胞外蛋白從前述的沼澤紅假單胞菌菌劑或前述制備方法制備得到的沼澤紅假單胞菌菌劑中提取得到。
[0009]作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種前述胞外蛋白的提取方法，具體包括以下步驟:
(1)硫酸銨沉淀-鹽析:向沼澤紅假單胞菌菌劑中加入硫酸銨至70%飽和度，使沼澤紅假單胞菌菌劑中的蛋白析出，得到混合液；
(2)離心:將步驟(I)中得到的混合液以IlOOOrpm轉(zhuǎn)速離心30min得到沉淀,將沉淀重懸于PBS緩沖液中得到蛋白重懸液；
(3)Sephadex G_25脫鹽:將步驟(2)中制備得到的蛋白重懸液低溫冷凍濃縮后，采用Sephadex G-25柱進(jìn)行脫鹽得到蛋白粗品；
(4)SephadexG_75柱層析分離:將步驟(3)制得的蛋白粗品采用Sephadex G_75柱進(jìn)行層析分離得到胞外蛋白。
[0010]前述的提取方法，進(jìn)一步的，步驟(2)中，PBS緩沖液的濃度為0.01M, pH為7.0。
[0011]前述的提取方法，進(jìn)一步的，步驟(3)中，蛋白重懸液以15%的上樣比例進(jìn)行Sephadex G-25柱脫鹽得到蛋白粗品，將蛋白粗品稀釋至10mg/mL。
[0012]前述的提取方法,進(jìn)一步的,步驟(4 )中，蛋白粗品按2%的上樣比例進(jìn)行SephadexG-75柱層析分離。
[0013]前述的提取方法，進(jìn)一步的，步驟(4)中層析分離后，獲得的各個(gè)蛋白組分，然后進(jìn)行活性測(cè)定，合并活性組分，低溫冷凍濃縮即得到胞外蛋白。
[0014]作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供了一種前述的胞外蛋白或前述提取方法提取得到的胞外蛋白在煙草花葉病毒病防治中的應(yīng)用。
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
(I)本發(fā)明從沼澤紅假單胞菌LY-6菌劑可以分泌出對(duì)煙草花葉病毒具有鈍化作用的胞外蛋白，從而起到對(duì)煙草花葉病毒的抑制作用。
[0016](2)本發(fā)明首次從從沼澤紅假單胞菌LY-6菌劑的胞外產(chǎn)物中提取胞外蛋白，其提取工藝簡(jiǎn)單、流程短、成本低，提取過(guò)程對(duì)環(huán)境無(wú)污染。
[0017](3)本發(fā)明從沼澤紅假單胞菌LY-6菌劑中提取獲得的蛋白組分分子量在15kD?25kD之間，熱穩(wěn)定性高、耐儲(chǔ)藏、對(duì)煙草花葉病毒的體外鈍化作用效果好。
[0018]本發(fā)明的沼澤紅假單胞菌，其名稱(chēng)為沼澤紅假單胞菌LY-6 {Rhodopseudomonaspalustris LY-6)，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M 2014525 ;保藏單位地址位于中國(guó)武漢大學(xué)，保藏日期為2014年10月29日。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019]為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整的描述。
[0020]圖1為本發(fā)明實(shí)例I中沼澤紅假單胞菌LY-6菌株的菌落圖片。
[0021]圖2為本發(fā)明實(shí)施例4中沼澤紅假單胞菌LY-6菌株發(fā)酵液中胞外提取蛋白組分對(duì)煙草花葉病毒的體外鈍化作用效果圖。
[0022]圖3為本發(fā)明實(shí)例4中沼澤紅假單胞菌LY-6菌株發(fā)酵液中胞外提取蛋白組分對(duì)煙草花葉病毒的體外鈍化作用效果樹(shù)狀圖。

【具體實(shí)施方式】
[0023]以下結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體優(yōu)選的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述，但并不因此而限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0024]以下實(shí)施例中所采用的材料和儀器均為市售。
[0025]實(shí)施例1:
一種沼澤紅假單胞菌菌株為沼澤紅假單胞菌LY-6 {Rhodopseudomonas palus trisLY-6)，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC M 2014525，保藏單位地址位于中國(guó)武漢大學(xué)，保藏日期為2014年10月29日，該菌株被命名為沼澤紅假單胞菌LY-6{.Rhodopseudomonas palustris LY-6)。
[0026]參見(jiàn)圖1:本發(fā)明的沼澤紅假單胞菌菌株LY-6，為革蘭氏陰性菌，經(jīng)生理生化鑒定和分子生物學(xué)鑒定為沼澤紅假單胞菌，主要生物學(xué)特征有:雙層固體平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)4d?8d，形成紅色的圓形菌落，菌落邊緣整齊光滑、菌落直徑0.2mm?0.60mm ;液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)7d呈深紅色；在厭氧和微氧條件下生長(zhǎng)良好；生理化特性為V-P反應(yīng)與甲基紅反應(yīng)陰性、H2S反應(yīng)、明膠液化、脲酶試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)均陽(yáng)性，最適生長(zhǎng)溫度30°C?32°C，pH=7。
[0027]實(shí)施例2:
一種沼澤紅假單胞菌菌劑，采用實(shí)施例1的沼澤紅假單胞菌菌株LY-6為原料，經(jīng)活化、種子培養(yǎng)、生產(chǎn)培養(yǎng)、離心制備得到，其具體制備方法包括以下步驟:
(O活化:將沼澤紅假單胞菌LY-6菌株的保存種按雙層平板培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至紅色單菌落出現(xiàn)；采用的培養(yǎng)基為光合細(xì)菌固體培養(yǎng)基，配方為:0.1被％的(NH4) 2S04、
0.02wt% 的 MgS04、0.5wt% 的 NaHC03、0.05wt% 的 K2HP04、0.02wt% 的 NaCl、0.15wt% 的酵母膏和 1.5wt% 的瓊脂，pH=7.0。
[0028](2)種子培養(yǎng):將步驟(I)培養(yǎng)的紅色單菌落接入至120mL血清瓶中，在溫度為30°C?32°C、光照條件為2500Lx?4000Lx、pH=7.0條件下，用光合細(xì)菌液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期得到菌液。光合細(xì)菌液體培養(yǎng)基的配方為:0.lwt%的(NH4) 2S04、0.02wt%的MgS04、0.5wt% 的 NaHCO3>0.05wt% 的 K2HP04、0.02wt% 的 NaCl、0.15wt% 的酵母膏，ρΗ=7.0。
[0029](3)生產(chǎn)培養(yǎng):將步驟(2)種子培養(yǎng)后得到的菌液接種到生產(chǎn)瓶中，用光合細(xì)菌生產(chǎn)培養(yǎng)基(培養(yǎng)基成分與上述光合細(xì)菌液體培養(yǎng)基一致)進(jìn)行生產(chǎn)培養(yǎng)，菌液的接種量為所述光合細(xì)菌菌株生產(chǎn)培養(yǎng)基總體積的5%，在溫度為30°C?32°C、光照條件為2500Lx?4000Lx、pH=7.0條件下，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期得到菌劑；
(4)離心:將步驟(3)生產(chǎn)培養(yǎng)得到的菌劑進(jìn)行8000rpm、4°C、15min離心后,棄上清,然后用0.22 μ m濾膜進(jìn)行抽濾去除上清中殘留的具體，收集濾液，即制得菌劑。
[0030]實(shí)施例3:
一種沼澤紅假單胞菌胞外蛋白，從實(shí)施例2的沼澤紅假單胞菌菌劑中提取得到，蛋白組分分子量在15kD?25kD之間，其具體的提取方法為:
(I)硫酸銨沉淀-鹽析:在4°C條件下，向沼澤紅假單胞菌菌劑中加入硫酸銨至70%飽和度；待蛋白沉淀從發(fā)酵液中析出得到混合液。
[0031](2)離心、蛋白沉淀收集:將步驟(I)中制備得到的混合液以I100rpm離心30mins(離心溫度為4°C )，棄上清，收集沉淀。將沉淀重懸于0.01M、pH=7.0的PBS緩沖液中得到蛋白重懸液。
[0032](3) Sephadex G-25脫鹽:將步驟(2)中制備得到的蛋白重懸液低溫冷凍濃縮后，按15%的上樣比例，采用S^hadex G_25柱進(jìn)行脫鹽。收集脫鹽后的蛋白進(jìn)行低溫冷凍濃縮，并用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定濃縮后蛋白濃度，將濃縮后的蛋白稀釋至10mg/mL。
[0033](4)Sephadex G-75柱層析分離:將步驟(3)中制備得到的濃度為10mg/mL的蛋白粗品按2%的上樣比例，采用S印hadex G-75柱進(jìn)行層析分離。將獲得的各個(gè)蛋白組分進(jìn)行活性測(cè)定(活性測(cè)定的方法參照半葉法測(cè)定)，合并活性組分，將活性組分低溫冷凍濃縮后獲得胞外蛋白。
[0034]實(shí)施例4:
一種實(shí)施例3的胞外蛋白在煙草花葉病毒病防治中的應(yīng)用，具體的應(yīng)用方法為:
將胞外蛋白配制成 400 μ g/mL >200 μ g/mL > 100 μ g/mL >50 μ g/mL >25 μ g/mL的溶液，并將400 μ g/mL進(jìn)行100 V處理15min滅活，然后采用半葉法測(cè)定活性。
[0035]半葉法測(cè)定各蛋白組分的抗病毒活性:將純化的煙草花葉病毒(TMV)提取液稀釋至10 μ g/mL，與稀釋成各個(gè)濃度的蛋白組分按1:1混合后，24°C條件下保存12h，然后摩擦接種于第6、7、8心葉煙葉片上，24°C培養(yǎng)3d后計(jì)算蛋白液對(duì)TMV抑制率。
[0036]抑制率=(對(duì)照枯斑數(shù)-蛋白處理枯斑數(shù))/對(duì)照枯斑數(shù)X 100%。
[0037]參見(jiàn)圖2和圖3，圖2中編號(hào)1、2、3、4、5分別表示濃度為400 μ g/mL、200 μ g/mL > 100 μ g/mL >50 μ g/mL >25 μ g/mL的胞外蛋白組分處理,柱上不同小寫(xiě)字母表不差異顯著性(P〈0.05)，從圖中2和圖3中可以知道:胞外蛋白液在濃度為50 μ g/mL仍具有一定活性，當(dāng)濃度為12.5 μ g/mL時(shí)，與對(duì)照無(wú)顯著差異；高溫處理后的蛋白失去對(duì)TMV的體外鈍化效果。當(dāng)濃度達(dá)到200 μ g/mL以上時(shí)，對(duì)煙草花葉病毒的體外鈍化作用達(dá)到89%。
0.01M、pH=7.0的PBS緩沖液為空白對(duì)照。
[0038]以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上的限制。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例揭示如上，然而并非用以限定本發(fā)明。任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)和技術(shù)方案的情況下，都可利用上述揭示的方法和技術(shù)內(nèi)容對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案做出許多可能的變動(dòng)和修飾，或修改為等同變化的等效實(shí)施例。因此，凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所做的任何簡(jiǎn)單修改、等同替換、等效變化及修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案保護(hù)的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種沼澤紅假單胞菌菌株，其特征在于，所述沼澤紅假單胞菌菌株為沼澤紅假單胞菌V1-^Rhodopseudomonas palustris LY_6),保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為 CCTCC Μ 2014525。
2.一種沼澤紅假單胞菌菌劑，其特征在于，采用權(quán)利要求1所述的沼澤紅假單胞菌菌株經(jīng)活化、種子培養(yǎng)、生產(chǎn)培養(yǎng)、離心后制備得到。
3.—種權(quán)利要求2所述的沼澤紅假單胞菌菌劑的制備方法，其特征在于，具體包括以下步驟: (1)活化:將沼澤紅假單胞菌菌株的保存種按雙層平板培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)至紅色單菌落出現(xiàn)； (2)種子培養(yǎng):將步驟(1)培養(yǎng)的紅色單菌落接入至血清瓶中，在溫度為30°C?32°C、光照條件為2500Lx?4000Lx、pH為7.0條件下，用光合細(xì)菌液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期得到菌液； (3)生產(chǎn)培養(yǎng):將步驟(2)種子培養(yǎng)后得到的菌液接種到生產(chǎn)瓶中，用光合細(xì)菌生產(chǎn)培養(yǎng)基進(jìn)行生產(chǎn)培養(yǎng)，菌液的接種量為所述光合細(xì)菌菌株生產(chǎn)培養(yǎng)基總體積的5%，在溫度為30°C?32°C、光照條件為2500Lx?4000Lx、pH=7.0條件下，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期； (4)離心:將步驟(3)生產(chǎn)培養(yǎng)得到的菌液進(jìn)行8000rpm、4°C、15min離心后，收集上清，然后用0.22 μ m濾膜進(jìn)行抽濾得到濾液，即制得沼澤紅假單胞菌菌劑。
4.一種胞外蛋白，其特征在于，所述胞外蛋白從權(quán)利要求2所述的沼澤紅假單胞菌菌劑或權(quán)利要求3所述制備方法制備得到的沼澤紅假單胞菌菌劑中提取得到。
5.一種權(quán)利要求4所述胞外蛋白的提取方法，其特征在于，具體包括以下步驟: (1)硫酸銨沉淀-鹽析:向沼澤紅假單胞菌菌劑中加入硫酸銨至70%飽和度，使所述沼澤紅假單胞菌菌劑中的蛋白析出，得到混合液； (2)離心:將所述步驟(1)中得到的混合液以llOOOrpm轉(zhuǎn)速離心30min得到沉淀，將所述沉淀重懸于PBS緩沖液中得到蛋白重懸液； (3)Sephadex G_25脫鹽:將所述步驟(2)中制備得到的蛋白重懸液低溫冷凍濃縮后，采用Sephadex G_25柱進(jìn)行脫鹽得到蛋白粗品； (4)SephadexG_75柱層析分離:將步驟(3)制得的蛋白粗品采用Sephadex G_75柱進(jìn)行層析分離得到胞外蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述步驟(2)中，所述PBS緩沖液的濃度為0.01M, pH為7.0。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述步驟(3)中，所述蛋白重懸液以15%的上樣比例進(jìn)行S印hadex G_25柱脫鹽得到蛋白粗品，將所述蛋白粗品稀釋至10mg/mL。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述步驟(4)中，所述蛋白粗品按2%的上樣比例進(jìn)行Sephadex G_75柱層析分離。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述步驟(4)中層析分離后，獲得的各個(gè)蛋白組分，然后進(jìn)行活性測(cè)定，合并活性組分，低溫冷凍濃縮即得到胞外蛋白。
10.一種權(quán)利要求4所述的胞外蛋白或權(quán)利要求5至9任一項(xiàng)所述提取方法提取得到的胞外蛋白在煙草花葉病毒病防治中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07K1/30GK104403978SQ201410750073
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】劉勇, 張德詠, 蘇品, 譚新球, 張松柏, 馮推紫, 彭靜, 張卓 申請(qǐng)人:湖南省植物保護(hù)研究所