專利名稱：梔子有效成分在α-葡萄糖苷酶抑制劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種中藥提取物、有效部位和有效成分，具體地說(shuō)是涉及桅子有效成分西紅花苷I和西紅花酸作為a_葡萄糖苷酶抑制劑及其提取方法。
背景技術(shù)：
根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟報(bào)告，目前全球糖尿病人數(shù)已逾I億，預(yù)測(cè)2025年將突破3億，主體為 2 型糖尿病(Asian-Pacific Type 2 Diabetes Policy Group.Type 2 diabetespractical targets and treatments 2005, fourth edition6_7:25)。我國(guó)糖尿病患病率逐年增高，從1979年的0.67%上升到1997年的3.6%，估計(jì)現(xiàn)已有糖尿病患者2000萬(wàn)以上，居世界第2位(丁學(xué)屏主編.《中西醫(yī)結(jié)合糖尿病學(xué)》人民衛(wèi)生出版社.2004.3第I版，I，52)，其 中2型糖尿病亦占到90%。因此，預(yù)防和治療糖尿病極為緊迫。糖尿病前期即葡萄糖調(diào)節(jié)受損(impaired glucose regulation, IGR),其包括空腹血糖受損(impaired fasting glucose, IFG)和葡萄糖耐量缺損(impairedglucosetolerance IGT)。而發(fā)展成糖尿病，幾乎都要經(jīng)過(guò)IGT階段(Alice Y.YCheng, GeorgeFantus.0ral antihyperglycemic therapy for type 2 diabetesmellitus CMAJ.2005:172 (2) =213-226.)。我國(guó)有近IGT 3000萬(wàn)人，(衛(wèi)生部疾病控制司，中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì)，中國(guó)慢性病預(yù)防與控制2004; 12 (6):283.)他們是最重要的2型糖尿病高危人群，每年約有8% 11%進(jìn)展為2型糖尿病，其轉(zhuǎn)化的危險(xiǎn)性居世界前列。對(duì)于IGT和2型糖尿病早期患者，均表現(xiàn)為餐后高血糖，而餐后高血糖對(duì)機(jī)體的危害遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)空腹高血糖，(衛(wèi)生部疾病控制司，中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病學(xué)分會(huì).中國(guó)慢性病預(yù)防與控制2004; 12 (6): 283.)餐后高血糖的糖毒作用，不僅極易誘發(fā)大血管、微血管、周圍神經(jīng)等多組織的病變，引起各種并發(fā)癥，(BellDS.1mportance of postprandialglucose control.Southern med J 2001:94 (8):804-809.)還與冠心病和糖尿病的總死亡率之間相關(guān)性大于空腹高血糖，所以降低餐后血糖是預(yù)防2型糖尿病的發(fā)生，減少其并發(fā)癥和降低死亡率的重要措施之一。因此，a-葡萄糖苷酶抑制劑，被亞太地區(qū)2型糖尿病政策組，制訂的2005年第四版《2型糖尿病實(shí)用目標(biāo)與治療》一書(shū)中，仍然推薦為降餐后血糖的一線藥物(Asian-Pacific Type 2 Diabetes Policy Group.Type 2diabetespractical targets and treatments 2005, fourth edition 6-7: 25)。a-葡萄糖苷酶抑制劑是通過(guò)抑制小腸上皮細(xì)胞表面a-葡萄糖苷酶的活性，延遲和減少單糖在其上部的吸收，明顯降低餐后高血糖(Coutinho M, Gerstein HC, WangY，etal.The relationship between glucose and incident cardiovascular events.Ametaregression analysis of published data from 20 studies of 95, 783 individualsfollowed forl2.4 years.Diabetes Care 1999:22 (2):223-240.),來(lái)治療葡萄糖耐量降低和 2 型糖尿病的(DECODE Studty Group.The European Diabetes EpidemiologyGroup.Glucose tolerance and cardiovascular mortality: comparison of fastiog and2-hour diagnostic criteria.Arch Intern Med.2001, 161 (3): 397-405.).上個(gè)世紀(jì)七十年代先后從微生物發(fā)酵產(chǎn)生的三種a-葡萄糖苷酶抑制劑，即阿卡波糖(拜唐蘋)、伏格列波糖(倍欣)和米格列醇己被廣泛應(yīng)用于臨床。STOP-NIDDM (2003年公布有9個(gè)國(guó)家40個(gè)研究中心參加，用拜唐蘋IOOmg, tid,干預(yù)人群平均3.6年))研究已證實(shí)(Chiasson JI,Josse RG,Gom is R,etal.Acarbose treatment and the risk of cardiovasculardisease and hypertension in patients with impaired glucose tolerance theSTOP-NIDDM trial JAMA, 2003，290 (4):486-494.)，阿卡波糖可使 IGT 轉(zhuǎn)化為 2 型糖尿病的危險(xiǎn)下降36%,還可明顯減少其心血管疾病發(fā)生的危險(xiǎn)性。(Van de Laar FA, LucassenPL, etal.Alpha-glucosidase inhibitors for type 2 diabetes mellitus.ACP JClub.2005;143(3):66.)阿卡波糖明顯降低糖化血紅蛋白；空腹和負(fù)荷后血糖以及負(fù)荷后胰島素水平；并使體重指數(shù)降低。但是，上述這類抑制劑市場(chǎng)價(jià)格都比較貴，要滿足低收入患者長(zhǎng)期用其干預(yù)IGT、2型糖尿病早期的餐后高血糖，延緩2型糖尿病的發(fā)生或減輕胰島B細(xì)胞功能的衰竭，是件不容易堅(jiān)持的事。從天然產(chǎn)物、中藥中篩選更多、更便宜的a_葡萄糖苷酶抑制劑，近年來(lái)有不少報(bào)道，有多糖、黃酮、鞣質(zhì)、皂甙、生物堿或提取物等各種類型。但是，根據(jù)文獻(xiàn)檢索，利用體外a -葡萄糖苷酶抑制活性篩選模型，對(duì)西紅花苷I和西紅花酸進(jìn)行a -葡萄糖苷酶抑制活性的體外篩選試驗(yàn)尚未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種a -葡萄糖苷酶抑制劑桅子有效成分及其提取方法。1、桅子藥用
桅子為菌草科(Rubiaceae)植物桅子Gardeniajasminoides Ellis的干燥成熟果實(shí)，化學(xué)成分主要包括環(huán)烯醚萜苷類、二萜類(西紅花苷類)、有機(jī)酸酯類以及其他類化合物?！侗静菥V目》曾記載桅子具有解五種黃病，利五淋，通小便，解消渴，明目的功效，其中“解消渴”與糖尿病的臨床相關(guān)癥狀有關(guān)。因此，這一治則為從桅子中篩選治療糖尿病的a-葡萄糖苷酶抑制劑奠定了理論基礎(chǔ)。2、桅子成分分析
主要包括環(huán)烯醚萜苷類、二萜類(西紅花苷類)、有機(jī)酸酯類以及其他類化合物。單職苷類已報(bào)道有20余種，主要是桅子苷(gardenoside),京尼平苷(geniposide) (2),京尼平-10-龍膽雙糖苷(genipin -1 ^ -gentiobioside)等。二職類化合物主要包括藏紅花酸(croceic acid),藏紅花素-二 P _D_龍膽二糖苷(Crocin I)等。有機(jī)酸酯類主要有綠原酸(chlorogenic acid), 3，4_ 二 _0_ 咖啡酞基奎寧酸(3,4-d1-0-caffeoyl quinic acid)等。還有三萜酸類，熊果酸。本發(fā)明的目的由以下的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)
一種a -葡萄糖苷酶抑制劑--桅子有效成分，其特征在于該提取物為西紅花苷I和西紅花酸。上述桅子有效成分的提取方法如下: (I)西紅花苷I的提取制備:
將桅子粉碎得粗粉，然后50%乙醇滲漉得滲漉液，減壓回收溶劑，得桅子提取物浸膏；取桅子提取物浸膏上大孔吸附樹(shù)脂，用70%乙醇洗脫，得有效部位桅子黃色素；取桅子黃色素上硅膠柱層析，再經(jīng)氯仿:甲醇(5:2)的混合溶液洗脫，得西紅花苷I。(2)西紅花酸的提取制備:
將桅子粉碎得粗粉，然后50%乙醇滲漉得滲漉液，減壓回收溶劑，得桅子提取物浸膏；取桅子提取物浸膏上大孔吸附樹(shù)脂，用70%乙醇洗脫，得有效部位桅子黃色素；取桅子黃色素上硅膠柱層析，再經(jīng)氯仿:甲醇(25:1)的混合溶液洗脫，得西紅花酸。取上述的桅子提取物、桅子黃色素、桅子有效成分西紅花苷I和西紅花酸均可在制備a-葡萄糖苷酶抑制劑中應(yīng)用。有益效果
經(jīng)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明桅子提取物5、10、50、100mg/ml相當(dāng)生藥的四個(gè)不同濃度，以及100mg/ml阿卡波糖作陽(yáng)性藥對(duì)照，分別加入測(cè)定體系，阿卡波糖對(duì)a-葡萄糖苷酶的抑制率為66.40%，桅子提取物的抑制率分別為0.80,9.33,61.47,83.20%。桅子黃色素類5、10、50、100mg/ml相當(dāng)生藥的四個(gè)不同濃度，以及100 mg/ml阿卡波糖作陽(yáng)性藥對(duì)照，分別加入測(cè)定體系，阿卡波糖對(duì)a -葡萄糖苷酶的抑制率為66.40%，桅子提取物的抑制率分別為20.80,29.60,78.13,96.93%。西紅花苷I和西紅花酸1.56、3.13、6.25、12.50、25.00 mg/ml相當(dāng)于生藥的五個(gè)不同濃度，以及25mg/ml阿卡波糖作陽(yáng)性藥對(duì)照，分別加入測(cè)定體系，阿卡波糖對(duì)a -葡萄糖苷酶的抑制率為66.00%,西紅花苷I的抑制率分別為5.69,27.94,27.05,83.19、99.24% ;西紅花酸的抑制率分別為 57.02,90.27,100.00,99.62,94.18%。因此，實(shí)驗(yàn)表明桅子中抑制a -葡萄糖苷酶活性的有效成分為西紅花苷I和西紅花酸。
具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1:一種a-葡萄糖苷酶抑制劑一桅子有效成分西紅花苷I和西紅花酸的提取方法如下:
(I)西紅花苷I的制備:將桅子粉碎得粗粉，然后50%乙醇滲漉得滲漉液，減壓回收溶劑，得浸膏;取浸膏上大孔吸附樹(shù)脂，用70%乙醇洗脫得有效部位桅子黃色素；取桅子黃色素上硅膠柱層析再經(jīng)氯仿:甲醇(5:2)的混合溶液洗脫，得西紅花苷I。(2)西紅花酸的制備:將桅子粉碎得粗粉，然后50%乙醇滲漉得滲漉液，減壓回收溶劑，得浸膏；取浸膏上大孔吸附樹(shù)脂，用70%乙醇洗脫得有效部位桅子黃色素；取桅子黃色素上硅膠柱層析再經(jīng)氯仿:甲醇(25:1)的混合溶液洗脫，得西紅花酸。實(shí)施例2:桅子有效成分西紅花苷I和西紅花酸對(duì)a -葡萄糖苷酶的抑制作用: (一)材料
1、試劑 a -葡萄糖苷酶(a-glucosidase), Sigma公司，批號(hào)1001134428。4_硝基酚-a-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)，Sigma公司，批號(hào)101027065。還原型谷胱甘肽(Reducedglutathione), Sigma公司，批號(hào)1001005780。磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀,購(gòu)于廣東汕頭西隴化工廠，以上均分析純?cè)噭?、儀器 BT-224半自 動(dòng)生化分析儀，意大利產(chǎn)；L550臺(tái)式低速離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司JA2103N型電子天平，上海民橋精密儀器有限公司；ACS型-15C系列電子計(jì)重秤，上海華德衡器有限公司。
3、藥物與藥材阿卡波糖片，拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號(hào)BJ07287。成分:阿卡波糖，每片含50毫克阿卡波糖。(二)方法
1.反應(yīng)體系優(yōu)化
根據(jù)Tremblay等的方法測(cè)定a -葡萄糖苷酶活性,在磷酸鉀緩沖液(pH6.8)體系中，反應(yīng)溫度37°C，以PNPG為反應(yīng)底物，加入a -葡萄糖苷酶，以Na2C03為終止液。PNPG溶液無(wú)色，但經(jīng)a -葡萄糖苷酶水解釋放出對(duì)硝基苯酚(PNP)，PNP在堿性條件下呈黃綠色，在400nm處有最大吸收，當(dāng)加入a -葡萄糖苷酶抑制劑時(shí)，可以抑制a -葡萄糖苷酶的活性，減少PNP的釋放，因此可以通過(guò)吸光度的變化來(lái)測(cè)定抑制活性。調(diào)整a -葡萄糖苷酶和底物PNPG的濃度，a-葡萄糖苷酶濃度固定后，當(dāng)?shù)孜餄舛仍黾游舛戎禑o(wú)明顯變化時(shí)確定為最佳反應(yīng)體系。反應(yīng)系統(tǒng)為67mmol/L磷酸鉀緩沖液(37° C，pH6.8)870 yl，lmg/ml谷胱甘肽溶液25 u L, a-葡萄糖苷酶溶液(0.91,1.82,2.74U/mL) 35 y L，混勻，37 °(:水浴保溫 IOmin 后，加入pNPG溶液(5、10、15、20、25、30mmol/L) 70 y L，再置原水浴中繼續(xù)保溫15min后，再加A 4mL 0.lmol/L Na2C03溶液，冷卻后，以空白管調(diào)零，于波長(zhǎng)405nm處測(cè)定在酶的作用下釋放出對(duì)硝基酚(PNP)的吸光度(A)。
2.西紅花苷I和西紅花酸抑制a-葡萄糖苷酶活性的測(cè)定
反應(yīng)系統(tǒng)為67mmol/L磷酸鉀緩沖液(37°C，pH6.8) 870 yl，lmg/ml谷胱甘肽溶液25 u L, 2.74U/mL a -葡萄糖苷 酶溶液35 y L，與IOy L西紅花苷I和西紅花酸濃度為(1.56,3.13,6.25、12.5、25mg/ml), 10 u L 阿卡波糖(陽(yáng)性藥對(duì)照管，100.0 mg/mL);混勻，37°〇水浴保溫IOmin后，加入15mmol/L pNPG溶液70 y L，再置原水浴中繼續(xù)保溫IOmin后，加入4mL 0.lmol/L Na2C03溶液，以空白管調(diào)零，于波長(zhǎng)400nm處測(cè)定在酶的作用下釋放出對(duì)硝基酚(PNP)的吸光度(A)。其他操作同上。a-葡萄糖苷酶管除不加提取物，空白對(duì)照管內(nèi)加a-葡萄糖苷酶，而不加pNPG外，均由蒸餾水補(bǔ)足體積，其他反應(yīng)同前。中藥空白對(duì)照管內(nèi)除不加PNPG外，需加入相應(yīng)提取物，其濃度、加量與中藥管前平行，其他操作同空白管。a-葡萄糖苷酶抑制率計(jì)算公式如下:
酶活性抑制率=1 - (A樣品一 A背景)]/ (A酶一 A空白)X 100%
(三)結(jié)果
PNPG濃度達(dá)到10 15mmol/L之間，不同濃度的a -葡萄糖苷酶與pNPG反應(yīng)均出現(xiàn)拐點(diǎn)，考慮反應(yīng)敏感度，選擇斜率較大的曲線數(shù)據(jù)，即:2.74U/mL a -葡萄糖苷酶溶液、15mmol/L pNPG溶液。因此確定了 a -葡萄糖苷酶抑制作用試驗(yàn)最佳反應(yīng)體系為:67mmol/L磷酸鉀緩沖液870 yl，lmg/ml谷胱甘肽溶液25 u L，2.74U/mL a-葡萄糖苷酶溶液35 u L，
1 Smmol/T, pNPG 溶液 70 u L, 0.lmol/L Na2CO3 溶液 4mL。見(jiàn)表 I。
權(quán)利要求
1.一種桅子有效成分在a-葡萄糖苷酶抑制劑中的應(yīng)用，其特征在于桅子有效成分為西紅花苷I和西紅花酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的桅子有效成分，其制備方法如下: (1)西紅花苷I的提取制備: 取從桅子中得到的桅子黃色素上硅膠柱層析，再經(jīng)5: 2的氯仿:甲醇混合溶液洗脫，得西紅花苷I; (2)西紅花酸的提取制備: 取從桅子中得到的 桅子黃色素上硅膠柱層析，再經(jīng)25: 2的氯仿:甲醇混合溶液洗脫，得西紅花酸。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種α-葡萄糖苷酶抑制劑——梔子有效成分。經(jīng)鑒定，其有效成分為西紅花苷Ⅰ和西紅花酸。經(jīng)體外實(shí)驗(yàn)以阿卡波糖為陽(yáng)性|對(duì)照，觀察梔子兩個(gè)有效成分對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的影響。結(jié)果表明，梔子兩個(gè)有效成分對(duì)α-葡萄糖苷酶均有明顯的抑制作用，呈量效關(guān)系。
文檔編號(hào)C07H1/08GK103239462SQ20131021392
公開(kāi)日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2013年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2013年6月3日
發(fā)明者肖小華, 徐麗瑛, 王麗華, 周艷艷, 丁琦, 李艷, 曾憲儀 申請(qǐng)人:江西省藥物研究所