一種真菌漆酶誘導(dǎo)活性化合物及其發(fā)酵制備方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬化合物分離純化【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種微生物來源的新型真菌漆酶高效誘導(dǎo)化合物的發(fā)酵制備、分離純化工藝，及其在誘導(dǎo)真菌漆酶生產(chǎn)方面的應(yīng)用。其特征在于包括下述步驟：通過真菌發(fā)酵制備含有活性化合物的發(fā)酵液，經(jīng)過萃取獲得的活性化合物粗提物依次經(jīng)不同層析樹脂吸附，以不同濃度甲醇-水作為洗脫劑純化精制，最終獲得純化的活性化合物分子；獲得的活性化合物在1～500μM濃度下可以高效誘導(dǎo)漆酶生產(chǎn)真菌分泌胞外漆酶。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：誘導(dǎo)化合物來源于真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物；誘導(dǎo)化合物工作濃度低，有效工作濃度為1～500μM；誘導(dǎo)化合物具有高的真菌漆酶誘導(dǎo)活性。
【專利說明】一種真菌漆酶誘導(dǎo)活性化合物及其發(fā)酵制備方法與應(yīng)用
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2012年5月7日，申請(qǐng)?zhí)枮?012101384476，發(fā)明名稱為“一種真菌漆酶誘導(dǎo)活性化合物及其發(fā)酵制備方法與應(yīng)用”的分案申請(qǐng)。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于化合物分離純化【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種微生物來源的真菌漆酶誘導(dǎo)活性化合物的發(fā)酵制備、高純度漆酶誘導(dǎo)活性化合物的純化工藝及其在真菌漆酶誘導(dǎo)方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003]漆酶(Laccase，ECl.10.3.2)是一類含銅的多酚氧化酶，能夠催化多種酚類和非酚類化合物氧化，同時(shí)伴隨有分子氧還原成水。漆酶作用底物廣泛、催化效率高，在生物制漿和漂白、食品風(fēng)味改良、飼料營(yíng)養(yǎng)改善、人工合成染料脫色、紡織纖維軟化細(xì)化、新型藥物開發(fā)、生物傳感器制造及新型能源開發(fā)等領(lǐng)域具有潛在重要應(yīng)用價(jià)值(Arora DS, SharmaRK(2010)Ligninolytic fungal laccases and their biotechnological applications.Appl Biochem Biotechnol 160:1760 - 1788),近年來成為國(guó)際酶工程學(xué)和環(huán)境科學(xué)交叉領(lǐng)域研究的一個(gè)熱點(diǎn)。
[0004]漆酶廣泛存在于高等真菌(特別是擔(dān)子菌)中。多數(shù)真菌分泌的天然漆酶存在產(chǎn)量低、發(fā)酵周期長(zhǎng)、后處理繁瑣等缺點(diǎn)，無法滿足工業(yè)化應(yīng)用的需要。目前，用來提高漆酶的生物合成產(chǎn)量主要有兩種方法:重組表達(dá)和添加化合物誘導(dǎo)。然而，重組表達(dá)產(chǎn)量依然較低、且生產(chǎn)成本高、后處理難度大，使漆酶生產(chǎn)的成本大大提高，限制了漆酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用；有效的誘導(dǎo)劑多為芳香類化合物或重金屬離子，其有環(huán)境毒性并且價(jià)格昂貴，有效作用濃度大，通常在10_3~10_2摩爾級(jí)別，易造成環(huán)境污染，生產(chǎn)后的發(fā)酵液需要脫毒處理，提高了生產(chǎn)成本，同樣無法突破漆酶產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的瓶頸。因此，尋找一種清潔、高效的漆酶生產(chǎn)方式是推進(jìn)漆酶產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程的迫切需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明是為避免上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的不足之處，提供一種高效真菌漆酶誘導(dǎo)活性化合物(名稱為3-羥基-2-辛基-戊二酸)的發(fā)酵制備和分離純化工藝及其在真菌漆酶誘導(dǎo)發(fā)酵方面的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明的目的之一是提供一種對(duì)真菌漆酶具有高誘導(dǎo)活性的化合物，該化合物有如下分子式:
[0007]
【權(quán)利要求】
1.一種對(duì)真菌漆酶具有高誘導(dǎo)活性的化合物的發(fā)酵制備方法，其特征在于:使用的發(fā)酵菌株為Gongronella sp.，經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得發(fā)酵液，所述發(fā)酵液經(jīng)分離純化后獲得如下分子式的純活性化合物:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的活性化合物的發(fā)酵制備方法，其特征在于:所述發(fā)酵培養(yǎng)是指將Gongronella sp.接種在經(jīng)滅菌的ρΗ4.0~7.0的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于溫度25~31°C、搖床轉(zhuǎn)速100~150rpm條件下培養(yǎng)3~7天后通過紗布過濾收集發(fā)酵液備用；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為每升水中含10~20g蔗糖、I~2g DL-天冬酰胺、0.7~1.5g KH2PO4、0.2~0.6gMgSO4.7Η20、0.02 ~0.15gNa2P04.7Η20、0.01 ~0.05g CaCl2,0.01 ~0.05g FeSO4.7H20、0.01 ~0.04g 腺嘌呤、20 ~60μ g VB1O
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的活性化合物的發(fā)酵制備方法，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為每升水中含15g蔗糖、1.5g DL-天冬酰胺、Ig KH2P04、0.5g MgSO4.7H20、0.1gNa2PO4.7Η20、0.01g CaCl2,0.01g FeSO4.7Η20、0.0275g 腺嘌呤、50 μ g VB10
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的活性化合物的發(fā)酵制備方法，其特征在于，所述分離純化依次包括以下步驟: (1)制備的發(fā)酵液通過萃取劑體積比1:1萃取，萃取液在100~2000Pa，30~55°C的條件下減壓蒸餾，去除萃取劑，得到活性化合物粗制品；所述萃取劑為乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚中的任意一種； (2)將粗制品通過甲醇溶解，按照粗制品與層析樹脂A質(zhì)量比1:10~20上樣，使用體積濃度20%、40%、60%、80%、100%甲醇水溶液梯度洗脫，每個(gè)濃度洗脫3~5柱體積，收集合并活性化合物組分并在100~2000Pa，30~55°C的條件下減壓蒸餾濃縮收集的層析組分，得濃縮產(chǎn)物一； (3)步驟(2)中獲得的濃縮產(chǎn)物一通過甲醇溶解，按照粗制品與層析樹脂B質(zhì)量比1:10~20上樣，使用體積濃度20%、40%、60%、80%、100%甲醇水溶液梯度洗脫，每個(gè)濃度洗脫3~5柱體積，收集合并含活性化合物組分并在100~2000Pa，30~55°C的條件下減壓蒸餾，得濃縮產(chǎn)物二 ； (4)步驟(3)中獲得的濃縮產(chǎn)物二通過甲醇溶解，按照粗制品與層析樹脂C質(zhì)量比1:10~20上樣，使用體積20%、40%、60%、80%、100%甲醇水溶液梯度洗脫，每個(gè)濃度洗脫3~5柱體積，收集合并含活性化合物組分并在100~2000Pa，30~55°C的條件下減壓蒸餾獲得純物質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的活性化合物的發(fā)酵制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中所述的層析樹脂A為市售D101、LX-60非極性大孔樹脂。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的活性化合物的發(fā)酵制備方法，其特征在于，步驟(3)中所述的層析樹脂B為市售MCI GEL CHP20P MCI系列精細(xì)層析樹脂。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的活性化合物的發(fā)酵制備方法，其特征在于，步驟(4)中所述的層析樹脂C為市售十八烷基硅烷鍵合硅膠(ODS)非極性層析樹脂。
【文檔編號(hào)】C07C59/245GK103834695SQ201410085685
【公開日】2014年6月4日 申請(qǐng)日期:2012年5月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月7日
【發(fā)明者】肖亞中, 方澤民, 劉娟娟, 洪宇植, 房偉 申請(qǐng)人:安徽大學(xué)