專利名稱：醋酸鮭降鈣素的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制藥領(lǐng)域，具體地說，涉及一種醋酸鮭降鈣素的制備方法。
背景技術(shù)：
醋酸鮭降鈣素能夠抑制破骨細(xì)胞的活性；抑制骨鹽溶解，阻止骨內(nèi)鈣釋出；改善骨密度，有效緩解疼痛癥狀；降低骨折的危險性和降低血鈣。因此，臨床上主要用于治療老年骨質(zhì)疏松癥，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，骨轉(zhuǎn)移癌致高鈣血癥。目前醋酸鮭降鈣素的制備方法多是利用Fmoc-策略固相法制備鮭魚降I丐素,主要包括以下步驟:Fmoc-Rink Amide MBHA樹脂或Rink Amide AM樹脂脫Fmoc-保護(hù)后按照固相合成的方法依次連接各種保護(hù)氨基酸得到保護(hù)三十二肽樹脂；其間依次脫去Fmoc —保護(hù)基團(tuán)；脫側(cè)鏈保護(hù)基團(tuán)及切肽同步進(jìn)行，得還原型粗品；粗品經(jīng)弱堿空氣氧化反應(yīng)，并經(jīng)反相HPLC分離純化，制得醋酸鮭降鈣素精品。但是該方法耦聯(lián)32位氨基酸時均采用對稱酸酐法，均需要在反應(yīng)罐外進(jìn)行制酸酐過濾步驟，使得某些位的氨基酸的耦聯(lián)較為困難，合成的收率較低。此外，醋酸鮭降鈣素屬于中長肽，空間位阻大，脫除難度大，也影響了合成的收率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是現(xiàn)有制備方法在耦聯(lián)32位氨基酸時，均采用對稱酸酐法，使得某些位的氨基酸的耦聯(lián)較為困難，合成的收率較低。本發(fā)明的技術(shù)方案如下:一種醋酸鮭降鈣素的制備方法，包括以下步驟:用脫保護(hù)試劑將Rink AmideMBHA樹脂脫保護(hù)，去Fmoc保護(hù)基團(tuán)；以脫保護(hù)后的Rink Amide MBHA樹脂為起始原料，以Fmoc保護(hù)的氨基酸為單體，依次耦聯(lián)氨基酸，得到醋酸鮭降鈣素肽樹脂；其中，耦聯(lián)第1、
·2、4 13、15 19、21、23、25和27 32位氨基酸時的縮合劑為N，N- 二異丙基碳二亞胺(N，N-diisopropyl carbodiimide, DIC) /1-輕基苯并三氮唑(1-Hydroxybenzotriazole,HOBt);耦聯(lián)第3、14、20、22、24和26位氨基酸時的縮合劑為六氟磷酸苯并三唑_1_基-氧基三 批咯 燒基(Benzotriazol-l-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafIuorophosphate, PyBOP) /HOBt ;稱聯(lián)第2 32位氨基酸之前,用所述脫保護(hù)試劑依次脫去上一位耦聯(lián)產(chǎn)物的Fmoc保護(hù)基團(tuán)；裂解所述醋酸鮭降鈣素肽樹脂，然后加入乙醚沉淀所述醋酸鮭降鈣素肽樹脂，得到還原型醋酸鮭降鈣素粗肽；將所述還原型醋酸鮭降鈣素粗肽環(huán)化得到氧化型醋酸鮭降鈣素粗肽；將所述氧化型醋酸鮭降鈣素粗肽純化、轉(zhuǎn)鹽、濃縮和凍干得到醋酸鮭降鈣素。進(jìn)一步，所述脫保護(hù)試劑的制備方法為:將哌啶溶于哌啶溶于二氯甲烷(dichloromethane, DCM) / 氮氮二甲基甲酸胺(N，N-Dimethylformamide, D MF) /N-甲基批咯燒酮(N-methyl-2-pyrrolidone, NMP)溶液中，并加入曲拉通-100,制備得到所述脫保護(hù)試劑，其中，DCM/DMF/NMP的體積比=1:1: 1，哌啶占所述脫保護(hù)試劑的體積百分比為20%，曲拉通-100占所述脫保護(hù)試劑的體積百分比為1%;所述脫保護(hù)的反應(yīng)溫度為15°C。
進(jìn)一步:所述Rink Amide MBHA 樹脂的替代度< 0.6mmol/g。進(jìn)一步:稱聯(lián)第I位氨基酸時，Rink Amide MBHA樹脂:氨基酸:H0Bt:DIC的摩爾比為1:3:3:3 ;耦聯(lián)第2和4 11位氨基酸時，上一位耦聯(lián)產(chǎn)物:氨基酸:H0Bt:DIC的摩爾比為1:3:3:3 ;耦聯(lián)第12、13和15 19位氨基酸時，上一位耦聯(lián)產(chǎn)物:氨基酸:H0Bt:DIC的摩爾比為1:3.3:3.3:3.3 ;耦聯(lián)第21、23、25和27 32位氨基酸時，上一位耦聯(lián)產(chǎn)物:氨基酸:H0Bt:DIC的摩爾比為1:3.9:3.9:3.9 ;耦聯(lián)第3位氨基酸時，上一位耦聯(lián)產(chǎn)物:氨基酸:H0Bt =PyBOP的摩爾比為1:3:3:3 ;耦聯(lián)第14和20位氨基酸時，上一位耦聯(lián)產(chǎn)物:氨基酸:H0Bt =PyBOP的摩爾比為1:3.3:3.3:3.3 ;耦聯(lián)第22,24和26位氨基酸時，上一位耦聯(lián)產(chǎn)物:氨基酸:H0Bt =PyBOP的摩爾比為1:3.9:3.9:3.9 ;耦聯(lián)第7 20位氨基酸時，所述脫保護(hù)試劑的每次體積用量比耦聯(lián)第I位氨基酸時增加20% ;耦聯(lián)第21 32位氨基酸時，所述脫保護(hù)試劑的每次體積用量比 耦聯(lián)第I位氨基酸時增加50%。進(jìn)一步:所述耦聯(lián)的溫度為35°C，時間為2.5 3小時。進(jìn)一步:所述裂解的裂解液各成分的體積比為三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA):1, 2-乙二硫醇(1，2-ethanedi thiol, EDT ):三異丙基娃燒(Tri isopropyl si lane,HS):苯甲硫醚=90:2.5:4:3.5，裂解時間為2小時。進(jìn)一步:所述環(huán)化的氧化劑為雙氧水，pH值為7.4 7.6，時間為2小時。進(jìn)一步:所述純化的色譜柱為直徑10cm、填料為粒徑IOum的十八烷基鍵合硅膠、孔徑100義的C18柱，流動相分別為磷酸-三乙胺緩沖液和乙腈，流速為250ml/min，上樣量為3 5g,色譜儀的檢測波長為220nm。進(jìn)一步:所述轉(zhuǎn)鹽包括離子轉(zhuǎn)換、去離子、平衡和洗脫，所述轉(zhuǎn)鹽的色譜柱為直徑5cm、填料為粒徑IOum的十八烷基鍵合硅膠、孔徑100 A的C18柱，流速為50ml/min，上樣量為5 10g，色譜儀的檢測波長為280nm ;其中，所述離子轉(zhuǎn)換的流動相分別為乙酸銨和乙腈，所述去離子的流動相分別為純水和乙腈，所述平衡的流動相分別為冰醋酸和乙腈，所述洗脫的流動相分別為冰醋酸和乙腈。進(jìn)一步:所述濃縮的溫度為33°C，真空度≤lOmbar。本發(fā)明的技術(shù)效果如下:1、特定位的氨基酸，比如天冬酰胺、谷氨酰胺、精氨酸等是基團(tuán)龐大的氨基酸，它們的空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜，空間位阻較大，耦聯(lián)相當(dāng)困難，傳統(tǒng)的對稱酸酐法應(yīng)用到這幾個氨基酸耦聯(lián)效率很低，本發(fā)明采用對稱酸酐法和PyB0P/H0BT活化法交替耦聯(lián)氨基酸，專用于空間位阻大，空間結(jié)構(gòu)復(fù)雜的特殊氨基酸，可有效提高耦聯(lián)效率，可以制得收率較高的醋酸鮭降鈣素；此外，采用PyB0P/H0BT活化法不需要在反應(yīng)罐外進(jìn)行制酸酐過濾步驟，使制備過程簡單。2、本發(fā)明的方法隨著耦聯(lián)氨基酸增多和肽鏈增長，逐漸增加氨基酸、耦聯(lián)劑、脫保護(hù)試劑和洗滌劑的用量，從耦聯(lián)第7位氨基酸開始，脫保護(hù)試劑和洗滌劑的體積用量增加20%，耦聯(lián)第12位氨基酸開始，氨基酸和耦聯(lián)劑的摩爾用量增加10%，耦聯(lián)第21位氨基酸開始，氨基酸和耦聯(lián)劑的摩爾用量增加30%，脫保護(hù)試劑和洗滌劑的體積用量增加50%，有效提高合成收率。3、傳統(tǒng)的脫除方法只能脫除大部分的Fmoc基團(tuán)，要脫除徹底必然損傷肽鏈，增加副反應(yīng)產(chǎn)物，本發(fā)明采用的脫保護(hù)試劑，有助于長鏈肽的合成收率，脫除效果好且脫除完全，也有利于降低精制難度。曲拉酮-100可以減小多肽結(jié)構(gòu)的空間位阻，有利于哌啶完全的徹底的脫除Fmoc基團(tuán)，同時減少哌啶對整個肽鏈的損傷；徹底脫除Fmoc基團(tuán)有利于合成收率的提聞，大大減小副反應(yīng)廣物的廣生。4、本發(fā)明控制脫保護(hù)反應(yīng)溫度，越長的肽鏈，在脫除反應(yīng)時要控制溫度越低，可以有效保護(hù)肽鏈不被脫除反應(yīng)放出的熱量破壞，這樣有助于長肽鏈的合成收率，形成的肽鏈完整，也有利于精制難度的降低，從而有效提高產(chǎn)品質(zhì)量。5、本發(fā)明采用的裂解試劑及其配比，增加了裂解過程中的保護(hù)劑和捕捉劑，適當(dāng)降低了三氟乙酸的比例，降低了鮭降鈣素在裂解中的損失，提高了裂解的收率，降低了后期純化精制的難度。6、本發(fā)明采用低替代度的Rink Amide MBHA樹脂，以便減小合成過程中的空間位阻，提高合成效率和產(chǎn)品收率，降低精制難度和成本。
具體實施例方式實施例1制備脫保護(hù)試劑脫保護(hù)試劑的制備方法為:將哌啶溶于DCM/DMF/NMP溶液中，并加入曲拉通_100，制備得到脫保護(hù)試劑，其中DCM/DMF/NMP的體積比=1:1: 1，哌啶占脫保護(hù)試劑的體積百分比為20%，曲拉通-100占脫保護(hù)試劑的體積百分比為1%。實施例2Rink Amide MBHA樹脂的預(yù)處理將替代度彡0.6mmol/g的Rink Amide MBHA樹脂投入到反應(yīng)器中，先用DMF洗滌一次，抽干。然后用適量DMF常溫溶漲，N2吹拂，攪拌約30min至樹脂充分泡漲，抽干液體。再用DMF洗滌一次，抽干 。將Rink Amide MBHA樹脂在15°C下脫保護(hù)反應(yīng)20min去除Fmoc保護(hù)基團(tuán)，排干，脫保護(hù)試劑為3200ml，Rink Amide MBHA樹脂的重量濃度為5 10ml/g。該脫保護(hù)溫度可以有效保護(hù)肽鏈不被脫保護(hù)反應(yīng)放出的熱量破壞，從而有效提高產(chǎn)品質(zhì)量。最后依次用DMF、甲醇和DMF洗滌，排干。脫保護(hù)后，用玻璃棒挑取少許樹脂，茚檢，顯深紫紅色，表明Fmoc已脫，待投料。實施例3耦聯(lián)反應(yīng)得到醋酸鮭降鈣素肽樹脂( I)第I位氨基酸的耦聯(lián)第I位氨基酸的耦聯(lián)反應(yīng)的投料配比如表I所示，第I位氨基酸為Fmoc-Cys(Trt)-0H。表I第I位氨基酸耦聯(lián)反應(yīng)投料配比
權(quán)利要求
1.一種醋酸鮭降鈣素的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 用脫保護(hù)試劑將Rink Amide MBHA樹脂脫保護(hù)，去Fmoc保護(hù)基團(tuán)； 以脫保護(hù)后的Rink Amide MBHA樹脂為起始原料，以Fmoc保護(hù)的氨基酸為單體，依次耦聯(lián)氨基酸，得到醋酸鮭降鈣素肽樹脂；其中，耦聯(lián)第1、2、4 13、15 19、21、23、25和27 32位氨基酸時的縮合劑為DIC/HOBt ;耦聯(lián)第3、14、20、22、24和26位氨基酸時的縮合劑為PyBOP/HOBt ;耦聯(lián)第2 32位氨基酸之前，用所述脫保護(hù)試劑依次脫去上一位耦聯(lián)產(chǎn)物的Fmoc保護(hù)基團(tuán)； 裂解所述醋酸鮭降鈣素肽樹脂，然后加入乙醚沉淀所述醋酸鮭降鈣素肽樹脂，得到還原型醋酸鮭降鈣素粗肽； 將所述還原型醋酸鮭降鈣素粗肽環(huán)化得到氧化型醋酸鮭降鈣素粗肽； 將所述氧化型醋酸鮭降鈣素粗肽純化、轉(zhuǎn)鹽、濃縮和凍干得到醋酸鮭降鈣素。
2.如權(quán)利要求I所述的醋酸鮭降鈣素的制備方法，其特征在于，所述脫保護(hù)試劑的制備方法為將哌啶溶于DCM/DMF/NMP溶液中，并加入曲拉通-100，制備得到所述脫保護(hù)試齊[J，其中，DCM/DMF/NMP的體積比=1:1: 1，哌啶占所述脫保護(hù)試劑的體積百分比為20%，曲拉通-100占所述脫保護(hù)試劑的體積百分比為1%;所述脫保護(hù)的反應(yīng)溫度為15°C。
3.如權(quán)利要求I所述的醋酸鮭降鈣素的制備方法，其特征在于所述RinkAmide MBHA樹脂的替代度≤0. 6mmol/g。
4.如權(quán)利要求I 3任一項所述的醋酸鮭降鈣素的制備方法，其特征在于耦聯(lián)第I位氨基酸時，Rink Amide MBHA樹脂:氨基酸=HOBt :DIC的摩爾比為1:3:3:3 ;耦聯(lián)第2和4 11位氨基酸時，上一位耦聯(lián)產(chǎn)物氨基酸H0Bt =DIC的摩爾比為1:3:3:3 ;耦聯(lián)第12、13和15 19位氨基酸時，上一位耦聯(lián)產(chǎn)物氨基酸H0Bt =DIC的摩爾比為1:3. 3:3. 3:3. 3 ;耦聯(lián)第21、23、25和27 32位氨基酸時，上一位耦聯(lián)產(chǎn)物氨基酸H0Bt =DIC的摩爾比為1:3.9:3.9:3.9 ;耦聯(lián)第3位氨基酸時，上一位耦聯(lián)產(chǎn)物氨基酸H0Bt =PyBOP的摩爾比為1:3:3:3 ;耦聯(lián)第14和20位氨基酸時，上一位耦聯(lián)產(chǎn)物氨基酸H0Bt =PyBOP的摩爾比為1:3. 3:3. 3:3. 3 ;耦聯(lián)第22,24和26位氨基酸時，上一位耦聯(lián)產(chǎn)物氨基酸=HOBt =PyBOP的摩爾比為1:3. 9:3. 9:3. 9 ;耦聯(lián)第7 20位氨基酸時，所述脫保護(hù)試劑的每次體積用量比耦聯(lián)第I位氨基酸時增加20% ;耦聯(lián)第21 32位氨基酸時，所述脫保護(hù)試劑的每次體積用量比耦聯(lián)第I位氨基酸時增加50%。
5.如權(quán)利要求4所述的醋酸鮭降鈣素的制備方法，其特征在于所述耦聯(lián)的溫度為35°C，時間為2. 5 3小時。
6.如權(quán)利要求I所述的醋酸鮭降鈣素的制備方法，其特征在于所述裂解的裂解液各成分的體積比為TFA:EDT:HS:苯甲硫醚=90:2. 5:4:3. 5，裂解時間為2小時。
7.如權(quán)利要求I所述的醋酸鮭降鈣素的制備方法，其特征在于所述環(huán)化的氧化劑為雙氧水，PH值為7. 4 7. 6，時間為2小時。
8.如權(quán)利要求I所述的醋酸鮭降鈣素的制備方法，其特征在于所述純化的色譜柱為直徑10cm、填料為粒徑IOum的十八烷基鍵合硅膠、孔徑100 A的C18柱，流動相分別為磷酸-三乙胺緩沖液和乙腈，流速為250ml/min，上樣量為3 5g，色譜儀的檢測波長為220nm。
9.如權(quán)利要求I所述的醋酸鮭降鈣素的制備方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)鹽包括離子轉(zhuǎn)換、去離子、平衡和洗脫，所述轉(zhuǎn)鹽的色譜柱為直徑5cm、填料為粒徑IOum的十八烷基鍵合硅膠、孔徑100爲(wèi)的C18柱，流速為50ml/min，上樣量為5 10g，色譜儀的檢測波長為280nm;其中，所述離子轉(zhuǎn)換的流動相分別為乙酸銨和乙腈，所述去離子的流動相分別為純水和乙腈，所述平衡的流動相分別為冰醋酸和乙腈，所述洗脫的流動相分別為冰醋酸和乙月青。
10.如權(quán)利要求I所述的醋酸鮭降鈣素的制備方法，其特征在于所述濃縮的溫度為33°C，真空度≤lOmbar。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種醋酸鮭降鈣素的制備方法，包括以下步驟用脫保護(hù)試劑將Rink Amide MBHA樹脂脫保護(hù)，去Fmoc保護(hù)基團(tuán)；以脫保護(hù)后的Rink Amide MBHA樹脂為起始原料，以Fmoc保護(hù)的氨基酸為單體，依次耦聯(lián)氨基酸，得到醋酸鮭降鈣素肽樹脂；縮合劑為DIC/HOBt或者PyBOP/HOBt；裂解所述醋酸鮭降鈣素肽樹脂，然后加入乙醚沉淀所述醋酸鮭降鈣素肽樹脂，得到還原型醋酸鮭降鈣素粗肽；將所述還原型醋酸鮭降鈣素粗肽環(huán)化得到氧化型醋酸鮭降鈣素粗肽；將所述氧化型醋酸鮭降鈣素粗肽純化、轉(zhuǎn)鹽、濃縮和凍干得到醋酸鮭降鈣素。本發(fā)明的醋酸鮭降鈣素的收率達(dá)20%以上。
文檔編號C07K1/16GK103254305SQ201310213820
公開日2013年8月21日 申請日期2013年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2013年5月31日
發(fā)明者路兵, 徐偉, 張鴻雁 申請人:青島國大生物制藥股份有限公司