一種1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了1,4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制備方法：將腺苷蛋氨酸產(chǎn)生菌的發(fā)酵液酸化、過濾后得濕菌體，干燥，凍融處理，將無機(jī)強(qiáng)酸的水溶液和濕菌體混合均勻；將含破壁菌體的酸液于陶瓷膜中過濾，并添加無機(jī)強(qiáng)酸的水溶液，收集濾液；將濾液過納濾膜，得濃縮液A；過中等極性大孔吸附樹脂柱，水洗后得流出液B；過H+型大孔弱酸性陽離子交換樹脂柱，用1,4-丁二磺酸洗脫H+型大孔酸性陽離子交換樹脂柱，分布收集并將流出液C合并；將收集液依次過超濾膜和納濾膜；將濃縮液D和1,4-丁二磺酸混合，調(diào)節(jié)1,4-丁二磺酸與腺苷蛋氨酸比例，干燥后即得。本發(fā)明的制備方法操作簡單，產(chǎn)品收率較高，色澤白，純度高。
【專利說明】-種1,4- 丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種1，4- 丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 1，4_ 丁二橫酸腺苷蛋氨酸（S-adenosyl-L-methionninel，4-butanedisulfonat e)是 S-腺苷蛋氨酸（S-adenosyl-L-methionine，簡稱 SAM, SAMe)的 1，4一丁二磺酸鹽，在 臨床上用于治療抑郁癥、關(guān)節(jié)炎、肝功能紊亂等疾患，適用于肝硬化前和肝硬化所致肝內(nèi)膽 汁淤積；適用于妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積。
[0003] 其化學(xué)名稱：（± ) _5' (R*)(R*)氣基竣丙基]甲橫基]-5' -脫 氧腺苷1，4一丁烷二磺酸鹽。其分子式為=C15H23N6O5S + ^C4H9O6S2 ·0· 65C4H1Q06S2 ;其分子量為 748. 24。具體結(jié)構(gòu)式可參考中國專利申請CN201210126839. 0。
[0004] 中國專利 CN200510019206. X，美國專利 USP4990606、USP5128249 和歐洲專利 EP0162323均闡明了 SAM的分離純化及成鹽工藝，其中也包括SAM的1，4一丁二磺酸鹽。最 近，中國專利申請CN201210126839. 0又將制備工藝中的超濾膜過濾步驟置于柱分離過程 步驟之后，同時提高了 1，4_ 丁二磺酸的比例。同時CN201210126839. 0還對上述專利的缺 點(diǎn)進(jìn)行了描述，然而，其制備方法仍然存在操作步驟繁瑣，丁二磺酸含量偏高等缺點(diǎn)，且未 說明其中（S)-S-腺苷蛋氨酸與（R)-S-腺苷蛋氨酸的比例是否達(dá)到國家進(jìn)口藥品注冊標(biāo)準(zhǔn) JX20000239 要求。
[0005] 在注射用丁二磺酸腺苷蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)（國家進(jìn)口藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)JX20000239)中，對 于1，4- 丁二磺酸腺苷蛋氨酸而言，要求其中的（S) -S-腺苷蛋氨酸占腺苷蛋氨酸總比例為 60-75%，現(xiàn)有的制備方法很難制得符合要求的1，4- 丁二磺酸腺苷蛋氨酸，因此往往在分離 純化后還要額外添加（R)-S-腺苷蛋氨酸至相關(guān)比例，并且無法確保產(chǎn)品能夠達(dá)到原料藥 標(biāo)準(zhǔn)的要求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于克服了現(xiàn)有技術(shù)中1，4- 丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制 備方法復(fù)雜，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，純度低，無法保障制得的產(chǎn)品符合相關(guān)原料藥標(biāo)準(zhǔn)等缺陷， 提供一種1，4-丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制備方法。本發(fā)明的制備方法操作簡單，產(chǎn)品收率較 高，色澤白，純度高，制得產(chǎn)品中的（S)-S-腺苷蛋氨酸和（R)-S-腺苷蛋氨酸的比例、1，4-丁 二磺酸和腺苷蛋氨酸的比例符合國家進(jìn)口藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)JX20000239的要求。
[0007] 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題。
[0008] 本發(fā)明提供了一種1，4- 丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制備方法，其包括下述步驟：
[0009] (1)調(diào)節(jié)腺苷蛋氨酸產(chǎn)生菌的發(fā)酵液的pH值至2. 5?3. 0,過濾后得濕菌體，將所 述濕菌體干燥至含水量在5?20wt%后，進(jìn)行凍融處理，所述凍融處理的方法為：將所述濕 菌體于-20?-80°C冷凍12?24h，再于20?25°C融化2?4h ;所述凍融處理進(jìn)行的次數(shù) 為1?3次；將pH值為2?4的無機(jī)強(qiáng)酸的水溶液和所述濕菌體混合均勻，于0?KTC下 放置1?3h，得含破壁菌體的酸液；其中，所述濕菌體和所述無機(jī)強(qiáng)酸的水溶液的體積比為 1:3 ?1:8 ;
[0010] (2)在0?KTC下，將所述含破壁菌體的酸液于陶瓷膜中過濾，過濾的同時向所述 陶瓷膜中添加 pH值為2?4的無機(jī)強(qiáng)酸的水溶液，至濾液中的腺苷蛋氨酸的含量在0. 05g/ L以下，收集所述濾液；其中，所述陶瓷膜的孔徑為20?300nm ;
[0011] (3)將所述濾液過納濾膜，濃縮所述濾液至腺苷蛋氨酸的濃度為4?5g/L，得濃縮 液A ;所述納濾膜的截留分子量為100?200 ;
[0012] (4)調(diào)節(jié)所述濃縮液A的pH值至2?5,過中等極性大孔吸附樹脂柱，水洗后得流 出液B ;所述的中等極性大孔吸附樹脂柱中的大孔吸附樹脂為聚苯乙烯-二乙烯苯樹脂；
[0013] (5)將所述流出液B的pH值調(diào)節(jié)至4. 5?6. 0后，過H+型大孔弱酸性陽離子交換 樹脂柱，用水洗脫除鹽，用〇. 01?〇. 〇2mol/L的醋酸水溶液洗脫除雜，再用水洗脫除醋酸， 用PH值為3?5的1，4- 丁二磺酸洗脫所述的H+型大孔酸性陽離子交換樹脂柱，分布收集 并將流出液C合并，得收集液；所述流出液C中腺苷蛋氨酸的HPLC純度在97%以上；
[0014] (6)將所述收集液依次過超濾膜和納濾膜；所述的超濾膜的截留分子量為5000? 10000,所述納濾膜的截留分子量為100?200,得濃縮液D ;將所述濃縮液D和1，4- 丁二磺 酸混合，調(diào)節(jié)1，4- 丁二磺酸與腺苷蛋氨酸的摩爾比為1. 55?1. 65,干燥后即得。
[0015] 步驟（1)中，所述腺苷蛋氨酸產(chǎn)生菌為本領(lǐng)域常規(guī)使用的可以產(chǎn)生腺苷蛋氨酸的 菌種，較佳地為釀酒酵母，更佳地為釀酒酵母CPCC340488。
[0016] 步驟（1)中，所述腺苷蛋氨酸產(chǎn)生菌的發(fā)酵液可采用本領(lǐng)域常規(guī)的發(fā)酵培養(yǎng)方法 進(jìn)行制備。在本發(fā)明的一較佳實(shí)施方式中，所述腺苷蛋氨酸產(chǎn)生菌的發(fā)酵液由下述制備方 法制得：
[0017] 1)將所述腺苷蛋氨酸產(chǎn)生菌接種于斜面培養(yǎng)基進(jìn)行斜面培養(yǎng)，于29?31°C下培 養(yǎng)3d，再于3?5°C下冷藏5d以上，得生長好的斜面；其中，所述斜面培養(yǎng)基含有：大豆蛋 白胨2. Owt%、酵母膏0. 5wt%、葡萄糖2. Owt%和瓊脂條2. Owt%，所述斜面培養(yǎng)基的pH值為 6. 0 ；
[0018] 2)將所述生長好的斜面接種于種子培養(yǎng)基進(jìn)行種子培養(yǎng)，于27?29°C下以220? 250rpm的轉(zhuǎn)速搖床培養(yǎng)20?24h ;其中，所述種子培養(yǎng)基含有：葡萄糖2. Owt%、酵母膏 I. Owt%和大豆蛋白胨2. Owt%，所述種子培養(yǎng)基的pH值為6. 0 ;
[0019] 3)發(fā)酵罐培養(yǎng)，于發(fā)酵罐中通氣發(fā)酵65?72h，發(fā)酵過程中補(bǔ)加 D，L-蛋氨酸，即 得所述腺苷蛋氨酸產(chǎn)生菌的發(fā)酵液；發(fā)酵罐培養(yǎng)基中含有：蔗糖l〇wt%、酵母膏I. Owt%、硫 酸銨0. 3wt%、磷酸二氫鉀0. 5wt%和D，L-蛋氨酸I. 5wt%，所述發(fā)酵罐培養(yǎng)基的pH值為5. 0。
[0020] 其中，按本領(lǐng)域常識，所述冷藏的時間不超過1個月。
[0021] 其中，所述培養(yǎng)后的斜面接種于種子培養(yǎng)基的方法為本領(lǐng)域常規(guī)的方法，較佳地 按照下述操作進(jìn)行：將無菌水加入到所述生長好的斜面，所述無菌水和所述生長好的斜面 的體積比較佳地為1:10,用無菌接種棒刮下，置于振蕩器中振蕩均勻后以0. 5mL/250mL瓶 或I. 5mL/750mL瓶的接種量接入所述的種子培養(yǎng)基，即可。
[0022] 步驟（1)中，所述調(diào)節(jié)腺苷蛋氨酸產(chǎn)生菌的發(fā)酵液的pH值的方法可為本領(lǐng)域常規(guī) 的方法，一般用酸性調(diào)節(jié)劑進(jìn)行。所述酸性調(diào)節(jié)劑較佳地為鹽酸、硫酸和草酸中的一種或多 種。
[0023] 步驟（1)中，所述過濾的方法和條件可為本領(lǐng)域常規(guī)的方法和條件。所述過濾較 佳地為板框過濾。
[0024] 步驟（1)中，所述干燥的方法和條件可為本領(lǐng)域常規(guī)的方法和條件。所述干燥較 佳地為晾干或冷風(fēng)吹干。
[0025] 步驟（1)中，所述無機(jī)強(qiáng)酸可為本領(lǐng)域常規(guī)使用的無機(jī)強(qiáng)酸，較佳地為鹽酸、硫酸 和磷酸中的一種或多種。
[0026] 步驟（2)中，所述過濾的方法和條件可為本領(lǐng)域常規(guī)的方法和條件。所述過濾的 壓力較佳地在6bar以下。所述陶瓷膜的規(guī)格可為本領(lǐng)域常規(guī)使用的規(guī)格，所述陶瓷膜的面 積較佳地為〇. 1?lm2。所述的陶瓷膜更佳地為江蘇久吾高科技股份有限公司生產(chǎn)的陶瓷 膜。
[0027] 步驟（2)中，所述無機(jī)強(qiáng)酸可為本領(lǐng)域常規(guī)使用的無機(jī)強(qiáng)酸，較佳地為鹽酸、硫酸 和磷酸中的一種或多種。
[0028] 步驟（4)中，所述調(diào)節(jié)所述濃縮液A的pH值的方法可為本領(lǐng)域常規(guī)的方法，一般 用酸性調(diào)節(jié)劑進(jìn)行。所述酸性調(diào)節(jié)劑較佳地為鹽酸、硫酸和草酸中的一種或多種。
[0029] 步驟（4)中，所述中等極性大孔吸附樹脂可為本領(lǐng)域常規(guī)使用的中等極性的大孔 吸附樹脂，所述的大孔吸附樹脂的表面積較佳地在300m 2/g以上，所述大孔吸附樹脂的特征 孔徑較佳地為150?400A，所述大孔吸附樹脂的調(diào)和平均粒徑較佳地為250?840 μ m。所 述中等極性大孔吸附樹脂更佳地為上海華震科技有限公司生產(chǎn)的HZ系列大孔吸附樹脂或 蘇州納微生物科技有限公司生產(chǎn)的NM-100大孔吸附樹脂。
[0030] 步驟（5)中，所述將所述流出液B的pH值調(diào)節(jié)至4. 5?6. 0的方法可為本領(lǐng)域常 規(guī)的方法，一般用堿性調(diào)節(jié)劑進(jìn)行。所述堿性調(diào)節(jié)劑較佳地為NaOH和/或氨水。
[0031] 步驟（5)中，所述的H+型大孔酸性陽離子交換樹脂柱的高徑比較佳地為2?5。所 述H +型大孔弱酸性陽離子交換樹脂柱較佳地為D152離子交換樹脂柱、FPC3500離子交換樹 脂柱、IRC50離子交換樹脂柱或CG50離子交換樹脂柱。
[0032] 步驟（5)中，所述腺苷蛋氨酸的HPLC純度可由本領(lǐng)域常規(guī)的HPLC檢測方法測得。 本發(fā)明中，腺苷蛋氨酸的HPLC的檢測條件和方法較佳地為：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填 充劑；以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；取甲酸銨6. 3g，辛烷磺酸鈉 I. 0g，加水700ml溶 解，用甲酸調(diào)節(jié)pH值至2. 8,加水稀釋至IOOOml，混合均勻，得溶液E，將溶液E和甲醇以體 積比4:1的比例混合均勻，得流動相；流速為I. 25ml/min ;檢測波長為260nm，柱溫為30°C。
[0033] 步驟（6)中，調(diào)節(jié)1，4_ 丁二磺酸與腺苷蛋氨酸摩爾比的方法和條件為本領(lǐng)域常規(guī) 的方法和條件。所述調(diào)節(jié)1，4- 丁二磺酸與腺苷蛋氨酸摩爾比較佳地為1. 59?1. 63,更佳 地為1. 62。
[0034] 步驟（6)中，所述干燥的方法和條件可為本領(lǐng)域常規(guī)的方法和條件。所述干燥較 佳地為噴霧干燥或冷凍干燥。
[0035] 按本領(lǐng)域常識，本發(fā)明中，所述的水均為純水和/或無菌水。
[0036] 在符合本領(lǐng)域常識的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí) 例。
[0037] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0038] 本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：
[0039] 本發(fā)明的制備方法操作簡單，產(chǎn)品收率高，色澤白，純度高，制得產(chǎn)品中的 (S) -S-腺苷蛋氨酸和（R) -S-腺苷蛋氨酸的比例、1，4- 丁二磺酸和腺苷蛋氨酸的比例符合 相關(guān)原料藥標(biāo)準(zhǔn)要求。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0040] 圖1為實(shí)施例5所制得的1，4- 丁二磺酸腺苷蛋氨酸的HPLC檢測圖譜。

【具體實(shí)施方式】
[0041] 下面通過實(shí)施例的方式進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí) 施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商 品說明書選擇。
[0042] 下述實(shí)施例中，腺苷蛋氨酸的HPLC的檢測條件和方法為：以十八烷基硅烷鍵合硅 膠為填充劑；取甲酸銨6. 3g，辛烷磺酸鈉 I. 0g，加水700ml溶解，用甲酸調(diào)節(jié)pH值至2. 8,加 水稀釋至1000ml，搖勻，取此溶液800ml加甲醇200ml，搖勻，作為流動相；流速為I. 25ml/ min ;檢測波長為260nm，柱溫30°C。
[0043] 下述實(shí)施例中，采用的釀酒酵母CPCC340488菌種購自中國藥用微生物菌種保藏 管理中心（CPCC)，該菌種公開對外銷售。
[0044] 實(shí)施例1
[0045] 一種1，4- 丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制備方法，其包括下述步驟：
[0046] (1)對腺苷蛋氨酸產(chǎn)生菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，具體步驟按下述操作進(jìn)行：
[0047] 1)將釀酒酵母CPCC340488菌種接種于斜面培養(yǎng)基進(jìn)行斜面培養(yǎng)，于30°C下培養(yǎng) 3d，再于4°C下冷藏5d，得生長好的斜面；其中，斜面培養(yǎng)基含有：大豆蛋白胨2. Owt%、酵母 膏0. 5wt%、葡萄糖2. Owt%和瓊脂條2. Owt%，斜面培養(yǎng)基的pH值為6. 0 ;
[0048] 2)將20mL無菌水加入到生長好的斜面，用無菌接種棒刮下，置于振蕩器中振蕩均 勻后以0. 5mL/250mL瓶的接種量接入種子培養(yǎng)基，進(jìn)行種子培養(yǎng)，于28°C下以250rpm的 轉(zhuǎn)速搖床培養(yǎng)24h ;其中，種子培養(yǎng)基含有：葡萄糖2. Owt%、酵母膏I. Owt%和大豆蛋白胨 2. Owt%，種子培養(yǎng)基的pH值為6. 0 ;
[0049] 3)發(fā)酵罐培養(yǎng)，于10L發(fā)酵罐中通氣發(fā)酵72h，發(fā)酵過程中補(bǔ)加 I. 6wt%相對于發(fā) 酵罐培養(yǎng)基重量的D，L-蛋氨酸，即得發(fā)酵液；發(fā)酵罐培養(yǎng)基中含有：蔗糖10wt%、酵母膏 I. Owt%、硫酸銨0. 3wt%、磷酸二氫鉀0. 5wt%和D，L-蛋氨酸I. 5wt%，發(fā)酵罐培養(yǎng)基的pH值 為 5.0 ;
[0050] 用硫酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值至3. 0,板框過濾后得I. 8L濕菌體，濕菌體經(jīng)冷風(fēng)吹干 至含水量在5wt%后，進(jìn)行凍融處理2次，凍融處理的方法為：將濕菌體于-20°C冷凍24h，再 于20?25°C融化4h ;將5. 4L的pH值為2的鹽酸水溶液和凍融后的濕菌體混合均勻，于 0?KTC下放置lh，得含破壁菌體的酸液；
[0051] (2)在0?KTC下，將含破壁菌體的酸液于陶瓷膜中過濾，過濾的同時向陶瓷膜中 添加 pH值為2的鹽酸水溶液，至濾液中的腺苷蛋氨酸的含量在0. 05g/L以下，收集澄清濾 液；其中，陶瓷膜的孔徑為200nm，陶瓷膜的面積為0. lm2,過濾時的壓力在6bar以下；
[0052] (3)將濾液過納濾膜，濃縮濾液至腺苷蛋氨酸的濃度為4?5g/L，得8. 5L濃縮液 A ;納濾膜的截留分子量為100?200 ;
[0053] (4)用鹽酸調(diào)節(jié)濃縮液A的pH值至3,過高徑比為5:1且柱體積為3L的HZ-816 大孔吸附樹脂柱，并用2. 5L純水洗出，得流出液B ;
[0054] (5)用NaOH將流出液B的pH值調(diào)節(jié)至5. 5后，過高徑比為3:1且柱體積為5L的 H+型FPC3500離子交換樹脂柱，用純水洗脫除鹽，用0. 02mol/L的醋酸水溶液洗脫除雜，再 用純水洗脫除醋酸，用pH值為3的1，4- 丁二磺酸洗脫H+型FPC3500離子交換樹脂柱，分 布收集并將流出液C合并，得收集液；流出液C中腺苷蛋氨酸的HPLC純度在97%以上；
[0055] (6)將收集液依次過超濾膜和納濾膜；超濾膜的截留分子量為5000?10000,納濾 膜的截留分子量為100?200,得濃縮液D ;將濃縮液D和1，4-丁二磺酸混合，調(diào)節(jié)1，4-丁 二磺酸與腺苷蛋氨酸的摩爾比為1. 63:1，冷凍干燥后即得。
[0056] 所制得的1，4- 丁二磺酸腺苷蛋氨酸凍干粉末32. 5g，色澤白，HPLC純度為97. 1%， 其中（S) -S-腺苷蛋氨酸占總腺苷蛋氨酸的比例為72%，總收率為85%。
[0057] 實(shí)施例2
[0058] -種1，4- 丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制備方法，其包括下述步驟：
[0059] (1)對腺苷蛋氨酸產(chǎn)生菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，具體步驟按下述操作進(jìn)行：
[0060] 1)將釀酒酵母CPCC340488菌種接種于斜面培養(yǎng)基進(jìn)行斜面培養(yǎng)，于30°C下培養(yǎng) 3d，再于4°C下冷藏5d，得生長好的斜面；其中，斜面培養(yǎng)基含有：大豆蛋白胨2. Owt%、酵母 膏0. 5wt%、葡萄糖2. Owt%和瓊脂條2. Owt%，斜面培養(yǎng)基的pH值為6. 0 ;
[0061] 2)將20mL無菌水加入到生長好的斜面，用無菌接種棒刮下，置于振蕩器中振蕩均 勻后以I. 5mL/750mL瓶的接種量接入種子培養(yǎng)基，進(jìn)行種子培養(yǎng)，于28°C下以250rpm的 轉(zhuǎn)速搖床培養(yǎng)24h ;其中，種子培養(yǎng)基含有：葡萄糖2. Owt%、酵母膏I. Owt%和大豆蛋白胨 2. Owt%，種子培養(yǎng)基的pH值為6. 0 ;
[0062] 3)發(fā)酵罐培養(yǎng)，于IOOL發(fā)酵罐中通氣發(fā)酵72h，發(fā)酵過程中補(bǔ)加 I. 6wt%相對于 發(fā)酵罐培養(yǎng)基重量的D，L-蛋氨酸，即得發(fā)酵液；發(fā)酵罐培養(yǎng)基中含有：蔗糖10wt%、酵母膏 I. Owt%、硫酸銨0. 3wt%、磷酸二氫鉀0. 5wt%和D，L-蛋氨酸I. 5wt%，發(fā)酵罐培養(yǎng)基的pH值 為 5.0 ;
[0063] 用硫酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值至3. 0,板框過濾后得16L濕菌體，濕菌體經(jīng)冷風(fēng)吹干 至含水量在20wt%后，進(jìn)行凍融處理2次，凍融處理的方法為：將濕菌體于-80°C冷凍24h， 再于20?25°C融化4h ;將64L的pH值為2的硫酸水溶液和凍融后的濕菌體混合均勻，于 0?KTC下放置lh，得含破壁菌體的酸液；
[0064] (2)在0?KTC下，將含破壁菌體的酸液于陶瓷膜中過濾，過濾的同時向陶瓷膜中 添加 pH值為2的硫酸水溶液，至濾液中的腺苷蛋氨酸的含量在0. 05g/L以下，收集澄清濾 液；其中，陶瓷膜的孔徑為20nm，陶瓷膜的面積為1.0m2,過濾時的壓力在6bar以下；
[0065] (3)將濾液過納濾膜，濃縮濾液至腺苷蛋氨酸的濃度為4?5g/L，得80L濃縮液A ; 納濾膜的截留分子量為100?200 ;
[0066] (4)用硫酸調(diào)節(jié)濃縮液A的pH值至4,過高徑比為5:1且柱體積為30L的HZ-803 大孔吸附樹脂柱，并用25L純水洗出，得流出液B ;
[0067] (5)用氨水將流出液B的pH值調(diào)節(jié)至5. 0后，過高徑比為3:1且柱體積為30L的 H+型D152離子交換樹脂柱，用純水洗脫除鹽，用0. 02mol/L的醋酸水溶液洗脫除雜，再用純 水洗脫除醋酸，用pH值為4的1，4- 丁二磺酸洗脫H+型D152離子交換樹脂柱，分布收集并 將流出液C合并，得收集液；流出液C中腺苷蛋氨酸的HPLC純度在97%以上；
[0068] (6)將收集液依次過超濾膜和納濾膜；超濾膜的截留分子量為5000?10000,納濾 膜的截留分子量為100?200,得濃縮液D ;將濃縮液D和1，4-丁二磺酸混合，調(diào)節(jié)1，4-丁 二磺酸與腺苷蛋氨酸的摩爾比為1. 59:1，噴霧干燥后即得。
[0069] 所制得的1，4- 丁二磺酸腺苷蛋氨酸粉末385. 8g，色澤白，HPLC純度為97. 5%，其 中（S) -S-腺苷蛋氨酸占總腺苷蛋氨酸的比例為73%，總收率為80%。
[0070] 實(shí)施例3
[0071] 一種1，4- 丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制備方法，其包括下述步驟：
[0072] (1)對腺苷蛋氨酸產(chǎn)生菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，具體操作步驟同實(shí)施例2 ;
[0073] 用草酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值至3. 0,板框過濾后得15L濕菌體，濕菌體經(jīng)冷風(fēng)吹干 至含水量在l〇wt%后，進(jìn)行凍融處理2次，凍融處理的方法為：將濕菌體于_80°C冷凍24h， 再于20?25°C融化4h ;將75L的pH值為4的硫酸水溶液和凍融后的濕菌體混合均勻，于 0?KTC下放置3h，得含破壁菌體的酸液；
[0074] (2)在0?KTC下，將含破壁菌體的酸液于陶瓷膜中過濾，過濾的同時向陶瓷膜中 添加 pH值為2的草酸水溶液，至濾液中的腺苷蛋氨酸的含量在0. 05g/L以下，收集澄清濾 液；其中，陶瓷膜的孔徑為200nm，陶瓷膜的面積為1.0m2,過濾時的壓力在6bar以下；
[0075] (3)將濾液過納濾膜，濃縮濾液至腺苷蛋氨酸的濃度為4?5g/L，得76L濃縮液A ; 納濾膜的截留分子量為100?200 ;
[0076] (4)用草酸調(diào)節(jié)濃縮液A的pH值至2,過高徑比為5:1且柱體積為30L的NM-100 大孔吸附樹脂柱，并用25L純水洗出，得流出液B ;
[0077] (5)用NaOH將流出液B的pH值調(diào)節(jié)至6. 0后，過高徑比為3:1且柱體積為30L的 H+型IRC50離子交換樹脂柱，用純水洗脫除鹽，用0. Olmol/L的醋酸水溶液洗脫除雜，再用 純水洗脫除醋酸，用PH值為3的1，4- 丁二磺酸洗脫H+型IRC50離子交換樹脂柱，分布收 集并將流出液C合并，得收集液；流出液C中腺苷蛋氨酸的HPLC純度在97%以上；
[0078] (6)將收集液依次過超濾膜和納濾膜；超濾膜的截留分子量為5000?10000,納濾 膜的截留分子量為100?200,得濃縮液D ;將濃縮液D和1，4-丁二磺酸混合，調(diào)節(jié)1，4-丁 二磺酸與腺苷蛋氨酸的摩爾比為1.65:1，噴霧干燥后即得。
[0079] 所制得的1，4- 丁二磺酸腺苷蛋氨酸粉末280. 5g，色澤白，HPLC純度為98. 1%，其 中（S) -S-腺苷蛋氨酸占總腺苷蛋氨酸的比例為71%，總收率為78%。
[0080] 實(shí)施例4
[0081] 一種1，4- 丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制備方法，其包括下述步驟：
[0082] (1)對腺苷蛋氨酸產(chǎn)生菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，具體操作步驟同實(shí)施例2 ;
[0083] 用硫酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值至3. 0,板框過濾后得17L濕菌體，濕菌體經(jīng)冷風(fēng)吹干 至含水量在20wt%后，進(jìn)行凍融處理3次，凍融處理的方法為：將濕菌體于-50°C冷凍12h， 再于20?25°C融化4h ;將130L的pH值為3的磷酸水溶液和凍融后的濕菌體混合均勻，于 0?KTC下放置lh，得含破壁菌體的酸液；
[0084] (2)在0?KTC下，將含破壁菌體的酸液于陶瓷膜中過濾，過濾的同時向陶瓷膜中 添加 pH值為2的磷酸水溶液，至濾液中的腺苷蛋氨酸的含量在0. 05g/L以下，收集澄清濾 液；其中，陶瓷膜的孔徑為160nm，陶瓷膜的面積為1.0m2,過濾時的壓力在6bar以下；
[0085] (3)將濾液過納濾膜，濃縮濾液至腺苷蛋氨酸的濃度為4?5g/L，得70L濃縮液A ; 納濾膜的截留分子量為100?200 ;
[0086] (4)用磷酸調(diào)節(jié)濃縮液A的pH值至3,過高徑比為4:1且柱體積為30L的HZ-806 大孔吸附樹脂柱，并用25L純水洗出，得流出液B ;
[0087] (5)用氨水將流出液B的pH值調(diào)節(jié)至4. 5后，過高徑比為5:1且柱體積為30L的 H+型FPC3500離子交換樹脂柱，用純水洗脫除鹽，用0. Olmol/L的醋酸水溶液洗脫除雜，再 用純水洗脫除醋酸，用pH值為4. 5的1，4- 丁二磺酸洗脫H+型FPC3500離子交換樹脂柱， 分布收集并將流出液C合并，得收集液；流出液C中腺苷蛋氨酸的HPLC純度在97%以上；
[0088] (6)將收集液依次過超濾膜和納濾膜；超濾膜的截留分子量為5000?10000,納濾 膜的截留分子量為100?200,得濃縮液D ;將濃縮液D和1，4-丁二磺酸混合，調(diào)節(jié)1，4-丁 二磺酸與腺苷蛋氨酸的摩爾比為1. 55:1，冷凍干燥后即得。
[0089] 所制得的1，4- 丁二磺酸腺苷蛋氨酸粉末292. 7g，色澤白，HPLC純度為97. 2%，其 中（S) -S-腺苷蛋氨酸占總腺苷蛋氨酸的比例為72%，總收率為82%。
[0090] 實(shí)施例5
[0091] 一種1，4- 丁二磺酸腺苷蛋氨酸的制備方法，其包括下述步驟：
[0092] (1)對腺苷蛋氨酸產(chǎn)生菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，具體操作步驟同實(shí)施例2 ;
[0093] 用硫酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH值至3. 0,板框過濾后得15L濕菌體，濕菌體經(jīng)晾干至含 水量在15wt%后，進(jìn)行凍融處理1次，凍融處理的方法為：將濕菌體于-80°C冷凍12h，再于 20?25°C融化4h ;將45L的pH值為3的硫酸水溶液和凍融后的濕菌體混合均勻，于0? KTC下放置2h，得含破壁菌體的酸液；
[0094] (2)在0?KTC下，將含破壁菌體的酸液于陶瓷膜中過濾，過濾的同時向陶瓷膜中 添加 pH值為3的硫酸水溶液，至濾液中的腺苷蛋氨酸的含量在0. 05g/L以下，收集澄清濾 液；其中，陶瓷膜的孔徑為300nm，陶瓷膜的面積為1.0m2,過濾時的壓力在6bar以下；
[0095] (3)將濾液過納濾膜，濃縮濾液至腺苷蛋氨酸的濃度為4?5g/L，得70L濃縮液A ; 納濾膜的截留分子量為100?200 ;
[0096] (4)用硫酸調(diào)節(jié)濃縮液A的pH值至2,過高徑比為4:1且柱體積為30L的HZ-812 大孔吸附樹脂柱，并用25L純水洗出，得流出液B ;
[0097] (5)用NaOH將流出液B的pH值調(diào)節(jié)至5. 5后，過高徑比為4:1且柱體積為30L的 H+型FPC3500離子交換樹脂柱，用純水洗脫除鹽，用0. 02mol/L的醋酸水溶液洗脫除雜，再 用純水洗脫除醋酸，用pH值為5的1，4- 丁二磺酸洗脫H+型FPC3500離子交換樹脂柱，分 布收集并將流出液C合并，得收集液；流出液C中腺苷蛋氨酸的HPLC純度在97%以上；
[0098] (6)將收集液依次過超濾膜和納濾膜；超濾膜的截留分子量為5000?10000,納濾 膜的截留分子量為100?200,得濃縮液D ;將濃縮液D和1，4-丁二磺酸混合，調(diào)節(jié)1，4-丁 二磺酸與腺苷蛋氨酸之比為1. 62:1，冷凍干燥后即得。
[0099] 所制得的1，4- 丁二磺酸腺苷蛋氨酸粉末232. 6g，色澤白，HPLC純度為97. 3%，其 HPLC圖譜見圖1，其中（S) -S-腺苷蛋氨酸占總腺苷蛋氨酸的比例為72%，總收率為82%。
【權(quán)利要求】
1. 一種1，4-下二賴酸腺巧蛋氨酸的制備方法，其包括下述步驟： (1) 調(diào)節(jié)腺巧蛋氨酸產(chǎn)生菌的發(fā)酵液的抑值至2. 5?3. 0,過濾后得濕菌體，將所述 濕菌體干燥至含水量在5?20wt%后，進(jìn)行凍融處理，所述凍融處理的方法為；將所述濕菌 體于-20?-8(TC冷凍12?2化，再于20?25C融化2?化；所述凍融處理進(jìn)行的次數(shù) 為1?3次；將抑值為2?4的無機(jī)強(qiáng)酸的水溶液和所述濕菌體混合均勻，于0?1(TC下 放置1?化，得含破壁菌體的酸液；其中，所述濕菌體和所述無機(jī)強(qiáng)酸的水溶液的體積比為 1:3 ?1:8 ; (2) 在0?1(TC下，將所述含破壁菌體的酸液于陶瓷膜中過濾，過濾的同時向所述陶瓷 膜中添加抑值為2?4的無機(jī)強(qiáng)酸的水溶液，至濾液中的腺巧蛋氨酸的含量在0. 05g/L W 下，收集所述濾液；其中，所述陶瓷膜的孔徑為20?300nm ; (3) 將所述濾液過納濾膜，濃縮所述濾液至腺巧蛋氨酸的濃度為4?5g/l，得濃縮液A ; 所述納濾膜的截留分子量為100?200 ; (4) 調(diào)節(jié)所述濃縮液A的抑值至2?5,過中等極性大孔吸附樹脂柱，水洗后得流出液 B ;所述的中等極性大孔吸附樹脂柱中的大孔吸附樹脂為聚苯己帰-二己帰苯樹脂； (5) 將所述流出液B的抑值調(diào)節(jié)至4. 5?6. 0后，過H+型大孔弱酸性陽離子交換樹脂 柱，用水洗脫除鹽，用0. 01?0. 〇2mol/L的醋酸水溶液洗脫除雜，再用水洗脫除醋酸，用抑 值為3?5的1，4-下二賴酸洗脫所述的H+型大孔酸性陽離子交換樹脂柱，分布收集并將 流出液C合并，得收集液；所述流出液C中腺巧蛋氨酸的HPLC純度在97% W上； (6) 將所述收集液依次過超濾膜和納濾膜；所述的超濾膜的截留分子量為5000? 10000,所述納濾膜的截留分子量為100?200,得濃縮液D ;將所述濃縮液D和1，4-下二賴 酸混合，調(diào)節(jié)1，4-下二賴酸與腺巧蛋氨酸的摩爾比為1. 55?1. 65,干燥后即得。
2. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（1)中，所述腺巧蛋氨酸產(chǎn)生菌為 釀酒酵母；和/或，步驟（1)中，所述調(diào)節(jié)腺巧蛋氨酸產(chǎn)生菌的發(fā)酵液的抑值用酸性調(diào)節(jié)劑 進(jìn)行，所述酸性調(diào)節(jié)劑為鹽酸、硫酸和草酸中的一種或多種；和/或，步驟（1)中，所述的過 濾為板框過濾；和/或，步驟（1)中，所述干燥為瞭干或冷風(fēng)吹干；和/或，步驟（1)中，所述 無機(jī)強(qiáng)酸為鹽酸、硫酸和磯酸中的一種或多種。
3. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟（1)中，所述腺巧蛋氨酸產(chǎn)生菌為 釀酒酵母CPCC340488。
4. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（2)中，所述過濾的壓力在化ar W 下；所述陶瓷膜的面積為0. 1?Im2 ;和/或，步驟（2)中，所述無機(jī)強(qiáng)酸為鹽酸、硫酸和磯酸 中的一種或多種。
5. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（4)中，所述調(diào)節(jié)所述濃縮液A的 pH值用酸性調(diào)節(jié)劑進(jìn)行，所述酸性調(diào)節(jié)劑為鹽酸、硫酸和草酸中的一種或多種。
6. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（4)中，所述的大孔吸附樹脂的表 面積在300mVg W上，所述大孔吸附樹脂的特征孔徑為150?400A,所述大孔吸附樹脂的 調(diào)和平均粒徑為250?840 y m。
7. 如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟（4)中，所述中等極性大孔吸附樹 脂為HZ系列大孔吸附樹脂或NM-100大孔吸附樹脂。
8. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（5)中，所述將所述流出液B的抑 值調(diào)節(jié)至4. 5?6. 0用堿性調(diào)節(jié)劑進(jìn)行，所述堿性調(diào)節(jié)劑為化0H和/或氨水。
9. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（5)中，所述的H+型大孔酸性陽離 子交換樹脂柱的高徑比為2?5 ;所述H+型大孔弱酸性陽離子交換樹脂柱為D152離子交換 樹脂柱、FPC3500離子交換樹脂柱、IRC50離子交換樹脂柱或CG50離子交換樹脂柱。
10. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（6)中，所述調(diào)節(jié)1，4-下二賴酸 與腺巧蛋氨酸摩爾比為1.59?1.63 ;和/或，步驟（6)中，所述干燥為噴霧干燥或冷凍干 燥。
【文檔編號】C07H1/08GK104418928SQ201310379731
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年8月27日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月27日
【發(fā)明者】李繼安, 陳代杰, 陳舟舟, 林惠敏, 胡敏, 趙運(yùn)霞, 張瓊, 李亞軍 申請人:上海醫(yī)藥工業(yè)研究院, 中國醫(yī)藥工業(yè)研究總院