一種含有動(dòng)物固醇和天然精氨酸結(jié)構(gòu)片段的合成陽(yáng)離子脂質(zhì)、合成方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種含有動(dòng)物固醇和天然精氨酸結(jié)構(gòu)片段的合成陽(yáng)離子脂質(zhì)、合成方法及其應(yīng)用。采用常溫高效化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)方法，將作為疏水砌塊的動(dòng)物固醇和作為陽(yáng)離子砌塊的天然精氨酸通過(guò)氨基酸連接砌塊分別進(jìn)行偶聯(lián)制得，方法簡(jiǎn)便、高效、易操作，且起始原料為市售試劑，易于模塊化制備。本發(fā)明獲得的陽(yáng)離子脂質(zhì)具有水溶性、兩親性、低細(xì)胞毒性、良好生物相容性等優(yōu)點(diǎn)，能在緩沖液中高效結(jié)合基因物質(zhì)形成納米尺度的、穩(wěn)定的復(fù)合體。通過(guò)相關(guān)細(xì)胞生物學(xué)評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)該類陽(yáng)離子脂質(zhì)載體負(fù)載的綠色熒光蛋白報(bào)告基因(eGFP)在人肺癌細(xì)胞株H1299內(nèi)能夠高效轉(zhuǎn)染、表達(dá)目標(biāo)蛋白,較市售參比轉(zhuǎn)染試劑明顯較低的細(xì)胞毒性。能作為低毒、高效的基因輸送載體生物材料。
【專利說(shuō)明】一種含有動(dòng)物固醇和天然精氨酸結(jié)構(gòu)片段的合成陽(yáng)離子脂質(zhì)、合成方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及面向有機(jī)生物功能材料的制備方法與生物醫(yī)藥應(yīng)用領(lǐng)域，特別涉及到一種含有天然動(dòng)物固醇和天然精氨酸化學(xué)結(jié)構(gòu)片段的合成陽(yáng)離子脂質(zhì)及其在制備基因轉(zhuǎn)染載體試劑中的應(yīng)用。
技術(shù)背景
[0002]天然產(chǎn)物作為次級(jí)代謝產(chǎn)物廣泛分布在動(dòng)物、植物和微生物中，其具有維持生理活動(dòng)、介導(dǎo)自身防御和調(diào)控生物生殖的功能。天然產(chǎn)物中，除生物大分子如蛋白質(zhì)(多肽)、核酸、聚糖之外，還有許多生物小分子化合物，包括氨基酸、核苷酸、糖類、脂類(脂肪和甾體)、萜類化合物等，其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)骨架和特殊的功能基團(tuán)賦予了這些天然產(chǎn)物豐富多樣的生物活性。近年來(lái)隨著對(duì)生物相容性材料研究的深入，一些來(lái)源豐富、具有獨(dú)特分子結(jié)構(gòu)和多修飾位點(diǎn)的天然產(chǎn)物分子被逐步應(yīng)用于構(gòu)建具有基因、藥物傳輸性能的納米生物材料。目前，基于天然陽(yáng)離子脂質(zhì)、類脂質(zhì)來(lái)構(gòu)建生物相容性基因載體材料受到了人們的廣泛關(guān)注，該系列陽(yáng)離子脂質(zhì)、類脂質(zhì)基因載體的作用原理是借助其所攜帶的正電荷與負(fù)電性的治療基因(DNA、RNAi)通過(guò)靜電相互作用，形成結(jié)構(gòu)與形態(tài)穩(wěn)定的復(fù)合體(complex),保護(hù)復(fù)合體中DNA或RNAi在體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間血液循環(huán)中不易被核酸酶特異性降解，同時(shí)防止復(fù)合體團(tuán)聚形成更大尺寸的聚集體，實(shí)現(xiàn)治療用基因藥物高效率輸送與細(xì)胞內(nèi)重組轉(zhuǎn)染表達(dá)。因此，作為基因輸送載體的天然脂質(zhì)材料既要滿足自身的低毒性、無(wú)免疫原性、生物可降解性，還需要能夠與治療用外源基因DNA或RNAi有效地復(fù)合形成穩(wěn)定的納米尺度的聚集體(通常在50-400nm)，使其具有血液長(zhǎng)循環(huán)周期，減少器官的選擇性濾出和與血液成份的非特異性相互作用。一般情 況下，為了實(shí)現(xiàn)陽(yáng)離子分子載體和基因間有較強(qiáng)的結(jié)合能力(Binding Affinity),需要保證載體分子有較高的電荷密度。然而,現(xiàn)有的大量研究發(fā)現(xiàn)，在提高現(xiàn)有脂質(zhì)體、類脂質(zhì)體中陽(yáng)離子片段分子量和電荷密度的同時(shí)，其作為基因輸送載體應(yīng)用時(shí)的細(xì)胞毒性顯著增大，不能滿足臨床基因治療的實(shí)際應(yīng)用要求。因此，如何運(yùn)用分子工程手段，研發(fā)生物相容性好、并具有高效基因復(fù)合、負(fù)載性能的新型脂質(zhì)基因載體是發(fā)展高效、低毒基因轉(zhuǎn)染試劑的重要方向。
[0003]動(dòng)物固醇類化合物是一類具有重要生理功能的天然留族化合物，在動(dòng)物體內(nèi)多種脂質(zhì)如低密度脂蛋白(LDL)中廣泛存在，具有較強(qiáng)的疏水性和良好的生物相容性，因此，基于天然動(dòng)物固醇類化合物的骨架結(jié)構(gòu)，通過(guò)進(jìn)一步化學(xué)修飾連接水溶性天然產(chǎn)物陽(yáng)離子片段，制備得到系列動(dòng)物固醇衍生的兩親類脂質(zhì)體功能分子，將有可能同時(shí)具有較低細(xì)胞毒性和水溶性。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)報(bào)道了一些由動(dòng)物留醇衍生的兩親性陽(yáng)離子功能分子(Bioconjugate Chem, 2013, 24，487 - 519),具體的如膽固醇-生物素偶聯(lián)的陽(yáng)離子脂質(zhì)(Chem Biol Drug Des, 2013，82，376 - 383)，大環(huán)取代胺類(ChemPlusChem, 2012，77，584 - 591)等，其性能已經(jīng)在構(gòu)建功能基因載體中得到了初步研究。本發(fā)明人在前期的相關(guān)工作中開(kāi)發(fā)了系列基于二硫鍵的膽固醇脂質(zhì)基因載體(Biomaterials2011，11,3507;ZL201010182428.4)，發(fā)現(xiàn)二硫化學(xué)鍵的引入對(duì)降低合成脂質(zhì)載體的細(xì)胞毒性具有重要作用。進(jìn)一步還發(fā)展了系列基于天然生物相容性膽固醇的類脂質(zhì)陽(yáng)離子有機(jī)功能分子作為基因轉(zhuǎn)染試劑(CN201110040189.3)，并成功應(yīng)用于質(zhì)粒DNA的高效細(xì)胞轉(zhuǎn)染。此外，還發(fā)展了用“Click”方法在溫和的條件下快速偶聯(lián)制備功能陽(yáng)離子脂質(zhì)體的方法(ZL201110040189.3)。上述工作為研究開(kāi)發(fā)由天然產(chǎn)物膽固醇衍生的新型載體生物功能材料與生物相容性功能基因轉(zhuǎn)染試劑提供了新的途徑。
[0004]然而，總體上國(guó)內(nèi)外基于動(dòng)物固醇的兩親陽(yáng)離子類脂質(zhì)分子的研究與應(yīng)用開(kāi)發(fā)的相關(guān)報(bào)道較少。另一方面，從藥物載體或者治療基因藥物的載體實(shí)際應(yīng)用考慮，現(xiàn)有已經(jīng)報(bào)道的基于天然留醇結(jié)構(gòu)的基因載體功能分子普遍存在合成步驟繁瑣，產(chǎn)率較低、制備成本高等現(xiàn)實(shí)問(wèn)題。因此，基于上述考慮，有必要發(fā)展新型高效率、反應(yīng)條件溫和、易操作、結(jié)構(gòu)高度模塊化的天然留醇類功能陽(yáng)離子分子的制備方法，為大量、低成本合成制備基于天然甾醇類天然產(chǎn)物、且具有分子結(jié)構(gòu)多樣性的新型生物相容性陽(yáng)離子功能基因載體分子提供可能，并在此基礎(chǔ)上，通過(guò)細(xì)胞層次上的生物學(xué)性能評(píng)價(jià)，進(jìn)一步反饋指導(dǎo)上述基于天然甾醇類天然產(chǎn)物生物功能載體的設(shè)計(jì)和制備，從而促進(jìn)其作為基因、藥物等生物功能載體材料(或試劑)的應(yīng)用，這也是本發(fā)明所致力解決的目標(biāo)。 [0005]發(fā)明的內(nèi)容
[0006]本發(fā)明的要解決的問(wèn)題之一在于提供一種含有動(dòng)物固醇和天然精氨酸化學(xué)結(jié)構(gòu)片段的合成陽(yáng)離子脂質(zhì)。
[0007]本發(fā)明要解決的問(wèn)題之二在于提供一種含有動(dòng)物固醇和天然精氨酸化學(xué)結(jié)構(gòu)片段的合成陽(yáng)離子脂質(zhì)的合成方法，即運(yùn)用常溫化學(xué)偶聯(lián)方法高效制備得到所述的一種含有動(dòng)物固醇和天然精氨酸化學(xué)結(jié)構(gòu)片段的合成陽(yáng)離子脂質(zhì)。
[0008]本發(fā)明要解決的問(wèn)題之三是提供一種含有動(dòng)物固醇和天然精氨酸化學(xué)結(jié)構(gòu)片段的合成陽(yáng)離子脂質(zhì)作為基因載體材料的用途。尤其是在制備基因轉(zhuǎn)染載體試劑中的應(yīng)用。
[0009]依據(jù)本發(fā)明所提供的一種含有動(dòng)物固醇和天然精氨酸化學(xué)結(jié)構(gòu)片段的合成陽(yáng)離子脂質(zhì)，其結(jié)構(gòu)式(I )可以表示如下:
[0010]
【權(quán)利要求】
1.一種含有動(dòng)物固醇和天然精氨酸化學(xué)結(jié)構(gòu)片段的合成陽(yáng)離子脂質(zhì)，其具有如下結(jié)構(gòu)式(i):

2.如權(quán)利要求1所述的一種含有動(dòng)物固醇和天然精氨酸化學(xué)結(jié)構(gòu)片段的合成陽(yáng)離子 脂質(zhì)的合成方法，由以下三步驟組成: 第一步驟:將動(dòng)物固醇溶于脫水干燥的有機(jī)溶劑中，在催化量的堿存在的條件下加入到溶于有機(jī)溶劑中的末端氨基Boc保護(hù)的氨基酸中，在室溫下反應(yīng)10-24h得到具有末端氨基Boc保護(hù)的動(dòng)物固醇中間體，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如式(II)所示；所述的動(dòng)物固醇、堿和末端氨基Boc保護(hù)的氨基酸的摩爾比為1.0:1.0~2.0 ；1.0~1.5 ;所述的動(dòng)物固醇為膽固醇或氫化膽固醇；
3.如權(quán)利要求2所述的一種含有動(dòng)物固醇和天然精氨酸化學(xué)結(jié)構(gòu)片段的合成陽(yáng)離子脂質(zhì)的合成方法，其特征是步驟一、二、三中，所述有機(jī)溶劑是乙酸乙酯、四氫呋喃、1，4_ 二氧六環(huán)、二氯甲烷、三氯甲烷、二甲基亞砜、N，N-二甲基甲酰胺、1，2_ 二氯乙烷、乙腈、丙酮、苯或甲苯。
4.如權(quán)利要求2所述的一種含有動(dòng)物固醇和天然精氨酸化學(xué)結(jié)構(gòu)片段的合成陽(yáng)離子脂質(zhì)的合成方法，其特征是步驟一或二中所述合成中使用的堿是二乙胺、三乙胺、氨水、碳酸鉀、氫氧化鈉、氫氧化鉀、甲醇鈉、甲醇鉀、1，4-二氮雜二環(huán)[2.2.2]辛烷、1，8-二氮雜環(huán)[5，4，O] 十一烯-7、吡啶、甲基吡啶或4- 二甲氨基吡啶。
5.如權(quán)利要求2所述的一種含有動(dòng)物固醇和天然精氨酸化學(xué)結(jié)構(gòu)片段的合成陽(yáng)離子脂質(zhì)的合成方法，其特征是步驟一中使用的末端氨基Boc保護(hù)的氨基酸是ω-氨基乙酸
6.如權(quán)利要求2所述的一種含有動(dòng)物固醇和天然精氨酸化學(xué)結(jié)構(gòu)片段的合成陽(yáng)離子脂質(zhì)的合成方法，其特征是所述步驟二、三中使用的酸為鹽酸、高氯酸、三氟甲磺酸或三氟乙酸。
7.如權(quán)利要求2所述的一種含有動(dòng)物固醇和天然精氨酸化學(xué)結(jié)構(gòu)片段的合成陽(yáng)離子脂質(zhì)的合成方法，其特征是所述步驟一或二的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)蒸餾、柱層析純化。
8.如權(quán)利要求2所述的一種含有動(dòng)物固醇和天然精氨酸化學(xué)結(jié)構(gòu)片段的合成陽(yáng)離子脂質(zhì)的合成方法，其特征是所述步驟三的產(chǎn)物經(jīng)過(guò)蒸除有機(jī)溶劑、加入醚進(jìn)行沉淀好過(guò)濾干燥純化；所述的醚是乙醚、丙醚、異丙醚、丁醚、甲基叔丁基醚、甲基乙烯基醚、乙二醇二甲醚或二苯醚。
9.如權(quán)利要求7所述的一種含有動(dòng)物固醇和天然精氨酸化學(xué)結(jié)構(gòu)片段的合成陽(yáng)離子脂質(zhì)的方法，其特征是所述柱層析純化使用的有機(jī)溶劑是乙酸乙酯、四氫呋喃、1，4-二氧六環(huán)、二氯甲烷、三氯甲烷、1，2-二氯乙烷、甲醇、乙醇、乙醚、乙腈、丙酮、苯或甲苯、或者它們的混合溶劑。
10.一種如權(quán)利要求1所述的一種含有動(dòng)物固醇和天然精氨酸化學(xué)結(jié)構(gòu)片段的合成陽(yáng)離子脂質(zhì)作為基因 傳輸載體材料的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07C51/41GK103772469SQ201410060042
【公開(kāi)日】2014年5月7日 申請(qǐng)日期:2014年2月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月21日
【發(fā)明者】曹阿民, 盛瑞隆, 王昭, 李明睿 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所